CN111748564B - 经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用 - Google Patents

经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111748564B
CN111748564B CN202010668042.8A CN202010668042A CN111748564B CN 111748564 B CN111748564 B CN 111748564B CN 202010668042 A CN202010668042 A CN 202010668042A CN 111748564 B CN111748564 B CN 111748564B
Authority
CN
China
Prior art keywords
violacein
gene cluster
fermentation
genetically engineered
expression vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010668042.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111748564A (zh
Inventor
张玉阳
陈红萍
牛志远
杨荣迪
李志坤
李艳娇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinxiang Medical University
Original Assignee
Xinxiang Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinxiang Medical University filed Critical Xinxiang Medical University
Priority to CN202010668042.8A priority Critical patent/CN111748564B/zh
Publication of CN111748564A publication Critical patent/CN111748564A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111748564B publication Critical patent/CN111748564B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/165—Heterorings having nitrogen atoms as the only ring heteroatoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用，通过对紫色杆菌素生物合成基因簇的核糖体结合位点进行定点突变和密码子缺失突变改造，促进紫色杆菌素合成蛋白的有效翻译，获得生产潜力显著提高的改造基因簇；通过将上述改造基因簇或者含有改造基因簇的重组载体导入到宿主菌，获得了高产紫色杆菌素的工程菌；进一步对工程菌的发酵条件进行了优化并提供紫色杆菌素的分离纯化方法。本发明构建的基因工程菌株不仅能够显著提高紫色杆菌素的产量，且与常规的紫色杆菌素20℃或25℃低温发酵不同，在25‑37℃的温度条件下均可高效生产紫色杆菌素代谢产物，解决了发酵过程中的降温成本高的问题，适用于规模化生产。

Description

经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、 工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
紫色杆菌素(violacein)是微生物产生的一种代谢产物，属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化缩合而成，具有抗肿瘤、抗病毒、抗金黄色葡萄球菌感染、抗氧化、抗疟疾、调节免疫等良好的生物活性，同时由于其本身的蓝紫色特征，可以作为一种天然色素。因此，紫色杆菌素在医药、保健、化妆品、食品添加剂、杀虫剂、纺织品、玩具等广泛的工业市场中具有潜在的应用价值。
由于紫色杆菌素类化合物具有良好的应用潜力，人们对提高其在发酵液中的产量做了大量的工作。然而，由于原产菌存在低生产率和潜在条件致病性，当前主要将紫色杆菌素生物合成基因簇在实验室常见的模式菌株中进行异源表达,然后进行代谢工程和合成生物学的改造。在这些研究中，普遍采用了几种策略。第一种策略是，尝试不同的表达菌株，如E.coli,C.freundii,E.aerogenes,C.glutamicum。第二种策略是，优化色氨酸前体供应的中心代谢途径，包括色氨酸产生和调控基因的过表达、抑制和降解基因的敲除等。第三种策略是，针对紫色杆菌素合成基因簇进行改造，或者是过表达限速酶，或者是对紫色杆菌素的五个合成基因操纵子进行重新排序。虽然当前基因工程菌的发酵产量已经获得很大提高，但仍不能满足未来工业化生产中对成本的严格要求。为了进一步提高紫色杆菌素的产量，应尝试新的策略并加以应用。
发明内容
本发明的目的是从紫色杆菌素生物合成基因的有效翻译角度，通过对其合成基因相应的核糖体结合位点进行突变改造，提高紫色杆菌素合成基因簇的生产潜力，同时构建出一系列高产紫色杆菌素的基因工程菌株，用于生产应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇。这些经过遗传改造的基因簇是在SEQ ID NO：5所示的紫色杆菌素生物合成相关基因核苷酸序列基础上进行的突变。SEQ ID NO：5是来源于Chromobacterium violaceum(ATCC 12472)的紫色杆菌素生物合成相关基因的核苷酸序列，包含紫色杆菌素整个合成途径中涉及的5个酶相关的vioA，vioB，vioC，vioD，vioE基因。
