CN101591630B - 一种耐辐射奇球菌及产生的微生物抗紫外辐射制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)CGMCC No.2960及发酵获得的抗紫外辐射制剂。通过将菌种接种于培养基表面，30℃、48～72h恒温培养，将增殖培养的菌株接种于培养基中，180～200rpm、30℃、24～48h；发酵培养所获得的培养物经4000rpm离心或过滤处理后收集上清液，在40～45℃下真空旋转浓缩到4～5倍；将浓缩液在室温下用乙酸乙酯萃取，将回收的部分利用真空旋转蒸发仪，在40～45℃下进行减压旋转蒸发浓缩获得抗紫外辐射制剂。本发明利用对紫外辐射具有良好抗性的微生物进行抗紫外辐射制剂及相关产品的开发，将在化妆品、医药、食品等行业将具有广泛的应用前景。
Description
发明领域
本发明涉及微生物发酵及其代谢产物领域，特别是涉及一种抗紫外辐射的微生物菌株及其由该菌株发酵产生的抗紫外辐射制剂的技术领域。
背景技术
阳光中的紫外线是200～400nm的电磁波，分为三个波段，长波(UVA，320～400nm)、中波(UVB，280～320nm)与短波(UVC，200～280nm)。其中UVB和UVA可以穿过大气层，能使皮肤晒红、晒黑、晒伤，引发皮肤细胞DNA氧化性损伤、免疫抑制、炎症等，并可导致DNA突变及皮肤癌的发生。
紫外辐射对生物体的损伤作用包括两个部分，一是辐射的直接损伤；二是辐射引起的大量自由基导致的间接损伤。化妆品中加人一定量的防晒剂，能预防减少紫外线对人体的损伤。目前化妆品中使用的防晒剂有紫外线吸收剂和紫外线屏蔽剂，前者对UVA区和UVB区的紫外线有较强的吸收性能，能减少或完全吸收紫外线，成为防晒剂的主要发展方向，特别是天然成分的分离、筛选已经成为医药、化妆品基础研发的热点，具有很高的实际应用价值。
微生物具有多样的生理代谢特征和超强的环境的适应能力，其代谢产物已经成为人类重要的化学品库，是重要功能性化合物的研究与开发基础。近年的研究发现，出于对自然环境的适应性，微生物中存在对紫外辐射具有强抗性的物种，如Moraxella-Acinetobacter(Lewis C.Keller，Thomas L.，Thompson，R.BurtMaxxy.UV Light-Induced Survival Response in a Highly Radiation Resistant Isolateof the Moraxella-Acinetobacter Group+.Applied and Environmental Microbiology.1982，2：424-429.)、Deinococcus frigens、Deinococcus saxicola和Deinococcusmarmoris(Peter Hirsch，Claudia A.Gallikowski，et al.Deinococcus frigens sp.nov.，Deinococcus saxicola sp.nov.，and Deinococcus marmoris sp.nov.，Low Temperatureand Draught-tolerating，UV-resistant Bacteria from Continental Antarctica.Appl.Microbiol.2004，27：636-645.)、Deinococcus yunweiensis(Yu Qin Zhang，Cheng-Hang Sun，Wen-Jun Li，Li-Yan Yu，Jian-Qin Zhou，1Yue-Qin Zhang，Li-Hua Xu，Cheng-Lin Jiang.Deinococcus yunweiensis sp.nov.，a gamma-and UV-radiation-resistant bacterium from China.International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology.2007，57：370-375.)、耐辐射杆菌RR533.2(吕星，邢瑞云，周绪斌，刘琼明，郑晖.一种短杆状耐辐射菌的分离与鉴定.微生物学报.2003，6：301-306.)、Pantoea agglomerans KFS-9(王洪媛，抗UV-B辐射菌Pantoea agglomeransKFS-9的选育及其抗辐射机制的研究.中国海洋大学，2006.)、Pantoeaagglomerans TCa-7(梁晓婷，Pantoea agglomerans TCa-7抗紫外辐射损伤作用的研究.中国海洋大学，2007.)等各类微生物。
近年来对抗辐射微生物研究发现，其代谢产物或是具有紫外辐射吸收作用，或是具有清除氧自由基的功效，或是具有多种医药功能，并对其它生物具有良好的保护作用。如抗紫外菌Pantoea agglomerans KFS-9产生的色素类物质对290～340nm的紫外线辐射具有良好的吸收特性，多糖类物质具有清除氧自由基的功效，且能有效保护UVB辐射下的微生物细胞(王洪媛，江晓路，抗UV-B辐射菌紫外吸收代谢产物分析及其抗辐射辐射活性研究.中国海洋药物杂志.2006，4：1-5.)；在南极强紫外辐射环境中的蓝藻细菌(cyanobacteria)产生的一种可吸收紫外线的特殊脂溶性色素Scytonemi(SinhaRP，Klisch M，GronigerA，et al.Uhraviolet-absorbing/screening substances in cyanobactefia，phytoplanktonand macroalgae[J].J Photochem PhotobiolB：Biol，1998，47(2)：83-88.)、真菌产生一种具有吸收紫外辐射特性的水溶性代谢物(Karentz D，Bosch 1，DunlapWC.Distribution of UV-absorbing compo unds in the Antarctic Iimpet Nacehaconcinna[J].AntarcticJUS，1992，27(5)：121-126.)、以及地衣产生的具有良好辐射吸收特性的多酚类代谢产物(Bachereau F，Asta J.Effects of solar ultravioletradiation at high altitude on the physiology and the biochemistry of a terricolouslichen(Cetraria islandica L.)[J].Symbiosis，1997，23(2-3)：197-201.)等。
微生物作为一种重要的生物资源，其代谢产物已在化妆品、医药、食品等行业得到了广泛的研究并取得了重大的应用。利用对紫外辐射具有良好抗性的微生物进行抗紫外辐射制剂及相关产品的开发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于通过获得抗紫外辐射菌株及通过对获得菌株的发酵培养从而获得具有抗紫外辐射特性的制剂。
本发明通过从新疆地区分离筛选出的一株抗紫外辐射特性的微生物菌株RUV-113，从而获得抗紫外微生物产物产生菌，经微生物菌株的分类与鉴定分析，确定其为耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)。同时，本发明还提供了一种利用本发明提供的菌株，通过发酵培养及提取工艺获得的微生物抗紫外辐射粗制剂。
本发明提供了一株抗紫外辐射菌株RUV-113，命名为Deinococcus sp.，其能够产生抗紫外辐射代谢产物。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2009年3月18日，保藏号是CGMCC No 2960。经微生物学鉴定为耐辐射奇球菌(Deinococcus Radiodurance)，简称耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)。该菌株培养温度10-55℃，最适培养温度30℃。该菌种生长于MM培养基(牛肉膏1.5g、酵母膏3g、蛋白陈5g、葡萄糖10g、琼脂15-20g、蒸馏水1L)表面，经30℃、72h培养，菌落呈橙红色、小、圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、不透明；细胞圆形、呈二联或四联状。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》等对RUV-113菌株进行形态学及生理生化测定，主要生理生化测定结果如下表所示。通过PCR获得RUV-113菌株的16S rDNA/RNA序列，经序列测定及BLAST同源性对比与进化分析，结果表明RUV-113与Deinococcus radiodurans DSM 20539T(Y11332)16SrDNA同源性为97％，确定为耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)。
本发明提供了利用耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)CGMCC No 2960，通过发酵培养及提取工艺获得的微生物抗紫外辐射制剂的方法及制剂。
RUV-113菌株可采用斜面传代培养保存方式或是真空冷冻干燥方法进行长期的保藏。其中斜面培养方式适合于RUV-113生长的固体基础培养基进行培养，30℃、48～72h，待菌落形成橙红色后置于4℃下恒温保藏，3～6个月传代一次。利用真空干燥法进行菌种保藏，在低温或常温下可保藏1年以上。
