CN108070546A - 产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产3‑羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用，尤其是涉及包含丙酰辅酶A脱氢酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因和丙二酰辅酶A还原酶基因的重组大肠杆菌，以及利用所述重组大肠杆菌以葡萄糖和丙酸为底物生产3‑羟基丙酸方法，和所述重组大肠杆菌在生产3‑羟基丙酸中的用途。

Description

产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌，以及利用该重组大肠杆菌生产3-羟基丙酸的方法和用途。
背景技术
3-羟基丙酸(缩写为3-HP)具有羧基和羟基两种官能团，与乳酸互为同分异构体，但是和乳酸相比，3-羟基丙酸的化学性质更为活泼。3-羟基丙酸作为一种重要的平台化合物，具有很多用途，例如，作为很多光学活性物质的前体，用于医药、农药、表面活性剂的生产，其中在医药方面可用于抗癌药环磷酰胺、心可安、泛酸、泛醇以及许多新药的合成中。同时，3-羟基丙酸也是合成丙烯酸、丁二酸、1,3-丙二醇以及特种聚酯等的原料。
生物法制备3-羟基丙酸由于其副产物少、环境友好且产物易分离等优势而备受关注。野生菌和基因工程菌都可以用于生物法生产3-羟基丙酸，它们的代表性例子包括假丝酵母、基因工程大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等等。基因工程菌相比于野生菌具有生长迅速、基因背景清晰、副产物较少等优点。
用于生物法生产3-羟基丙酸的底物可以采用丙酸、丙烯酸、甘油、葡萄糖等等。用甘油作为底物生产3-羟基丙酸的产量比较可观，但是这种方法存在的一个弊端是在菌体代谢过程中需要添加价格昂贵的B12作为辅酶，这使得生产成本较高。以葡萄糖为底物生产3-羟基丙酸时原料成本低，但是，3-羟基丙酸的产量相对较低。
发明内容
本发明提供了一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌，利用该重组大肠杆菌可以同时以葡萄糖和丙酸为底物高效低成本地制备3-羟基丙酸。
因此，本发明的一个方面提供了一种包含丙酰辅酶A脱氢酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因和丙二酰辅酶A还原酶基因的重组大肠杆菌。
本发明的重组大肠杆菌还可以包含丙酸辅酶A转移酶基因、3-羟基丙酰辅酶A脱氢酶基因。
本发明的另一方面提供了利用本发明的重组大肠杆菌生产3-羟基丙酸的方法，其中以葡萄糖和丙酸为底物。
本发明的再一方面提供了本发明的重组大肠杆菌在生产3-羟基丙酸中的用途。
具体实施方式
本申请的发明人发现通过在作为宿主菌的重组大肠杆菌中引入丙酰辅酶A脱氢酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因和丙二酰辅酶A还原酶基因，也就是说，重组菌株不仅可以进行以丙酸为底物生产3-羟基丙酸的代谢途径，而且可以进行以葡萄糖为底物生产3-羟基丙酸的代谢途径，当同时以丙酸和葡萄糖为底物时，3-羟基丙酸产量远远大于单独以丙酸为底物时或者单独以葡萄糖为底物时的3-羟基丙酸产量。
上述重组大肠杆菌的制备方法如下：
(1)利用RT-PCR技术从皱褶假丝酵母mRNA中扩增出如SEQ ID NO.1所示含1329个碱基对的丙酰辅酶A脱氢酶基因pacd，将其插入表达载体pACYCDuet-1中，得到重组质粒pACYCDuet-pacd。将所得重组质粒转化E.coli JM109(DE3)，通过含氯霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌E.coliJM109(DE3)/pACYCDuet-pacd。
(2)获取包含如SEQ ID NO.2所示含6638个碱基对的乙酰辅酶A羧化酶基因acc的重组质粒pCS11(根据以下文献获得：Weatherly S C,Volrath S L,Elich T D.Expressionand characterization of recombinant fungal acetyl-CoA carboxylase andisolation of a soraphen-binding domain.Biochemical Journal,2004,380(1):105-110.)。利用PCR技术从橙色绿屈挠菌基因组中扩增出如SEQ ID NO.3所示含3660个碱基对的丙二酰辅酶A还原酶基因mcr，将其插入到表达载体pET-28a中，得到重组质粒pET28-mcr。将重组质粒pET28-mcr和表达载体pBAD18用XbaⅠ和HindⅢ双酶切后连接，得到重组质粒pBAD18-mcr。将重组质粒pCS11和重组质粒pBAD18-mcr转化E.coli JM109(DE3)，筛选获得重组大肠杆菌E.coli JM109(DE3)/pCS11/pBAD18-mcr。
(3)将重组质粒pACYCDuet-pacd转入重组大肠杆菌E.coli JM109(DE3)/pCS11/pBAD18-mcr中，得到本发明的重组大肠杆菌E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr。
也可以进行以下操作中的任一种：
(a)利用PCR技术扩增来自埃氏巨球菌(ATCC 17753)基因组DNA的如SEQ ID NO.4所示含1554个碱基对的丙酸辅酶A转移酶(PCT)基因pct，将其插入表达载体pET-28a中，得到重组质粒pET28-pct。利用PCR技术扩增来自橙色绿曲挠菌(ATCC 29365)基因组DNA的如SEQ ID NO.5所示含945个碱基对的3-羟基丙酰辅酶A脱氢酶(HPCD)基因hpcd，将其插入到重组载体pET28-pct的多克隆位点，得到重组质粒pET28-pct-hpcd。将所得重组质粒pET28-pct-hpcd转化E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd，筛选获得重组大肠杆菌E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pET28-pct-hpcd。