具体的，所述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇如下：
1)vioBm：是将SEQ ID NO：5所示紫色杆菌素生物合成相关基因中vioB基因的天然核糖体结合位点序列(GGGAAA)被突变为(AAGGAG)；
2)vioCm：是将SEQ ID NO：5所示紫色杆菌素生物合成相关基因中vioC基因的起始密码子“ATG”与vioB基因的终止密码子“TGA”共用“A”碱基，该突变缩短了vioC天然核糖体结合位点“GAGAGG”与其起始密码子“ATG”的距离至4bp；
3)vioDm：是将SEQ ID NO：5所示紫色杆菌素生物合成相关基因中vioC基因3’端的密码子“GTC”发生删除突变，该突变缩短了vioD天然核糖体结合位点“AGGGAG”与其起始密码子“ATG”的距离至6bp；
4)vioEm：是将SEQ ID NO：5所示紫色杆菌素生物合成相关基因中vioE基因的天然核糖体结合位点序列(AGGAGG)被突变为(AAGGAG)；
其中，vioBm、vioCm、vioDm、vioEm的突变位点核苷酸序列如图2所示。
5)vioBEm：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1，是将SEQ ID NO：5所示紫色杆菌素生物合成相关基因中vioB基因的天然核糖体结合位点序列(GGGAAA)被突变为(AAGGAG)，同时vioE基因的天然核糖体结合位点序列(AGGAGG)被突变为(AAGGAG)；
6)vioBCEm：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2，是在SEQ ID NO：1的基础上，进一步将vioC基因的起始密码子“ATG”与vioB基因的终止密码子“TGA”共用“A”碱基，该突变缩短了vioC天然核糖体结合位点“GAGAGG”与其起始密码子“ATG”的距离至4bp；
7)vioBDEm：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3，是在SEQ ID NO：1的基础上，进一步将vioC基因3‘端的密码子“GTC”发生删除突变，该突变缩短了vioD天然核糖体结合位点“AGGGAG”与其起始密码子“ATG”的距离至6bp；
8)vioBCDEm：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4，是在SEQ ID NO：1的基础上，进一步将vioC基因的起始密码子“ATG”与vioB基因的终止密码子“TGA”共用“A”碱基，该突变缩短了vioC天然核糖体结合位点“GAGAGG”与其起始密码子“ATG”的距离至4bp，同时，将vioC基因3‘端的密码子“GTC”发生删除突变，该突变缩短了vioD天然核糖体结合位点“AGGGAG”与其起始密码子“ATG”的距离至6bp；
本发明第二方面提供包含上述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇的重组表达载体。这些重组载体可以通过本领域常规方法将本发明的基因簇核苷酸序列连接于各种载体上构建，所述载体可以是本领域常规的各种载体，如质粒、噬菌体或病毒载体等，优选高拷贝数的pETduet-1。
本发明第三方面提供包含上述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇的基因工程菌，能够用于紫色杆菌素的生产。这些工程菌可以通过将本发明的重组表达载体转化至宿主菌中获得。所述宿主菌可以为本领域常规的各种菌种，能够满足重组表达载体可以稳定自我复制，且所携带的经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇可以有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，进一步的，优选E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21(DE3)(tnaA-)，后者是将E.coliBL21(DE3)基因组中的tnaA基因(SEQ ID NO：6)由卡那霉素抗性基因(SEQID NO：7)替换。
本发明第四方面提供一种生产紫色杆菌素的方法，通过将上述工程菌接种于培养基，发酵获得紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素。所述培养基可以是本领域能够使基因工程菌生长并生产紫色杆菌素的培养基，优选LB液体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％氯化钠)或LB固体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％氯化钠，3％琼脂粉)。发酵条件只要能够使工程菌正常生长并产生紫色杆菌素即可。本发明采取发酵条件：将上述基因工程菌过夜培养的种子按2％接菌量接种于LB液体培养基，220rpm/min,37℃培养至OD600nm＝0.8，然后调至适宜的发酵温度，同时加入IPTG诱导剂，继续连续发酵适当时间。
优选的，所述发酵温度为25℃-37℃；
优选的，所述发酵时间为24-72小时；
优选的，所述培养基中添加浓度为0.01-0.04mM的诱导剂IPTG；
优选的，所述培养基中还可以添加浓度为1-2mM色氨酸前体；
经实验优化得到最佳发酵条件：所述发酵温度为30℃，发酵时间为48h，培养基中添加诱导剂IPTG的浓度为0.02mM，饲喂色氨酸前体的浓度为2mM。
