CN101948456B - 具有抗肿瘤活性的类莪术内酯衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具有抗肿瘤活性的类莪术内酯衍生物及其制备方法，所述的类莪术内酯及其氧代衍生物的结构，如通式(I)所示化合物具有螺内酯型母核结构，还公开了这类化合物的制备方法，其中利用到生物转化方法，发明还公开了制备过程中如通式(II)所示的中间体。本发明制备的化合物具有抗肿瘤活性。
Description
技术领域：
本发明涉及具有抗肿瘤活性的类莪术内酯衍生物及其制备方法，其制备方法涉及一种新的倍半萜类化合物的结构修饰改造的新方法，即利用生物转化或化学转化法或两者相结合获得新的化合物，结构修饰涉及到母核结构由吉马烷型到螺内酯型的转变。
背景技术：
中药莪术为姜科姜黄属植物蓬莪术(Curcumaphaeocaulis Val.)、广西莪术(Curcumakwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang)和温郁金(Curcuma wenyujin Y H.Chen et C.ling)的干燥根茎。莪术油为中药莪术中提取出的挥发油组分，莪术油具有抗肿瘤(Sun et al.，2009；Wu et al.，2000)、抗氧化(Loc et al.，2008；Mau et al.，2003)、抗菌(Lai et al.，2004；Wilson et al.，2005)等药理作用。近来研究表明莪术油具有抗H5N1亚型禽流感病毒的作用。(黄亚东et al.，2009)中药莪术中的主要活性成分包括倍半萜类，姜黄素类等，而倍半萜类是其中主要活性成分之一，到目前为止，已经分离得到80多种此类化合物。(Matsuda et al.，2001a；Matsuda et al.，2001b；刘晓宇et al.，2007；张金梅，2006)根据结构骨架可以分为吉马烷型、愈创木烷型、蒈烷型、桉烷型、没药烷型、榄香烷型、苍耳烷型、杜松烷型、螺内酯型、蛇麻烷型、拉松烷型等类型。现代药理及临床研究表明莪术中的多种倍半萜类化合物具有抗肿瘤、抗血栓和抑制D-galactosamine/LPS诱导的肝损伤等多种药理活性。(Lee，2006；Matsuda et al.，2001b)
莪术二酮(Curdione)是从莪术油中分离得到的主要活性成分之一。研究发现莪术二酮能够抑制D-半乳糖胺(D-galactosamin)/脂多糖(lipopolysaccharide)诱导的急性肝损伤。(Matsuda，2001；Matsuda et al.，1998)最近研究发现莪术二酮能够抑制环氧化酶2基因mRNA的表达，(Oh et al.，2007)还能够降低CYP3A4的蛋白表达水平。(Hou et al.，2010)但是莪术二酮的化学结构决定了其水溶性低，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂的特性，而不溶于水，也就限制了其应用。科学家尝试对其进行结构修饰，以增强其水溶性，或对其进行衍生化，以开发具有其他生物活性的药物。利用多种真菌及植物细胞能够转化莪术二酮得到多种羟基化及环氧化的莪术二酮。(Asakawa et al.，1991；Horiike et al.，1997；Ma et al.，2006；Maet al.，2007；Ma et al.，2005)莪术内酯(Curcumalactone)是一种螺内酯型倍半萜类化合物，其并非天然存在的化合物，而是在莪术药材中提取挥发油过程中由莪术二酮转变生成的化合物，并发现莪术二酮在盐酸的作用下转变成为莪术内酯，其立体结构通过X射线单晶衍射的方法得到确证。(GAO et al.，1986；胡皆汉et al.，1986)莪术内酯同样不溶于水，易溶于乙醇、氯仿丙酮等有机溶剂，与莪术二酮不同的是莪术内酯包含4个手性中心。
近些年，生物转化逐渐成为有机合成反应中，特别是在不对称合成和手性化合物拆分中经常用到的一种重要工具。与传统的化学合成相比，生物转化具有高度的立体选择性和区域选择性，特别是在非活泼碳原子上立体选择性的官能化是较难通过普通的有机化学方法实现的。(Lamare and Furstoss，1990)因此，生物转化的方法在对生物活性天然产物的结构改造及精细化工中制备手性中间体的过程中有着广泛的应用。(David，2008；Duetz et al.，2001)