(b)利用如SEQ ID NO.6所示含70个碱基对的引物YgfH-FP和如SEQ ID NO.7所示含70个碱基对的引物YgfH-RP，采用文献(Datsenko KA,Wanner BL.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci U S A.2000；97(12):6640-5.)的方法，对大肠杆菌JM109(DE3)的丙酰辅酶A:琥珀酰辅酶A转移酶(YgfH)基因进行了敲除，获得了JM109(DE3)-ΔYgfH宿主菌。利用如SEQ ID NO.8所示含71个碱基对的引物PrpC-FP和如SEQ ID NO.9所示含70个碱基对的引物PrpC-RP，采用文献(Datsenko KA,Wanner BL.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci U S A.2000；97(12):6640-5.)的方法，对大肠杆菌JM109(DE3)-ΔYgfH的甲基枸橼酸合成酶(PrpC)基因进行了敲除，获得了JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC宿主菌。将重组质粒pACYCDuet-pacd、pCS11、pBAD18-mcr转化到JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC宿主菌，获得了目标重组菌JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr。
利用本发明的重组大肠杆菌生产3-羟基丙酸的方法可以按照常规基因工程菌发酵制备3-羟基丙酸的方法进行，下面的描述给出了优选的实施方式。
(1)种子液的培养：将接种后的培养液在37℃，摇床转速200r/min的条件下培养12-16小时；所述培养液组成为：蛋白胨5-10g/L，NaCl5-10g/L，酵母膏1-5g/L，卡那霉素浓度0-50mg/L，氨苄青霉素0-50mg/L，氯霉素浓度0-34mg/L。
(2)发酵培养：培养条件为接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6-0.8时加入IPTG至终浓度为10-100μM、阿拉伯糖终浓度为0-20mM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达6-12小时，加入丙酸1-10g/L、葡萄糖4-10g/L、NaHCO30-2g/L、生物素0-25mg/L转到37℃培养，发酵培养25小时；所述发酵培养基组成：蛋白胨5-10g/L，NaCl5-10g/L，酵母膏1-5g/L，葡萄糖0-10g/L，丙酸0-10g/L，卡那霉素浓度0-50mg/L，氨苄青霉素0-50mg/L，氯霉素浓度0-34mg/L。
实施例
以下通过实施例将更详细地描述本发明。
基因工程菌的构建：
1：E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr的构建
根据Genebank公布的皱褶假丝酵母中pacd基因的序列设计引物：
P1其中划线部分为NdeI酶切位点
5’-GGTACTCCATATGTCGATTAAGGACG-3’(SEQ ID No.10)
P2其中划线部分为XhoI酶切位点
5’-CCGCTCGAGTTACAACTTGGCCAAC-3’(SEQ ID No.11)
利用RT-PCR技术，扩增出目的片段插入表达载体pACYCDuet-1中，得到重组质粒pACYCDuet-pacd。通过基因测序，获得如SEQ ID NO.1所示的pacd基因序列。
根据橙色绿屈挠菌基因组中mcr基因的序列设计引物：
P3其中划线部分为BamHI酶切位点
5’-CTCGGATCCATGAGCGGAACAGGACGACT-3’(SEQ ID No.12)
P4其中划线部分为HindⅢ酶切位点
5’-CCTAAGCTTACACGGTAATCGCCCGTCC-3’(SEQ ID No.13)
利用PCR技术从橙色绿屈挠菌基因组中扩增出目的片段，将其插入到克隆载体pBSⅡ-T中，得到重组质粒pBS-mcr。通过基因测序，获得如SEQ ID NO.3所示的mcr基因序列。将获得的重组质粒pBS-mcr和载体pET-28a利用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接，得到重组质粒pET28-mcr。将重组质粒pET28-mcr和表达载体pBAD18利用XbaⅠ和HindⅢ双酶切后连接，得到重组质粒pBAD18-mcr。将两个重组质粒pCS11和pBAD18-mcr转化E.coliJM109(DE3)，通过含卡那霉素和氨苄青霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌E.coli JM109(DE3)/pCS11/pBAD18-mcr。
将重组质粒pACYCDuet-pacd转化E.coli JM109(DE3)，通过含氯霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd。
将重组质粒pACYCDuet-pacd转化E.coli JM109(DE3)/pCS11/pBAD18-mcr，通过含卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr。
2:E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pET28-pct-hpcd的构建
根据Genebank公布的埃氏巨球菌(ATCC 17753)中丙酸辅酶A转移酶(PCT)基因pct的序列设计引物：
pct-NdeΙ-FP其中划线部分为NdeI酶切位点