本发明第五方面提供一种纯化分离紫色杆菌素的方法，将通过上述生产紫色杆菌素的方法得到的发酵液收集，12000rpm离心5min，舍弃上清液得到细胞沉淀，用一倍体积甲醇洗涤几次，直到细胞沉淀无色为止；再将洗涤后的甲醇进行真空蒸馏富集，得到紫色杆菌素粗品；
优选的，所述方法还包括用硅胶柱层析法对所得的紫色杆菌素粗品进一步纯化的步骤：将0.2g紫色杆菌素粗品溶解于1ml甲醇，加入到2cm×20cm硅胶柱上，利用500ml乙酸乙酯/石油醚＝9/1进行洗脱，分步收集洗脱液，真空干燥后得到紫色杆菌素；
优选的，所述方法还包括高效液相色谱分离的步骤，条件为：色谱柱：YMC-PackODS-AQ(4.6×250mm，5μm)；流动相A：ddH2O；流动相B：乙腈，含0.5％甲酸；检测波长：UV＝575nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；洗脱程序0-15min，50％-100％B；15-16min，100％B；16-17min，100％-50％B；17-30min，50％B；收集保留时间为7min的洗脱峰，真空干燥后得到99.9％纯度的紫色杆菌素纯品；收集保留时间为10.5min的洗脱峰，真空干燥后得到99.9％纯度脱氧紫色杆菌素纯品。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇，从紫色杆菌素生物合成基因的有效翻译角度，通过对其合成基因相应的核糖体结合位点进行定点突变和密码子的缺失突变改造，提高紫色杆菌素合成基因簇的生产潜力。
本发明通过将上述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇或者含有相应基因簇的重组载体导入到宿主菌，获得高产紫色杆菌素的基因工程菌；并在此基础上对宿主菌进行基因修饰，将E.coli BL21(DE3)基因组中的降解色氨酸的色氨酸酶(tnaA)基因敲除。本发明构建的基因工程菌株不仅能够显著提高紫色杆菌素的产量，而且与常规的紫色杆菌素低温发酵不同(20℃或25℃)，在25-37℃的温度条件下均可高效生产紫色杆菌素代谢产物，其产量并不会随着温度的升高而降低，解决了发酵过程中的降温成本高的问题，适用于规模化生产。
本发明对基因工程菌的发酵条件进行了优化，提供了最适宜的发酵温度、时间、诱导剂浓度以及色氨酸前体的添加量，进一步提高发酵液中紫色杆菌素的产量。本发明提供的紫色杆菌素基因工程菌，可以在固体或液体LB培养基中发酵生产紫色杆菌素，培养基成分简单价格低廉，且突变株BCDEm(tnaA-)的紫色杆菌素产量高达3269.7μM/L。
本发明进一步对发酵液中和紫色杆菌素的分离纯化工艺进行探索，获得不同纯度等级的紫色杆菌素产品；通过高效液相色谱将紫色杆菌素与脱氧紫色杆菌素分离，分别得到紫色杆菌素与脱氧紫色杆菌素纯度高达99.9％的纯品，为后续的工业化生产或科学研究奠定基础。
附图说明
图1是紫色杆菌素生物合成基因簇的表达质粒Vio12472的结构示意图；
图2是Bm，Cm，Dm，Em菌株中对应于vioBm，vioCm，vioDm，vioEm的RBS突变测序结果图；
图3是Vio12472/E.coli BL21(DE3)，Bm，Cm，Dm，Em，BEm，BCEm，BDEm的平板培养表型图；
图4是宿主菌E.coli BL21(DE3)(tnaA-)的构建与扩增验证结果图；
图5是紫色杆菌素、脱氧紫色杆菌素标品及Vio12472/E.coli BL21(DE3)发酵产物的液相检测(UV575nm)结果图；
图6是紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的标准曲线图；
图7是Vio12472/E.coli BL21(DE3)，Bm，Cm，Dm，Em，BEm，BCEm，BDEm，BCDEm菌株的发酵产量图；
图8是BCDEm菌株的发酵温度优化结果图；
图9是BCDEm菌株的诱导剂IPTG添加量优化结果图；
图10是BCDEm菌株的诱导发酵时间优化结果图；
图11是Vio12472/E.coli BL21(DE3)(tnaA-)和BCDEm(tnaA-)两株菌的过量色氨酸前体喂养发酵结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：野生型紫色杆菌素生物合成基因簇(vioABCDE)的获得
利用上海生工生物公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒对Chromobacteriumviolaceum(ATCC 12472)的基因组DNA进行分离，获得紫色杆菌素基因簇克隆的PCR扩增模板；随后利用引物对Vio-pETduet-PF/PR，通过Takara公司生产的高保真酶Prime
Figure BDA0002581166060000041
GXL DNA polymerase扩增得到7325bp的vioABCDE(SEQ ID NO：5)。
实施例2：重组表达载体Vio12472的构建
利用南京Vazyme公司的重组克隆试剂盒，将vioABCDE操纵子(7325bp)重组构建到pETduet-1表达载体的KpnI位点。测序验证后形成的质粒命名为Vio12472(如图1)。
实施例3：重组表达载体Vio12472-vioB-RBSm、Vio12472-vioC-RBSm、Vio12472-vioD-RBSm、Vio12472-vioE-RBSm的构建
(1)以实施例2获得的野生型质粒Vio12472为模板，利用引物对vioB-RBSm-PF/PR采用反向PCR扩增技术在紫色杆菌素生物合成基因簇中vioB基因的核糖体结合位点引入定点突变。PCR产物先用DpnI酶在37℃下孵育1h，消除PCR模板，然后将酶解产物转化E.coliDH5α化学感受态细胞，涂布Amp抗性LB平板。