倍半萜类化合物是天然产物中数量较多的一种，广泛存在于多种芳香油中。研究发现很多倍半萜类具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤等活性，因此科学家们系统的进行了大量的筛选以找到具有新的有生物活性倍半萜类物质，并在原有结构上进行结构修饰获得多种衍生物，进行进一步筛选。而生物转化通常可以在温和条件下对天然化合物进行结构修饰，另外还可以相对容易的将一些含量丰富容易得到的萜类官能化，从而成为潜在的手性助剂或不对称合成中的手性单元。(Azerad，2000)
发明内容：
本发明的目的是提供一类具有抗肿瘤活性的类莪术内酯衍生物：
本发明所述的类莪术内酯衍生物具有如下结构通式：
具有如下结构特征：
其中：通式I-A所示化合物为通式I中C-9与C-10之间虚线为双键，R3、R4不存在：
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为β构型，R1、R2为氢，C-7位为β构型异丙基；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为β构型，R1为羟基、R2为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为β构型，R1为氢、R2为羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为α构型，R1、R2为氢，C-7位为α或β构型异丙基；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为α构型，R1、R2为氢或羟基，C-7位为β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为S型，C-1为α或β构型，R1、R2为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为α构型，C-5位为S或R型，C-1为α或β构型，R1、R2为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
或为通式I-B所示化合物，其为通式I中C-9与C-10之间虚线不存在：
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为β构型，R1、R2为氢，R3为氢，R4为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为β构型，R1、R2为氢，R3为羟基，R4为氢，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为β构型，R1、R2为氢，R3、R4为羟基，C-7位为β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为β构型，R1为氢、R2为羟基，R3、R4为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为β构型，R1为羟基、R2为氢或羟基，R3、R4为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为R型，C-1为α构型，R1、R2为氢或羟基，R3、R4为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为β构型，C-5位为S型，C-1为α或β构型，R1、R2为氢或羟基，R3、R4为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
4位甲基为α构型，C-5位为R或S型，C-1为α或β构型，R1、R2为氢或羟基，R3、R4为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键；
或为通式I-C所示化合物，其为通式I中C-9与C-10之间虚线为环氧键，R3、R4不存在：
4位甲基为α或β构型，C-5位为R或S型，C-1为α或β构型，R1、R2为氢或羟基，C-7位为α或β构型异丙基或C-7与C-11之间为双键或为环氧键。
本发明的另一目的是提供类莪术内酯衍生物的制备方法，即利用生物转化与化学方法相结合获得新的倍半萜类化合物的方法。本发明利用黑曲霉(Aspergillus niger)转化以及化学方法结合实现对类莪术二酮化合物的转化获得新的螺内酯型化合物，且此反应具有高度的立体选择性。
