CN103232964B - 一种高产阿扎霉素f类化合物菌株链霉菌tkpj3039及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039及其应用。链霉菌TKPJ3039保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为链霉菌TKPJ3039Streptomycessp.TKPJ3039，保藏编号为CCTCCNO：M2013221。链霉菌TKPJ3039可用于制备阿扎霉素F类化合物，将其种子液接种到发酵培养基上进行发酵即可获得阿扎霉素F类化合物。若发酵培养基为葡萄糖马铃薯培养基，则阿扎霉素F类化合物的产量可达4.07g/L，与野生链霉菌211726在原始培养基发酵相比，产量提高了近4倍；若发酵培养基为甘油马铃薯培养基，则阿扎霉素F类化合物种类丰富，为11个以上。

Description

一种高产阿扎霉素 F 类化合物菌株链霉菌 TKPJ3039 及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高产阿扎霉素F（Azalomycin F）类化合物菌株链霉菌TKPJ3039及其应用。

背景技术

目前主要从链霉菌属的不同种所产的次级代谢产物中发现阿扎霉素类化合物，文献报道有四种类型，分别为Azalomycin B（阿扎霉素B）、Concanamycins、Bispolides和Azalomycin F，其内酯环碳原子数分别为16、18、20和36元，均显示出广谱的抗真菌、抗细菌和细胞毒活性。

Azalomycin B可由孢链霉菌、吸水链霉菌、白色链霉菌、紫黑链霉菌、假轮枝链霉菌和小小链霉菌合成，具有典型大环内酯类抗生素的抗菌特征，如抗枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、白喉棒状杆菌、破伤风芽孢杆菌的活性，对某些植物的病原菌水稻腐霉菌、一串红小菌核也具有较强的抑制作用；此外还具有抗寄生虫活性，可作为瘤胃动物增长促进剂、免疫抑制剂及用于研究ATPase的类型（严淑玲，2002）。在Streptomyces melanosporofaciens生物制备阿扎霉素B的研究中，一级种子在糊精和水解玉米淀粉作为主要碳源的培养基中生长良好，以大豆油和蔗糖作为碳源使用60L发酵罐装料35kg发酵7天后阿扎霉素B含量为1.2g/kg (M.IKOŠOVÁ etal, 2004)。

Concanamycins A在1981年分离得到，因其可以使细胞酸化瓦解而具有多种生物活性，如抗病毒、免疫抑制的活性以及衰减MDB肿瘤细胞株的耐受性，它也是一种治疗骨质疏松症的潜在药物，第一次由Stille交叉偶联反应全合成制得(Kazunobu Toshima etal, 2002)。

Bispolides 是由Noriyuki Okujo等在马来西亚土壤中分离的Microbispora sp. A34030的培养物中发现，结构鉴定为一类二十元的双内酯化合物，具有较好的抗金黄色葡萄糖球菌的活性(Noriyuki Okujo, 2007)。

阿扎霉素F（Azalomycin F）类，具有抗G+和广谱抗真菌活性，同时还对多种农业病虫害有抑制或杀灭作用。包括Azalomycins F3a、F4a、F5a（Chandra A., Nair A.. Azalomycin F complex from Streptomyces hygroscopicus, MSU/MN-4-75B[J]. J. Antibiotics.1995, 48(8):896-898.）；2-位去甲基的RS-22A、B、C（Ubukata M., Morita T.I., Osada H..RS-22A,B and C: new macrolide antibiotics from Streptomyces violaceusniger Ⅱ. Physico-chemical properties and structure elucidation[J]. J. Antibiotics.1995, 48(4):293-299.）2-位去甲基、28-位甲基取代的Shurimycins A、B(Kumazawa S., Asami Y., Awane k.,et al.. Structure studies of new macrolide antibiotics, Shurimycins A and B[J]. J. Antibiotics.1994, 47(6):688-696.)。杨佩文等从马来西亚链霉菌ECO00002的次级代谢产物分离得到Azalomycin F3和Azalomycin F4，经结构鉴定为36元环的大环内酯化合物，其原药的防效与同等剂量的一线化学农药扑海因、三环唑、茵核净和百菌清对番茄灰霉病、水稻稻瘟病、烟草赤星病及辣椒炭疽病具有的保护作用相当(杨佩文等，2009)。 Gan Jun Yuan等从红树林微生物次级代谢产物化学筛选中分离并鉴定了一类具有36元环的大环内酯化合物Azalomycins F3a、F4a和F5a，具有广谱的抗菌活性，对人的结肠癌细胞HCT-116具有中度细胞毒活性(Gan Jun Yuan etal, 2010)。Ganjun Yuan在2013年又发表了7种具有36元环的Azalomycins F3a、F4a和F5a的酯类同系物(Ganjun Yuan etal, 2013)。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种高产阿扎霉素F类化合物菌株。