(2)平板置于恒温箱，经37℃培养过夜后产生新转化子，平行挑取3个转化子进行DNA测序验证。
(3)对测序正确的转化子，采用常规的质粒提取方法得到相应突变质粒Vio12472-vioB-RBSm。
按照与Vio12472-vioB-RBSm相似的构建流程，分别利用引物对vioC-RBSm-PF/PR，vioD-RBSm-PF/PR，vioE-RBSm-PF/PR构建得到Vio12472-vioC-RBSm、Vio12472-vioD-RBSm、Vio12472-vioE-RBSm。
实施例4：重组表达载体Vio12472-vioBE-RBSm的构建
以Vio12472-vioB-RBSm质粒为PCR扩增模板，利用vioE-RBSm-PF/PR引物对构建得到Vio12472-vioBE-RBSm质粒，具体操作步骤同实施例3。
重组表达载体Vio12472-vioBE-RBSm中包含经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇vioBEm，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例5：重组表达载体Vio12472-vioBCE-RBSm的构建
以实施例3获得的Vio12472-vioB-RBSm质粒为PCR扩增模板，首先利用vioC-RBSm-PF/PR引物对构建得到Vio12472-vioBC-RBSm质粒；然后以后者为模板，利用vioE-RBSm-PF/PR引物对构建得到Vio12472-vioBCE-RBSm质粒，具体操作步骤同实施例3。
重组表达载体Vio12472-vioBCE-RBSm中包含经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇vioBCEm，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例6：重组表达载体Vio12472-vioBDE-RBSm的构建
以实施例3获得的Vio12472-vioB-RBSm质粒为PCR扩增模板，首先利用vioD-RBSm-PF/PR引物对构建得到Vio12472-vioBD-RBSm质粒；然后以后者为模板，利用vioE-RBSm-PF/PR引物对构建得到Vio12472-vioBDE-RBSm质粒，具体操作步骤同实施例3。
重组表达载体Vio12472-vioBDE-RBSm中包含经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇vioBDEm，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例7：重组表达载体Vio12472-vioBCDE-RBSm的构建
以实施例3获得的Vio12472-vioC-RBSm质粒为PCR扩增模板，首先利用vioD-RBSm-PF/PR引物对构建得到Vio12472-vioCD-RBSm质粒；然后以后者为模板，利用vioE-RBSm-PF/PR引物对构建得到Vio12472-vioCDE-RBSm质粒；然后以Vio12472-vioCDE-RBSm质粒为模板，利用vioB-RBSm-PF/PR引物对构建得到Vio12472-vioBCDE-RBSm质粒，具体操作步骤同实施例3。
重组表达载体Vio12472-vioBCDE-RBSm中包含经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇vioBCDEm，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
实施例8：基因工程菌Bm、Cm、Dm、Em、BEm、BCEm、BDEm和BCDEm的构建
将实施例3-7所获得的重组表达载体Vio12472-vioB-RBSm、Vio12472-vioC-RBSm、Vio12472-vioD-RBSm、Vio12472-vioE-RBSm、Vio12472-vioBE-RBSm、Vio12472-vioBCE-RBSm、Vio12472-vioBDE-RBSm以及Vio12472-vioBCDE-RBSm分别转化大肠杆菌，获得高产紫色杆菌素基因工程菌，步骤如下：
(1)以上质粒分别取2-3μL与100μLE.coli BL21(DE3)化学感受态混合，冰浴30min后，迅速置于42℃，90s，然后再次冰浴5min；
(2)在以上孵育细胞中添加900μL新鲜LB培养基，置于37℃摇床恢复培养1h；
(3)将以上恢复培养过的菌液，取200-300μL涂布Amp抗性LB固体平板，在超净工作台中晾干后，转入37℃培养12-16h；
(4)经培养长出的转化子单克隆即使所需菌株，作为发酵使用。
Bm，Cm，Dm，Em菌株中对应于vioBm，vioCm，vioDm，vioEm的RBS突变测序结果图2所示，Vio12472/E.coli BL21(DE3)，Bm，Cm，Dm，Em，BEm，BCEm，BDEm的平板培养表型如图3所示。
实施例9：宿主菌E.coli BL21(DE3)(tnaA-)的构建