5’-CCAATCTCCATATGAGAAAAGTAGAAATCATTA-3’(SEQ ID No.14)
pct-BamHΙ-RP其中划线部分为BamHΙ酶切位点
5’-TATGGATCCTTATTTTTTCAGTCCCATGGGA-3’(SEQ ID No.15)
利用PCR技术，扩增出目的片段插入表达载体pET-28a中，得到重组质粒pET28-pct。对重组质粒pET28-pct测序获得如SEQ ID NO.4所示的pct基因序列。
根据Genebank公布的橙色绿曲挠菌(ATCC 29365)中3-羟基丙酰辅酶A脱氢酶(HPCD)基因hpcd的序列设计引物：
hpcd-NdeΙ-FP其中划线部分为NdeI酶切位点
5’-CCAATCTCCATATGAGTGAAGAGTCTCTG-3’(SEQ ID No.16)
hpcd-BamHΙ-RP其中划线部分为BamHΙ酶切位点
5’-TATGGATCCAGATCGCAATCGCTCGTG-3’(SEQ ID No.17)
利用PCR技术扩增来自橙色绿曲挠菌(ATCC 29365)基因组DNA的如SEQ ID NO.5所示含945个碱基对的3-羟基丙酰辅酶A脱氢酶(HPCD)基因hpcd，将其插入到克隆载体pBSⅡ-T中，得到重组质粒pBS-hpcd。将获得的重组质粒pBS-hpcd和载体pET-28a用NdeΙ和BamHⅠ双酶切后连接，得到重组质粒pET28-hpcd。将重组质粒pET28-hpcd用BglⅡand EcoRⅠ酶切获得的DNA片段，和重组载体pET28-pct用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后获得的DNA片段进行连接，得到重组质粒pET28-pct-hpcd。
将所得重组质粒pET28-pct-hpcd转化E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd，通过含卡那霉素和氯霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pET28-pct-hpcd。
3：E.coli JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr的构 建
利用Red重组技术，用卡那霉素抗性基因替换大肠杆菌E.coli JM109(DE3)基因组上的YgfH基因以及PrpC基因，然后通过质粒pCP20表达的FLP内切酶消除卡那霉素抗性基因，分别得到敲除YgfH基因、PrpC基因，以及两种基因共同敲除大肠杆菌工程菌E.coliJM109(DE3)-ΔYgfH、E.coli JM109(DE3)-ΔPrpC以及E.coli JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC。
将三个重组质粒pCS11、pBAD18-mcr和pACYCDuet-pacd通过化学法转化大肠杆菌工程菌E.coli JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC，涂布于含有氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的LB培养基上，得到阳性克隆E.coli JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr。
3-羟基丙酸的生产：
实施例1：以葡萄糖和丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr
(2)发酵培养基：丙酸1g/L，葡萄糖4g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母膏5g/L，卡那霉素浓度50mg/L，氨苄青霉素50mg/L，氯霉素浓度34mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6时加入IPTG至终浓度为100μM、阿拉伯糖终浓度为6.7mM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/L、葡萄糖4g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为14.2mM。
实施例2：以葡萄糖和丙酸为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr
(2)发酵培养基：丙酸1g/L，葡萄糖4g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,酵母膏5g/L，卡那霉素浓度50mg/L，氨苄青霉素50mg/L，氯霉素浓度34mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.8时加入IPTG至终浓度为100μM、阿拉伯糖终浓度为6.7mM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/L、葡萄糖4g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为21.49mM。
对比例1：仅以丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd
(2)发酵培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母膏5g/L，丙酸1g/L，氯霉素浓度34mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6时加入IPTG至终浓度为100μM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为0.24mM。
对比例2：仅以丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pET28-pct-hpcd
