CN103665083B - 一种分离纯化11α-羟基坎利酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用大孔树脂分离纯化11α-羟基坎利酮的方法，包括菌丝体分离、烘干粉碎、加热醇提取、大孔树脂柱吸附分离纯化、加压连续层析、浓缩烘干。工艺流程简单，成本低，效益高，层析柱可以活化再生，适合工业化分离纯化11α-羟基坎利酮。使用甲醇溶液加热提取，可使11α-羟基坎利酮提取率较高。采用AB-8大孔树脂，可在高压恒流泵驱动下连续层析，最终获得较纯的11α-羟基坎利酮。
Description
技术领域
本发明专利涉及使用大孔树脂分离纯化11α-羟基坎利酮的方法，属于微生物转化产物的提取分离纯化领域。
背景技术
11α-羟基坎利酮是坎利酮羟基化反应后形成的甾体类衍生物，也是合成依普利酮的重要药物中间体。依普利酮作为治疗高血压和其他心血管疾病的新型药物，具备广阔的市场前景。微生物转化坎利酮合成11α-羟基坎利酮的方法具有专一性强、反应条件温和、催化效率高、副产物少、成本低、污染少等优点。
由于11α-羟基坎利酮在水中的溶解度极低，由微生物发酵合成的11α-羟基坎利酮主要吸附在菌丝体表面，很难依靠过滤、离心或萃取单纯的物理方法分离。同时，发酵液中还存在未转化的坎利酮，而坎利酮的物理、化学性质与11α-羟基坎利酮类似，故对提取物的纯化也是一个重要步骤。
国内目前对微生物发酵合成11α-羟基坎利酮及其分离纯化有部分研究和报道，发酵合成11α-羟基坎利酮所用的微生物主要是赭曲霉、根霉等，对发酵完成后产物11α-羟基坎利酮提取方法主要是有机溶剂萃取，纯化方法主要是多次结晶法。例如专利（CN101845474A）用经过波长为200nm-280nm紫外线照射10-30小时的赭曲霉，作为发酵合成11α-羟基坎利酮的微生物，发酵完成后经过离心机菌液分离，获得的菌丝体加入2.5％的二氯甲烷萃取3-4次，弃菌丝体残渣，蒸馏回收溶剂二氯甲烷后，加入0.5％甲苯，冷却结晶精制，得到11α-羟基坎利酮；专利（CN1727494A）和专利（CN103255192A）分别用赭曲霉（AS3.4411）和赭曲霉（TCCC41060）进行发酵合成了11α-羟基坎利酮，但均未提及产物11α-羟基坎利酮的提取纯化方法；2005年茅燕勇利用赭曲霉（NG0216）、葡枝根霉（NG0305）和粉红单端孢霉（NG0207）均进行发酵合成了11α-羟基坎利酮，其用冷凝回流法对产物11α-羟基坎利酮进行了提取，用三次重结晶法对提取的11α-羟基坎利酮进行了纯化；2012年崔凤杰等对利用根霉（Rhizopussp．UJS-0602）发酵合成的11α-羟基坎利酮进行分离提取，证明洗脱法和浸泡法对11α-羟基坎利酮具有较好的分离效果。
目前提取发酵合成的11α-羟基坎利酮的方法是将转化后的发酵液过滤，上清液通过有机溶剂萃取，过滤出的菌体通过用有机溶剂加热搅拌提取、浸泡、洗脱或匀浆，然后将有机溶剂合并后，真空浓缩并多次重结晶。这需要大量有毒有机溶剂，且在提取后的11α-羟基坎利酮的纯化步骤繁琐。因此，寻找一种简便、提取效率高的提取方法，对转化后的发酵液中的11α-羟基坎利酮的提取纯化就显得极为重要。
发明内容
本发明涉及一种使用大孔树脂分离纯化11α-羟基坎利酮的工艺，包括菌丝体的抽滤或离心、烘干粉碎、加热浸提、加压高效大孔树脂分离、重结晶等。
一种使用大孔树脂分离纯化11α-羟基坎利酮的方法，其方法具体包括以下步骤：
(1)将根霉(Rhizopussp．UJS-0602，CICC3143，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)或赭曲霉(Aspergillusochraceus，CICC40239，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)转化坎利酮制得的含有11α-羟基坎利酮的发酵液进行1000-6000r/min离心10-30分钟或抽滤后，取菌丝体或菌体40-100℃烘干，粉碎至50-200目。