(1)从大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA中分别扩增出上臂片段790bp(tnaA-KO-us-PF/PR引物对)和下游片段732bp(tnaA-KO-ds-PF/PR)，同时利用引物对tnaA-KO-PF/PR从质粒pJTU4659扩增出含有卡那霉素(Kanamycin，Kan)抗性基因的中臂片段1303bp；然后采用重叠延伸PCR技术将上、中、下臂三个DNA片段拼接到一起，得到一个人工的长片段，具体实验步骤如下：1)利用上海生工细菌基因组提取试剂盒得到大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA，作为下一步扩增的模板；2)分别利用tnaA-KO-us-PF/PR引物对和tnaA-KO-ds-PF/PR引物对扩增上下游片段；3)以实验室保存的质粒pJTU4659为模板，利用tnaA-KO-PF/PR引物对扩增得到卡那霉素抗性基因片段；4)利用重叠延伸PCR技术(95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，总共30个循环)和tanA-KO-us-PF/tnaA-KO-ds-PR引物对，将以上三个DNA片段拼接成一个长片段。
(2)将以上长片段和λ-red辅助质粒pKOBEG(阿泊拉霉素抗性，Apramycin)一起电转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，其中电穿孔采用微脉冲电穿孔器(Bio-Rad)和电穿孔槽(0.1cm电极间隙宽度)在1.8KV和4.6ms条件下进行，转化后的菌液涂布Kan抗性LB平板。
(3)以上培养物经37℃培养过夜后，在Kan抗性固体板上形成转化子菌落，平行挑取3个菌落首先用引物对tnaA-KOV-PF/PR进行PCR扩增验证，对于未敲除tnaA基因的大肠杆菌菌BL21(DE3)的扩增条带大小是2277bp，对于Kan抗性基因插入的tnaA突变株的扩增条带大小是2944bp，对于突变株随后采用DNA测序验证为正确突变。
该突变菌株的构建流程与验证结果见图4。
实施例10：基因工程菌BCDEm(tnaA-)Vio12472/E.coli BL21(DE3)(tnaA-)的构建
将实施例7构建的Vio12472-vioBCDE-RBSm质粒转化E.coli BL21(DE3)(tnaA-)的化学感受态细胞，得到本发明中的生产紫色杆菌素的大肠杆菌基因工程菌BCDEm(tnaA-)，具体转化步骤同实施例8。
实施例11：发酵生产紫色杆菌素
(1)Vio12472/E.coli BL21(DE3)，Bm，Cm，Dm，Em，BEm，BCEm，BDEm，BCDEm在相同培养条件下的摇瓶发酵：野生型菌和突变体的培养均在250ml摇瓶中进行，添加50mlLB培养液(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L氯化钠，pH 7.0)，发酵流程为：过夜培养的种子按2％接菌量接种，220rpm/min，37℃培养至OD600nm＝0.8，然后培养温度调至25℃，同时加入0.1mMIPTG诱导剂，继续连续发酵24h，对发酵产生的紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素进行测定。
(2)紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的定量分析：为了准确定量菌株的发酵产量，根据HPLC中浓度与峰面积的相关性(图5)，分别制作了紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的标准曲线(图6)。分别采用五个不同浓度(50、100、250、500、1000μM/L)的标准品进行HPLC分析。进样量是20μL。制样过程如下:1)首先,对200μL发酵菌液在12000rpm下离心1min，上清液丢弃；2)其次,紫色细胞沉积物利用200μL甲醇洗了三次,直到变成无色；3)甲醇洗涤液合并均匀,经12000rpm离心5min后，取20μL上层清液注入高效液相进行分析检测。注：每组样品三个平行，结果取平均数。
根据标准曲线对对各菌株发酵液中的紫色杆菌素进行定量分析，结果如图7所示，基因工程菌Bm、Cm、Dm、Em的紫色杆菌素产量相对于野生型菌株Vio12472/E.coli BL21(DE3)的提高有限，但基因工程菌BEm的紫色杆菌素产量达到1016.3μM/L，是野生型菌株的2.21倍，由此可知，紫色杆菌素生物合成相关基因中vioB基因的天然核糖体结合位点序列以及vioC基因的天然核糖体结合位点序列的联合突变具有协同作用，这可能与VioB和VioE是紫色杆菌素生物合成的限速酶相关。基因工程菌BEm、BCEm、BDEm、BCDEm的紫色杆菌素产量相对于野生型均值均极显著提高，其中，最高产菌株BCDEm在没有优化发酵条件之前，紫色杆菌素产量已经达到野生型出发菌株Vio12472/E.coli BL21(DE3)的2.41倍。本发明突破了紫色杆菌素合成的限速瓶颈，使得紫色杆菌素的产量大大提高。
实施例12：紫色杆菌素发酵条件优化
(1)本实施例采用单因素法，以BCDEm菌株为例，对关键发酵参数(培养温度，IPTG诱导剂浓度，诱导发酵时间)进行了优化。
首先对温度参数进行了优化，选取了16℃、20℃、25℃、30℃、37℃等五个温度条件，结果表明发酵温度为25℃-37℃时紫色杆菌素产量较高，其中30℃对于紫色杆菌素的生产最有利，结果如图8。然后对IPTG诱导剂浓度进行了优化，选取了0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mM等不同浓度，结果表明诱导剂IPTG浓度0.01-0.04mM时紫色杆菌素产量较高，其中0.02mM条件下紫色杆菌素的总产量最高，结果如图9。最后对诱导发酵时间进行了优化，连续检测24h～192h时间段内紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的产量变化，表明发酵时间为24-72小时紫色杆菌素产量较高，其中48h时产量最高，结果如图10。在在最优发酵条件下，即发酵温度为30℃，发酵时间为48h，培养基中添加诱导剂IPTG的浓度为0.02mM时，BCDEm菌株的紫色杆菌素总产量达到2382.6μM/L。