长期保藏的菌种在发酵培养之前首先在适合于RUV-113生长的固体培养基上进行增殖培养，本发明选择TGY培养基[0.5％(m/v)胰蛋白胨，0.3％(m/v)酵母膏，0.1％(m/v)葡萄糖，1.5％(m/v)琼脂，pH 7.0]，以平板划线法或涂布法接种RUV-113于固体培养基表面，30℃、48～72h恒温培养，同时检测其是否有杂菌污染。将增殖培养的RUV-113接种于TGY液体培养基中，180～200rpm、30℃、24～48h；发酵培养所获得的培养物经4000rpm离心或过滤处理后收集上清液，在40～45℃下真空旋转浓缩到4～5倍；将浓缩液在室温下用1∶1的乙酸乙酯萃取。加入乙酸乙酯后充分混匀，静置，等分层后，回收乙酸乙酯部分。将回收的部分利用真空旋转蒸发仪，在40～45℃下进行减压旋转蒸发浓缩至样品成胶体状物质且体积不再发生变化，此为RUV-113发酵获得的抗紫外辐射代谢产物粗制剂，此粗制剂可利用真空冷冻干燥法获得固体粉制剂。
同时，本发明也可通过利用本发明提供的耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)CGMCC No 2960，通过公知的传统发酵培养及提取工艺技术可获得的微生物抗紫外辐射制剂。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
本发明定向筛选到抗紫外辐射产生菌RUV-113，经鉴定为耐辐射奇球菌(Deinococcus Radiodurance)，经实验证明耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)CGMCC No 2960是一种抗紫外辐射菌株，通过发酵获得的抗紫外辐射代谢产物粗制剂；利用乙酸乙酯或正丁醇提取胞外代谢产物，从而获得具有抗紫外辐射特性的制剂。
附图说明
图1为基于16SrDNA序列的RUV-113菌株同源进行化分析结果；
图2为正丁醇提取物对紫外波长扫描结果；
图3为乙酸乙酯提取物紫外波长扫描结果；
图4为正丁醇提取物清除DPPH自由基特性测定结果；
图5为乙酸乙酯提取清除DPPH自由基特性测定结果；
图6为乙酸乙酯提取物对紫外辐射下大肠杆菌(E.coli)的保护作用，其中，E.coli为未加入乙酸乙酯提取的对照处理样，E-R为加入乙酸乙酯提取物的处理样。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指质量百分比。
实施例一：抗紫外辐射菌株RUV-113的鉴定
通过从新疆马兰地区分离筛选出的一株抗紫外辐射特性的微生物菌株RUV-113，命名为耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)，其能够产生抗紫外辐射代谢产物。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2009年3月18日，保藏号是CGMCC No 2960。经微生物学鉴定为耐辐射奇球菌(Deinococcus)属菌。该菌株培养温度10-55℃，最适培养温度30℃。该菌种生长于MM培养基(牛肉膏1.5g、酵母膏3g、蛋白陈5g、葡萄糖10g、琼脂15-20g、蒸馏水1L)表面，经30℃、72h培养，菌落呈橙红色、小、圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、不透明；细胞圆形、呈二联或四联状。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》等对RUV-113菌株进行形态学及生理生化测定，主要生理生化测定结果如下表所示。通过PCR获得RUV-113菌株的16S rDNA/RNA序列，经序列测定及BLAST同源性对比与进化分析，结果表明RUV-113与Deinococcus radioduransDSM 20539T(Y11332)16SrDNA同源性为97％，确定为耐辐射奇球菌(Deinococcus sp)。比对分析结果参见附图1。RUV-113主要的生理生化特性如下表所示：
注：“+”为阳性反应；“-”为阴生反应。
实施例二：RUV-113发酵获得的抗紫外辐射代谢产物制剂
将耐辐射奇球菌(Deinococcus sp.)CGMCC No 2960在TGY培养基[0.5％(m/v)胰蛋白胨，0.3％(m/v)酵母膏，0.1％(m/v)葡萄糖，1.5％(m/v)琼脂，pH 7.0]，以平板划线法或涂布法接种RUV-113于固体培养基表面，30℃、48～72h恒温培养，同时检测其是否有杂菌污染。将增殖培养的菌株接种于TGY液体培养基中，180～200rpm、30℃、24～48h；发酵培养所获得的培养物经4000rpm离心或过滤处理后收集上清液，在40～45℃下真空旋转浓缩到4～5倍；将浓缩液在室温下用1∶1的乙酸乙酯萃取。加入乙酸乙酯后充分混匀，静置，等分层后，回收乙酸乙酯部分。将回收的部分利用真空旋转蒸发仪，在40～45℃下进行减压旋转蒸发浓缩至样品成胶体状物质且体积不再发生变化，此为RUV-113发酵获得的抗紫外辐射代谢产物粗制剂，此粗制剂可利用真空冷冻干燥法获得固体粉制剂。
