CN108251339A - 一株乙偶姻高产菌株及其在发酵生产乙偶姻中的应用 - Google Patents

一株乙偶姻高产菌株及其在发酵生产乙偶姻中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株乙偶姻高产菌株及其在发酵生产乙偶姻中的应用，属于生物工程技术领域。本发明的解淀粉芽孢杆菌H‑5，于2017年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017694。本发明的乙偶姻高产菌株H‑5的乙偶姻耐受能力达90g/L。在30L发酵罐上对H‑5进行放大培养，培养时间为52h，乙偶姻产量达到85.24g/L，是目前以微生物发酵法生产乙偶姻的最高产量。

Description

一株乙偶姻高产菌株及其在发酵生产乙偶姻中的应用
技术领域
本发明涉及一株乙偶姻高产菌株及其在发酵生产乙偶姻中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
乙偶姻，化学名为3-羟基-2-丁酮，又名甲基乙酰甲醇，通常单体为无色或淡黄色液体，二聚体为白色结晶状粉末，具有特殊的奶油香气，天然存在可可、干酪、香蕉、葡萄、玉米等许多食品中，是一种广泛使用的食品级香料，在GB2760-2011(食品安全国家标准/食品添加剂使用标准)中被列为允许使用的食品用合成香料。同时，乙偶姻作为一种重要的4碳平台化合物，被美国能源部列为30种优先开发利用的平台化合物之一。特别是手性乙偶姻作为高附加值化学品，可广泛应用于手性药物和化学中间体的合成。
目前，乙偶姻的生产方法主要有化学合成、酶转化和微生物发酵法。传统的化学合成乙偶姻方法主要有丁二酮部分加氯工艺、2,3-丁二醇选择性氧化工艺以及丁酮氯化水解工艺等，这些方法虽操作简便且技术成熟，但目标产品的得率低，且环境污染严重。酶转化法与化学合成法类似，并未能从根本上解决原料短缺问题，从而无法广泛普及。与前两种方法相比，微生物发酵制备乙偶姻大多以糖质为原料，具有高效、环保、可持续等优势，可以减轻资源和环境压力，从而促进我国低碳经济和循环经济的建设，已引起人们广泛关注。
近年来，已报道的非致病性(GRAS)乙偶姻高产菌株多是通过传统诱变(如物理诱变和化学诱变)或简单筛选(VP试验)而获得，利用生物法制备乙偶姻的研究重点大部分集中在以糖类物质为底物的微生物发酵过程，2014年利用B.amyloliquefaciens E-11以葡萄糖为底物采用5L发酵罐发酵生产乙偶姻71.5g/L。由于传统诱变筛选方式得到的菌株积累了很多未知的突变点，有些突变可能会影响菌株的鲁棒性和重组能力，所以通过代谢工程和合成生物学手段改造这些遗传背景清晰的、具有乙偶姻工业化生产潜力的菌株，从而提高乙偶姻的产量和生产力，会成为今后研究者关注的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得乙偶姻高产菌株的复合诱变选育方法、一株高产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌诱变株，以及应用该菌株发酵生产乙偶姻的方法。
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)H-5，于2017年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017694。
本发明的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌H-5在食品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是应用所述解淀粉芽孢杆菌H-5生产乙偶姻。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述解淀粉芽孢杆菌H-5应用于生产食品香料。
本发明的第三个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌H-5在医药中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌H-5发酵生产乙偶姻的方法，所述方法是将菌种接入种子培养基中进行种子培养，35～38℃，180～220rpm培养10～15h；然后将种子培养基以5～15％的接种量接入发酵培养基进行发酵培养；在35～38℃，通气量0.8～1.2vvm，过程中pH维持6～7，搅拌转速分为两阶段调控，发酵前期300～500rpm，发酵后期500～600rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基以g/L计：葡萄糖50～70，酵母粉5～15，大豆蛋白胨5～15，牛肉膏5～15，NaCl 0.1～1。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基以g/L计：葡萄糖150～250，酵母粉10～20，蛋白胨10～20，KH2PO42～5，K2HPO42～5，MgSO4·7H2O 0.2～0.5，CH3COONa 0.3～0.7。
本发明的第五个目的是提供包含所述解淀粉芽孢杆菌H-5的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
本发明的有益效果：
本发明以Bacillus amyloliquefaciens FMME088为出发菌株，通过ARTP和60Coγ射线复合诱变，筛选获得一株高乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌，命名为Bacillusamyloliquefaciens H-5，并验证其乙偶姻耐受能力达90g/L。在30L发酵罐上对H-5进行放大培养，培养时间为52h，乙偶姻产量达到85.24g/L，是目前以微生物发酵法生产乙偶姻的最高产量。
生物材料保藏
解淀粉芽孢杆菌H-5Bacillus amyloliquefaciens H-5，于2017年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2017694。
附图说明
图1为乙偶姻标准曲线；
图2为色谱检测结果，A为1g/L乙偶姻标样，B为56h发酵液；
图3为突变株与出发菌株经液体发酵培养的乙偶姻产量；
图4为突变株Bacillus amyloliquefaciens H-5在30L发酵罐培养的发酵曲线。
具体实施方式
以下是乙偶姻高产菌株的复合诱变选育和用其发酵生产乙偶姻的实施例。
实施例1：
(1)适应性进化：
A、取原始菌株Bacillus amyloliquefaciens FMME088200μL接入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，37℃，200rpm培养12h后接入装有50mL筛选液体培养基(乙偶姻浓度为70g/L)的500mL摇瓶中，37℃，200rpm培养24h后，将菌液4℃，6000rpm，离心5min，所得菌体全部转接乙偶姻浓度为70g/L的筛选液体培养基3次，再取第三次培养24h后的菌液，4℃，6000rpm，离心5min，所得菌体全部转接到装有50mL筛选液体培养基(乙偶姻浓度为80g/L)的500mL摇瓶中，重复转接乙偶姻浓度为80g/L的筛选液体培养基3次。重复此操作，逐步提高培养基中乙偶姻的浓度，分别为85、90、95g/L进行培养。
B、将经过逐级驯化后得到的菌液稀释涂布于筛选固体培养基上(乙偶姻浓度分别为0、40、50、55、60和65g/L)，37℃培养1-3天。
