CN103255191A - 双液相系统发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种采用双液相发酵系统发酵分枝杆菌Mycobacterium sp.DE6823制备雄烯二酮的方法，发酵培养基水相选用无菌蒸馏水，油相可选用米糠油、葵花油、大豆油和花生油，在发酵转化完成后，通过膜分离方法，得到含有雄烯二酮的溶液，经浓缩、脱色、过滤、浓缩、重结晶和真空干燥等操作可得到纯度在99％以上的雄烯二酮。根据选用油相的不同，植物甾醇的转化率在59％～85％的范围之间。本发明解决了我国现有雄烯二酮生产工艺中原料受季节和地域的限制，可有效降低对生态环境的破坏，具有操作简单、环境污染小、转化率高、生产成本低等特点，适合产业化生产。

Description

双液相系统发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮

一、技术领域

本发明利用发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮的方法属于生物技术领域，涉及利用双液相发酵系统进行发酵降解。

二、背景技术

雄烯二酮的化学结构式如下：

雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用，可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的，其可用来生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用来合成氢化可的松、氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也可以直接用于生产抗早孕米非司酮和各类计划生育药。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药产品，如福美司坦等及类固醇类激素免疫抗原等，目前，全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD作原料生产的医药品种不断增加。

Peterson和Murray在美国专利No.2,602,769中公开了一种用根霉属真菌生产孕酮的II-a-羟化的方法；Kraychy在美国专利NO.3,684,657中公开了一种用分枝杆菌属从包含17-烷基的类固醇生成雄-4-烯-3，17-二酮，雄-1，4烯-3，17-二酮和20a-羟甲基孕-1，4-二烯-3-酮的方法。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出雄甾-4-烯-3，17-双酮(雄烯二酮)及雄甾-1，4-二烯-3，17-双酮(雄烯二酮D)并以此作为合成甾体药物的原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而得到雄烯二酮和雄烯二酮D；70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产雄烯二酮D获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇作为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力己获得很大进展。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解雄烯二酮、ADD的转化率。Upjohn公司在美国专利No.4,293,644中描述了一种通过——分枝杆菌(ATCC29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-双酮(雄烯二酮)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的产物的方法。

国内在这方面也作了一系列的研究。王敬一，殷芝华，周维善在对β-谷甾醇侧链的降解产生4-雄甾-3，17-双酮的研究中发现：雄烯二酮产物的积累与培养基中葡萄糖的多少有关，结果证明葡萄糖过高不利于雄烯二酮的转化。自80年代以来，微生物降解甾醇生成雄烯二酮甾体技术得到充分发展并在工业上得到广泛应用。我国从国内外来源的诸多菌株中筛选到(Mycrobacteriumphlei93201)，在9a羟化酶抑制剂2，2’-联吡啶存在下能将β-谷甾醇降解为ADD及微量雄烯二酮的菌株。

目前，AD的生产方法国内外有较大的差别，国外主要采用微生物法发酵转化植物甾醇，而国内由于发酵工艺的不成熟，AD的生产厂家仍旧采用从薯蓣植物资源中提取薯蓣皂苷元(简称皂素)，化学合成雄烯二酮。薯蓣皂苷元主要是从穿地龙(一种野生名贵中药材)中提取，消耗量大，已濒临枯竭，因此，采用该方法进行生产AD，严重受到原料的影响。国内也有科研机构在研究利用微生物法发酵转化植物甾醇制得AD的生产方法，但是由于发酵量较小，难以达到工业生产的需求。

利用微生物发酵法降解植物甾醇工业化应用的一个难题是如何解决植物甾醇的溶解性问题：植物甾醇不溶于水，而在发酵过程中，菌株的生长、代谢、繁殖均是在水相中进行，甾醇不溶于水的物理特性降低了菌株对甾醇的利用率。

双液相发酵的研究始于19世纪60年代，是指在发酵液中加入一种新的，与水不相溶的油相，例如以液态烷烃为底物进行SCP生产。目前，发酵生产中双液相发酵体系有三类，第一类是以商品化的以烷烃或油脂为碳源的发酵体系；第二类是氧载体发酵体系，即将对氧有较高溶解度，但又不溶于水的有机溶剂(称为氧载体)称为氧载体加入到好氧发酵体系中，加快发酵体系的氧传递速度；第三类是近几年开始开展研究的，在上述两类双液相发酵体系中引入一种固体载体或乳化剂，利用这种载体所具有的很强的与水和油的双重吸附能力，增加双液相间的接触面积，从而提高传质与发酵产率。

