CN105801718A - 一种虫草花多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种虫草花多糖的提取方法，所述的提取方法包括如下步骤：粉碎、水提、一次醇沉、酶解、脱蛋白、二次醇沉、超滤、柱层析；本发明提取方法产品回收率高、纯度好，虫草花多糖得率大于1.8％，多糖的纯度大于90.0％；本发明提取方法工艺简单，所用试剂易得，生产成本低，易于实现工业化。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从虫草花中提取多糖的方法。
(二)背景技术
“虫草花”并非花，实质上是虫草子实体，而不是冬虫夏草子实体。培养基是仿造天然虫子所含的各种养分，包括谷物类、豆类、蛋奶类等，属于一种真菌类。与常见的香菇、平菇等食用菌很相似，只是菌种、生长环境和生长条件不同。为了跟冬虫夏草区别开来，商家起了一个美丽的名字，把它叫做“虫草花”，虫草花外观上最大的特点是没有了“虫体”，而只有橙色或者黄色的“草”。
虫草多糖是非特异性的免疫调节剂，具有抗肿瘤、抗炎症、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等多种功能。多糖是虫草中最重要、最丰富的生理活性物质之一。虫草多糖被认为是虫草具有双向免疫调节的药效成分，有抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂等功效。虫草多糖甚至对艾滋病毒有直接的抑制作用，并且有望成为阻止艾滋病毒携带者表现症状的药物。此外虫草多糖在日用化妆品方面，在食品工业、发酵工业及石油工业等行业上也有着广泛的应用。
目前市场上真菌多糖产品很多，但是未见有虫草花多糖的产品，更没有专门针对虫草花多糖的提取方法。
(三)发明内容
本发明提供了一种虫草花多糖的提取方法，该方法综合了水提醇沉法、超声波促进和膜分离技术的长处，摒弃了单一方法的高品质和低成本难以融合的缺点，既能保持多糖结构破坏少、纯度高、提取率高、达到多级分离的效果，又能减少能耗降低加工成本。
本发明采用如下技术方案：
一种虫草花多糖的提取方法，所述的提取方法按如下步骤进行：
(1)粉碎：将干燥的虫草花进行粉碎并过筛，得到虫草花粉末；
步骤(1)中，所述过筛的筛孔为80～120目；
(2)水提：将步骤(1)所得虫草花粉末与蒸馏水以料液质量比1：20～80混合，加热煮沸2～3h，并辅以超声波辅助提取，之后离心10～15min，取上清液，离心所得残渣重复水提3～4次，合并各次所得上清液，浓缩至原体积(即浓缩操作前的初始体积)的1/4～1/10，得到多糖提取液；
步骤(2)中，所述超声波的功率为500W，频率为20KHz；所述离心的速率为8000～10000rpm；所述的浓缩采用60～80℃下旋蒸的方式浓缩；
(3)一次醇沉：温度4～25℃下，将步骤(2)所得多糖提取液与食用酒精以体积比1：1.5～4混合，进行醇沉24～30h，沉淀析出，离心10～15min，取离心所得固体物质重复醇沉2～3次，得到粗多糖；
步骤(3)中，所述离心的速率为8000～10000rpm；所述离心所得固体物质重复醇沉的方法为：将固体物质用30～40质量倍的水溶解，得到溶解液，再将所得溶解液与食用酒精以体积比1：1.5～4混合，进行醇沉24～30h，沉淀析出，离心10～15min得到固体物质，如此重复醇沉2～3次，得到粗多糖；
(4)酶解：将步骤(3)所得粗多糖溶于30～40质量倍的蒸馏水中，用Na2CO3水溶液调节pH值为7.2～7.8，得到粗多糖溶液，加入胰蛋白酶、甲苯，在35～37℃下恒温水解18～24h，之后浓缩至原体积(即浓缩操作前的初始体积)的1/4～1/2，得到蛋白酶解液；