(2)在前面优化的最优发酵条件下，本发明针对Vio12472/E.coli BL21(DE3)(tnaA-)和BCDEm(tnaA-)两株菌，利用不同浓度的色氨酸前体(0、1、2、4、6、8、10mM)，比较了它们之间产生紫色杆菌素的差异。操作方法为：过夜培养的种子按2％接菌量接种，220rpm/min,37℃培养至OD600nm＝0.8，然后培养温度调至30℃，加入0.02mM IPTG诱导剂，同时分别添加终浓度为(0、1、2、4、6、8、10mM)的色氨酸前体物质，继续连续发酵48h。按实施例8中的定量方法，对各生产菌株中的紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素成分进行定量分析，表明在2mM色氨酸饲喂条件下，突变株BCDEm(tnaA-)的紫色杆菌素产量最高，达到3269.7μM/L，同时野生型Vio12472/E.coli BL21(DE3)(tnaA-)的紫色杆菌素也达到最高，为2284.0μM/L，如附图11。
实施例13：紫色杆菌素的分离纯化
(1)紫色杆菌素粗品的制备：
由于紫色杆菌素在水中的溶解度较差，这些产物在细胞排出后会紧紧地附着在产生菌的表面。因此，将发酵液收集，首先用12000rpm离心5min得到细胞沉淀(上清舍去)，用一倍体积甲醇洗涤几次，直到细胞沉淀无色为止；再将洗涤后的甲醇进行真空蒸馏富集，得到紫色杆菌素粗品。
(2)硅胶柱层析：
将0.2g紫色杆菌素粗品溶解于1ml甲醇，加入到2cm×20cm硅胶柱上，利用500ml乙酸乙酯/石油醚＝9/1进行洗脱，分步收集洗脱液，真空干燥后得到紫色杆菌素；
(3)高效液相色谱分离：
将硅胶柱层析后得到的产物进行高效液相色谱分离，条件为：色谱柱：YMC-PackODS-AQ(4.6×250mm，5μm)；流动相A：ddH2O；流动相B：乙腈，含0.5％甲酸；检测波长：UV＝575nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；洗脱程序0-15min，50％-100％B；15-16min，100％B；16-17min，100％-50％B；17-30min，50％B；收集保留时间为7min的洗脱峰，真空干燥后得到99.9％纯度的紫色杆菌素纯品；收集保留时间为10.5min的洗脱峰，真空干燥后得到99.9％纯度的脱氧紫色杆菌素纯品。
表1:本发明中用到的引物序列汇总
Figure BDA0002581166060000091
Figure BDA0002581166060000101
Figure BDA0002581166060000111
Figure BDA0002581166060000121
Figure BDA0002581166060000131
Figure BDA0002581166060000141
Figure BDA0002581166060000151
Figure BDA0002581166060000161
Figure BDA0002581166060000171
Figure BDA0002581166060000181
Figure BDA0002581166060000191
Figure BDA0002581166060000201
Figure BDA0002581166060000211
Figure BDA0002581166060000221
Figure BDA0002581166060000231
Figure BDA0002581166060000241
Figure BDA0002581166060000251

Claims (15)

1.一种经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
2.含有如权利要求1所述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇的重组表达载体。
3.构建权利要求2所述的重组表达载体的方法，其特征在于，是将权利要求1所述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇连接于载体上。
4.含有如权利要求1所述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇或如权利要求2所述的重组表达载体的基因工程菌。
5.构建如权利要求4所述的基因工程菌的方法，其特征在于，是将权利要求2所述的重组表达载体导入宿主菌，获得高产紫色杆菌素基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的构建基因工程菌的方法，其特征在于，所述宿主菌为E.coliBL21(DE3) (tnaA - )，是将序列如SEQ ID NO：6所示的E.coli BL21(DE3)基因组中的tnaA基因由序列如SEQ ID NO：7所示的卡那霉素抗性基因替换。
7.一种生产紫色杆菌素的方法，是将权利要求4所述的基因工程菌接种到含有碳源的培养基中发酵生产紫色杆菌素。
8.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法，其特征在于，所述培养基为LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%氯化钠；或LB固体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%氯化钠，3%琼脂粉。
9.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法，其特征在于，发酵温度为25℃-37℃；发酵时间为24-72小时。