实施例三：正丁醇提取物对紫外辐射吸收特性测定
将保藏的RUV-113菌株接种于TGY培养基上进行传代培养，待菌种生长成熟，检测其是否有杂菌污染。确定无杂菌污染的情况下接其接种于TGY液体培养中，30～35℃、150rpm振荡培养48～60h；发酵培养物经4000rpm离心处理，去沉淀，1000ml上清液在40～45℃下减压浓缩5倍，获得的浓缩液用1∶1的正丁醇萃取，4～6h；回收正丁醇组分，在45℃下减压旋转蒸发浓缩至体积不发生改变，此为正丁醇提取物。
浓缩液中加入20ml正丁醇溶解稀释，置于紫外分光光度计下进行220～400nm紫外扫描分析。分析结果参见附图2所示，RUV-113菌株的发酵正丁醇提取物对UVA、UVB、UVC均具有吸收特性。
实施例四：乙酸乙酯提取物对紫外辐射吸收特性测定
将保藏的RUV-113菌株接种于TGY培养基上进行传代培养，待菌种生长成熟，检测其是否有杂菌污染。确定无杂菌污染的情况下接其接种于TGY液体培养中，30～35℃、150rpm振荡培养48～60h；发酵培养物经4000rpm离心处理，去沉淀，上清液在40～45℃下减压浓缩5倍，获得的浓缩液用1∶1的乙酸乙酯萃取，4～6h。回收乙酸乙酯组分，在45℃下减压旋转蒸发浓缩至体积不发生改变，此为乙酸乙酯提取物。
乙酸乙酯提取物中加入20ml正丁醇溶解稀释，置于紫外分光光度计下进行220～400nm紫外扫描分析。分析结果参见附图3所示，RUV-113菌株的发酵乙酸乙酯提取物对UVA、UVB、UVC均具有吸收特性。
实施例五：DPPH法测定正丁醇提取物清除自由基能力。
准确称取DPPH(二苯代苦味酰基)2.5mg，使用甲醇定溶至100ml，即配制成质量浓度25ug/ml DPPH溶液。取上述溶液3.9ml与实施例一中的正丁醇提取物的20ml正丁醇溶解稀释液0.1ml迅速混合反应，并在OD515nm测定5min中变化率。参见附图4所示，在5分钟内，正丁醇提取物对DPPH产生物自由基具有一定的清除能力。
实施例六：DPPH法测定乙酸乙酯提取物清除自由基能力。
准确称取DPPH(二苯代苦味酰基)2.5mg，使用甲醇定溶至100ml，即配制成质量浓度25ug/ml DPPH溶液。取上述溶液3.9ml与实施例二中乙酸乙酯提取物的20ml正丁醇溶解稀释液0.1ml迅速混合反应，并在OD515nm测定5min中变化率。参见附图5所示，5分钟内乙酸乙酯提取物对DPPH产生的自由基具有一定的清除能力。
实施例七：乙酸乙酯提取物对大肠杆菌(E.coli)的辐射保护作用
以大肠杆菌JM109为测试菌株，以液体LB(填加培养基配方)为基础培养基对JM109进行增殖培养24h。4000rpm收集培养物中的菌体，以生理盐水(0.75％NaCL)溶液洗涤菌体两次后再以生理盐水进行悬浮并稀释为OD600为0.2的菌悬液；处理样中加入实施例二中的1％的乙酸乙酯萃取物以20ml生理盐水溶解稀释液，不加的样设为对照。取5mL菌悬液置于9cm培养皿中，放置于15W紫外灯下20cm处，振荡辐照处理，每10min取样进行1次，以平板涂布法检测JM109的存活量。结果参见附图6所示。RUV-113菌株发酵代谢产物乙酸乙酯提取物对紫外辐照下的E.coli JM109具有良好的保护作用。
Claims (2)
1.一种耐辐射奇球菌RUV-113(Deinococcus sp.)CGMCC No.2960。
2.一种利用权利要求1所述的耐辐射奇球菌RUV-113(Deinococcus sp.)CGMCC No.2960发酵获得的抗紫外辐射制剂，其特征在于，将耐辐射奇球菌RUV-113 CGMCC No.2960在TGY培养基：0.5％(m/v)胰蛋白胨，0.3％(m/v)酵母膏，0.1％(m/v)葡萄糖，1.5％(m/v)琼脂，pH 7.0，以平板划线法或涂布法接种RUV-113于固体培养基表面，30℃、48～72h恒温培养，同时检测其是否有杂菌污染；将增殖培养的菌株接种于TGY液体培养基中，180～200rpm、30℃、24～48h；发酵培养所获得的培养物经4000rpm离心或过滤处理后收集上清液，在40～45℃下真空旋转浓缩到4～5倍；将浓缩液在室温下用1∶1的乙酸乙酯萃取；加入乙酸乙酯后充分混匀，静置，等分层后，回收乙酸乙酯部分；将回收的部分利用真空旋转蒸发仪，在40～45℃下进行减压旋转蒸发浓缩至样品成胶体状物质且体积不再发生变化，此为发酵获得的抗紫外辐射代谢产物粗制剂，经真空冷冻干燥法获得固体粉制剂。
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Granted publication date: 20120905 Termination date: 20170630 |