CN113951367A - 高有机硒含量的食用菌蛋白粉、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高有机硒含量的食用菌蛋白粉、制备方法及应用。利用脉冲电压辅助碱性溶液提取食用菌有效成分，高效提取，避免强碱对有效成分的破坏。利用壳聚糖分别在碱性和酸性条件下对提取液中蛋白质、多糖、硒进行富集，再进行等电点沉淀、醇析收集蛋白质和多糖，实现尽可能充分的收集有效成分，尤其是提高硒含量。进一步的对壳聚糖进行了改性，通过降解、接枝有机改性剂，实现在提高产物吸收率的同时保持良好的吸附沉淀效果。所得高有机硒含量的食用菌蛋白粉得率高、硒含量高、吸收率好、保健功能性强，可应用于制备富硒食品。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种高有机硒含量的食用菌蛋白粉、制备方法及应用。
背景技术
食用菌是指能形成大型的肉质(或胶质)子实体或菌核类组织，并能供人们食用或药用的一类大型真菌。其蛋白质含量高于一般蔬果，其中富含人体必须氨基酸，且种类齐全，具有优秀的保健作用。有机硒是指硒的有机化合物，动植物体内的含硒蛋白是一种天然有机硒，是硒在机体内发挥功能的主要存在形式。其生物活性高，具有缓解疲劳、增强免疫等作用。
天然食用菌中含硒蛋白含量低。中国专利CN 109965075 A公开了一种从富硒食用菌中提取硒蛋白的方法，通过制备富硒食用菌；酸性提取；酶解；制备粗硒蛋白液；醇析干燥得到成品。将硒富集在食用菌中并且转换为有机硒，再用酶解、离心、过滤等方式得到硒蛋白，该发明成品中的硒含量为64.48μg/g。可见，即使以富硒食用菌作为原料，经常规方法提取，获得的硒蛋白含量也不高，在食品加工领域中使用，成本偏高。
实际上，食用菌中的多糖与蛋白质含量不相上下，多糖与硒结合形成的硒多糖，特别是食用菌中富含的β-葡聚糖也是一种具有提高机体免疫功能的食品，糖尿病人也可食用。利用富硒食用菌提取制备保健品时，若只提取含硒蛋白，含硒多糖被浪费，将造成损失。中国专利CN 101933610 B公开了一种食药用菌细胞组分的综合提取法及提取物的应用，对食药用菌细胞进行酶法结合超声破壁，然后分别对提取液和菌渣采用不同顺序的水提、醇提和脂提工艺进行提取，获得纤维素、蛋白质、核酸、多糖、脂肪酸等多种营养组分和生物活性组分。提取收率显著提高，原料得到充分利用。该发明先后两次采用蛋白酶/多肽酶水解提取蛋白质，对蛋白质生物活性造成不利影响。
发明内容
食用菌中部分蛋白质与多糖结合紧密，不易完全分离，且如果完全除去多糖成分也将导致蛋白质的损失。
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种高有机硒含量的食用菌蛋白粉、制备方法及应用。
第一方面，提供一种高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.将高有机硒含量的食用菌洗净、烘干、粉碎过筛，得到高有机硒含量的食用菌粉；
S2.将高有机硒含量的食用菌粉与碱性水混合，浸泡后，搅拌，并施加脉冲电压辅助提取，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.逐次分步调节碱提液的pH至等电点，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S4.调节步骤S3所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩，得到浓缩糖液，加入无水乙醇，静置后离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗后，得到多糖粗提物；
S5.将步骤S3所得蛋白粗提物与步骤S4所得多糖粗提物混合，溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，灭菌，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
优选的，所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.将高有机硒含量的食用菌洗净、烘干、粉碎过筛，得到高有机硒含量的食用菌粉；
S2.将高有机硒含量的食用菌粉与碱性水混合，浸泡后，搅拌，并施加脉冲电压辅助提取，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.在碱提液中加入富集剂，低温搅拌，同时通入二氧化碳反应，过滤，分别收集滤饼和滤液，得到提取物A和提取液Ⅰ；