(2)常压室温等离子体(ARTP)诱变
A、制备菌悬液
取上述筛选出的菌株200μL接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，37℃，200rpm培养12h至对数中后期，将菌液4℃，6000rpm，离心5min，弃去培养基，菌体用PBS溶液洗涤3次，再用生理盐水重悬，将菌悬液OD600调至3.0。
B、ARTP诱变处理
取制备好的菌悬液10μL均匀涂抹至已灭菌冷却的小铁片上，并置入ARTP育种机，诱变功率100W，高纯氦气通气量10SLM，处理距离2mm，分别处理0、90、120、150s。
C、后培养
将处理后的小铁片取出，放入装有990μL种子培养基的1.5mL离心管中，用涡旋振荡仪振荡菌体至少100s，使其彻底悬浮于种子培养基中，而后转入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，37℃，200rpm后培养12h。
D、筛选
将后培养菌液分别稀释至10-2和10-3浓度，取100μL涂布于筛选固体培养基(乙偶姻浓度分别为0、40、50、55、60和65g/L)。以ARTP诱变处理0s为对照组。将涂布好的平板置于37℃恒温培养箱中培养1-3天。从含有不同浓度乙偶姻的平板上挑取单菌落，进行摇瓶发酵验证，并挑选乙偶姻生产能力较出发菌株优良的菌株再次进行摇瓶发酵验证，筛选出乙偶姻生产能力最优的一株菌。
(3)60Coγ射线辐照处理
A、制备菌悬液
取上述经ARTP筛选得到的菌株200μL接入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，37℃，200rpm培养12h至对数中后期，将菌液4℃，6000rpm，离心5min，弃去培养基，菌体用PBS溶液洗涤3次，再用生理盐水重悬，将菌悬液OD600调至3.0。
B、60Coγ射线辐照处理
将制备好的菌悬液分置于五支试管中，每管10mL，直接进行γ射线处理，辐照剂量分别为0、0.6、0.8和0.9kGy。
C、筛选
将经辐照处理后的菌悬液分别稀释至10-2和10-3浓度，取100μL涂布于筛选固体培养基(乙偶姻浓度分别为0、40、50、55、60和65g/L)。以辐照剂量0kGy为对照组。将涂布好的平板置于37℃恒温培养箱中培养1-3天。从含有不同浓度乙偶姻的平板上挑取单菌落，进行摇瓶发酵验证，并挑选乙偶姻生产能力较出发菌株优良的菌株再次进行摇瓶发酵验证，培养48h后离心收集发酵液，发酵液经过预处理并采用内标法经高效液相色谱进行定性分析，使得乙偶姻标准品峰高增高的菌株即为产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌。筛选出33株高产乙偶姻的菌株，其中菌株H-5的乙偶姻生产能力最优，已于2017年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2017694。
实施例2
对筛选的菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见下表1、2)：
表1菌落形态特征对比
表2菌株生理生化鉴定结果
实施例3：突变菌株乙偶姻耐受性检测
步骤1：配制培养基
种子培养基以g/L计：葡萄糖60，酵母粉10，大豆蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 0.5；
乙偶姻耐受性验证培养基以g/L计：乙偶姻(0、70、80、85、90、95、100)，葡萄糖20，酵母粉12.5，蛋白胨12.5，KH2PO43，K2HPO43，MgSO4·7H2O 0.4；
固体培养基以g/L计：葡萄糖20，酵母粉10，大豆蛋白胨10，NaCl 5，琼脂粉20。
步骤2：乙偶姻耐受性检验
从冷藏的甘油管中取0.2mL接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中37℃、200rpm振荡培养12h。将种子接入含有70mL乙偶姻耐受性验证培养基的750mL摇瓶中，初始OD600＝1.5，37℃、200rpm振荡培养6h，然后加入乙偶姻，使培养基乙偶姻浓度最终为0、70、80、85、90、95和100g·L-1，6h后取样测指标。
步骤3：菌体存活率的测定
用平板计数法，在无菌操作下把不同条件处理的细胞稀释到OD600＝1，取相同体积的稀释液，5000rpm，离心5min，收集菌体，用相同体积的生理盐水重悬洗涤两次，然后悬浮于生理盐水中，取1mL悬浮液将细胞稀释到10-3、10-4和10-5后，各取0.1mL涂布于固体培养基平板中，37℃培养12h，计算菌落数(每个梯度做三个平行)，乙偶姻浓度为90和95g/L时，菌体存活率分别为10.9％和0.5％。
存活率(％)＝存在乙偶姻的菌落数/对照菌落数×100％。
实施例4：突变菌株H-5摇瓶发酵
步骤1：配制培养基
种子培养基以g/L计：葡萄糖60，酵母粉10，大豆蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 0.5；
发酵培养基以g/L计：葡萄糖180，酵母粉15，蛋白胨15，KH2PO43，K2HPO43，MgSO4·7H2O 0.4；
步骤2：种子制备
50mL种子培养基装于500mL三角瓶中置于115℃灭菌15min。菌株保藏于终浓度为15％的甘油管中，分别取四种菌种(原始菌株、适应性进化所得菌株、ARTP诱变所得菌株以及H-5菌株)200μL保藏菌液接入50mL种子培养基中进行种子培养，37℃，200rpm培养12h。
步骤3：摇瓶发酵培养
种子培养基以10％的接种量接入装有70mL发酵培养基的750mL具挡板三角瓶中进行发酵培养。在37℃，200rpm条件下发酵48h，取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的乙偶姻含量。结果如图3所示，H-5的产量最高，达到69.6g/L。
实施例5：突变菌株H-5发酵罐发酵
步骤1：配制培养基
种子培养基以g/L计：葡萄糖60，酵母粉10，大豆蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 0.5；
发酵培养基以g/L计：葡萄糖200，酵母粉15，蛋白胨15，KH2PO43，K2HPO43，MgSO4·7H2O 0.4，CH3COONa 0.5；
步骤2：种子制备
50mL种子培养基装于500mL三角瓶中置于115℃灭菌15min。菌株保藏于终浓度为15％的甘油管中，取200μL保藏菌液接入50mL种子培养基中进行种子培养，37℃，200rpm培养12h；
步骤3：5L发酵罐发酵培养
5L发酵罐中发酵培养基装液量为2.5L，接种量10％(v/v)，温度为37℃，通气量1.0vvm，过程中pH维持6.5，搅拌转速分为两阶段调控，发酵前期0～36h为350rpm，发酵后期36～56h为500rpm，发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的乙偶姻含量。培养时间52h，产量达到最大为80.4g/L。
实施例6：突变菌株H-5发酵罐发酵
步骤1：同实施例5
步骤2：同实施例5
步骤3：30L发酵罐发酵培养
30L发酵罐中发酵培养基装液量为18L，接种量10％(v/v)，温度为37℃，通气量1.0vvm，过程中pH维持6.5，搅拌转速分为两阶段调控，发酵前期0～40h为450rpm，发酵后期40～60h为600rpm，发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的乙偶姻含量。结果如图4所示，发酵时间52h，产量达到最大为85.0g/L。