本发明的另一目的在于提供上述菌株在制备阿扎霉素F类化合物中的应用。

本发明的再一目的在于提供利用上述菌株制备阿扎霉素F类化合物的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏日期：2013年5月20日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学），其分类命名为链霉菌TKPJ3039 Streptomyces sp. TKPJ3039，保藏编号为CCTCC NO：M2013221。

所述的链霉菌TKPJ3039通过太空诱变得到，具体为：将链霉菌211726（Streptomyces sp. 211726，保藏编号为CCTCC NO：M209153）的孢子送往“神州8号”搭载，返回后制备孢子悬液，分离单菌落，挑取214株菌发酵，检测阿扎霉素类化合物合成量，初筛获得84株正变株，再经过复筛和遗传稳定性测试获得。

所述的链霉菌TKPJ3039具有如下生物学特征：

菌落在YE固体培养基（葡萄糖4g、酵母提取物4g、麦芽提取物10g、琼脂20g，去离子水1L，pH7.2-7.4）上生长呈圆形，四周光滑，中间凹下，白色孢子集中于凸起菌落部分，背面呈米黄色。

所述的链霉菌TKPJ3039具有如下分子生物学特征：16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

上述链霉菌TKPJ3039在制备阿扎霉素F类化合物中的应用。

利用链霉菌TKPJ3039制备阿扎霉素F类化合物的方法，包含如下步骤：将链霉菌TKPJ3039种子液接种到发酵培养基上进行发酵，阿扎霉素F类化合物存在于发酵液中。

所述的发酵培养基优选为葡萄糖马铃薯培养基或甘油马铃薯培养基；其中，葡萄糖马铃薯培养基的配方包含如下配比的成分：葡萄糖10g、酵母提取物9.23g、马铃薯淀粉26.7g，去离子水1L，pH7.2-7.4；甘油马铃薯培养基的配方包含如下配比的成分：甘油10mL、马铃薯淀粉35g、酵母粉6g、去离子水1L，pH调至7.2-7.4。

所述的种子液优选为链霉菌TKPJ3039孢子液接种YE液体培养基（葡萄糖4g、酵母提取物4g、麦芽提取物10g、去离子水1L，pH7.2-7.4）在28℃、220rpm条件下，培养2-3天的菌液。

所述的种子液的量优选为发酵培养基体积的10%。

所述的发酵的条件优选为：培养温度25-30℃，220-240rpm，容器装量1-2/10，发酵周期10-14天。

所述的利用上述链霉菌TKPJ3039制备阿扎霉素F类化合物的方法，还包括阿扎霉素F类化合物的粗提取步骤，具体为：量取一定体积发酵液，等体积加入甲醇，浸提12h，7500rpm×10min离心取上清液，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，用旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯得到阿扎霉素F类化合物的粗提物。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明利用菌株链霉菌TKPJ3039，通过发酵工艺优化，用摇瓶发酵的方式将阿扎霉素F类化合物的产量由链霉菌TKPJ3039在原始培养基发酵的产量2.73g/L与野生链霉菌211726在原始培养基发酵产量1.04g/L相比，提高1.6倍。链霉菌TKPJ3039利用优化后的葡萄糖马铃薯培养基发酵，产量为4.07g/L；与链霉菌TKPJ3039在原始培养基发酵产量2.73g/L相比，提高到1.5倍。利用链霉菌TKPJ3039优化后的甘油马铃薯培养基发酵产阿扎霉素F类化合物种类更丰富。且葡萄糖马铃薯培养基和甘油马铃薯培养基成分简单，成本低。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