10.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法，其特征在于：培养基中还添加诱导剂IPTG，其浓度为0.01-0.04mM。
11.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法，其特征在于：培养基中还添加色氨酸前体，其浓度为1-2mM。
12.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法，其特征在于：发酵温度为30℃，发酵时间为48h，培养基中还添加诱导剂IPTG和色氨酸前体，培养基中添加诱导剂IPTG的浓度为0.02mM，饲喂色氨酸前体的浓度为2mM。
13.一种分离纯化紫色杆菌素的方法，是将根据权利要求7-9任一项所述的生产紫色杆菌素的方法得到的发酵液收集，12000rpm离心5min，舍弃上清液得到细胞沉淀，用一倍体积甲醇洗涤3次，直到细胞沉淀无色为止；再将洗涤后的甲醇进行真空蒸馏富集，得到紫色杆菌素粗品。
14.根据权利要求13所述的分离纯化紫色杆菌素的方法，其特征在于：所述方法还包括用硅胶柱层析法对所得的紫色杆菌素粗品进一步纯化的步骤：将0.2 g紫色杆菌素粗品溶解于1ml甲醇，加入到2 cm×20 cm硅胶柱上，利用500 ml乙酸乙酯/石油醚=9/1进行洗脱，分步收集洗脱液，真空干燥后得到紫色杆菌素。
15.根据权利要求14所述的分离纯化紫色杆菌素的方法，其特征在于：所述方法还包括高效液相色谱分离的步骤，条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ，4.6×250mm，5μm；流动相A：ddH2O；流动相 B：乙腈，含0.5%甲酸；检测波长：UV=575nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；洗脱程序0-15min，50%-100%B；15-16min，100% B；16-17min，100% -50%B；17-30min，50% B；收集保留时间为7min的洗脱峰，真空干燥，得到99.9%纯度的紫色杆菌素纯品；收集保留时间为10.5min的洗脱峰，真空干燥，得到99.9%纯度的脱氧紫色杆菌素纯品。
CN202010668042.8A 2020-07-13 2020-07-13 经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用 Active CN111748564B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010668042.8A CN111748564B (zh) 2020-07-13 2020-07-13 经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010668042.8A CN111748564B (zh) 2020-07-13 2020-07-13 经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111748564A CN111748564A (zh) 2020-10-09
CN111748564B true CN111748564B (zh) 2022-07-22

Family

ID=72710514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010668042.8A Active CN111748564B (zh) 2020-07-13 2020-07-13 经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111748564B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195129B (zh) * 2020-10-22 2023-01-31 南京师范大学 紫色杆菌素生物合成基因簇及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101386834A (zh) * 2008-10-28 2009-03-18 清华大学 生产紫色杆菌素的方法及重组菌
CN101659698A (zh) * 2008-08-26 2010-03-03 清华大学 紫色杆菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用
CN102703367A (zh) * 2011-03-28 2012-10-03 清华大学 一种制备紫色杆菌素的方法及其专用菌
CN104694448A (zh) * 2013-12-06 2015-06-10 清华大学 一种生产紫色杆菌素的工程菌及其应用
CN107365779A (zh) * 2017-08-22 2017-11-21 中国科学院天津工业生物技术研究所 利用谷氨酸棒状杆菌生产紫色杆菌素的方法
CN112195129A (zh) * 2020-10-22 2021-01-08 南京师范大学 紫色杆菌素生物合成基因簇及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5632370B2 (ja) * 2008-07-11 2014-11-26 ツィンファ ユニバーシティ デオキシビオラセインを産生する組み換え細菌及びその使用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101659698A (zh) * 2008-08-26 2010-03-03 清华大学 紫色杆菌素合成相关蛋白质系统及其编码基因簇与应用
