CN111040046A - 一种绣球菌多糖的高效制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绣球菌多糖的高效制备方法，其包括如下步骤：S1.绣球菌子实体干燥，粉碎备用；S2.取预处理后的绣球菌粉末，加入二甲基亚砜水溶液，置于双极性方波高压脉冲电场中提取，其中脉冲电场强度为10‑50Kv/cm,频率为200‑1000Hz,收集提取液；S3.将提取液进行微波提取，微波功率为300‑500W,提取温度为100‑120℃；S4.将微波提取后的提取液进行离心，上清液减压浓缩后，用无水乙醇醇沉得粗多糖沉淀；粗多糖沉淀用有机溶剂洗涤，干燥，即得。本发明采用高压脉冲电场与微波提取相结合，以二甲基亚砜溶液为提取溶剂能够高效提取绣球菌多糖，提高绣球菌多糖的提取率和纯度。

Description

一种绣球菌多糖的高效制备方法

技术领域

本发明涉及绣球菌的提取技术领域，具体涉及一种绣球菌多糖的高效制备方法。

背景技术

绣球菌(Sparassis Crispa)是一种珍贵的药食两用真菌，享“万菇之王”之美誉，有效成分主要有蛋白质、多糖、麦角固醇、葡糖苷酰鞘氨醇、腺苷和其他一些小分子化合物等；绣球菌中含有大量β-葡聚糖、抗氧化物质、维生素和矿物质，其超氧化物歧化酶和维生素E的含量居菌藻类食物前列，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗高血压、抗糖尿病等多种药理活性。绣球菌中主要的活性物质为多糖，尤以绣球菌β-葡聚糖含量最高。天然的β-葡聚糖主要有2种存在形式：一种是β-(1→3)-葡聚糖，另一种是β-(1→6)-葡聚糖。其中β-(1→ 3)-葡聚糖具有广泛的生物学活性，存在的结构形式为β-(1→3)糖苷键链接的线性主链并带有β-(1→6)糖苷键链接的分支结构。目前对β-(1→3)-葡聚糖生物活性研究和应用较多，包括免疫药理学活性、造血功能等，广泛应用于化妆品、保健品等领域。绣球菌中β-葡聚糖的含量很高，据日本东京实验研究实验室的检测结果，可高达干重的43.6％，Kim等实验测定绣球菌水提物中β-葡聚糖含量为39.3％；廉添添等测定绣球菌柄部和瓣片部分中β-葡聚糖含量达40％以上。

从绣球菌中提取多糖，制成各种药品、保健食品具有很大的研究价值。

中国专利文献CN104448014A公开了一种绣球菌碱溶多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)碱溶粗多糖提取

将绣球菌子实体粉末经加水溶胀过夜、水浴提取3次每次2h后离心，所得残渣经细胞破碎仪破壁10min、0.1mol/mL氢氧化钠提取3次每次2h后再次离心，合并上清液，用0.1mol/mL盐酸中和后浓缩至10mL，将浓缩液用3倍体积无水乙醇进行醇沉过夜离心，向沉淀中添加无水乙醇、乙醚进行洗涤，离心后将沉淀进行干燥，即得碱溶粗多糖；

(2)碱溶粗多糖纯化

精确称量碱溶粗多糖，用蒸馏水配制成5％糖液，加入10％三氯乙酸调节其pH值至3，静置过夜，以5000r/min离心10min，在上清液中加入4倍体积的95％乙醇再静置过夜，离心，向沉淀中添加无水乙醇、乙醚洗涤，洗涤过后于真空干燥器中干燥，即得去蛋白碱溶多糖。

中国专利文献CN104958314A公开了一种具有神经保护作用的绣球菌SC031 多糖提取物的制备方法，其由以下步骤制备：

将绣球菌SC031经发酵罐得到发酵液，以4000-5000转/分钟离心5-10分钟，弃上清，沉淀冻干，得到绣球菌伞菌粉，菌粉按照100倍量80℃热水提取 2次，每次3小时，过滤并回收提取液并浓缩至室温相对密度为1.15-1.20，真空干燥，即得绣球菌多糖提取物。

中国专利文献CN106188333A公开了一种绣球菌多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：将绣球菌干燥为水分百分含量为10～11％，将绣球菌进行超微粉为粒径为5～10μm的超微粉；

(2)超声波热水提取：向绣球菌超微中加入10～15倍质量份的水，在40～ 65℃下，进行超声波萃取30～40min，离心固液分离，得绣球菌提取液；

(3)膜分离纯化多糖：将提取液通过超滤膜，收集分子量在8KDa～100KDa 的产品即得绣球菌多糖。

CN104448014A采用碱提取法，主要提取在碱液中含有较高提取率的多糖。

CN104958314A采用冻溶法，采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂，从而使细胞内活性物质的溶出。

CN106188333A采用超声波热水提取法，利用超声波的机械效应、空化效应、热效应，可加速绣球菌细胞的劈裂，增大介质分子的的运动速度和穿透力，使得活性物质快速溶出，从而提高提取率。