本发明涉及的类莪术内酯衍生物，其可以通过生物转化方法制备，包括发酵转化法、静息细胞转化法和粗酶液转化法。
转化用菌株的培养及发酵条件为：
斜面培养基：配制含葡萄糖1～10％，马铃薯浸汁5～30％，琼脂1～2.5％，pH 6～9的固体培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100mL，下同。100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、制成斜面。
种子和发酵培养基：蛋白胨0～2％、葡萄糖0～3％、蔗糖0～3％、K2HPO40～1％、KCl0～1％、MgSO40～1％、FeSO4·7H2O 0～0.1％，pH 5～9的液体培养基，100～120℃灭菌20～50分钟，灭菌后冷却，分别作为种子或发酵培养液。
生物转化底物溶液的配制：将底物溶解于适当的溶剂，例如甲醇、乙醇或二甲基亚砜等，经无菌的0.22μm的过滤器除菌成为底物储备液。加入到转化体系后的终浓度为0.001～100g/L。
(一)发酵转化法
1：直接发酵转化法：
接种菌株于发酵培养基中，培养8～240小时，将底物储备液加到培养基中，继续培养8～144小时。
2：二阶段发酵转化法：
A：第一阶段发酵培养：将菌株接种到新鲜的斜面培养基上于10～50℃培养8～240小时，接种到装有20～150mL液体培养基的250mL三角瓶中，在150～250rpm，15～50℃振荡培养8～144小时，得到种子培养液。
B：第二阶段发酵培养：将种子培养液以3％～15％(菌体湿重计，w/v)，在100～250rpm，15～50℃条件下振荡培养12～144小时。加入底物储备液，继续培养8～144小时。
(二)静息细胞转化法：
将菌株接种到新鲜的斜面培养基上于10～40℃培养12～240小时，接种到装有20～150mL液体培养基的250mL三角瓶中，在100～250rpm，15～50℃振荡培养6～120小时。过滤或离心收获菌体，用无菌的10～100mmol/L、pH 5.0～8.0的磷酸钾缓冲液洗涤菌体后，将菌体加入到无菌的装有10～100mL磷酸钾缓冲液(10～100mmol/L、pH 5.0～8.0)的三角瓶中，接种量3％～15％(菌体湿重计，w/v)，加入底物溶液，继续培养0.1～144小时。
(三)粗酶液转化法：
粗酶液制备方法：将菌株接种到新鲜的斜面培养基上于10～40℃培养8～240小时，产生丰富的孢子后，取3～10mL无菌生理盐水或无菌液体培养基或无菌双蒸水加入到新鲜斜面培养物中制备孢子悬液。将孢子悬液接入到装有20～150mL液体培养基的250mL三角瓶中，在150～250rpm，18～40℃振荡培养2～120小时。过滤收获菌体，用1.5ml Tris·HCl pH 7.0的缓冲液洗涤菌体。
以下操作在-10～10℃进行。称取1.0g湿菌体加入玻璃匀浆器中，同时加入1.5ml Tris·HClpH 7.0的缓冲液和0.5g的石英砂进行研磨。将匀浆液于14000rpm离心30min，取上清液用于制备转化产物，并贮存于-70℃。
酶法制备转化产物：5.0mL的酶反应体系包括缓冲液(pH 6.0～10.0)、0.1～100mmol/L的底物、0.01～10mmol/L的NADH+或NADPH+溶液和0.01～10mg/mL蛋白浓度的粗酶液，在15～50℃反应0.1～96小时。缓冲液为Tris·HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液等，优选Tris·HCl缓冲液，所述的酶反应温度为10～50℃，pH 7.0～9.0。
以上生物转化反应结束后，过滤或抽滤除去菌体，粗酶液可加入有机溶剂使蛋白变性再过滤除去，滤液以有机溶剂萃取，优选乙酸乙酯，回收酯层，减压回收溶剂后得到粗产物。
粗产物经过柱层析或重结晶等方法，获得所述化合物。
本发明涉及的类莪术内酯衍生物，还可以通过化学转化方法制备：
将底物溶解于适当的溶剂中，例如甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、二氧六环、氯仿或二甲基亚砜等，底物终浓度为0.001～100g/L，在溶剂中加入质量百分比浓度(w/v)0.001～50％的酸，所述酸可以是质子酸或路易斯酸，或两者的混合物，也可以是其他能够使溶剂成为酸性的试剂。底物在上述含酸溶剂中的终浓度为0.001～100g/L，充分混匀后置于-50～200℃反应，反应0.01～144小时。所得产物经柱层析或重结晶等方法纯化产物，并以其为底物，通过上述生物转化方法转化，经过通过柱层析等方法获得目的产物。