(2)发酵培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母膏5g/L，丙酸1g/L，氯霉素浓度34mg/L，卡那霉素50mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6时加入IPTG至终浓度为100μM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为0.47mM。
对比例3：仅以丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr
(2)发酵培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母膏5g/L，丙酸1g/L，氯霉素浓度34mg/L，卡那霉素浓度50mg/L，氨苄青霉素50mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6时加入IPTG至终浓度为100μM、阿拉伯糖终浓度为6.7mM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为2.52mM。
对比例4：仅以丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr。
(2)发酵培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母膏5g/L，丙酸1g/L，氯霉素浓度34mg/L，卡那霉素浓度50mg/L，氨苄青霉素50mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6时加入IPTG至终浓度为100μM、阿拉伯糖终浓度为6.7mM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为4.69mM。
对比例5：仅以葡萄糖作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)/pCS11/pBAD18-mcr
(2)发酵培养基：葡萄糖4g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母膏5g/L，卡那霉素浓度50mg/L，氨苄青霉素50mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6时加入IPTG至终浓度为100μM、阿拉伯糖终浓度为6.7mM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入葡萄糖4g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为2.69mM。
对比例6：仅以葡萄糖作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr
(2)发酵培养基：葡萄糖4g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母膏5g/L,卡那霉素浓度50mg/L，氨苄青霉素50mg/L，氯霉素浓度34mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6时加入IPTG至终浓度为100μM、阿拉伯糖终浓度为6.7mM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入葡萄糖4g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为6.68mM。
对比例7：仅以葡萄糖作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：E.coli JM109(DE3)-ΔYgfH-ΔPrpC/pACYCDuet-pacd/pCS11/pBAD18-mcr。
(2)发酵培养基：葡萄糖4g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母膏5g/L,卡那霉素浓度50mg/L，氨苄青霉素50mg/L，氯霉素浓度34mg/L。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待OD600在0.6时加入IPTG至终浓度为100μM、阿拉伯糖终浓度为6.7mM，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入葡萄糖4g/L，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为8.12mM。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。
<110> 北京科技大学
<120> 产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及其应用
<130> 201604
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1329
<212> DNA
<213> 皱褶假丝酵母
<400> 1
atgtcgatta aggacgacat ccctgccatc ttttacgaaa aactttcccc ccgcgggctt 60
gaggctatcg ccaaaaccaa ggaattcgtc gacacttact gctcccccgc cgacgagatc 120
tacttccaac aggtgagaac tgacgaccgc cggtggaagg aaacgccccc catcaccgag 180
cacttgaaga agaaagctaa agagctcggg ttatggaaca tgttcttgct gaagcactac 240
gccgagggcg ccggctacac caacttggag tacgggctta tggcccagta ccttggccgc 300
agccacatcg cccctgaagc taccaacacc aatgctcctg acaccggcaa catggagatt 360