S4.调节提取液Ⅰ的pH至2-3，继续搅拌反应，然后过滤，用醋酸水溶液冲洗滤饼，分别收集滤饼和滤液，得到提取物B和提取液Ⅱ；
S5.逐次分步调节提取液Ⅱ的pH至等电点，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S6.调节步骤S5所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩，得到浓缩糖液，加入无水乙醇，静置后离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗后，得到多糖粗提物；
S7.将步骤S3所得提取物A、步骤S4所得提取物B、步骤S5所得蛋白粗提物与步骤S6所得多糖粗提物混合，溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，灭菌，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
进一步优选的，所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.将高有机硒含量的食用菌洗净、烘干至含水率为5-8％、粉碎并过60-100目筛，得到高有机硒含量的食用菌粉；
S2.将高有机硒含量的食用菌粉与碱性水按照料液比1g:(8-20)mL混合，浸泡30-60min后，以100-300rpm转速搅拌，并施加脉冲电压辅助提取40-50min，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.按照料液比1g:(80-100)mL在碱提液中加入富集剂，在0-10℃，以100-300rpm转速搅拌，同时以10-20kg/h的速度通入二氧化碳，反应至溶液pH为7-8时，过滤，分别收集滤饼和滤液，得到提取物A和提取液Ⅰ；
S4.调节提取液Ⅰ的pH至2-3，保持100-300rpm转速继续搅拌20-30min，过滤，用0.3-0.6倍提取液Ⅰ体积的0.08-0.12mol/L的醋酸水溶液冲洗滤饼，分别收集滤饼和滤液，得到提取物B和提取液Ⅱ；
S5.逐次分步调节提取液Ⅱ的pH至等电点pH＝3-4、5-6，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S6.调节步骤S5所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩至原体积的1/4-1/3，得到浓缩糖液，加入浓缩糖液体积2-3倍的无水乙醇，静置12-24h，离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗，得到多糖粗提物；
S7.将步骤S3所得提取物A、步骤S4所得提取物B、步骤S5所得蛋白粗提物与步骤S6所得多糖粗提物混合，得到高有机硒含量的食用菌提取物，再以料液比1g:(5-10)mL溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，135-140℃灭菌3-6s，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
所述脉冲电压的电源参数为：电压20-30kV，频率为100-120Hz，矩形波脉冲的宽度为2-10μs。
蛋白质和多糖都可以通过碱提法从食用菌中提取出来。碱溶液可以使食用菌结构变得松散，蛋白中二硫键、氢键、酰胺键断裂，在一定范围内，提取蛋白质。且一般情况下，随溶液pH值增大，蛋白质的溶解度增加。碱法提取多糖时，所需溶液的碱性也较强。但pH过高却容易造成蛋白质和酶失活，在一定程度上也会破坏多糖的硫酸酯基结构，破坏活性结构。
施加脉冲电压辅助提取，利用脉冲电场对生物细胞的电穿孔作用，使之破碎，有助于将生物细胞中的蛋白、多糖等分子释放出来。具有能耗低，反应快，溶剂消耗小，无副反应的优点。并且，在碱溶液中，大部分蛋白质带负电荷，使电场施加给蛋白质的作用力更大，机械动能增强。相对于在碱性溶液中不施加脉冲电压提取，或在中性水溶液中施加脉冲电压提取，提取效果明显提升。因此，脉冲电压辅助提取时，可以在相对较弱的碱性环境下达到更好的提取效果。碱性溶剂消耗小也减少了后续酸液的用量，便于生产操作。
所述碱性水为浓度0.02-0.05mol/L的氢氧化钠水溶液。
所述富集剂为壳聚糖、改性壳聚糖中的任意一种。