三、发明内容

本发明所要解决的技术问题为克服发酵过程中原料不溶的问题，设计一种提高菌株利用率，增加植物甾醇转化率，提高产物提取率的方法。

本发明的具体步骤如下：

(1)菌株微生物发酵

分枝杆菌(Mycobacterium sp.DE6823)以8％-17％接种量接种至发酵培养基中(培养基主要由玉米淀粉、KH₂PO₄、NH₄NO₃、航空煤油、消泡剂等组成，其余为油相和水相)，培养温度保持在30℃-32℃，搅拌速度为130-300r/min，pH的范围为8.2-8.4，发酵时间为6-12天。

(2)发酵液中雄烯二酮的提取制备

发酵结束后，过滤去除发酵液中的固体，加入少量NaCl，加速两像分离，取油相，其内加入乙醇，充分搅拌后，通过膜过滤，乙醇将先于其他油相滤出，按体积浓缩，在浓缩液中加入适量活性炭脱色，过滤，滤液旋蒸，得到雄烯二酮粗品，溶于丙酮，加热回流半小时，冷却、结晶，抽滤、真空干燥，得到雄烯二酮晶体，纯度达到99.0％以上。

本发明主要创新点如下：

(1)本发明采用双液相系统发酵法降解植物兹醇制备雄烯二酮，不仅增大了甾醇溶解度，提高了底物的投料量，而且将细胞培养与产物萃取分离耦合，减少了代谢产物的反馈作用，同传统的单水相发酵法相比有效提高了目的产物的发酵浓度，同时也利于目的产物的提取。

(2)本发明采用双液相培养系统作为微生物转化的发酵系统，可有效减少有机项物质对菌株的毒害作用，雄烯二酮的发酵浓度得到显著提高。

(3)本发明采用膜分离技术取代传统的萃取方法进行雄烯二酮的提取纯化，减少了有机溶剂的使用，简化了生产工艺，有效提高了产品的产率和纯度，雄烯二酮的纯度可达到99％以上。

四、具体实施方式

下面结合实例对本发明技术方案进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

菌株：分枝杆菌(Mycobacterium sp.DE6823)

菌株接入量：10％

发酵培养基：玉米淀粉10％，NH₄NO₃ 0.1％，K₂HPO₃ 0.1％，航空煤油0.2％，消泡剂0.002％，葵花油的浓度为20g/L，植物甾醇的添加浓度为22g/L。

发酵罐容积：10L，按50％发酵液加入。

搅拌速度：160r/min

发酵时间：8d

pH范围：8.2-8.4

待发酵完成后，过滤除去发酵液中的固体，加入5g/L的K₂CO₃，搅拌，静置，两相分层，取油层，加入乙醇，充分搅拌，通过以聚丙烯膜的膜装置，乙醇相将会很快流出，而油相由于粘度和分子较大，会被膜截住。将含有AD的乙醇溶液按体积10∶1浓缩，在浓缩液中加入5％活性炭脱色，过滤，滤液旋蒸，得到AD粗品，溶于丙酮，加热回流0.5h，冷却、结晶、抽滤、真空干燥，得到AD晶体93.5g，纯度为99.3％，转化率85％。

实施例2

菌株：同实施例1

菌株接入量：8％

发酵培养基：玉米淀粉8％，NH₄NO₃ 0.2％，K₂HPO₃ 0.1％，航空煤油0.3％，消泡剂0.005％，大豆油的浓度为20g/L，植物甾醇的添加浓度为22g/L。

发酵罐容积：100L，按50％发酵液加入。

搅拌速度：300r/min

发酵时间：9d

pH范围：8.2～8.4

待发酵完成后，过滤除去发酵液中的固体，加入8g/L的Na₂CO₃，搅拌，静置，两相分层，取油层，加入丙酮，充分搅拌，通过以聚丙烯膜的膜装置，丙酮相将会很快流出，而油相由于粘度和分子较大，会被膜截住。将含有AD的丙酮溶液按体积10∶1浓缩，在浓缩液中加入5％活性炭脱色，过滤，滤液旋蒸，得到AD粗品，溶于丙酮，加热回流1h，冷却、结晶、抽滤、真空干燥，得到AD晶体737g，纯度为99.1％，转化率63％。

实施例3

菌株：同实施例1

菌株接入量：12％

发酵培养基：玉米淀粉12％，NH₄NO₃ 0.1％，K₂HPO₃ 0.2％，航空煤油0.5％，消泡剂0.002％，米糠油的浓度为26g/L，植物甾醇的添加浓度为22g/L。发酵罐容积：100L，按50％发酵液加入。

搅拌速度：250r/min

发酵时间：9d

pH范围：8.2～8.4

待发酵完成后，过滤除去发酵液中的固体，加入8g/L的K₂CO₃，搅拌，静置，两相分层，取油层，加入异丁醇，充分搅拌，通过以聚丙烯膜的膜装置，异丁醇相将会很快流出，而油相由于粘度和分子较大，会被膜截住。将含有AD的异丁醇溶液按体积10∶1浓缩，在浓缩液中加入5％活性炭脱色，过滤，滤液旋蒸，得到AD粗品，溶于丙酮，加热回流1h，冷却、结晶、抽滤、真空干燥，得到AD晶体649g，纯度为99.2％，转化率59％。

实施例4

菌株：同实施例1

菌株接入量：14％

发酵培养基：玉米淀粉14％，NH₄NO₃ 0.2％，K₂HPO₃ 0.2％，航空煤油0.5％，消泡剂0.007％，花生油的浓度为24g/L，植物甾醇的添加浓度为22g/L。发酵罐容积：100L，按50％发酵液加入。

搅拌速度：250r/min

发酵时间：10d

pH范围：8.2～8.4

待发酵完成后，过滤除去发酵液中的固体，加入10g/L的NaCl，搅拌，静置，两相分层，取油层，加入异丁醇，充分搅拌，通过以聚丙烯膜的膜装置，异丁醇相将会很快流出，而油相由于粘度和分子较大，会被膜截住。将含有AD的异丁醇溶液按体积15∶1浓缩，在浓缩液中加入5％活性炭脱色，过滤，滤液旋蒸，得到AD粗品，溶于丙酮，加热回流1h，冷却、结晶、抽滤、真空干燥，得到AD晶体682g，纯度为99.4％，转化率62％。

实施例5

菌株：同实施例1

菌株接入量：17％

发酵培养基：玉米淀粉17％，NH₄NO₃ 0.2％，K₂HPO₃ 0.2％，航空煤油0.5％，消泡剂0.009％，花生油的浓度为22g/L，植物甾醇的添加浓度为22g/L。

发酵罐容积：100L，按50％发酵液加入。

搅拌速度：300r/min

发酵时间：11d

pH范围：8.2～8.4

待发酵完成后，过滤除去发酵液中的固体，加入10g/L的NaCl，搅拌，静置，两相分层，取油层，加入丙酮，充分搅拌，通过以聚丙烯膜的膜装置，丙酮相将会很快流出，而油相由于粘度和分子较大，会被膜截住。将含有AD的丙酮溶液按体积20∶1浓缩，在浓缩液中加入5％活性炭脱色，过滤，滤液旋蒸，得到AD粗品，溶于丙酮，加热回流1h，冷却、结晶、抽滤、真空干燥，得到AD晶体660g，纯度为99.1％，转化率60％。

Claims (10)

1.本发明涉及一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮(雄甾-4-烯-3，17-双酮，简称AD)的方法，其具体步骤如下：发酵菌种接种至双液相培养基中，保持一定的温度，加入植物甾醇，搅拌、控制pH值，发酵完成后，采用膜分离技术获得含AD溶液，后经浓缩、活性炭脱色、过滤、浓缩、重结晶、真空干燥得到AD晶体，纯度达到99％以上。

2.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于发酵菌种为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DE6823，其菌种保藏编号为CGMCC No.6419。

3.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于双液相指的是水相和油相；水相具体为灭菌蒸馏水，油相具体可是米糠油、葵花油、大豆油和花生油。

4.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于菌种的接入量为8％～17％。

5.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于培养基配方如下：玉米淀粉4～17％(g/L)，NH₄NO₃ 0.1～0.4％(g/L)，K₂HPO₃ 0.1～0.2％(g/L)，航空煤油0.1～0.5％(g/L)，消泡剂0.002～0.009％(g/L)，油相的浓度为14～26g/L，植物甾醇的添加浓度维持15～22g/L，其余为灭菌蒸馏水。

6.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于保持一定温度为30℃～32℃。

7.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于搅拌速度为130～300r/min；pH值范围为8.2～8.4。

8.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于有机溶剂指的是烷基醇和烷基酮，具体包括乙醇、甲醇、异丁醇、丙酮。

9.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于发酵结束后，过滤，滤去发酵液中的固体，加入少量的无机盐，取油相，加入权利要求8所述溶剂，充分搅拌后，通过膜过滤，浓缩，在浓缩液中加入活性炭，回流10～20min，过滤、滤液旋蒸得到AD粗品。

10.根据权利要求9所述的一种利用微生物发酵降解植物甾醇制备雄烯二酮，其特征在于无机盐指的是NaCl、K₂CO₃和Na₂CO₃。