cttgccaagt acggcaacga ctaccacaag cagcgctacc tccagccgct tctcgacggt 420
aaaatccgcc tggcgttctt aatgacggaa aaggggacgt cgctgtccaa cgcccttaac 480
atctcgtgcc tggcaaaact taaccaaaat ggcaactacg tcatcaacgg cgtcaagtgg 540
ttcgccctgg gtgccggcga cccccggtgc aaggtgtggt tgacgatgtg caagaccggc 600
gacgacgacg ccaaccccta tttcaaccac tcgttgcttg tgcttgacgt cgacaaggcc 660
ctcgccctgg gacaggctcg tgttgtccgc ccgttgcacg tgtttggcta cgacgacgct 720
cctcacggtc actgtgaaat tgaatttaac aactacgaag tgtccaaaga ggaaatggcc 780
aacgtcatcc tcggccaggt gggccaagga tttgccatca tccagctgag attggggccg 840
gggcgcatcc accactgcat gcggatgatt ggcgtcggcg aattcgcctt gatgagagtg 900
gctcagcggg ctaaccaccg tatcatcttc ggtaagccca tggccaagcg cgaactgttt 960
ttgaacgcct acgctcaggc aaagatcgac atccaaaagt gccgcttgtt tgttcttaat 1020
gccgcccacc acatcgacat tgccggagcc aaagcggcgc aagccgacat cgccatggcc 1080
aagatcgaga ccccgagaac catccttcgc atcttggact gggggatcca gatgtttggc 1140
gccgaagggg tgtctcaaga caccgagctc tcgcgcatgt acgcgttggg gcggacgtta 1200
cgcattgccg acggccccga tgaagctcac ttgggccaat tggcccgtaa ggagctgaag 1260
aagttccctt acgtcgatga gtactttaag cggtttgaag aaaataaggc gaagttggcc 1320
aagttgtaa 1329
<210> 2
<211> 6638
<212> DNA
<213> 玉米黑粉菌
<400> 2
atgccgcctc cggatcacaa ggcagtcagc cagtttatcg gtaagtttga atgtaaaagt 60
cttgtattta ccctacaagt tggcgctgac ccaactccca actgcgctat gcgactacag 120
gcggcaaccc gcttgaaacc gctcccgcca gccctgttgc cgactttatt cgcaaacagg 180
gtggtcacag tgtcatcacc aaggtcctca tttgcaacaa cggtatcgcc gccgtcaagg 240
agattcgctc catccgaaaa tgggcctacg agacctttgg cgatgagcgt gccattgaat 300
ttaccgtcat ggccacccct gaggacctca aagtcaatgc cgactacatc cgcatggccg 360
accaatacgt cgaggtaccc ggtggctcta acaacaacaa ctacgctaac gtcgacctca 420
tcgtcgatgt cgctgagcga gccggcgttc acgccgtatg ggctggctgg ggtcacgcct 480
ccgagaaccc acgcctacct gaatcgctcg ccgcctccaa gcacaagatc atctttatcg 540
gtccccccgg ctccgccatg cgctcgcttg gtgacaagat ctcgtccacc atcgtcgcac 600
agcacgccga cgtgccatgc atgccctggt ccggtaccgg catcaaggag accatgatga 660
gcgatcaggg tttcctgacc gtctcggacg acgtctacca acaggcctgc atccacaccg 720
ctgaagaagg tcttgagaag gccgaaaaga tcggctaccc cgtcatgatc aaggcctccg 780
aaggtggagg aggaaagggt atccgaaagt gtaccaacgg cgaagaattc aagcagctct 840
acaacgccgt tctcggtgaa gtgcccggct cgcccgtttt cgttatgaaa ctcgccggcc 900
aggcgcgtca tctcgaggtg cagctgctgg ccgatcagta cggcaacgcc atcagcatct 960
ttggtcgtga ctgctctgtc cagcgtcgtc accaaaagat catcgaggag gctcctgtca 1020
ctatcgctcc tgaggatgcc cgcgagtcca tggagaaggc tgccgtgcgt ctcgccaaac 1080
tggtcggcta cgtctctgcc ggtaccgtcg aatggctcta ctctcccgag tcgggcgagt 1140
ttgccttcct cgagctcaac ccccgtcttc aggtcgagca ccctactacc gagatggtct 1200
cgggtgtcaa cattcccgct gcccagcttc aggtcgccat gggtatccct ctctactcga 1260