CN101386834A (zh) * 2008-10-28 2009-03-18 清华大学 生产紫色杆菌素的方法及重组菌
CN102703367A (zh) * 2011-03-28 2012-10-03 清华大学 一种制备紫色杆菌素的方法及其专用菌
CN104694448A (zh) * 2013-12-06 2015-06-10 清华大学 一种生产紫色杆菌素的工程菌及其应用
CN107365779A (zh) * 2017-08-22 2017-11-21 中国科学院天津工业生物技术研究所 利用谷氨酸棒状杆菌生产紫色杆菌素的方法
CN112195129A (zh) * 2020-10-22 2021-01-08 南京师范大学 紫色杆菌素生物合成基因簇及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Direct RBS Engineering of the biosynthetic gene cluster for efcient productivity of violaceins in E. coli";Yuyang Zhang et al.;《Microbial Cell Factories》;20210208;第20卷(第38期);第1-13页 *
"Genetic control of violacein biosynthesis to enable a pigment-based whole-cell lead biosensor";Chang-ye Hui et al.;《RSC Advances》;20200728;第10卷;第28106-28113页 *
"紫色杆菌素研究与开发进展";李红等;《肇庆学院学报》;20150331;第36卷(第2期);第44-48页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111748564A (zh) 2020-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110241061B (zh) 提高短乳杆菌γ-氨基丁酸合成能力的方法及其应用
WO2014121724A1 (zh) 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
JP7475434B2 (ja) Ｌ－トリプトファン産生効率を向上させるトランスポーター遺伝子の大腸菌における使用
CN110055204B (zh) 一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用
CN109777763B (zh) 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
WO2015000327A1 (zh) 厦门霉素生物合成基因簇、用途及菌株
CN111748564B (zh) 经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇、重组表达载体、工程菌及其应用
CN109456987B (zh) 高产l-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用
CN111117942B (zh) 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用
US20210324391A1 (en) Recombinant microorganism, preparation method therefor and application thereof in producing coenzyme q10
CN116024150A (zh) 一种生产乙偶姻基因工程菌株及其构建方法与应用
CN114774341A (zh) 一种生产乳清酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN116970622A (zh) 稳定遗传筛选元件及其构建方法和应用
CN114672525A (zh) N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用
WO2024114637A1 (zh) 生产阿卡波糖的工程菌及其构建方法和应用
CN117106836B (zh) 磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用
CN115716868B (zh) 转录因子MrPigB突变体及其应用
CN111154706B (zh) L-色氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN117363553B (zh) 一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用
CN114107342B (zh) 一种去除发酵液中乳糖的方法
CN115125179B (zh) 产雷帕霉素的基因工程菌及其应用
CN118165905A (zh) 一株产l-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
US20150247174A1 (en) Engineering bacteria for producing dl-alanine and method for producing dl-alanine by using engineering bacteria
CN118064345A (zh) 一种从头合成靛蓝的重组大肠杆菌的构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant