CN101962635B - 生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法 - Google Patents

生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法。取鲜姜汁，用硫酸铵、无水乙醇制备生姜蛋白酶粗酶，磷酸缓冲液溶解得到粗酶液。将聚乙二醇、硫酸铵、电解质按照一定比例配制，调pH，形成双水相体系。加入生姜蛋白酶粗酶液，将分液漏斗封口，反复倒置，充分混合均匀，室温下静置分相，使体系上下相分离完全。将下相盐相放出，存好。然后往上相中加入硫酸铵盐溶液，二次萃取分离后，放出下相盐相，存好。往上相中再次加入硫酸铵盐溶液，进行第三次萃取，收集下相盐相进行透析，透析完后冻干即得纯酶。

Description

生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法
(一)技术领域
本发明涉及一种生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法。
(二)背景技术
生姜蛋白酶是从生姜中提取的有蛋白水解活性的酶，对食品的质量、风味、营养起重要作用，可用于肉类嫩化、酒类澄清等。在生姜蛋白酶提取分离技术上，可以用超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。然而，生姜蛋白酶属大分子物质，在超滤过程中易在膜表面聚积而产生浓差极化现象，且存在生姜蛋白酶在有机溶剂中易变性以及有机溶剂残留问题；盐析法提取的生姜蛋白酶活性较低，与应用要求相差甚远；絮凝法提取专一性不强，制得的生姜蛋白酶纯度不高，杂质含量较高；亲和层析法提取的酶纯度虽然较高，但是操作复杂，不易工业上的产业化生产，且用于亲和层析的前处理液是需经过初步纯化的酶液。而双水相萃取法能高效分离提取高纯度生姜蛋白酶。其原因是由于双水相萃取具有两相界面而张力低，有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，易于连续化操作，目标产物有较高的收率，不存在有机溶剂残留，分离过程经济等，其在生姜蛋白酶的制备中前景良好，但这方面迄今为止还未见报道。
双水相萃取(ATPS)技术是近年来发展起来的一项蛋白纯化方法，该方法是利用一种高分子聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物，在一定浓度下体系分成互不相溶的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力(如憎水键、氢键和离子键)等因素的影响，使得目标蛋白质和其它蛋白质在两相间的分配系数不同，从而达到分离目的。
(三)发明内容
本发明的目的是研发一种直接从生姜中提取较为纯化的生姜蛋白酶的新型萃取方法。
其方法是将生姜切成小块，与磷酸缓冲液按一定料液比例进行打浆，搅拌浆液，过滤，静置，离心，取上清液用无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀即粗酶。将聚乙二醇、硫酸铵、电解质按照一定比例配制，调pH，形成双水相体系。加入生姜蛋白酶粗酶液，将分液漏斗封口，反复倒置，充分混合均匀，室温下静置分相，使体系上下相分离完全。将下相盐相放出，存好。然后往上相中加入硫酸铵盐溶液，二次萃取分离后，放出下相盐相，存好。往上相中再次加入硫酸铵盐溶液，进行第三次萃取，收集下相盐相进行透析，透析完后冻干即得纯酶。
生姜蛋白酶的三步双水相萃取纯化方法是在双水相萃取技术基础上，增加了两步萃取，通过三步调整双水相系统中一系列参数，从而可选择性萃取、纯化目标蛋白酶，直接得到纯化的生姜蛋白酶。
(四)附图说明
图1生姜蛋白酶的三步双水相萃取流程
图1中1是鲜姜汁，2是硫酸铵，3是无水乙醇，4是粗酶，5是粗酶液，6是聚乙二醇，7是硫酸铵，8是电解质NaCl，9是配制双水相体系，10是第一步分相萃取，11向第一步分相萃取后的上相中加入硫酸铵盐溶液，12是第二步分相萃取，13向第二步分相萃取后的上相中加入硫酸铵盐溶液，14是第三步分相萃取，15将下相盐液透析，16是冻干的纯酶。
(五)具体实施方式
1.生姜蛋白酶的第一步双水相萃取
取鲜姜汁(1)，按照常规提取方法，用硫酸铵(2)、无水乙醇(3)制备生姜蛋白酶粗酶(4)。磷酸缓冲液溶解得到粗酶液(5)。配制分子量为4000、浓度为30％的聚乙二醇(6)溶液，10％的硫酸铵溶液(7)和2％的NaCl电解质溶液(8)，充分溶解后作为双水相体系(9)，调节体系的pH为8.0。将双水相体系溶液倒入分液漏斗中进行分相，待分相完成后，每20mL双水相体系溶液中加入3mL粗酶液。将分液漏斗封口，反复倒置2～3min，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2～3h，使体系上下相分离完全(10)。第一步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为6.17，酶活力回收率为393.77％，上相酶纯化倍数为1.85，酶的得率为1.20％。
2.生姜蛋白酶的第二步双水相萃取
生姜蛋白酶粗酶液进行第一步萃取后，将下相液放出存好，然后往上相中加入10mL20％的硫酸铵盐溶液(11)。将分液漏斗封口，反复倒置2～3min，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2～3h，使体系上下相分离完全(12)。第二步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为8.03，酶活力回收率为131.26％，上相酶纯化倍数为2.81，酶的得率为1.07％。
3.生姜蛋白酶的第三步双水相萃取
生姜蛋白酶粗酶液进行两步纯化萃取后，将下相液放出存好，然后往上相中加入15mL12％的硫酸铵盐溶液(13)。将分液漏斗封口，反复倒置2～3min，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2～3h，使体系上下相分离完全(14)。第三步双水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系数为2.04，酶活力回收率为80.63％，上相酶纯化倍数为2.91。经三步萃取纯化后，收集下相盐相进行透析(15)，透析完后冻干即得纯酶(16)，得率为0.72％。
应用上述方法获得的纯化生姜蛋白酶是一种优良的肉类嫩化剂，且具有酒类澄清、凝乳、水解大豆蛋白等作用，并对大肠杆菌、啤酒酵母和青霉有抑制生长效果。生姜蛋白酶-II还能够特异地水解P2位含有脯氨酸的多肽和蛋白质，这种对脯氨酸的特殊亲合性使其在生化研究中成为一种很有前途的工具酶。可广泛应用于食品加工、保健品、医药、生物技术等领域，是一种应用性强、应用范围广的新酶源，有很好的产业化和市场前景。

Claims (1)

1.一种生姜蛋白酶的三步双水相萃取方法，其特征在于：配制分子量为4000、浓度为30％的聚乙二醇溶液，10％的硫酸铵溶液和2％的NaCl电解质溶液，充分溶解后作为双水相体系，调节体系的pH为8.0，将双水相体系溶液倒入分液漏斗中进行分相，待分相完成后，每20mL双水相体系溶液中加入3mL生姜蛋白酶粗酶液，将分液漏斗封口，反复倒置2～3min，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2～3h，使体系上下相分离完全；生姜蛋白酶粗酶液进行第一步萃取后，将下相液放出存好，然后往上相中加入10mL 20％的硫酸铵盐溶液，将分液漏斗封口，反复倒置2～3min，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2～3h，使体系上下相分离完全；生姜蛋白酶粗酶液进行两步纯化萃取后，将下相液放出存好，然后往上相中加入15mL 12％的硫酸铵盐溶液，将分液漏斗封口，反复倒置2～3min，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2～3h，使体系上下相分离完全，经三步萃取纯化后，收集下相盐相进行透析，透析完后冻干即得纯酶。
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