本发明涉及的类莪术内酯衍生物，还可以通过化学转化法与生物转化法相互结合的方法制备：
(1)先通过上述生物转化法转化底物获得粗产物，经过纯化后得到转化中间体；再以其为化学转化的底物，通过上述化学转化法获得目的化合物。
(2)先通过上述化学转化法转化底物并分离纯化得到中间产物，再以其为生物转化的底物，通过上述生物转化法获得目的化合物。
本发明所述的化合物制备方法是通过生物转化与化学转化相结合的方法将类莪术二酮化合物转化成为新的衍生物，与底物相比，产物具有更多的手性中心，可以进一步衍生化获得更多衍生物或作为合成其他化合物的手性单元，为新药物的研发提供了更多的选择。若利用化学方法全合成，步骤较为困难，且反应条件较为剧烈，而本发明利用生物转化的方法环境友好，能源消耗低，且在收率、生物催化剂的稳定性和安全性或该方法的成本方面有较大优势。
具体实施方式：
实施例1：生物转化法制备3α-羟基莪术内酯：
1：培养基
A：斜面培养基
马铃薯20g、葡萄糖2g、琼脂2g、蒸馏水100mL。
B：液体培养基
蛋白胨5g、葡萄糖15g、蔗糖15g、K2HPO41.0g、KCl 0.5g、MgSO40.5g、FeSO4·7H2O0.01g、蒸馏水1000mL，pH 7.0。
以上培养基均于115℃蒸汽灭菌30min。
2：生物转化的过程
二阶段发酵法(two-stage process)：
A：第一阶段发酵培养：将菌株Aspergillus niger AS 3.739接种到固体斜面培养基斜面上，28℃培养7天，产生丰富的分生孢子后，加入5mL无菌液体培养基制备孢子悬液。将孢子悬液接入到装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中，在200rpm，28℃振荡培养72h，得到种子培养液。
B：第二阶段发酵培养：将种子培养液以5％(菌丝体湿重计，w/v)，在200rpm，28℃条件下振荡培养24小时。加入底物溶液(由乙醇溶解，经无菌的0.22μm的过滤器除菌)，使其在培养基中的终浓度为0.1g/L，继续培养72小时。
3：转化产物的分离纯化
培养物过滤除去菌丝体后，经等体积水饱和乙酸乙酯萃取3次，酯层合并减压浓缩得到浅黄色油状液体。通过硅胶柱层析，正己烷乙酸乙酯混合溶剂洗脱分离，减压浓缩得产物1。
4：转化产物的结构鉴定：
产物1：白色针状结晶(石油醚)。TOF-MS m/z：275[M+Na]+，提示分子量为252，已知莪术二酮的分子量为236，产物1与莪术二酮相比增加一个氧原子，分子式为C15H24O3。在核磁共振1H NMR、13C NMR以及HSQC、COSY、DEPT-135、HMBC和Sel.Gr.NOE谱图指导下，鉴定产物1为3α-羟基莪术内酯。
实施例2：化学转化的产物，再进行生物转化法制备9，10-二羟基化莪术内酯：
20mL氯仿中加入1％体积比的浓盐酸，再加入20mg莪术二酮，混匀后置于20℃反应24小时。减压干燥除去溶剂得到粗产物，经过柱层析，正己烷乙酸乙酯混合溶剂洗脱分离，减压浓缩得产物莪术内酯15mg。通过实例1中所述的生物转化的方法，以步骤3所得产物莪术内酯(乙醇溶解，经无菌的0.22μm的过滤器除菌)为底物，终浓度0.1g/L，再经过柱层析，正己烷乙酸乙酯混合溶剂洗脱分离得到转化产物。
转化产物的结构鉴定：
产物2：浅黄色油状物。TOF-MS m/z：293[M+Na]+，提示分子量为270，已知莪术二酮的分子量为236，产物为增加两个氧原子和两个氢原子，分子式为C15H26O4。在核磁共振1HNMR、13C NMR以及HSQC、COSY、DEPT-135和HMBC谱图指导下，鉴定产物2为9，10-二羟基化莪术内酯。
实施例3：生物转化的中间产物，再进行化学转化制备3α-羟基莪术内酯：
以实施例1中生物转化方法转化60mg莪术二酮，并分离得到中间产物3α-羟基莪术二酮18mg，将其加入到含有1％体积比浓盐酸的20mL氯仿中，于20℃反应24小时后，减压干燥除去溶剂，经过硅胶柱层析分离纯化得到白色针状结晶。产物的结构鉴定：
TOF-MS m/z：275[M+Na]+，提示分子量为252，与底物的分子量一致，分子式为C15H24O3。核磁共振数据与产物1核磁共振数据一致，鉴定产物3为3α-羟基莪术内酯。
实施例4：化学转化法转化3α-甲氧基莪术二酮成为3α-甲氧基莪术内酯：