(2)提取：将粉碎过的菌丝体或菌体用1-8倍体积的浓度为20-90%去离子水稀释的甲醇水溶液，于35-60℃浸泡0.5-5小时后，1000-3000r/min离心10-30分钟或过滤后，用0.5-5倍体积的浓度为20-90%甲醇水溶液洗涤滤渣，过滤，合并滤液。
(3)分离：滤液上AB-8大孔树脂柱，单柱上样，双柱洗脱。第一根上至饱和，第二根上至10-80%饱和。然后将两根树脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串联，开始洗脱。先用20-60%的甲醇水溶液洗脱2-10BV；然后再用60-90%的甲醇水溶液洗脱2-10BV。
(4)将含11α-羟基坎利酮的洗脱流分合并，在40-60℃下减压浓缩后，在40-90℃下烘干，得到提纯的11α-羟基坎利酮。
(5)将柱子用1-5倍乙酸乙酯洗脱AB-8大孔树脂柱再生，然后用蒸馏水洗至无乙酸乙酯味即可重复使用。
本方法中，11α-羟基坎利酮用高效液相色谱（HPLC）检测条件，色谱柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）；测定条件：甲醇-水为流动相，梯度洗脱40min；流速：0.8mL/min；检测波长280nm；柱温：30℃；进样量：5μL。采用外标法计算公式计算坎利酮和11-α-羟基坎利酮。转化率计算方法：
I:转化率（%），m：产物测定量；m 0 ：底物投入量；C：底物浓度
本发明程序步骤简单，适合11α-羟基坎利酮从微生物菌体中的分离纯化，克服了传统方法中需要大量有毒有机溶剂，且在提取后的11α-羟基坎利酮的纯化步骤繁琐，回收率不高等问题，本技术方案，纯化步骤简单，纯化后的纯度高，纯化后的11α-羟基坎利酮含量(HPLC)≥99.5％。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明技术方案做进一步详细阐述，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
(1)将培养7天布满孢子的根霉斜面用15mL无菌水洗下，得孢子悬浮液。将1mL孢子液加入装有50mL新鲜无菌培养基的500mL三角瓶中，25℃、220r/min条件培养48h后，加入坎利酮，使坎利酮在发酵液中浓度为1g/L，继续培养转化48h后，测其转化率为91.3%，停止转化。其中：根霉斜面培养基组分包括（g/L）：葡萄糖22.0，酵母膏20.0，大豆蛋白胨20.0，琼脂30.0，用浓度为10%的磷酸溶液调节培养基pH至5.0；液体转化培养基组分包括（g/L）：葡萄糖22.0，酵母膏16.5，玉米浆33.0。
(2)将转化后的发酵液进行1000rpm离心30分钟后，取菌丝体40℃烘干，粉碎至200目。
(3)提取。将粉碎过的菌丝体用8倍体积20%甲醇水溶液，于35℃浸泡5h后，1000rpm下离心30分钟后，用0.5倍体积的20%甲醇水溶液洗涤滤渣，过滤，合并滤液。
(4)分离。滤液上AB-8大孔树脂柱，单柱上样，双柱洗脱。第一根上至饱和，第二根上至10%饱和。然后将两根树脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串联，开始洗脱。先用60%的甲醇水溶液洗脱2BV；然后用90%的甲醇水溶液洗脱2BV。
(5)将只含11α-羟基坎利酮的流分合并，在40℃下减压浓缩后，在40℃下烘干，得到提纯的11α-羟基坎利酮。
(6)将柱子用1倍乙酸乙酯再生，然后用水洗至无乙酸乙酯味。
(7)纯化后的11α-羟基坎利酮用高效液相色谱（HPLC）检测，测得11α-羟基坎利酮含量(HPLC)为99.5％。
实施例2
(1)将培养5天布满孢子的赭曲霉斜面用5mL无菌水洗下，得孢子悬浮液。将3mL孢子液加入装有150mL新鲜无菌培养基的500mL三角瓶中，30℃、150r/min条件培养24h后，加入坎利酮，使坎利酮在发酵液中浓度为5g/L，继续培养转化96h后，测其转化率为96.2%后，停止转化。其中：赭曲霉斜面培养基组分包括（g/L）：葡萄糖20.0，酵母膏20.0，大豆蛋白胨20.0，琼脂20.0，用浓度为10%的磷酸溶液调节培养基pH至6.0；液体转化培养基组分包括（g/L）：葡萄糖20.0，酵母膏25.0，玉米浆2.0。