步骤(4)中，所述Na2CO3水溶液的浓度为0.1～0.2mol/L；所述胰蛋白酶的活性为8000～10000U/g；所述胰蛋白酶的加入量为0.05～0.1g/1g粗多糖；所述甲苯的体积用量为2.5～3.5mL/1g粗多糖；所述的浓缩采用60～80℃下旋蒸的方式浓缩；
(5)脱蛋白：将步骤(4)所得蛋白酶解液与Sevag试剂以体积比1：2.5～3混合，常温(20～30℃)抽提1～3h，之后离心10～15min，取上清液，将该上清液重复脱蛋白2～3次，之后浓缩至原体积(即浓缩操作前的初始体积)的1/4～1/3，得到脱蛋白多糖液；
步骤(5)中，所述的Sevag试剂为氯仿和正丁醇以体积比4：1配制而成的混合液；所述离心的速率为8000～10000rpm；所述的浓缩采用60～80℃下旋蒸的方式浓缩；
(6)二次醇沉：温度4～25℃下，将步骤(5)所得脱蛋白多糖液与食用酒精以体积比1：1.5～4.5混合，进行醇沉24～30h，沉淀析出，离心10～15min，取离心所得固体物质室温(20～30℃)晾干，得到多糖粗产物；
步骤(6)中，所述离心的速率为8000～10000rpm；
(7)超滤、柱层析：将步骤(6)所得多糖粗产物用30～40质量倍的蒸馏水溶解，再用超滤膜进行超滤，收集分子量10000道尔顿以上(一般为10000～1000000道尔顿)的组分，于常温(20～30℃)下进行SephadexG-100柱层析纯化，洗脱剂为重蒸水，收集含多糖的洗脱液(采用本领域常用的硫酸-苯酚法测定洗脱液中的多糖)，冷冻干燥，得到虫草花多糖。
本发明中，所述的食用酒精为市面上可商购获得的常规食用酒精，通常其中的乙醇含量为95％～98％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提取方法产品回收率高、纯度好，虫草花多糖得率大于1.8％，多糖的纯度大于90.0％；
(2)本发明提取方法工艺简单，所用试剂易得，生产成本低，易于实现工业化。
(四)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
(1)将干燥的虫草花进行粉碎并过筛(100目)，得到虫草花粉末；
(2)取虫草花粉末10g，将其与200mL无菌水混合，加热煮沸2h，并辅以超声波(功率为500W，频率为20KHz)辅助提取，之后离心10min，取上清液，离心后的残渣按上述过程再重复提取3次，合并各次所得上清液，采用旋转蒸发仪在60℃下浓缩至20mL，得到多糖提取液；
(3)4℃下，将多糖提取液20mL与食用酒精40mL混合，进行醇沉24h，沉淀析出，离心10min，取离心所得固体物质重复醇沉3次，得到粗多糖1.32g；
(4)将粗多糖1g溶于30mL蒸馏水中，用0.15mol/LNa2CO3水溶液调pH值为7.5，加入0.05g胰蛋白酶(活性9000U/g)，3mL甲苯，37℃恒温水解20h，70℃旋转蒸发浓缩至20mL，得到蛋白酶解液。
(5)将蛋白酶解液10mL与Sevag试剂30mL混合，抽提1h，之后离心10min，取上清液重复脱蛋白2次，之后60℃旋转蒸发浓缩至10mL，得到脱蛋白多糖液。
(6)4℃下，将脱蛋白多糖液10mL与食用酒精40mL混合，进行醇沉24h，沉淀析出，离心10min，取所得固体物质室温晾干，得到多糖粗产物0.74g；
(7)将多糖粗产物0.5g用蒸馏水15mL溶解，再用超滤膜进行超滤，收集分子量10000道尔顿以上的组分，然后于常温下进行SephadexG-100柱层析纯化，洗脱剂为重蒸水，收集含多糖的洗脱液，冷冻干燥，得到虫草花多糖0.39g。
本实施例所制备的虫草花多糖为淡褐色，利用烘箱等常规干燥方法无法干燥，利用冷冻干燥才能得到粉末，易吸湿，易溶于水，质量含量为91.4％。多糖含量检测：准确称取虫草花多糖10mg于100mL烧杯中，充分溶解，吸取多糖溶液0.5mL，加入5％苯酚1.0mL及浓硫酸3.0mL，静止10min，摇匀，室温放置15min，以蒸馏水为空白，于490nm处测吸光值。