阿扎霉素F类（Azalomycin F）化合物的含量检测方法如下：

取等体积甲醇浸提离心后的上清液用0.22μm滤头过滤，用WATERS 2998 HPLC，phenomenex C₁₈（250mm×4.60mm）反相色谱柱，进样20μL，全波长检测，λ=260nm，流速1mL/min，按梯度洗脱（0.00-15.00水:甲醇=95:5，15.00-25.00水:甲醇=70:30，25.00-30.00水:甲醇=0:100，30.00-35.00 水:甲醇=95:5）洗脱35min，t_min=20-35min，用外标法计算Azalomycin产量。外标方程为y=0.1246x+0.0097（y：阿扎霉素浓度g/L，x：峰面积V·s）。通过与标准品的保留时间及特征吸收波长判断Azalomycin F的种类。

实施例1 高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039的获得

将链霉菌211726（保藏编号为CCTCC NO：M209153）的孢子送往“神州8号”搭载，返回后制备孢子悬液，分离单菌落，挑取214株菌发酵，检测阿扎霉素类化合物合成量，初筛获得84株正变株，再经过复筛和遗传稳定性测试获得高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039。

链霉菌TKPJ3039已于2013年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，其分类命名为链霉菌TKPJ3039 Streptomyces sp. TKPJ3039，保藏编号为CCTCC NO：M2013221。

实施例2 链霉菌种子液的制备

将链霉菌的孢子悬浮液接种到YE液体培养基中，在28℃、摇床转速220rpm下培养3天得到种子液；其中，YE液体培养基组成：葡萄糖4g、酵母提取物4g、麦芽提取物10g、去离子水1L，pH7.2-7.4。

实施例3 优化后的葡萄糖马铃薯培养基的配制

称取26.7g马铃薯淀粉于烧杯中，加适量去离子水调匀后加入煮沸的去离子水中，边加边搅拌，溶解至澄清，称取酵母提取物9.23g、葡萄糖10 g，加入澄清的马铃薯淀粉溶液中，加去离子水至1L，在115℃下灭菌30min。

实施例4 链霉菌211726用原始培养基的液体发酵

按10%（体积比）的接种量将种子液接到原始发酵培养基（葡萄糖10g、酵母提取物2g、干酪素4g，去离子水1L，pH7.2-7.4）中，发酵培养基装液量为1/5，接种好的培养基置于28℃、220rpm的摇床中，培养10天。等体积甲醇浸提发酵液12h，离心取上清液过滤，经HPLC检测阿扎霉素F类化合物产量为1.04g/L，三个平行样分别检测到的阿扎霉素F类化合物种类个数分别为7、7、7。

实施例5 链霉菌TKPJ3039在原始发酵培养基中的发酵

按10%（体积比）的接种量将种子液接到原始发酵培养基（葡萄糖10g、酵母提取物2g、干酪素4g，去离子水1L，pH7.2-7.4）中，发酵培养基装液量为1/5，接种好的培养基置于28℃、220rpm的摇床中，培养10天。等体积甲醇浸提发酵液12h，离心取上清液过滤，经HPLC检测阿扎霉素F类化合物产量为2.73g/L。

实施例6 链霉菌TKPJ3039在优化后的葡萄糖马铃薯培养基中的发酵

按10%（体积比）的接种量将种子液接到优化后的葡萄糖马铃薯培养基，发酵培养基装液量为1/10，接种好的培养基置于28℃、240rpm的摇床中，培养10天。等体积甲醇浸提发酵液12h，离心取上清液过滤，经HPLC检测阿扎霉素F类化合物产量为4.07g/L。

实施例7 发酵产物的粗提取

量取2500mL发酵液，阿扎霉素含量1.09g/L，按等体积加入甲醇浸提12h，7500rpm×10min离心取上清液，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，用旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯，制得浸膏。取全部浸膏容至1L溶液，HPLC检测含量为0.22g/L，三个平行样分别检测到4、5、4种阿扎霉素化合物。