(2)将转化后的发酵液进行真空抽滤后，取菌丝体100℃烘干，粉碎至50目。
(3)提取。将粉碎过的菌丝体用1倍体积90%甲醇水溶液，于60℃浸泡0.5h后，过滤后，用5倍体积的90%甲醇水溶液洗涤滤渣，过滤，合并滤液。
(4)分离。滤液上AB-8大孔树脂柱，单柱上样，双柱洗脱。第一根上至饱和，第二根上至80%饱和。然后将两根树脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串联，开始洗脱。先用20%的甲醇水溶液洗脱10BV；然后用60%的甲醇水溶液洗脱10BV。
(5)将只含11α-羟基坎利酮的流分合并，在60℃下减压浓缩后，在90℃下烘干，得到提纯的11α-羟基坎利酮。
(6)将柱子用5倍乙酸乙酯再生，然后用水洗至无乙酸乙酯味。
(7)纯化后的11α-羟基坎利酮用高效液相色谱（HPLC）检测，测得11α-羟基坎利酮含量(HPLC)为99.7％。
实施例3
(1)将培养5天布满孢子的根霉斜面用10mL无菌水洗下，得孢子悬浮液。将2mL孢子液加入装有100mL新鲜无菌培养基的500mL三角瓶中，28℃、200r/min条件培养36h后，加入坎利酮，使坎利酮在发酵液中浓度为5g/L，继续培养转化84h后，测其转化率为93.2%后，停止转化。其中：根霉斜面培养基组分包括（g/L）：葡萄糖22.0，酵母膏20.0，大豆蛋白胨20.0，琼脂30.0，用浓度为10%的磷酸溶液调节培养基pH至5.0；液体转化培养基组分包括（g/L）：葡萄糖22.0，酵母膏16.5，玉米浆33.0。
(2)将转化后的发酵液进行6000rpm离心10分钟后，取菌丝体80℃烘干，粉碎至100目。
(3)提取。将粉碎过的菌丝体用4倍体积50%甲醇水溶液，于50℃浸泡2.5h后，3000rpm下离心10分钟后，用2.5倍体积的60%甲醇水溶液洗涤滤渣，过滤，合并滤液。
(4)分离。滤液上AB-8大孔树脂柱，单柱上样，双柱洗脱。第一根上至饱和，第二根上至50%饱和。然后将两根树脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串联，开始洗脱。先用40%的甲醇水溶液洗脱5BV；然后用70%的甲醇水溶液洗脱6BV。
(5)将只含11α-羟基坎利酮的流分合并，在55℃下减压浓缩后，在80℃下烘干，得到提纯的11α-羟基坎利酮。
(6)将柱子用4倍乙酸乙酯再生，然后用水洗至无乙酸乙酯味即可重复使用。
(7)纯化后的11α-羟基坎利酮用高效液相色谱（HPLC）检测，测得11α-羟基坎利酮含量(HPLC)为99.6％。
Claims (1)
1.一种分离纯化11α-羟基坎利酮的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
（1）将根霉(Rhizopussp．UJS-0602)或赭曲霉(Aspergillusochraceus)转化坎利酮制得的含有11α-羟基坎利酮的发酵液进行1000-6000r/min离心10-30分钟或抽滤后，取菌丝体40-100℃烘干，粉碎至50-200目；
（2）提取：将粉碎过的菌丝体用1-8倍体积的浓度为20-90%去离子水稀释的甲醇水溶液，于35-60℃浸泡0.5-5小时后，1000-3000r/min离心10-30分钟或过滤后，用0.5-5倍体积的浓度为20-90%甲醇水溶液洗涤滤渣，过滤，合并滤液；
（3）分离：滤液上AB-8大孔树脂柱，单柱上样，双柱洗脱；第一根上至饱和，第二根上至10-80%饱和；然后将两根树脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串联，开始洗脱；先用20-60%的甲醇水溶液洗脱2-10BV；然后再用60-90%的甲醇水溶液洗脱2-10BV；
（4）将含11α-羟基坎利酮的洗脱流分合并，在40-60℃下减压浓缩后，在40-90℃下烘干，得到提纯的11α-羟基坎利酮；
（5）将柱子用1-5倍乙酸乙酯洗脱AB-8大孔树脂柱再生，然后用蒸馏水洗至无乙酸乙酯味即可重复使用。
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