目前，高压脉冲电场提取绣球菌多糖的研究还没有发现有相关文献公开或报道。

发明内容

为此，本发明的目的在于提供一种绣球菌多糖的高效制备方法，该方法采用高压脉冲电场与微波提取相结合，以二甲基亚砜溶液为提取溶剂能够高效提取绣球菌多糖。

所采用的技术方案为：

一种绣球菌多糖的高效制备方法，包括如下步骤：

S1.绣球菌预处理：绣球菌子实体干燥，粉碎备用；

S2.取预处理后的绣球菌粉末，加入二甲基亚砜水溶液，置于双极性方波高压脉冲电场中提取，其中脉冲电场强度为10-50Kv/cm,频率为200-1000Hz,收集提取液；

S3.将提取液进行微波提取，微波功率为300-500W,提取温度为100-120℃；

S4.将微波提取后的提取液进行离心，上清液减压浓缩后，用无水乙醇醇沉得粗多糖沉淀；粗多糖沉淀用有机溶剂洗涤，干燥，即得绣球菌多糖。

高压脉冲电场的提取方法，其作用机理是利用细胞膜电穿孔原理，在外加电场下瞬间使细胞膜发生破坏，导致细胞膜破裂，细胞内成分流出。由于绣球菌多糖有粘性，采用高压脉冲电场的处理有助于多糖的释放，可提高提取率。脉冲电场强度为10-50Kv/cm,频率为200-1000Hz为较佳的实验条件。

微波提取的作用原理是，利用微波功率为300-500W产生的高频电磁波穿透萃取介质二甲基亚砜水溶液，到达被萃取物料绣球菌的内部，微波能迅速转化为热能而使细胞内部的温度快速上升。当细胞内部的压力超过细胞的承受能力时，细胞就会破裂，有效成分即从细胞内流出，并溶解于萃取介质二甲基亚砜水溶液中。提取温度为100-120℃，能够提高绣球菌多糖在二甲基亚砜水溶液中的溶解度。

用二甲基亚砜水溶液作为提取溶剂，可以增加细胞膜的通透性，有助于活性物质的释放，另外二甲基亚砜还可以促使蛋白质裂解为小分子的可溶于水的肽类物质，可用于除蛋白，提高绣球菌多糖的纯度。

从而，采用高压脉冲电场与微波提取相结合，以二甲基亚砜溶液为提取溶剂能够高效提取绣球菌多糖，提高绣球菌多糖的提取率和纯度。

进一步地，S1中，绣球菌子实体于60±5℃真空干燥至恒重，粉碎，并过 60-100目筛后备用。

进一步地，S2中，取预处理后的绣球菌粉末，加入10-30倍重量的浓度为 5-10vol％二甲基亚砜水溶液，在40-50℃温度下置于双极性方波高压脉冲电场中提取。

进一步地，S2中，置于双极性方波高压脉冲电场中提取的时间为0.5-2h。

进一步地，S3中，微波提取的时间为2-8min。

进一步地，S4中，无水乙醇的用量为上清液减压浓缩体积的3-5倍。

进一步地，S4中，所述有机溶剂采用无水乙醇、乙醚和丙酮的一种或多种。

进一步地，S4中，粗多糖沉淀依次用无水乙醇、乙醚和丙酮洗涤，真空干燥，粉碎过筛，即得绣球菌多糖。

综上，本发明的有益效果在于：

1.绣球菌多糖有粘性，采用高压脉冲电场的处理有助于多糖的释放，可提高提取率。

2.高压脉冲电场与微波协同提取绣球菌多糖，可以大大提高绣球菌多糖提取率，提取率可以达到13.2％-15.5％。

3.用二甲基亚砜水溶液作为提取溶剂，可以增加细胞膜的通透性，有助于活性物质的释放，另外二甲基亚砜还可以促使蛋白质裂解为小分子的可溶于水的肽类物质，可用于除蛋白，提高绣球菌多糖的纯度。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1

一种绣球菌多糖的高效制备方法，包括如下步骤：

(1)绣球菌预处理：绣球菌子实体60℃真空干燥至恒重，粉碎，并过60 目筛后备用；

(2)取预处理后的绣球菌粉末，加入10倍重量的5vol％二甲基亚砜水溶液，在40℃温度下置于双极性方波高压脉冲电场中提取，其中脉冲电场强度为 20Kv/cm,频率为400Hz,处理时间0.5h,收集提取液；

(3)将提取液进行微波提取，微波功率为300W,萃取温度为100℃，萃取时间2min；

(4)将微波提取后的提取液进行离心，上清液减压浓缩至一定体积，用相当于浓缩液的三倍体积量的无水乙醇醇沉得粗多糖沉淀。沉淀物依次用无水乙醇、乙醚和丙酮洗涤，真空干燥，粉碎过筛，即得绣球菌多糖。多糖得率为13.2％。多糖纯度为70.1％。

多糖得率的测定：

多糖得率＝得到的绣球菌多糖重量/称取的绣球菌粉末重量×100％。

多糖纯度的测定：

按照参考文献[1]，采用苯酚－硫酸法进行多糖纯度测定。

参考文献[1]：Lo S,Russell J,Taylor A.Determination of glycogen insmall tissue samples[J].Journal of Applied Physiology,1970,28 (2):234-236.

