CN105566268B - 一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物的提取纯化领域，具体涉及一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法。先采用硅胶柱对红曲霉液态发酵液的上清液进行分离，依次选用乙酸乙酯、乙酸乙酯和甲醇按体积比2:1混合的溶剂、乙酸乙酯和甲醇按体积比3:1混合的溶剂进行梯度洗脱，得溶解液；然后再采用LH20柱对溶解液进行分离，依次选用超纯水、20%（v/v）甲醇溶液、50%（v/v）甲醇溶液进行梯度洗脱，得到纯化的洛伐他汀溶液。本发明避免使用毒性较大的溶剂，分离效率明显提高（纯度可达95%），解决了工艺复杂、成本高的问题，适于工业化生产。

Description

一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法

技术领域

本发明属于药物的提取纯化领域，具体涉及一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法。

技术背景

洛伐他汀(Lovastatin)是微生物的一种代谢产物，被证实具有强烈抑制胆固醇合成的作用，属他汀类药物，其高效、低廉的特性使其成为临床上治疗高胆固醇、高血脂症状的首选药物。其化学名称为[1S-[1α(R*)，3α，7β，8β(2S*，4S*)，8αβ]]-1，2，3，7，8，8α-六氢-3，7-二甲基-8-[2-(四氢-4-羟基-6氧代-二氢吡喃-2)-乙基]-1-奈基-2-甲基丁酸酯，有两种结构形态，分别为酸型和内酯型，在强碱条件下几乎以开环酸型存在，在酸性条件下两种形态都有，它们可以相互转化，化学结构式如下：

目前，生产洛伐他汀所采用的微生物主要有三大类：土曲霉、红曲霉和青霉，各大药厂生产洛伐他汀所选用的微生物最多是土曲霉，因其产量较高。红曲霉也是产洛伐他汀的一大菌种，虽然产量较土曲霉低，但是，红曲在我国已有1000多年历史，是古代食疗两用的中药材，因其安全、低毒的特性，红曲霉来源的洛伐他汀越来越受到消费者的喜爱。

红曲霉(Monascus)是一种小型丝状腐生真菌，大多数菌株在PDA培养基上长势良好，最初颜色较浅，随时间延长颜色呈红色或浅红色，菌落呈绒毡状或皮膜状，因种而异。洛伐他汀为红曲菌的次级代谢产物，研究表明，液态发酵洛伐他汀产量可达0.59g/L，固态发酵产量可达6.3g/kg。因此，红曲菌可作为洛伐他汀药物的生产菌株。近年来高血脂及相关的心血管疾病已成为影响人类身体健康的主要疾病之一，我国有8000万人血脂偏高，引起这些疾病的主要原因就是体内合成过多胆固醇，而洛伐他汀是抑制胆固醇合成最受欢迎的药物，其应用潜力巨大。

目前，洛伐他汀的分离纯化工艺主要采用萃取、结晶、重结晶的方法，这种方法存在两大问题：

一是该方法较适用于以土曲霉为生产菌的洛伐他汀分离，而红曲菌的代谢产物中除洛伐他汀外还含有大量的红曲色素，色素与洛伐他汀可溶性相似，难以萃取分离，也难以结晶除去。

二是洛伐他汀一般要经过多次重结晶才能达到纯化要求，而且每次精制采用溶剂体系不同，过程复杂，并且使收率降低，成本升高。

为了解决以上工艺问题，本发明采用柱层析技术分离红曲洛伐他汀。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法。通过采用硅胶柱和Sephadex LH20柱层析分离，选用不同极性有机溶剂进行梯度洗脱，达到了非常好的纯化效果（纯度可达95%），解决现有工艺复杂、收率低、成本高的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

红曲洛伐他汀的纯化制备方法，包括以下步骤：

1） 取红曲霉液态发酵液，用6 mol/L的氢氧化钠调pH10~12，室温下120~180 r/min 振荡1~3 h，4000~4500 r/min 离心5~10 min，取上清液；

2）硅胶柱层析：取适量步骤1）的上清液上样，上样后先加1~1.5倍柱体积乙酸乙酯溶剂进行洗脱，再加1.5~1.8 倍柱体积 的混合溶剂1（乙酸乙酯:甲醇=2:1，v/v）洗脱，最后加0.8~1倍柱体积的混合溶剂2（乙酸乙酯:甲醇=3:1，v/v）洗脱，控制流速在1滴/秒~2滴/秒；收集洗脱液用旋转蒸发器55℃~60℃蒸干，加水溶解，得溶解液；

3）LH20柱层析：取步骤2）的溶解液适量上样，上样后，先加1~1.1倍柱体积超纯水进行洗脱，再加1~1.5 倍柱体积 20% （v/v）甲醇洗脱，最后加1~1.2倍柱体积 50%（v/v）甲醇洗脱，控制流速在1滴/秒~2滴/秒；收集20%（v/v）甲醇洗脱液，用旋转蒸发器55℃~60℃蒸干，加水溶解，得到纯化的洛伐他汀溶液。