tccgcgacat ccgaaccctt tacggcatgg accctcgcgg taatgaggtc atcgactttg 1320
acttctctag ccccgagtcg ttcaagaccc agcgcaagcc tcagccccag ggccacgtag 1380
tcgcctgccg tatcactgcc gaaaaccccg acaccggctt caagcctggc atgggtgccc 1440
tcactgagct caacttccgc tccagcacct ccacctgggg ttacttctcc gtcgcagcca 1500
gcggtgctct ccacgagtac gccgattcgc agttcggaca catctttgcc tatggtgccg 1560
accgatccga ggcgcgaaaa cagatggtca tctcgctcaa ggagctctcc attcgcggtg 1620
acttccgtac caccgtcgaa tacctcatca agttgctcga gaccgacgcc ttcgagtcca 1680
acaagatcac cactggatgg ctcgatggtc tcattcagga ccgtctcact gccgaacgac 1740
ctcctgcgga cctcgctgtc atttgcggtg ctgccgtcaa ggctcatctc cttgcgcgtg 1800
agtgcgagga cgagtacaag cgcatcttga atagaggtca ggtccctcct cgcgacacca 1860
tcaagaccgt cttctcgatc gacttcatct acgagaacgt caagtacaac tttactgcca 1920
cgcgcagctc cgtctccggc tgggtcctct acctcaacgg tggacgtacg ctggtgcagc 1980
tccgacccct taccgacgga ggtctgctca ttggtctttc gggcaagtcg caccccgtct 2040
actggcgtga ggaggtcggc atgacccgtc tcatgatcga ctccaagacc tgcctcatcg 2100
agcaggagaa tgaccccacc cagatccgct cgccctcgcc cggtaagctc gttcgcttct 2160
tggtggattc gggcgaccac gtcaaggcca accaggccat tgcagagatc gaggtcatga 2220
agatgtactt gcctctcgtt gccgccgagg acggcgtcgt ctcgtttgtc aagaccgccg 2280
gtgttgctct cagccctgga gacattatcg gtattctctc gcttgatgac cctagccgtg 2340
tccagcacgc taaacccttt gctggccagc tgcccgactt tggaatgccc gtcatcgttg 2400
gcaacaagcc tcaccagcgt tacacggccc ttgtcgaggt actcaacgat atcctcgatg 2460
gttacgacca gagcttccgc atgcaggcgg tcatcaagga gctcatcgag acgctccgca 2520
accccgagct gccctacggt caggcctccc agattctgtc cagcttgggc ggccgtatcc 2580
ctgccaggct cgaggatgtg gtgcgcaaca caattgagat gggccactcg aagaacattg 2640
agttccccgc tgctcgtctg cgcaagctca ccgagaactt cctccgtgac agcgtcgacc 2700
ctgctatccg cggacaggtg caaatcacca ttgctcctct ctaccagctc ttcgagacct 2760
acgctggcgg cctcaaggct catgagggca acgtgcttgc ttcgttcctc caaaagtact 2820
acgaagttga gtcccagttt accggtgagg ctgacgtcgt tctcgagctt cgtctccagg 2880
ccgacggcga cctcgacaag gttgtggccc tgcagacttc gcgcaatggc atcaaccgca 2940
aaaacgctct gctgctcacc ttgcttgaca agcacatcaa gggcacctcg cccgtctcgc 3000
gtactagcgg tgctaccatg atcgaggctc tgcgcaagct tgcctcgctt cagggcaagt 3060
cgactgcccc catcgccctc aaggctcgtg aggtctcgct cgacgccgac atgcccagtc 3120
ttgccgaccg atcagctcag atgcaggcca ttcttcgtgg ctccgtcacc tcgtccaagt 3180
atggtggtga tgatgagtac catgctccct cgcttgaggt tctccgcgag ctcagcgact 3240
cacagtacag cgtgtacgat gtgctgcaca gcttcttcgg tcaccgcgag caccatgtcg 3300
cctttgccgc gctctgcacc tacgtcgtcc gcgcctaccg agcttacgag attgtcaact 3360
tcgactatgc cgttgaggac tttgacgtcg aagaacgcgc tgtgctcacc tggcagttcc 3420
agctgcctcg aagcgcttct tcgctcaagg agcgtgagcg tcaggtgtct atcagcgacc 3480