Claims (10)

1.一株解淀粉芽孢杆菌H-5，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌H-5于2017年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2017694。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌H-5在食品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是应用所述解淀粉芽孢杆菌H-5生产乙偶姻。
4.根据权利要求2或3任一所述应用，其特征在于，所述应用是将所述解淀粉芽孢杆菌H-5应用于生产食品香料。
5.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌H-5在医药中的应用。
6.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌H-5发酵生产乙偶姻的方法，其特征在于，所述方法是将菌种接入种子培养基中进行种子培养，35～38℃，180～220rpm培养10～15h；然后将种子培养基以5～15％的接种量接入发酵培养基进行发酵培养；在35～38℃，通气量0.8～1.2vvm，过程中pH维持6～7，搅拌转速分为两阶段调控，发酵前期300～500rpm，发酵后期500～600rpm。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养基以g/L计：葡萄糖50～70，酵母粉5～15，大豆蛋白胨5～15，牛肉膏5～15，NaCl 0.1～1。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基以g/L计：葡萄糖150～250，酵母粉10～20，蛋白胨10～20，KH2PO4 2～5，K2HPO4 2～5，MgSO4·7H2O 0.2～0.5，CH3COONa 0.3～0.7。
9.一种包含权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌H-5的微生物菌剂。
10.根据权利要求9所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
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