20mL氯仿中加入1％体积比的浓盐酸，再加入20mg的3α-甲氧基莪术二酮，混匀后置于20℃反应24小时。减压干燥除去溶剂得到粗产物，经过柱层析，正己烷乙酸乙酯混合溶剂洗脱分离，减压浓缩得17mg产物4。
产物4：浅黄色油状物。TOF-MS m/z：289[M+Na]+，提示分子量为266，分子式应为C16H26O3。在核磁共振1H NMR、13C NMR以及HSQC和HMBC谱图指导下，鉴定产物4为3α-甲氧基莪术内酯。
实施例5：生物转化法转化莪术二酮成为9，10-环氧化莪术内酯：
以实施例1中方法转化100mg莪术二酮，产物经分离纯化，得到产物5。
转化产物的结构鉴定：
产物5：白色针状结晶(石油醚)。TOF-MS m/z：275[M+Na]+，提示分子量为252，已知莪术二酮的分子量为236，产物1与莪术二酮相比增加一个氧原子，分子式为C15H24O3。在核磁共振1H NMR、13C NMR以及HSQC、DEPT-135和HMBC谱图指导下，鉴定产物1为3α-羟基莪术内酯。
实施例6：
采用四唑盐比色法即MTT法对化合物的抗肿瘤活性进行筛选。即利用活细胞的线粒体脱氢酶在代谢过程中将黄色的可溶性四唑盐MTT还原为不溶于水的蓝紫色产物甲臢(Formazan)晶体，通过酶标仪测量该细胞液的吸光度值(Optical density，OD)值，检测出待测样品对于肿瘤细胞的抑制能力。
所选化合物如下3α-羟基莪术内酯(化合物1)，9，10-二羟基化莪术内酯(化合物2)，3α-甲氧基莪术内酯(化合物4)，9，10-环氧化莪术内酯(化合物5)。
所选细胞系为：人胃癌细胞(SGC-7901)，人口腔皮样癌细胞株(KB)，人纤维肉瘤细胞(HT-1080)。
取对数生长期的各细胞，以适当浓度接种于96孔板内，100μL/well，培养24h后换成无血清的新鲜培养液，加药。加药后继续培养一定时间，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μL/well将细胞与终浓度0.25mg/mL MTT于37℃下共同孵育72h，然后加入等体积DMSO溶液，振荡溶解后测定器光密度值并计算细胞存活率。测定化合物对所选细胞的IC50结果如表1所示。
表1：不同化合物对三种细胞的IC50
*：阿霉素为对照试验
由表格中数据可知，所得化合物具有一定的抗肿瘤活性。
Claims (1)
1.类莪术内酯型化合物的制备方法，其特征在于，利用生物转化法制备：
A：第一阶段发酵培养：将菌株Aspergillus niger AS 3.739接种到固体斜面培养基斜面上，28 ℃培养7天，产生丰富的分生孢子后，加入5 mL无菌液体培养基制备孢子悬液；将孢子悬液接入到装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，在200 rpm，28 ℃振荡培养72 h，得到种子培养液；
B：第二阶段发酵培养：将种子培养液以5%的接种量接种到液体培养基，接种量以菌丝体湿重计，w/v，在200 rpm，28 ℃条件下振荡培养24小时；加入底物溶液，使其在培养基中的终浓度为0.1 g/L，继续培养72小时；所述底物是莪术二酮；
C：转化产物的分离纯化：培养物过滤除去菌丝体后，经等体积水饱和乙酸乙酯萃取3次，酯层合并减压浓缩得到浅黄色油状液体；通过硅胶柱层析，正己烷乙酸乙酯混合溶剂洗脱分离，减压浓缩得产物1；
D：转化产物的结构鉴定：鉴定产物1为3α-羟基莪术内酯；
所述斜面培养基：马铃薯20 g、葡萄糖2 g、琼脂2 g、蒸馏水100 mL；所述液体培养基：蛋白胨5 g、葡萄糖15 g、蔗糖15 g、K2HPO4 1.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.0；以上培养基均于115 ℃蒸汽灭菌30 min。
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| The Absolute Configuration of Curdione and the Stereostructure of Curcumalactone from Curcuma Wenyujin;Seiichi Inayama;《Chem. Pharm. Bull.》;19851231;第33卷(第5期);2179-2182 * |
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