实施例2

参照实施例1，本实施例的一种绣球菌多糖的高效制备方法，包括如下步骤：

(1)绣球菌预处理：绣球菌子实体60℃真空干燥至恒重，粉碎，并过60 目筛后备用；

(2)取预处理后的绣球菌粉末，加入20倍重量的8vol％二甲基亚砜水溶液，在40℃温度下置于双极性方波高压脉冲电场中提取，其中脉冲电场强度为 30Kv/cm,频率为600Hz,处理时间1h,收集提取液；

(3)将提取液进行微波提取，微波功率为400W,萃取温度为100℃，萃取时间2min；

(4)将微波提取后的提取液进行离心，上清液减压浓缩至一定体积，用三倍体积量的无水乙醇醇沉得粗多糖沉淀。沉淀物依次用无水乙醇、乙醚和丙酮洗涤，真空干燥，粉碎过筛，即得绣球菌多糖。多糖得率为13.8％。多糖纯度为 70.3％。

实施例3

参照实施例1，本实施例的一种绣球菌多糖的高效制备方法，包括如下步骤：

(1)绣球菌预处理：绣球菌子实体60℃真空干燥至恒重，粉碎，并过60 目后备用。

(2)取预处理后的绣球菌粉末，加入30倍重量的10vol％二甲基亚砜水溶液，在40℃温度下置于双极性方波高压脉冲电场中提取，其中脉冲电场强度为 40Kv/cm,频率为800Hz,处理时间1.5h,收集提取液。

(3)将提取液进行微波提取，微波功率为400W,萃取温度为110℃，萃取时间6min。

(4)将微波提取后的提取液进行离心，上清液减压浓缩至一定体积，用三倍体积量的无水乙醇醇沉得粗多糖沉淀。沉淀物依次用无水乙醇、乙醚和丙酮洗涤，真空干燥，粉碎过筛，即得绣球菌多糖。多糖得率为14.9％。多糖纯度为 70.7％。

实施例4

(1)绣球菌预处理：绣球菌子实体60℃真空干燥至恒重，粉碎，并过60 目后备用。

(2)取预处理后的绣球菌粉末，加入30倍重量的8vol％二甲基亚砜水溶液，在40℃温度下置于双极性方波高压脉冲电场中提取，其中脉冲电场强度为 50Kv/cm,频率为1000Hz,处理时间2h,收集提取液。

(3)将提取液进行微波提取，微波功率为500W,萃取温度为120℃，萃取时间8min。

(4)将微波提取后的提取液进行离心，上清液减压浓缩至一定体积，用三倍体积量的无水乙醇醇沉得粗多糖沉淀。沉淀物依次用无水乙醇、乙醚和丙酮洗涤，真空干燥，粉碎过筛，即得绣球菌多糖。多糖得率为15.5％。多糖纯度为 71.1％。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种绣球菌多糖的高效制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.绣球菌预处理：绣球菌子实体干燥，粉碎备用；

S2.取预处理后的绣球菌粉末，加入二甲基亚砜水溶液，置于双极性方波高压脉冲电场中提取，其中脉冲电场强度为10-50Kv/cm,频率为200-1000Hz,收集提取液；

S3.将提取液进行微波提取，微波功率为300-500W,提取温度为100-120℃；

S4.将微波提取后的提取液进行离心，上清液减压浓缩后，用无水乙醇醇沉得粗多糖沉淀；粗多糖沉淀用有机溶剂洗涤，干燥，即得绣球菌多糖。

2.根据权利要求1所述的绣球菌多糖的高效制备方法，其特征在于，S1中，绣球菌子实体于60±5℃真空干燥至恒重，粉碎，并过60-100目筛后备用。

3.根据权利要求1所述的绣球菌多糖的高效制备方法，其特征在于，S2中，取预处理后的绣球菌粉末，加入10-30倍重量的浓度为5-10vol％二甲基亚砜水溶液，在40-50℃温度下置于双极性方波高压脉冲电场中提取。

4.根据权利要求3所述的绣球菌多糖的高效制备方法，其特征在于，S2中，置于双极性方波高压脉冲电场中提取的时间为0.5-2h。

5.根据权利要求1所述的绣球菌多糖的高效制备方法，其特征在于，S3中，微波提取的时间为2-8min。

6.根据权利要求1所述的绣球菌多糖的高效制备方法，其特征在于，S4中，无水乙醇的用量为上清液减压浓缩体积的3-5倍。

7.根据权利要求1所述的绣球菌多糖的高效制备方法，其特征在于，S4中，所述有机溶剂采用无水乙醇、乙醚和丙酮的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的绣球菌多糖的高效制备方法，其特征在于，S4中，粗多糖沉淀依次用无水乙醇、乙醚和丙酮洗涤，真空干燥，粉碎过筛，即得绣球菌多糖。