硅胶柱的制备方法为：将80~120目的硅胶用乙酸乙酯浸泡后湿法装柱，柱子径高比为1:15~1:20，硅胶体积总量为上样量的20~25倍，得到硅胶柱。

LH20柱的制备方法为：取Sephadex LH20（羟丙基葡聚糖凝胶）用60%乙醇溶液（v/v）浸泡后湿法装柱，柱子径高比为1:15~1:20，LH20的体积总量为上样量的8~10倍，得到LH20柱。

本发明的有益效果在于：

1）发酵液处理简单，仅需两次过柱，效率高，周期短，降低成本；得到的洛伐他汀杂质少，纯度高，可达95%；

2）本发明避免使用毒性较大的溶剂，分离效率明显提高，解决了工艺复杂、成本高的问题，适于工业化生产。

附图说明

图1为紫色红曲霉液态发酵液中洛伐他汀粗品的HPLC图谱；

图2为紫色红曲霉液态发酵液中洛伐他汀纯化后HPLC图谱。

具体实施方式

本发明采用下列实施例来进一步说明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

红曲霉发酵液中洛伐他汀的分离纯化方法：

（1）将紫色红曲霉发酵液离心去除菌体，取上清液分装在250 mL锥形瓶中，装液量200 mL，用6 mol/L的氢氧化钠调pH为11，在室温下、180 r/min 振荡1 h，取出后4200 r/min 离心5 min，取上清液；经检测，上清中洛伐他汀含量在350~400mg/L；

（2）取120目硅胶用乙酸乙酯浸泡后湿法装柱，柱子直径为9mm，装柱高度约12~13cm，得到硅胶柱；取0.5mL步骤（1）中的上清液上样，上样后，先加15 mL乙酸乙酯进行洗脱，再加20 mL混合溶剂1（乙酸乙酯:甲醇=2:1，v/v）洗脱，最后加8mL混合溶剂2（乙酸乙酯:甲醇=3:1，v/v）洗脱，控制流速在1滴/秒。收集洗脱液；

（3）取（2）中的洗脱液20mL用旋转蒸发器55℃~60℃蒸干，加1mL水溶解，得溶解液；

（4）取Sephadex LH20用60%（v/v）乙醇浸泡后湿法装柱，柱子直径为9mm，装柱高度约4~5 cm，得到LH20柱；取步骤（3）中溶解液0.5 mL上样，上样后，先加5 mL超纯水进行洗脱，再加5 mL 20%（v/v）甲醇洗脱，最后加5 mL 50%（v/v）甲醇洗脱，控制流速在1滴/秒；收集5 mL 20%（v/v）甲醇洗脱液，得收集液；

（5）取步骤（4）中的收集液10 mL用旋转蒸发器60 ℃蒸干，加1 mL水溶解，得到纯化的洛伐他汀溶解液。

洛伐他汀纯度测定——HPLC检测法

色谱柱： HITACHI LaChromUltra C18 (5 μm)；

流动相：乙腈:0.01 wt%磷酸=60:40（v/v）；

检测波长：238 nm；

进样量：10 µL；

流速：1 mL/min；

柱温：28 ℃；

经HPLC检测，洛伐他汀纯度为95%，收率为45%。

Claims (5)

1.一种红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）取红曲霉液态发酵液，调pH为10~12，室温下120~180 r/min 振荡1~3 h，4000~4500r/min 离心5~10 min，取上清液；

2）硅胶柱层析：取步骤1）上清液上样，上样后先加1~1.5倍硅胶柱体积的乙酸乙酯进行洗脱，再加1.5~1.8 倍硅胶柱体积的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂1洗脱，最后加0.8~1倍硅胶柱体积的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂2洗脱，控制流速在1滴/秒~2滴/秒；收集洗脱液，用旋转蒸发器55℃~60℃蒸干，加水溶解，得溶解液；

3）Sephadex LH20柱层析：取步骤2）的溶解液上样，上样后，先加1~1.1倍LH20柱体积的超纯水进行洗脱，再加1~1.5 倍LH20柱体积的体积分数为20%的甲醇溶液洗脱，最后加1~1.2倍LH20柱体积的体积分数为50%的甲醇溶液洗脱，控制流速在1滴/秒~2滴/秒；收集体积分数为20%的甲醇洗脱液，用旋转蒸发器，55℃~60℃蒸干，加水溶解，得到纯化的洛伐他汀溶液。

2.根据权利要求1所述的红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于：步骤1）中采用6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH。

3.根据权利要求1所述的红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于：步骤2）的硅胶柱的制备方法为：将80~120目的硅胶用乙酸乙酯浸泡后湿法装柱，柱子径高比为1:15~1:20，硅胶体积总量为上样量的20~25倍，得到硅胶柱。

4.根据权利要求1所述的红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于：步骤2）中所述的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂1中，乙酸乙酯和甲醇的体积比为2:1；所述的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂2中，乙酸乙酯和甲醇的体积比为3:1。

5.根据权利要求1所述的红曲洛伐他汀的纯化制备方法，其特征在于：步骤3）中LH20柱的制备方法为：取Sephadex LH20用体积分数为60%的乙醇溶液浸泡后湿法装柱，柱子径高比为1:15~1:20，LH20的体积总量为上样量的8~10倍，得到LH20柱。