CN109880863A - 利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法 - Google Patents

Abstract

首次利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法。与传统提高抗生素产量的方法相比，该方法简便易行，可操作性强。该方法将链霉菌孢子添加到配好的含有不同浓度纳米颗粒的YBP液体培养基中，发酵一周左右，在此期间，定时测定菌株产两种有色色素‑放线紫红素和十一烷基灵菌红素的情况。该方法首次将纳米颗粒物作为一种添加剂应用于链霉菌的抗生素发酵，利用该方法对天蓝色链霉菌进行培养，发现添加1000mg/L的纳米氧化铝能使放线紫红素的产量提高4.6倍，使十一烷基灵菌红素的产量提高3.7倍。添加10mg/L的纳米铜能使放线紫红素的产量提高2.1倍，使十一烷基灵菌红素的产量提高1.8倍。

Description

利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法

技术领域

本发明属于提高抗生素产量的技术领域，具体涉及纳米材料的添加能够提高天蓝色链霉菌M145产两种抗生素的能力。

背景技术

在天然生产的抗生素中，由放线菌生产的抗生素占其中的2/3左右，而在这其中，作为放线菌的典型代表，链霉菌生产的抗生素占绝大多数，为80％左右(LpezGarce等，2014，Kieser等，2000)，且有100多种已应用于临床。目前，这些抗生素在抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、防治病虫害等方面得到了广泛的应用。例如用作植物病虫害防治的井冈霉素、中生霉素、春雷霉素等，用于杀寄生虫及螨虫的阿维菌素，用作免疫抑制剂的FK506和雷帕霉素，用作临床和兽医的四环素、红霉素等，测序发现，天蓝色链霉菌基因组上有二十多个次级代谢产物的基因簇，其中有两种产物为有色抗生素，分别是分泌到胞外的蓝色色素-放线紫红素和胞内的十一烷基灵菌红素，放线紫红素可以抑制革兰氏阳性菌，而十一烷基灵菌红素具有抗菌、抗癌作用，而且是良好的免疫抑制剂。

由于链霉菌巨大的商业价值及广泛的应用前景，目前研究人员采用多种手段来提高链霉菌产抗生素的能力，归结起来主要包括三大类：一是利用分子生物学的手段对功能已知的基因进行遗传改造，例如，在天蓝色链霉菌中，actⅡ-ORF4是抗生素放线紫红素合成的途径专一性调控因子，通过提高它的表达量，可以提高放线紫红素的产量；二是通过物理化学方法对链霉菌进行诱变，然后在诱变后代中挑选高产菌株，例如紫外诱变；三是改变发酵条件提高抗生素的产量。在工业应用中，这几种手段可以结合起来最终达到高产的目的。目前，对发酵条件的优化，主要通过选择适宜的碳源、氮源物质及pH、温度等最终达到高产的目的，对于通过添加适当比例的添加剂来提高抗生素产量的研究很少。

纳米材料是一类超微的材料，大小处在微观和宏观交界的过渡区域。在纳米尺度下，物质中粒子的波动使得原子之间的相互作用具有了很强的尺寸依赖性，因而纳米材料表现出与同组成的微米级材料完全不同的热学、磁学、电学、光学、力学及化学活性等。由于具备上述诸多特性，纳米材料已被广泛应用于机械制造、航空航天、信息科技、生物医药、化学催化、建筑、环境保护、家用电器、个护用品、纺织等领域。在现有的文献中，还没有利用纳米材料提高链霉菌产量的报道。

发明内容

本发明目的是解决利用现有的分子生物学和诱变等手段提高抗生素产量方法繁琐的问题，提供一种利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法。

本发明技术方案：

利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法，步骤如下：

1)对链霉菌进行培养，获得足够量的孢子。

具体操作是：将天蓝色链霉菌M145涂布至黄豆饼粉(MS)固体培养基上，在30-37℃条件下培养5-7天后，利用棉棒将孢子收集过滤后悬浮于体积百分含量为20％的甘油溶液中，并在-80℃下保藏；

所述MS固体培养基的组成及配制方法如下：称取黄豆饼粉20g，加入800mL自来水煮沸半小时后，使用六层纱布过滤除去滤渣，加入20g甘露醇，20g琼脂粉，自来水补至1L，调pH至7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。