实施例8 多种类阿扎霉素F类化合物在甘油马铃薯培养基上合成

按照前述种子液制备方法准备种子液，发酵培养基为已经初步优化的甘油马铃薯培养基，选为甘油10mL、马铃薯淀粉35g、酵母粉6g、去离子水1L，pH调至7.2-7.4，弹簧圈防结球，接种量200mL/1L，25℃，220rpm，发酵12天。三次平行发酵液中检测到阿扎霉素含量为0.81g/L，检测到的化合物个数分别为15、13、11。与原始培养基发酵结果，三次平行检测到阿扎霉素F类化合物的个数为7、7、7相比，甘油马铃薯淀粉培养基发酵产阿扎霉素F类化合物种类更丰富。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一种高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1486

<212> DNA

<213> Streptomyces sp.

<400> 1

gagtttgatc ttggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg 60

atgaaccggt ttcggccggg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc 120

cctgcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatacgac gcgttcccgc 180

atgggatacg cgtggaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt 240

ggtggggtga tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca 300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca 360

atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac 420

ctctttcagc agggaagaag cgcaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540

agagctcgta ggcggcttgt cgcgtcggat gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg 600

cgttcgatac gggcaggcta gagttcggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg 660

aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccgatactga 720

cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacgttggg aactaggtgt gggcgacatt ccacgttgtc cgtgccgcag ctaacgcatt 840

aagttccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc 900

cgcacaagcg gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct 960

tgacatacgc cggaaaaccc tggagacagg gtcccccttg tggtcggtgt acaggtggtg 1020

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtaagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080

cttgttctgt gttgccagca tgcctttcgg ggtgatgggg actcacagga gactgccggg 1140

gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg 1200

cacacgtgct acaatggccg gtacaatgag ctgcgaagcc gtgaggtgga gcgaatctca 1260

aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct 1320

agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacgccgccc 1380

gtcacgtcac gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc caacccttgt ggagggagcc 1440

gtcgaaggtg ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtaac 1486

Claims (8)

1.一种高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039，其特征在于该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其分类命名为链霉菌TKPJ3039Streptomyces sp.TKPJ3039，保藏编号为CCTCC NO：M2013221。

2.权利要求1所述的高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039在制备阿扎霉素F类化合物中的应用。

3.利用权利要求1所述的高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039制备阿扎霉素F类化合物的方法，其特征在于包含如下步骤：将链霉菌TKPJ3039种子液接种到发酵培养基上进行发酵。

4.根据权利要求3所述的制备阿扎霉素F类化合物的方法，其特征在于：所述的发酵培养基为葡萄糖马铃薯培养基或甘油马铃薯培养基；其中，葡萄糖马铃薯培养基的配方包含如下配比的成分：葡萄糖10g、酵母提取物9.23g、马铃薯淀粉26.7g，去离子水1L，pH7.2-7.4；甘油马铃薯培养基的配方包含如下配比的成分：甘油10mL、马铃薯淀粉35g、酵母粉6g、去离子水1L，pH调至7.2-7.4。

5.根据权利要求3所述的制备阿扎霉素F类化合物的方法，其特征在于：所述的种子液为链霉菌TKPJ3039孢子液接种YE液体培养基在28℃、220rpm条件下，培养2-3天的菌液；所述的YE液体培养基为：葡萄糖4g、酵母提取物4g、麦芽提取物10g、去离子水1L，pH7.2-7.4。

6.根据权利要求3所述的制备阿扎霉素F类化合物的方法，其特征在于：所述的种子液的量为发酵培养基体积的10％。

7.根据权利要求3所述的制备阿扎霉素F类化合物的方法，其特征在于：所述的发酵的条件为：培养温度25-30℃，220-240rpm，容器装量1-2/10，发酵周期10-14天。

8.根据权利要求3所述的制备阿扎霉素F类化合物的方法，其特征在于还包括阿扎霉素F类化合物的粗提取步骤，具体为：量取一定体积发酵液，等体积加入甲醇，浸提12h，7500rpm×10min离心取上清液，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，用旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯得到阿扎霉素F类化合物的粗提物。