生产中，等电点沉淀多采用某一个数值的等电点，天然提取物中蛋白质成分多样，选择某一确定数值的等电点容易造成部分蛋白质的损失。但选择多个等电点，则导致工艺繁杂，不利于生产。本发明添加富集剂，对有效成分进行富集，再进行蛋白质等电点沉淀、多糖醇析。
壳聚糖为天然阳离子型聚电解质，能与带负电荷的蛋白质等物质快速絮凝沉淀，自身无毒，对人体细胞具有很强的亲和性，且具有抑菌、抗癌、降脂、增强免疫等多种生理功能。壳聚糖在溶液中具有很强的吸附性，对金属离子也有螯合作用。壳聚糖作为富集剂，将蛋白质、多糖等物质絮凝沉淀，尤其是与含硒成分螯合沉淀，提高终产物高有机硒含量的食用菌蛋白粉的得率及硒含量。由于壳聚糖在酸性条件下溶解性好，碱性条件下不易溶解；但在碱性条件下，壳聚糖对金属离子、蛋白质等的富集作用更好。因此，先在碱性溶液中加入壳聚糖，并调节至低温弱碱性条件，提高壳聚糖溶解性，在碱性溶液中吸附收集有效成分；然后调节pH至酸性，继续吸附收集有效成分。分别在碱性和酸性条件下进行富集沉淀，实现尽可能充分的收集有效成分，尤其是提高硒含量。
酸性条件下壳聚糖被降解，分子量降低，溶解性更好，但由于-NH2的配位能力下降，分子链减小吸附架桥作用也下降，沉淀作用下降。且壳聚糖分子量绝对值还是较大，具有难以被人体消化吸收的长链糖分子特性，碱性溶液中沉淀的壳聚糖分子量更大，食用时影响人体吸收。因此，对壳聚糖进行了改性，通过酶解、接枝有机改性剂，在提高产物吸收率的同时保持良好的吸附沉淀效果。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将1-2重量份壳聚糖以料液比分散于20-100重量份水中，加入0.3-0.8重量份醋酸，在氮气保护下，以100-300rpm转速搅拌并加热到50-60℃，反应10-20min后，加入0.1-0.15重量份壳聚糖酶，保持100-300rpm转速搅拌反应4-6h，过滤，得到反应液A；
2)在氮气保护下，再在反应液A中加入1-1.6重量份有机改性剂，100-300rpm转速搅拌下加热至90-92℃，反应8-10h，自然冷却至室温，得到水解液；
3)在水解液中加入水解液体积1-2倍的无水乙醇，静置1-2h沉淀，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗，干燥，得到改性壳聚糖。
所述有机改性剂选自阿魏酸、苹果酸、柠檬酸、茶多酚中的至少一种。
优选的，所述有机改性剂由苹果酸和茶多酚按照重量比(2-3):(1-2)组成。
在壳聚糖酶的作用下，壳聚糖被降解为较小分子量的物质，溶解性更在壳聚糖酶的作用下，壳聚糖被降解为较小分子量的物质，溶解性更好，提高碱性条件的富集效果；与有机改性剂生成复合物：与茶多酚通过共价键结合，生成茶多酚-壳聚糖复合物；与苹果酸接枝生成苹果酸-壳聚糖复合物。对蛋白质、多糖产生交联，改善经水解后壳聚糖分子量减小导致吸附沉淀效果下降的问题。苹果酸安全无毒，易于吸收，并有天然果香味，是性能优异的食品添加剂，添加到氨基酸溶液中，可明显提高氨基酸的吸收率。并且具有治疗贫血、高血压、肝病等多种功能。茶多酚为多酚结构的天然产物，具有抗氧化、降血压、抗肿瘤等多重生物活性。作为食品添加剂使用，是一种新型高效且安全的蛋白交联剂，对蛋白质稳定性有提高作用。苹果酸和茶多酚协同作用，改善蛋白粉口味，提高其吸收率、稳定性和保健功能性。
本发明的高有机硒含量的食用菌选用富硒秀珍菇。
秀珍菇，平菇的一种。其味道鲜美，肉质脆嫩，营养丰富。鲜菇中蛋白质含量高，比一般蔬菜高3-6倍，氨基酸种类多，脂肪含量低，还含有碳水化合物、维生素及多种矿物质，具有抗癌、降血脂、润肠味等功效。种植过程中，通过秀珍菇的生长代谢，可以将无机硒转化为有机硒，获得富硒秀珍菇，大大提高其附加营养价值。
第二方面，提供一种按照上述方法制备的高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
第三方面，提供一种上述高有机硒含量的食用菌蛋白粉在富硒食品中的应用。
本发明的有益效果：利用脉冲电压辅助碱性溶液提取食用菌有效成分，高效提取，避免强碱对有效成分的破坏。利用壳聚糖分别在碱性和酸性条件下对提取液中蛋白质、多糖、硒进行富集，再进行等电点沉淀、醇析收集蛋白质和多糖，实现尽可能充分的收集有效成分，尤其是提高硒含量。进一步的对壳聚糖进行了改性，通过降解、接枝有机改性剂，实现在提高产物吸收率的同时保持良好的吸附沉淀效果。所得高有机硒含量的食用菌蛋白粉得率高、硒含量高、吸收率好、保健功能性强，可应用于制备富硒食品。
具体实施方式
实施例所用原料如下：
富硒秀珍菇，含水量为88.6g/100g，硒含量为14.7mg/kg，江苏雨田食用菌有限公司。
壳聚糖，分子量：200kDa，食品级，山东奥康生物科技有限公司。
壳聚糖酶，货号：AL-590422954071，酶活力：20万U，南京胜乐生物科技有限公司。
苹果酸，采用DL-苹果酸，货号：Q446，食品级，河南美味缘贸易有限公司。
茶多酚，货号：ys052，食品级，常州洋森生物科技实力供应商。
实施例1
高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.将富硒秀珍菇洗净、烘干至含水率为6％、粉碎并过80目筛，得到富硒秀珍菇粉；
S2.将富硒秀珍菇粉与碱性水按照料液比1g:15mL混合，浸泡40min后，以200rpm转速搅拌，并施加脉冲电压辅助提取40min，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.逐次分步调节碱提液的pH至等电点pH＝5、3.5、2.5，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S4.调节步骤S3所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，得到浓缩糖液，加入浓缩糖液体积2倍的无水乙醇，静置24h，离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗，得到多糖粗提物；
S5.将步骤S3所得蛋白粗提物与步骤S4所得多糖粗提物混合，得到富硒秀珍菇提取物，再以料液比1g:8mL溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，137℃灭菌5s，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
所述碱性水为浓度0.03mol/L的氢氧化钠水溶液。
所述脉冲电压的电源参数为：电压25kV，频率为100Hz，矩形波脉冲的宽度为6μs。
实施例2
高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.将富硒秀珍菇洗净、烘干至含水率为6％、粉碎并过80目筛，得到富硒秀珍菇粉；
S2.将富硒秀珍菇粉与碱性水按照料液比1g:15mL混合，浸泡40min后，以200rpm转速搅拌，并施加脉冲电压辅助提取40min，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.按照料液比1g:80mL在碱提液中加入富集剂，在6℃，以200rpm转速搅拌，同时以12kg/h的速度通入二氧化碳，反应至溶液pH为8时，过滤，分别收集滤饼和滤液，得到提取物A和提取液Ⅰ；
S4.调节提取液Ⅰ的pH至2.5，保持200rpm转速继续搅拌25min，过滤，用0.5倍提取液Ⅰ体积的0.1mol/L的醋酸水溶液冲洗滤饼，分别收集滤饼和滤液，得到提取物B和提取液Ⅱ；
S5.逐次分步调节提取液Ⅱ的pH至等电点pH＝3.5、5，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S6.调节步骤S5所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，得到浓缩糖液，加入浓缩糖液体积2倍的无水乙醇，静置24h，离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗，得到多糖粗提物；
S7.将步骤S3所得提取物A、步骤S4所得提取物B、步骤S5所得蛋白粗提物与步骤S6所得多糖粗提物混合，得到富硒秀珍菇提取物，再以料液比1g:8mL溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，137℃灭菌5s，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
所述碱性水为浓度0.03mol/L的氢氧化钠水溶液。
所述脉冲电压的电源参数为：电压25kV，频率为100Hz，矩形波脉冲的宽度为6μs。
所述富集剂为壳聚糖。
实施例3
高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.将富硒秀珍菇洗净、烘干至含水率为6％、粉碎并过80目筛，得到富硒秀珍菇粉；
S2.将富硒秀珍菇粉与碱性水按照料液比1g:15mL混合，浸泡40min后，以200rpm转速搅拌，并施加脉冲电压辅助提取40min，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.按照料液比1g:80mL在碱提液中加入富集剂，在6℃，以200rpm转速搅拌，同时以12kg/h的速度通入二氧化碳，反应至溶液pH为8时，过滤，分别收集滤饼和滤液，得到提取物A和提取液Ⅰ；
S4.调节提取液Ⅰ的pH至2.5，保持200rpm转速继续搅拌25min，过滤，用0.5倍提取液Ⅰ体积的0.1mol/L的醋酸水溶液冲洗滤饼，分别收集滤饼和滤液，得到提取物B和提取液Ⅱ；
S5.逐次分步调节提取液Ⅱ的pH至等电点pH＝3.5、5，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S6.调节步骤S5所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，得到浓缩糖液，加入浓缩糖液体积2倍的无水乙醇，静置24h，离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗，得到多糖粗提物；
S7.将步骤S3所得提取物A、步骤S4所得提取物B、步骤S5所得蛋白粗提物与步骤S6所得多糖粗提物混合，得到富硒秀珍菇提取物，再以料液比1g:8mL溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，137℃灭菌5s，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
所述碱性水为浓度0.03mol/L的氢氧化钠水溶液。
所述脉冲电压的电源参数为：电压25kV，频率为100Hz，矩形波脉冲的宽度为6μs。
所述富集剂为改性壳聚糖。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将1重量份壳聚糖以料液比分散于50重量份水中，加入0.5重量份醋酸，在氮气保护下，以200rpm转速搅拌并加热到55℃，反应15min后，加入0.1重量份壳聚糖酶，保持200rpm转速搅拌反应5h，过滤，得到反应液A；
2)在氮气保护下，再在反应液A中加入1.4重量份有机改性剂，200rpm转速搅拌下加热至92℃，反应8h，自然冷却至室温，得到水解液；
3)在水解液中加入水解液体积1.5倍的无水乙醇，静置2h沉淀，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗，干燥，得到改性壳聚糖。
所述有机改性剂为苹果酸。
实施例4
高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.将富硒秀珍菇洗净、烘干至含水率为6％、粉碎并过80目筛，得到富硒秀珍菇粉；
S2.将富硒秀珍菇粉与碱性水按照料液比1g:15mL混合，浸泡40min后，以200rpm转速搅拌，并施加脉冲电压辅助提取40min，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.按照料液比1g:80mL在碱提液中加入富集剂，在6℃，以200rpm转速搅拌，同时以12kg/h的速度通入二氧化碳，反应至溶液pH为8时，过滤，分别收集滤饼和滤液，得到提取物A和提取液Ⅰ；
S4.调节提取液Ⅰ的pH至2.5，保持200rpm转速继续搅拌25min，过滤，用0.5倍提取液Ⅰ体积的0.1mol/L的醋酸水溶液冲洗滤饼，分别收集滤饼和滤液，得到提取物B和提取液Ⅱ；
S5.逐次分步调节提取液Ⅱ的pH至等电点pH＝3.5、5，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S6.调节步骤S5所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，得到浓缩糖液，加入浓缩糖液体积2倍的无水乙醇，静置24h，离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗，得到多糖粗提物；
S7.将步骤S3所得提取物A、步骤S4所得提取物B、步骤S5所得蛋白粗提物与步骤S6所得多糖粗提物混合，得到富硒秀珍菇提取物，再以料液比1g:8mL溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，137℃灭菌5s，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
所述碱性水为浓度0.03mol/L的氢氧化钠水溶液。
所述脉冲电压的电源参数为：电压25kV，频率为100Hz，矩形波脉冲的宽度为6μs。
所述富集剂为改性壳聚糖。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将1重量份壳聚糖以料液比分散于50重量份水中，加入0.5重量份醋酸，在氮气保护下，以200rpm转速搅拌并加热到55℃，反应15min后，加入0.1重量份壳聚糖酶，保持200rpm转速搅拌反应5h，过滤，得到反应液A；
2)在氮气保护下，再在反应液A中加入1.4重量份有机改性剂，200rpm转速搅拌下加热至92℃，反应8h，自然冷却至室温，得到水解液；
3)在水解液中加入水解液体积1.5倍的无水乙醇，静置2h沉淀，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗，干燥，得到改性壳聚糖。
所述有机改性剂为茶多酚。
实施例5
高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：
S1.将富硒秀珍菇洗净、烘干至含水率为6％、粉碎并过80目筛，得到富硒秀珍菇粉；
S2.将富硒秀珍菇粉与碱性水按照料液比1g:15mL混合，浸泡40min后，以200rpm转速搅拌，并施加脉冲电压辅助提取40min，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.按照料液比1g:80mL在碱提液中加入富集剂，在6℃，以200rpm转速搅拌，同时以12kg/h的速度通入二氧化碳，反应至溶液pH为8时，过滤，分别收集滤饼和滤液，得到提取物A和提取液Ⅰ；
S4.调节提取液Ⅰ的pH至2.5，保持200rpm转速继续搅拌25min，过滤，用0.5倍提取液Ⅰ体积的0.1mol/L的醋酸水溶液冲洗滤饼，分别收集滤饼和滤液，得到提取物B和提取液Ⅱ；
S5.逐次分步调节提取液Ⅱ的pH至等电点pH＝3.5、5，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S6.调节步骤S5所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，得到浓缩糖液，加入浓缩糖液体积2倍的无水乙醇，静置24h，离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗，得到多糖粗提物；
S7.将步骤S3所得提取物A、步骤S4所得提取物B、步骤S5所得蛋白粗提物与步骤S6所得多糖粗提物混合，得到富硒秀珍菇提取物，再以料液比1g:8mL溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，137℃灭菌5s，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
所述碱性水为浓度0.03mol/L的氢氧化钠水溶液。
所述脉冲电压的电源参数为：电压25kV，频率为100Hz，矩形波脉冲的宽度为6μs。
所述富集剂为改性壳聚糖。
所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将1重量份壳聚糖以料液比分散于50重量份水中，加入0.5重量份醋酸，在氮气保护下，以200rpm转速搅拌并加热到55℃，反应15min后，加入0.1重量份壳聚糖酶，保持200rpm转速搅拌反应5h，过滤，得到反应液A；
2)在氮气保护下，再在反应液A中加入1.4重量份有机改性剂，200rpm转速搅拌下加热至92℃，反应8h，自然冷却至室温，得到水解液；
3)在水解液中加入水解液体积1.5倍的无水乙醇，静置2h沉淀，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗，干燥，得到改性壳聚糖。
所述有机改性剂由苹果酸和茶多酚按照重量比2:1组成。
测试例1
(1)蛋白粉得率测试
蛋白粉得率＝高有机硒含量的食用菌蛋白粉质量/富硒秀珍菇粉质量×100％
(2)总蛋白含量的测试
参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》采用凯氏定氮法检测总蛋白质含量。
(3)蛋白粉中硒含量的测试
分别取各实施例制备的高有机硒含量的食用菌蛋白粉，参照GB5009.93-2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》，采用氢化物原子荧光光谱法测试硒含量，试样用微波消解。
测试结果见表1。
表1：蛋白粉得率、蛋白质纯度和蛋白粉中硒含量的测试结果
实施例1通过脉冲电压辅助碱溶液提取，可高效获得食用菌有效成分，经等电点沉淀获得蛋白质，再醇析获得多糖。实施例2在实施例1基础上，加入富集剂壳聚糖进行富集沉淀，再进行等电点沉淀和醇析步骤，显著减少有效成分的损失，提高了蛋白粉得率。尤其是壳聚糖对蛋白质的絮凝作用，显著提高了蛋白质含量。壳聚糖与金属离子的螯合作用，也大大提高了蛋白粉硒含量。实施例3和实施例4在与实施例2相比，对壳聚糖进行了改性。改性壳聚糖具有更好的溶解性、更小的分子量，更易被机体吸收。且接枝了苹果酸、茶多酚结构，有效提高对多糖和蛋白质的富集沉淀效果，提高得率。茶多酚对蛋白质的富集效果更好，因此实施例4蛋白质含量更高。实施例5同时使用苹果酸和茶多酚作为富集剂，协同提高了蛋白粉得率、蛋白质含量、硒含量。
测试例2
受试小鼠共分6组，每组10只，以同样的食物进行喂养，让小鼠自由饮食。另，第1-5组分别以实施例1-5高有机硒含量的食用菌蛋白粉溶液进行灌胃，第6组以水作为对照组。每组每日灌胃1次，灌胃体积为0.2mL/10g，连续30天。所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉溶液由2g蛋白粉溶解于100mL水中制得。参照中国专利CN104509864B《一种具有改善胃肠功能的营养保健食品及其制备方法》实施例10：本发明营养保健食品对机体免疫力的影响，进行实验，记录负重游泳时间，检测不负重游泳90min后肝糖原、血清尿素。测试结果见表2。
表2：负重游泳时间、肝糖原、血清尿素的测试结果
随有效成分含量的提高，进食后，给机体提供更多的能量，提高免疫力。蛋白粉中的多糖被转化储存为肝糖原，肝糖原含量多，为机体提供更多能量，达到抗疲劳的效果。机体血清尿素由蛋白质分解代谢而来，其含量随运动负荷的增加而增加，机体对负荷适应能力越差，血清尿素的增加就越明显。剧烈运动后血清尿素增值的降低，表明机体耐力增加。运动时肝糖原被优先消耗，有利于保存体内蛋白质。因此虽然摄入蛋白质含量多，但吸收好，快速转化为机体蛋白储存起来，消耗分解少，血清尿素含量低。经改性后，壳聚糖分子量减小，且苹果酸、茶多酚促进机体蛋白质氨基酸的吸收，血清尿素含量进一步降低。
Claims (10)
1.高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将高有机硒含量的食用菌洗净、烘干、粉碎，得到高有机硒含量的食用菌粉；
S2.将高有机硒含量的食用菌粉与碱性水混合，浸泡后，搅拌，并施加脉冲电压辅助提取，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.逐次分步调节碱提液的pH至等电点，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S4.调节步骤S3所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩，得到浓缩糖液，加入无水乙醇，静置后离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗后，得到多糖粗提物；
S5.将步骤S3所得蛋白粗提物与步骤S4所得多糖粗提物混合，溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，灭菌，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
2.如权利要求1所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将高有机硒含量的食用菌洗净、烘干、粉碎，得到高有机硒含量的食用菌粉；
S2.将高有机硒含量的食用菌粉与碱性水混合，浸泡后，搅拌，并施加脉冲电压辅助提取，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.在碱提液中加入富集剂，低温搅拌，同时通入二氧化碳反应，过滤，分别收集滤饼和滤液，得到提取物A和提取液Ⅰ；
S4.调节提取液Ⅰ的pH至2-3，继续搅拌反应，然后过滤，用醋酸水溶液冲洗滤饼，分别收集滤饼和滤液，得到提取物B和提取液Ⅱ；
S5.逐次分步调节提取液Ⅱ的pH至等电点，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S6.调节步骤S5所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩，得到浓缩糖液，加入无水乙醇，静置后离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗后，得到多糖粗提物；
S7.将步骤S3所得提取物A、步骤S4所得提取物B、步骤S5所得蛋白粗提物与步骤S6所得多糖粗提物混合，溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，灭菌，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
3.如权利要求2所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将高有机硒含量的食用菌洗净、烘干、粉碎，得到高有机硒含量的食用菌粉；
S2.将高有机硒含量的食用菌粉与碱性水按照料液比1g:(8-20)mL混合，浸泡30-60min后，以100-300rpm转速搅拌，并施加脉冲电压辅助提取40-50min，过滤、离心，取上清液，得到碱提液；
S3.按照料液比1g:(80-100)mL在碱提液中加入富集剂，在0-10℃，以100-300rpm转速搅拌，同时以10-20kg/h的速度通入二氧化碳，反应至溶液pH为7-8时，过滤，分别收集滤饼和滤液，得到提取物A和提取液Ⅰ；
S4.调节提取液Ⅰ的pH至2-3，保持100-300rpm转速继续搅拌20-30min，过滤，用0.3-0.6倍提取液Ⅰ体积的0.08-0.12mol/L的醋酸水溶液冲洗滤饼，分别收集滤饼和滤液，得到提取物B和提取液Ⅱ；
S5.逐次分步调节提取液Ⅱ的pH至等电点pH＝3-4、5-6，在每一等电点沉淀离心，分别收集各等电点所得沉淀，混合，得到蛋白粗提物，剩余上清液为含糖液；
S6.调节步骤S5所得含糖液的pH至中性，旋转蒸发浓缩至原体积的1/4-1/3，得到浓缩糖液，加入浓缩糖液体积2-3倍的无水乙醇，静置12-24h，离心，取沉淀，用无水乙醇冲洗，得到多糖粗提物；
S7.将步骤S3所得提取物A、步骤S4所得提取物B、步骤S5所得蛋白粗提物与步骤S6所得多糖粗提物混合，得到高有机硒含量的食用菌提取物，再以料液比1g:(5-10)mL溶于水中，调节pH至中性，真空冷冻干燥，135-140℃灭菌3-6s，得到高有机硒含量的食用菌蛋白粉。
4.如权利要求1-3任一项所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述脉冲电压的电源参数为：电压20-30kV，频率为100-120Hz，矩形波脉冲的宽度为2-10μs。
5.如权利要求1-3任一项所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述碱性水为浓度0.02-0.05mol/L的氢氧化钠水溶液。
6.如权利要求2或3所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述富集剂为壳聚糖、改性壳聚糖中的任意一种。
7.如权利要求6所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述改性壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将1-2重量份壳聚糖以料液比分散于20-100重量份水中，加入0.3-0.8重量份醋酸，在氮气保护下，以100-300rpm转速搅拌并加热到50-60℃，反应10-20min后，加入0.1-0.15重量份壳聚糖酶，保持100-300rpm转速搅拌反应4-6h，过滤，得到反应液A；
2)在氮气保护下，再在反应液A中加入1-1.6重量份有机改性剂，100-300rpm转速搅拌下加热至90-92℃，反应8-10h，自然冷却至室温，得到水解液；
3)在水解液中加入水解液体积1-2倍的无水乙醇，静置1-2h沉淀，过滤，滤饼用无水乙醇冲洗，干燥，得到改性壳聚糖。
8.如权利要求7所述高有机硒含量的食用菌蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述有机改性剂选自阿魏酸、苹果酸、柠檬酸、茶多酚中的至少一种。
9.高有机硒含量的食用菌蛋白粉，其特征在于，采用如权利要求1-8任一项所述方法制备。
10.如权利要求9所述的高有机硒含量的食用菌蛋白粉在富硒食品中的应用。
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