2)将10-1000mg/L纳米材料加到YBP液体培养基中，超声半小时后121℃灭菌备用；

所述YBP液体培养基的组成及配制方法如下：称取酵母粉2g，牛肉膏2g，蛋白胨4g，NaCl 15g，葡萄糖10g，MgCl₂ 1g，加入1L蒸馏水溶解，调pH至7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。

所述的纳米材料包括：纳米氧化铝、纳米铜等纳米金属及金属氧化物。

3)添加步骤1)得到的链霉菌孢子至步骤2)配好的含有纳米材料的YBP液体培养基中，在30-37℃摇床中培养，发酵一周左右，在此期间，定时测定菌株产两种有色色素-放线紫红素和十一烷基灵菌红素的情况。对该方法的具体说明请参考本发明的实施例，通过添加纳米颗粒物实现了天蓝色链霉菌M145产抗生素量的提高。

本发明的优点和积极效果：

本发明方法简便易行，可操作性强。该方法首次将纳米颗粒物作为一种添加剂应用于链霉菌的抗生素发酵，所以该方法是用于链霉菌的抗生素高产发酵的一个新方法，利用该方法对天蓝色链霉菌进行培养，发现添加1000mg/L的纳米氧化铝能使放线紫红素的产量提高4.6倍，使十一烷基灵菌红素的产量提高3.7倍，添加10mg/L的纳米铜能使放线紫红素的产量提高2.1倍，使十一烷基灵菌红素的产量提高1.8倍。

附图说明

图1为实施例1添加0-1000mg/L的纳米氧化铝后，放线紫红素(a)和十一烷基灵菌红素(b)的产量变化。

图2为实施例2添加0-100mg/L的纳米铜后，放线紫红素(a)和十一烷基灵菌红素(b)的产量变化。

具体实施方式

实施例1：

利用纳米氧化铝作为添加剂提高天蓝色链霉菌M145产抗生素的能力的方法，包括以下步骤：

1)天蓝色链霉菌M145(Bentley SD等，2002,Complete genome sequence of themodel actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2).Nature,417:141-147)涂布至黄豆饼粉(MS)固体培养基上，在30℃条件下培养7天后，利用棉棒将孢子收集过滤后悬浮于20％(V/V)的甘油溶液中，并在-80℃下保藏。

所述的MS培养基的组成及配制方法如下：称取黄豆饼粉20g，加入800mL自来水煮沸半小时后，使用六层纱布过滤除去滤渣，加入20g甘露醇，20g琼脂粉，自来水补至1L，调pH至7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。

2)纳米氧化铝(CAS号：1344-28-1)购自上海麦克林生化科技有限公司，将不同浓度的纳米氧化铝分别加到YBP液体培养基中，超声半小时后121℃灭菌备用。

所述YBP液体培养基的组成及配制方法如下：称取酵母粉2g，牛肉膏2g，蛋白胨4g，NaCl 15g，葡萄糖10g，MgCl₂ 1g，加入1L蒸馏水溶解，调pH至7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。

3)将300μL(10⁸cfu/mL)步骤1)得到的链霉菌孢子加至步骤2)配制的YBP液体培养基中，在30℃摇床中培养。

4)每隔24小时从步骤3)的培养液中吸取5mL溶液。测定菌株产两种有色色素-放线紫红素和十一烷基灵菌红素的情况。具体方法如下：

将菌液在4000rpm条件下离心10分钟，倒出上清液并向其中加入等体积的1MNaOH，室温下放置一小时后在4000rpm条件下离心5分钟，最后利用紫外分光光度计测定其在633nm处的吸光值，记为A_A，以确定放线紫红素的产量。由于十一烷基灵菌红素是一种胞内的红色色素，在测定之前必须将其从胞内提取出来。首先将离心后的细胞悬浮于5mL事先利用0.1M HCl调节至pH为2的甲醛溶液中，在室温条件下震荡过夜，使十一烷基灵菌红素完全从细胞中提取出来。然后4000rpm离心5分钟除去破碎的细胞，利用紫外分光光度计测定在533nm波长下的吸光值，记为A_R。通过公式(1)和公式(2)计算溶液中放线紫红素的浓度C_A和十一烷基灵菌红素的浓度C_R：

C_A＝A_A/25.32； (1)

C_R＝A_R/100.5； (2)

5)本发明实施例步骤2)中纳米氧化铝的浓度分别设置为0，10，50，100，500和1000mg/L，培养一周，测得的放线紫红素和十一烷基灵菌红素的浓度如表1和表2所示：

