CN111748046A - 一种富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，包括：将富硒蕈菌菌粉与乙醇混合后，回流，抽滤，真空干燥得到脱脂菌粉；干燥的脱脂菌粉与蒸馏水混合后，调节PH值，加入纤维素酶，超声酶解，升温灭酶，高温浸煮，离心，得到提取液；提取液旋蒸浓缩，醇沉，离心，取沉淀，真空干燥得到粗硒多糖；粗硒多糖用蒸馏水复溶，加入中性蛋白酶酶解，离心，上清液用Sevage试剂除蛋白，离心，透析，冷冻干燥即得菌粉硒多糖。本发明采用超声协同纤维素酶法，辅以高温浸煮提取硒多糖，大大提高了硒多糖提取率；蛋白酶‑Sevage试剂联用法除蛋白，除蛋白效果好，硒多糖损失少。本发明提取方法简单可行，硒多糖的提取率高、杂质少，具有很好的应用价值和市场潜力。

Description

一种富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法

技术领域

本发明涉及多糖提取技术领域，尤其涉及一种富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法。

技术背景

硒是一种动植物必需的微量营养元素，能构成若干氧化物的活性中心，有促进体内过氧化物的分解、保护细胞膜结构和功能的作用，还具有清除体内自由基、抗癌、增强人体免疫力、拮抗重金属毒性等生物功能。硒通过调节至少30种硒蛋白的表达，影响人体重要的生理功能，其中一些硒蛋白已经得到了很好的化学以及生物学表征，例如谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)、硫氧还蛋白还原酶(TRs)。人体的许多疾病都与缺硒有关，例如克山病、心脑血管疾病、癌症、糖尿病等。因为硒不能在体内合成，必须从食物中摄取，所以人体缺硒现象非常普遍。中国是世界上缺硒最严重的国家之一，约有1亿多人口因膳食结构中硒含量不足使得人体处于低硒状态。因此，适当改善人体硒的摄入状况，有助于人体长远的健康，尤其是可以减少罹患癌症的风险。

我国曾经用无机硒盐亚硒酸钠防治克山病和大骨节病，获得显著效果。但是用无机硒盐补硒，吸收和利用方面都不理想，摄入量少，不起作用，稍微过量就有毒副反应。因此近年都趋向采用有机硒来为人体补硒。除高硒地区的农牧产品外，主要利用富含硒元素的菌物和藻类。所谓富硒蕈菌，就是指含硒量大大高于天然食品的食菌或药菌，本专利实验所采用的原料为湖南奇硒健康产业有限公司生产的富硒食用菌粉，产品质量达到《GB1903.22-2016食品安全国家标准食品营养强化剂富硒食用菌粉》。富硒蕈菌既可作滋补保健食品，又能制成药剂，残余的菌糠还是极佳的富硒饲料和肥料，生产成本不高，而且计量供给的可操作性较好，具有很好的效益。近年来，市场上已经出现了多种富硒蕈菌菌粉，取得了良好收益。因此富硒蕈菌具有极好的药用价值以及市场效益。

随着富硒蕈菌产业的发展，越来越多的科研工作者把目光投向了富硒蕈菌活性成分的研究上来，近年的研究表明，富硒蕈菌的主要活性成分为硒与多糖的有机结合——硒多糖。目前的研究已经证实多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、降血糖、增强免疫功能、抗菌、抗病毒、抗炎、抗辐射、抗突变、保护胃黏膜、保肾护肝等多种功能，并且一些多糖已被开发为药物或功能性食品，如香菇和茯苓多糖。而硒同样具有有益的生物学功能，并且许多生物学功能与多糖的功能不谋而合，因此我们有理由认为，硒和多糖的组合可能会取得优异的生物学效果。此外，由于硒和多糖具有独特的物理和化学特性，这种组合可以弥补硒和多糖在医学领域应用的固有局限性，如生物利用度低、溶解度低以及硒的毒性大等问题。事实上，很多科学研究已经证明硒与多糖的组合同时具备硒和多糖两者的生物活性，并且其生物活性普遍高于多糖和硒，而且更易被机体吸收和利用。不少研究也已经证明硒多糖在免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等方面具有广泛的应用。由于硒多糖独特的药理活性，使得植物硒多糖已逐渐成为了研究热点。因此，提供一种高效可行的从富硒蕈菌菌粉中提取硒多糖的方法意义重大。

硒多糖的提取属于天然植物多糖提取范畴，目前天然植物多糖提取方法多样，常见的提取方法包括热水浸提法、酸碱浸提法、超声波提取法、微波提取法以及酶法辅助提取法等，提取方法虽然看似多样，但每种方法都有其优缺点，就目前的技术来讲，在保证纯度的条件下多糖的提取率很难超过6％，一般植物多糖的提取率均在2％-5％之间，硒多糖的提取比例更低，而本发明提供的提取方法经过实验证明，硒多糖的提取率均在6％以上，最高可达近10％的提取率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，系统性强，耗时短，并且硒多糖的提取率高、杂质少，易于机械操作和工业化规模生产，具有极佳的应用价值和市场潜力的从富硒蕈菌菌粉中提取硒多糖的方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

S1：将富硒蕈菌菌粉与乙醇混合后，回流，抽滤，真空干燥得到脱脂菌粉；

S2：干燥的脱脂菌粉与蒸馏水混合后，调节PH值，加入纤维素酶，超声酶解，升温灭酶，高温浸煮，离心，得到提取液；

S3：提取液旋蒸浓缩，醇沉，离心，取沉淀，真空干燥得到粗硒多糖；

S4：粗硒多糖用蒸馏水复溶，加入中性蛋白酶酶解，离心，上清液用Sevage 试剂除蛋白，离心，透析，冷冻干燥即得菌粉硒多糖。

本发明中，步骤S1中用乙醇脱脂，相对于很多文献中提到的石油醚，乙醇是更理想的脂肪提取液，乙醇具有经济、实惠，易于回收的优点，不仅脂肪提取率高于石油醚，而且乙醇在脱脂过程中兼有脱色的效果。

优选地，步骤S1中所用乙醇体积分数为70-90％，菌粉与乙醇的料液比为 1:7-12。

本发明中，对乙醇回流的温度没做过多要求，应保证可以回流的同时温度不要过高即可。

本发明研究发现，相对于普通的热水浸提，在热水浸提之前用一定量的纤维素酶解细胞壁，再辅以一定功率的超声，可以大大提高多糖的提取率。但酶促反应一定需要确保特定的PH及温度等条件。

优选地，步骤S2中脱脂菌粉与蒸馏水的料液比为1:25-40，调节PH值为 4.0-6.0，加入纤维素酶量为底物菌粉的0.01-0.1％。

优选地，步骤S2中超声酶解温度为40-60℃，超声功率为90-180W，酶解时间为0.5-1h，灭酶温度为95-100℃，灭酶时间为8-25min，高温浸煮温度为 80-95℃。

本发明中，仍然利用硒多糖难溶于乙醇的特点对硒多糖进行醇析，醇析之前进行浓缩为了节省操作时间以及减少乙醇用量。

优选地，步骤S3中醇沉所用乙醇体积分数为75-95％，所用乙醇体积为浓缩液体积的3-4倍。

本发明研究发现，蛋白酶-Sevage试剂联用法除蛋白，除蛋白效果好，硒多糖损失量小，先用蛋白酶酶解蛋白质，能够有效地除去硒多糖溶液中的大部分蛋白质，加入的酶作为外来蛋白，用Sevage试剂除去，同时还能一定程度除去酶解过程中没有除去的蛋白。

优选地，步骤S4中加入中性蛋白酶的量为底物粗硒多糖的0.5-1％，酶解温度为10-60℃，酶解时间为1-3h。

优选地，步骤S4中Sevage试剂与上清液体积比为1:3-5，除蛋白次数为1-4 次。

本发明中，利用透析袋透析除去硒多糖溶液中的小分子杂质、寡糖以及一些低分子量杂质，还能一定程度的除去色素。

优选地，步骤S4中用截留分子量为3000-8000Da的透析袋，透析时间为 48-72h。

由于硒多糖溶液粘稠度过高，多糖分子量过大，抽滤操作很难达到固液分离的效果，所以本发明中多次用到离心操作。

优选地，步骤S2、S3、S4中离心转速为4000-6000r/min，离心时间为8-15min。

有益效果

1)本发明提取方法简单可行，系统性强，耗时短，并且硒多糖的提取率高、杂质少，易于机械操作和工业化规模生产，具有极佳的应用价值和市场潜力。

2)本发明采用超声协同纤维素酶法，辅以高温浸煮提取硒多糖，大大提高了硒多糖提取率。超声协同纤维素酶处理菌粉可使细胞壁破裂增多，再辅以高温浸煮使得硒多糖溶出率大大增加。

3)本发明采用蛋白酶-Sevage试剂联用法除蛋白，除蛋白效果好，硒多糖损失少。

4)本发明整体反应条件温和，所用试剂多为常用试剂，经济优惠，使用量少，整体符合绿色化学概念。

5)本发明所得硒多糖杂质少，可进一步得到不同品级的硒多糖纯品，为硒多糖的药理药效研究奠定很好的物质基础，应用价值高，市场潜力好。

附图说明

图1是实施例1中的富硒平菇菌粉硒多糖的紫外扫描光谱图；

图2是实施例2中的富硒香菇菌粉硒多糖的紫外扫描光谱图；

图3是实施例3中的富硒香菇菌粉硒多糖的紫外扫描光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。

实施例1：

一种富硒平菇菌粉硒多糖的高效提取方法，包括菌粉脱脂、超声协同纤维素酶提取硒多糖、醇析、除蛋白、透析等，其具体步骤为：

1)称取15g富硒平菇菌粉，按料液比1:8加入80％的乙醇，在60℃条件下回流搅拌回流4h，过滤，固体45℃真空干燥得脱脂菌粉；

2)称取10g脱脂菌粉，按料液比1:30加入蒸馏水，调节PH为5，加入1mg 的纤维素酶，120W、50℃条件下超声1h，取出置于100℃条件下10min，之后 85℃条件下搅拌浸煮2h，5000r/min离心15min，得上清液，重复操作两次，合并上清液，65℃、200r/min旋转蒸发浓缩成粘稠液体，即为富硒平菇菌粉硒多糖提取液；

3)将硒多糖提取液和95％乙醇按液体体积比1:3混合，置于4℃条件下静置醇析，5000r/min离心10min，固体45℃真空干燥得粗硒多糖；

4)干燥粗硒多糖用蒸馏水复溶，45℃条件下加入1％中性蛋白酶，酶解2h，按上清液体积的1/4添加Sevage试剂，震荡，5500r/min离心10分钟，弃去有机层及蛋白层，重复三次，硒多糖溶液置于3500Da的透析袋中透析48h，冷冻干燥即得富硒平菇菌粉硒多糖0.646g，提取率6.46％。

纯度鉴定：称取上述冷冻干燥后的菌粉硒多糖5mg，用5ml蒸馏水溶解，以蒸馏水做参比，于200-400nm波长下进行紫外光谱扫描，鉴定多糖纯度，结果如图1所示，结果表明所提取硒多糖在波长260nm和280nm处没有明显的吸收峰，说明多糖中已基本不含蛋白质与核酸，已获得较纯的多糖组分。

对比实验：利用单纯的热水浸煮法提取多糖，10g脱脂菌粉经水提、醇沉、除蛋白、透析最终冷冻干燥得硒多糖0.302g，提取率为3.02％，远低于本发明的硒多糖提取方法的提取率。

实施例2：

一种富硒香菇菌粉硒多糖的高效提取方法，包括菌粉脱脂、超声协同纤维素酶提取硒多糖、醇析、除蛋白、透析等，其具体步骤为：

1)称取20g富硒香菇菌粉，按料液比1:10加入85％的乙醇，在65℃条件下回流搅拌回流3h，过滤，固体真空干燥得脱脂菌粉；

2)称取12g脱脂菌粉，按料液比1:32加入蒸馏水，调节PH为5，加入2mg 的纤维素酶，110W、50℃条件下超声1h，取出置于100℃条件下12min，90℃条件下搅拌浸煮2h，5000r/min离心15min，得上清液，旋转蒸发浓缩成粘稠液体，即为富硒香菇菌粉硒多糖提取液；

3)将硒多糖提取液和90％乙醇按液体体积比1:4混合，置于4℃条件下静置醇析，5500r/min离心12min，固体真空干燥得粗硒多糖；

4)干燥粗硒多糖用蒸馏水复溶，40℃条件下加入0.8％中性蛋白酶，酶解3h，按上清液体积的1/4添加Sevage试剂，震荡，5500r/min离心8分钟，弃去有机层及蛋白层，重复两次，硒多糖溶液置于3500Da的透析袋中透析72h，冷冻干燥即得富硒香菇菌粉硒多糖0.846g，提取率7.05％。

纯度鉴定：称取上述冷冻干燥后的菌粉硒多糖10mg，用10ml蒸馏水溶解，以蒸馏水做参比，于200-400nm波长下进行紫外光谱扫描，鉴定多糖纯度，结果如图2所示，结果表明所提取硒多糖在波长260nm和280nm处没有明显的吸收峰，说明多糖中已基本不含蛋白质与核酸，已获得较纯的多糖组分。

对比实验：利用单纯的热水浸煮法提取多糖，12g脱脂菌粉经水提、醇沉、除蛋白、透析最终冷冻干燥得硒多糖0.475g，提取率为3.96％，远低于本发明的硒多糖提取方法的提取率。

实施例3：

一种富硒金针菇菌粉硒多糖的高效提取方法，包括菌粉脱脂、超声协同纤维素酶提取硒多糖、醇析、除蛋白、透析等，其具体步骤为：

1)称取16g富硒金针菇菌粉，按料液比1:12加入70％的乙醇，在65℃条件下回流搅拌回流3h，过滤，固体真空干燥得脱脂菌粉；

2)称取10g脱脂菌粉，按料液比1:40加入蒸馏水，调节PH为5，加入1.2mg 的纤维素酶，150W、50℃条件下超声0.5h，取出置于98℃条件下15min，85℃条件下搅拌浸煮2h，5500r/min离心15min，得上清液，旋转蒸发浓缩成粘稠液体，即为富硒金针菇菌粉硒多糖提取液；

3)将硒多糖提取液和90％乙醇按液体体积比1:4混合，置于4℃条件下静置醇析，5000r/min离心10min，固体真空干燥得粗硒多糖；

4)干燥粗硒多糖用蒸馏水复溶，30℃条件下加入0.8％中性蛋白酶，酶解3h，按上清液体积的1/4添加Sevage试剂，震荡，5500r/min离心8分钟，弃去有机层及蛋白层，重复两次，硒多糖溶液置于6000Da的透析袋中透析48h，冷冻干燥即得富硒金针菇菌粉硒多糖0.710g，提取率7.10％。

纯度鉴定：称取上述冷冻干燥后的菌粉硒多糖4mg，用4ml蒸馏水溶解，以蒸馏水做参比，于200-400nm波长下进行紫外光谱扫描，鉴定多糖纯度，结果如图3所示，结果表明所提取硒多糖在波长260nm和280nm处没有明显的吸收峰，说明多糖中已基本不含蛋白质与核酸，已获得较纯的多糖组分。

对比实验：利用单纯的热水浸煮法提取多糖，10脱脂菌粉经水提、醇沉、除蛋白、透析最终冷冻干燥得硒多糖0.378g，提取率为3.78％，远低于本发明的硒多糖提取方法的提取率。

Claims (9)

1.一种富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1：将富硒蕈菌菌粉与乙醇混合后，回流，抽滤，真空干燥得到脱脂菌粉；

S2：干燥的脱脂菌粉与蒸馏水混合后，调节PH值，加入纤维素酶，超声酶解，升温灭酶，高温浸煮，离心，得到提取液；

S3：提取液旋蒸浓缩，醇沉，离心，取沉淀，真空干燥得到粗硒多糖；

S4：粗硒多糖用蒸馏水复溶，加入中性蛋白酶酶解，离心，上清液用Sevage试剂除蛋白，离心，透析，冷冻干燥即得菌粉硒多糖。

2.根据权利要求1所述的富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于：步骤S1中所用乙醇体积分数为70-95%，菌粉与乙醇的料液比为1:7-12。

3.根据权利要求1所述的富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于：步骤S2中菌粉与蒸馏水料液比为1:25-40，调节PH值为4.0-6.0，加入纤维素酶量为底物菌粉的0.01-0.1%。

4.根据权利要求1所述的富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于：步骤S2中超声酶解温度为40-60℃，超声功率为90-180W，酶解时间为0.5-1h，灭酶温度为95-100℃，灭酶时间为8-25min，高温浸煮温度为80-95℃。

5.根据权利要求1所述的富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于：步骤S3中醇沉所用乙醇体积分数为75-95%，所用乙醇体积为浓缩液体积的3-4倍。

6.据权利要求1所述的富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于：步骤S4中加入中性蛋白酶的量为底物粗硒多糖的0.5-1%，酶解温度为10-60℃，酶解时间为1-3h。

7.据权利要求1所述的富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于：步骤S4中Sevage试剂与上清液体积比为1:3-5，除蛋白次数为1-4次。

8.据权利要求1所述的富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于：步骤S4中用截留分子量为3000-8000Da的透析袋，透析时间为48-72h。

9.据权利要求1所述的富硒蕈菌菌粉硒多糖的高效提取方法，其特征在于：步骤S2、S3、S4中离心转速为4000-6000r/min，离心时间为8-15min。

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