实施例2
(1)将干燥的虫草花进行粉碎并100目过筛，得到虫草花粉末；
(2)取虫草花粉末10g，将其与300mL无菌水混合，加热煮沸3h，并辅以超声波(功率为500W，频率为20KHz)辅助提取，之后离心10min，取上清液，离心后的残渣按上述过程再重复提取3次，合并各次所得上清液，采用旋转蒸发仪在60℃下浓缩至20mL，得到多糖提取液；
(3)4℃下，将多糖提取液20mL与食用酒精45mL混合，进行醇沉24h，沉淀析出，离心10min，取离心所得固体物质重复醇沉3次，得到粗多糖1.39g；
(4)将粗多糖1g溶于35mL蒸馏水中，用0.15mol/LNa2CO3水溶液调pH值为7.5，加入0.05g胰蛋白酶(活性9000U/g)，3.5mL甲苯，37℃恒温水解24h，70℃旋转蒸发浓缩至20mL，得到蛋白酶解液。
(5)将蛋白酶解液10mL与Sevag试剂25mL混合，抽提1h，之后离心10min，取上清液重复脱蛋白2次，之后60℃旋转蒸发浓缩至10mL，得到脱蛋白多糖液。
(6)4℃下，将脱蛋白多糖液10mL与食用酒精45mL混合，进行醇沉24h，沉淀析出，离心10min，取所得固体物质室温晾干，得到多糖粗产物0.81g；
(7)将多糖粗产物0.5g用蒸馏水15mL溶解，再用超滤膜进行超滤，收集分子量10000道尔顿以上的组分，然后于25℃下进行SephadexG-100柱层析纯化，洗脱剂为重蒸水，收集含多糖的洗脱液，冷冻干燥，得到虫草花多糖0.41g。
本实施例所制备的虫草花多糖为淡褐色，利用烘箱等常规干燥方法无法干燥，利用冷冻干燥才能得到粉末，易吸湿，易溶于水，质量含量为89.7％。多糖含量检测：准确称取虫草花多糖10mg于100mL烧杯中，充分溶解，吸取多糖溶液0.5mL，加入5％苯酚1.0mL及浓硫酸3.0mL，静止10min，摇匀，室温放置15min，以蒸馏水为空白，于490nm处测吸光值。
实施例3
(1)将干燥的虫草花进行粉碎并120目过筛，得到虫草花粉末；
(2)取虫草花粉末10g，将其与400mL无菌水混合，加热煮沸3h，并辅以超声波(功率为500W，频率为20KHz)辅助提取，之后离心10min，取上清液，离心后的残渣按上述过程再重复提取3次，合并各次所得上清液，采用旋转蒸发仪在60℃下浓缩至20mL，得到多糖提取液；
(3)4℃下，将多糖提取液20mL与食用酒精60mL混合，进行醇沉24h，沉淀析出，离心10min，取离心所得固体物质重复醇沉3次，得到粗多糖1.43g；
(4)将粗多糖1g溶于40mL蒸馏水中，用0.15mol/LNa2CO3水溶液调pH值为7.5，加入0.1g胰蛋白酶(活性9000U/g)，3mL甲苯，37℃恒温水解24h，70℃旋转蒸发浓缩至20mL，得到蛋白酶解液。
(5)将蛋白酶解液10mL与Sevag试剂30mL混合，抽提1h，之后离心10min，取上清液重复脱蛋白2次，之后60℃旋转蒸发浓缩至10mL，得到脱蛋白多糖液。
(6)4℃下，将脱蛋白多糖液10mL与食用酒精30mL混合，进行醇沉24h，沉淀析出，离心10min，取所得固体物质室温晾干，得到多糖粗产物0.78g；
(7)将多糖粗产物0.5g用蒸馏水20mL溶解，再用超滤膜进行超滤，收集分子量10000道尔顿以上的组分，然后于25℃下进行SephadexG-100柱层析纯化，洗脱剂为重蒸水，收集含多糖的洗脱液，冷冻干燥，得到虫草花多糖0.42g。
本实施例所制备的虫草花多糖为淡褐色，利用烘箱等常规干燥方法无法干燥，利用冷冻干燥才能得到粉末，易吸湿，易溶于水，质量含量为91.9％。多糖含量检测：准确称取虫草花多糖10mg于100mL烧杯中，充分溶解，吸取多糖溶液0.5mL，加入5％苯酚1.0mL及浓硫酸3.0mL，静止10min，摇匀，室温放置15min，以蒸馏水为空白，于490nm处测吸光值。
Claims (7)
1.一种虫草花多糖的提取方法，其特征在于，所述的提取方法按如下步骤进行：
(1)粉碎：将干燥的虫草花进行粉碎并过筛，得到虫草花粉末；
(2)水提：将步骤(1)所得虫草花粉末与蒸馏水以料液质量比1：20～80混合，加热煮沸2～3h，并辅以超声波辅助提取，之后离心10～15min，取上清液，离心所得残渣重复水提3～4次，合并各次所得上清液，浓缩至原体积的1/4～1/10，得到多糖提取液；
(3)一次醇沉：温度4～25℃下，将步骤(2)所得多糖提取液与食用酒精以体积比1：1.5～4混合，进行醇沉24～30h，沉淀析出，离心10～15min，取离心所得固体物质重复醇沉2～3次，得到粗多糖；
(4)酶解：将步骤(3)所得粗多糖溶于30～40质量倍的蒸馏水中，用Na2CO3水溶液调节pH值为7.2～7.8，得到粗多糖溶液，加入胰蛋白酶、甲苯，在35～37℃下恒温水解18～24h，之后浓缩至原体积的1/4～1/2，得到蛋白酶解液；
所述胰蛋白酶的活性为8000～10000U/g；所述胰蛋白酶的加入量为0.05～0.1g/1g粗多糖；所述甲苯的体积用量为2.5～3.5mL/1g粗多糖；
(5)脱蛋白：将步骤(4)所得蛋白酶解液与Sevag试剂以体积比1：2.5～3混合，常温抽提1～3h，之后离心10～15min，取上清液，将该上清液重复脱蛋白2～3次，之后浓缩至原体积的1/4～1/3，得到脱蛋白多糖液；
所述的Sevag试剂为氯仿和正丁醇以体积比4：1配制而成的混合液；
(6)二次醇沉：温度4～25℃下，将步骤(5)所得脱蛋白多糖液与食用酒精以体积比1：1.5～4.5混合，进行醇沉24～30h，沉淀析出，离心10～15min，取离心所得固体物质室温晾干，得到多糖粗产物；
(7)超滤、柱层析：将步骤(6)所得多糖粗产物用30～40质量倍的蒸馏水溶解，再用超滤膜进行超滤，收集分子量10000道尔顿以上的组分，于常温下进行SephadexG-100柱层析纯化，洗脱剂为重蒸水，收集含多糖的洗脱液，冷冻干燥，得到虫草花多糖。
2.如权利要求1所述的虫草花多糖的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过筛的筛孔为80～120目。
3.如权利要求1所述的虫草花多糖的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超声波的功率为500W，频率为20KHz。
4.如权利要求1所述的虫草花多糖的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离心所得固体物质重复醇沉的方法为：将固体物质用30～40质量倍的水溶解，得到溶解液，再将所得溶解液与食用酒精以体积比1：1.5～4混合，进行醇沉24～30h，沉淀析出，离心10～15min得到固体物质，如此重复醇沉2～3次，得到粗多糖。
5.如权利要求1所述的虫草花多糖的提取方法，其特征在于，步骤(4)中，所述Na2CO3水溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。
6.如权利要求1所述的虫草花多糖的提取方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(5)或(6)中，所述离心的速率为8000～10000rpm。
7.如权利要求1所述的虫草花多糖的提取方法，其特征在于，步骤(2)、(4)或(5)中，所述的浓缩采用60～80℃下旋蒸的方式浓缩。
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