表1：经0-1000mg/L的纳米氧化铝处理后，天蓝色链霉菌M145产放线紫红素的量(mg/L)

空白

10mg/L

50mg/L

100mg/L

500mg/L

1000mg/L

48h

0

0

0

0

0

0.28±0.04

72h

0.13±0.02

0.24±0.02

0.25±0.01

0.22±0.06

0.35±0.06

0.69±0.04

96h

0.58±0.11

0.67±0.09

0.59±0.11

0.64±0.12

0.86±0.09

1.44±0.02

120h

0.71±0.12

0.74±0.0194

0.95±0.09

1.01±0.11

2.07±0.08

3.22±0.11

144h

0.92±0.17

1.08±0.08

1.58±0.28

1.68±0.21

3.28±0.02

4.82±0.09

168h

1.08±0.09

1.22±0.18

1.67±0.09

1.68±0.06

3.30±0.14

4.96±0.05

表2：经0-1000mg/L的纳米氧化铝处理后，天蓝色链霉菌M145产十一烷基灵菌红素的量(mg/L)

空白

10mg/L

50mg/L

100mg/L

500mg/L

1000mg/L

24h

0

0.07±0.01

0.09±0.02

0.12±0.02

0.11±0.03

0.22±0.03

48h

0.62±0.08

0.95±0.011

1.26±0.06

1.49±0.09

1.59±0.07

2.01±0.13

72h

0.99±0.12

1.23±0.06

1.43±0.13

2.37±0.11

2.99±0.18

3.64±0.09

96h

0.46±0.08

0.59±0.06

0.62±0.12

0.88±0.07

0.96±0.11

1.32±0.02

120h

0.45±0.07

0.49±0.05

0.46±0.12

0.52±0.06

0.36±0.05

0.38±0.07

由表1可见，随着时间的增加，天蓝色链霉菌M145产放线紫红素的量逐渐增加，在168小时时逐渐趋于稳定(图1a)，未添加纳米氧化铝的M145产放线紫红素的量为1.08mg/L，而随着纳米氧化铝浓度的升高，M145产量也逐渐增加，当浓度为1000mg/L时，放线紫红素的产量可达4.96mg/L，此时的产量为对照的4.6倍。

由表2可见，随着时间的增加，天蓝色链霉菌M145产十一烷基灵菌红素的量是先增加后减少的(图1b)，这是由于十一烷基灵菌红素是一种胞内抗生素，不分泌到胞外，随着细胞后期的死亡，十一烷基灵菌红素也被降解，在72小时时，抗生素的积累量达到最大值，未添加纳米氧化铝的M145产十一烷基灵菌红素的量为0.99mg/L，而随着纳米氧化铝浓度的升高，M145产量也逐渐增加，当浓度为1000mg/L时，十一烷基灵菌红素的产量可达3.64mg/L，此时的产量为对照的3.7倍。

实施例2：

利用纳米铜作为添加剂提高天蓝色链霉菌M145产抗生素的能力的方法，包括以下步骤：

所述纳米材料改为纳米铜，其余同实施例1。纳米铜(CAS号：7440-50-8)购自上海麦克林生化科技有限公司

本发明实施例中纳米铜的浓度分别设置为0，5，10，20，50和100mg/L，培养一周，测得的放线紫红素和十一烷基灵菌红素的浓度如表3和表4所示：

表3：经0-100mg/L的纳米铜处理后，天蓝色链霉菌M145产放线紫红素的量(mg/L)

空白

5mg/L

10mg/L

20mg/L

50mg/L

100mg/L

72h

0.14±0.02

0.16±0.02

0.24±0.03

0.11±0.02

0.08±0.02

0.06±0.01

96h

0.34±0.08

0.57±0.09

0.87±0.09

0.25±0.03

0.22±0.03

0.11±0.02

120h

0.92±0.11

1.57±0.08

1.74±0.19

0.65±0.03

0.41±0.02

0.25±0.01

144h

1.28±0.15

2.29±0.02

2.68±0.11

0.97±0.11

0.61±0.04

0.28±0.02

168h

1.27±0.11

2.26±0.14

2.62±0.18

0.98±0.15

0.62±0.09

0.32±0.06

表4：经0-100mg/L的纳米铜处理后，天蓝色链霉菌M145产十一烷基灵菌红素的量(mg/L)

空白

5mg/L

10mg/L

20mg/L

50mg/L

100mg/L

48h

0.72±0.08

0.92±0.07

1.36±0.11

0.44±0.07

0.28±0.06

0.01

72h

1.49±0.12

2.29±0.18

2.73±0.06

0.84±0.12

0.43±0.13

0.41±0.05

96h

1.26±0.08

1.56±0.11

1.99±0.06

0.53±0.09

0.32±0.02

0.22±0.02

120h

0.45±0.07

0.36±0.05

0.99±0.05

0.32±0.05

0.26±0.02

0.21±0.04

由表3可见，随着时间的增加，天蓝色链霉菌M1435产放线紫红素的量逐渐增加，在168小时时逐渐趋于稳定(图2a)，未添加纳米铜的M145产放线紫红素的量为1.28mg/L，而随着纳米铜浓度的升高，M145产量先升高后降低，当浓度为10mg/L时，放线紫红素的产量达到最高，为2.68mg/L，此时的产量为对照的2.1倍。

由表4可见，随着时间的增加，天蓝色链霉菌M145产十一烷基灵菌红素的量是先增加后减少的(图2b)，这是由于十一烷基灵菌红素是一种胞内抗生素，不分泌到胞外，随着细胞后期的死亡，十一烷基灵菌红素也被降解，在72小时时，抗生素的积累量达到最大值，未添加纳米铜的M145产十一烷基灵菌红素的量为1.49mg/L，而随着纳米铜浓度的升高，M145产量先升高后降低，当浓度为10mg/L时，十一烷基灵菌红素的产量可达2.73mg/L，此时的产量为对照的1.8倍。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将天蓝色链霉菌M145涂布至黄豆饼粉(MS)固体培养基上，在30-37℃条件下培养5-7天后，利用棉棒将孢子收集过滤后悬浮于体积百分含量为20％的甘油溶液中，并在-80℃下保藏；

2)将纳米材料加到YBP液体培养基中，超声半小时后121℃灭菌备用；

3)将300-500mL步骤1)得到的天蓝色链霉菌孢子加至步骤2)配制的含有纳米材料的液体培养基中，摇床中培养；

4)利用紫外分光光度计测定法，定时计算步骤3)所述的培养溶液中放线紫红素的浓度C_A和十一烷基灵菌红素的浓度C_R。

2.根据权利要求1所述的利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征在于，步骤1)中所述MS固体培养基的组成及配制方法如下：称取黄豆饼粉20g，加入800mL自来水煮沸半小时后，使用六层纱布过滤除去滤渣，加入20g甘露醇，20g琼脂粉，自来水补至1L，调pH至7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。

3.根据权利要求1所述的利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征在于，步骤2)中所述YBP液体培养基的组成及配制方法如下：称取酵母粉2g，牛肉膏2g，蛋白胨4g，NaCl 15g，葡萄糖10g，MgCl₂ 1g，加入1L蒸馏水溶解，调pH至7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。

4.根据权利要求1至3任一项所述的利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征在于，步骤4)所述溶液中放线紫红素的浓度C_A的计算方法是：

将菌液在4000-6000rpm条件下离心10分钟，倒出上清液并向其中加入等体积的1MNaOH，室温下放置1小时后，在4000rpm条件下离心5分钟，最后利用紫外分光光度计测定其在633nm处的吸光值，记为A_A，通过公式(1)计算溶液中放线紫红素的浓度C_A，

C_A＝A_A/25.32； (1)。

5.根据权利要求1至3任一项所述的利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征在于，步骤4)所述溶液中十一烷基灵菌红素的浓度C_R的计算方法是：

由于十一烷基灵菌红素是一种胞内的红色色素，在测定之前必须将其从胞内提取出来；首先将离心后的细胞悬浮于5mL事先利用0.1M HCl调节至pH为2的甲醛溶液中，在室温条件下震荡过夜，使十一烷基灵菌红素完全从细胞中提取出来；然后4000rpm离心5分钟除去破碎的细胞，利用紫外分光光度计测定在533nm波长下的吸光值，记为A_R，通过公式(2)计算溶液中十一烷基灵菌红素的浓度C_R，

C_R＝A_R/100.5； (2)。

6.根据权利要求1至3任一项所述的利用纳米材料作为添加剂提高链霉菌抗生素产量的方法，其特征在于，所述的纳米材料为纳米金属及金属氧化物。