tcagcatgat ggataacaac aggagggctc gccccatccg cgagctgcgc actggtgcca 3540
tgaccagctg cgccgatgtg gccgacattc ctgaacttct ccctaaggtt ctcaagttct 3600
tcaagtcttc tgccggtgcc agtggagcgc ccatcaatgt gctaaacgtt gctgttgtcg 3660
accagactga ctttgtcgac gccgaagtgc gaagccagct tgccctgtac accaatgcct 3720
gcagcaagga gttttccgct gctcgtgtcc gccgtgtcac ctacctcctt tgccagcccg 3780
gcttgtatcc cttcttcgcc accttccgtc ccaacgagca gggcatctgg tccgaagaga 3840
aggcgattcg caacatcgaa cccgcgcttg cctaccagct tgagctcgac agggtcagca 3900
agaactttga gctcaccccc gttccggtct cgtcgtccac gatccatctc tactttgctc 3960
gtggtatcca gaactcggcc gatacccgat tctttgttcg ctcactcgtc cgtcccggcc 4020
gcgtgcaggg cgacatggct gcatacctca tctccgaatc ggaccgcatt gtcaacgata 4080
ttctcaacgt catcgaggta gctcttggcc agcccgagta ccgcaccgcc gatgcttcgc 4140
acatcttcat gtctttcatc taccagctgg atgtcagcct cgtggatgtg cagaaggcta 4200
ttgccggctt ccttgagcga cacggcaccc gcttcttccg tctccgcatc acaggtgccg 4260
agatccgcat gattctaaac ggtcccaacg gcgagccccg cccgatccga gcctttgtca 4320
ccaacgagac cggtctggtc gtccgatacg agacatacga ggagactgtc gccgatgacg 4380
gctctgtgat tctgcgcggc atcgagcccc agggcaagga tgccacgctc aatgcccaga 4440
gcgcacactt cccttacaca accaaggtgg cactgcagtc gcgacgatct cgtgcccacg 4500
ctttgcagac caccttcgtc tacgacttta tcgatgtgct tggtcaggcc gtgcgtgcgt 4560
cgtggagaaa ggttgctgcc agcaagattc ccggtgatgt catcaagtcg gccgtcgagt 4620
tggtctttga cgagcaggag aacctgcgtg aggtcaagcg tgctcctggt atgaacaaca 4680
tcggcatggt tgcttggctc gtcgaggtgc tcacccccga gtaccccgct ggccgtaagc 4740
tcgttgtcat cgggaacgac gtcaccatcc aggctggctc gttcggcccc gttgaggacc 4800
gcttcttcgc tgctgcctcc aagctcgccc gtgagcttgg tgtgccgcgc ctctacatct 4860
cggccaattc gggtgcccgt atcggcttgg caactgaggc gctcgacctg ttcaaggtca 4920
agttcgtcgg cgacgaccct gccaagggtt tcgagtacat ctacctcgac gacgagtcgc 4980
tccaagccgt ccaggccaag gcgcccaaca gtgtcatgac caagcccgtc caggccgctg 5040
atggcagcgt ccataacatc atcaccgata tcatcggcaa gcctcagggg ggtctcggtg 5100
tcgagtgtct gtcgggcagt ggtctcattg ccggtgagac cagccgtgca aaggaccaga 5160
tcttcactgc caccatcatc acgggacgaa gtgtcggtat cggtgcctat cttgctcgtc 5220
tgggcgagcg tgtaatccag gtcgagggct cgcccttgat cctcactggt tatcaggcac 5280
tcaacaagct gctgggtcgt gaggtctata cctcgaacct acagctcggt ggtcctcaga 5340
tcatgtacaa gaacggtgtt tctcacctca ctgctcagga cgacctcgac gctgtcaggt 5400
cgtttgtcaa ctggatatca tacgttcctg ctcagcgtgg tggacctctg ccgatcatgc 5460
ccaccaccga tagctgggac cgagcggtca cataccagcc tcctcgtggt ccttacgacc 5520
cacgatggct catcaacggt accaaggccg aagacggcac caagctcacc ggtcttttcg 5580
atgaaggctc atttgtcgag acgcttggcg gctgggccac ttcggtagtc actggtcgtg 5640
ctcgcctggg cggcatccct gtcggtgtga tcgctgtcga gacgcgcacg ctcgagcgtg 5700
ttgttccggc cgaccctgcg aaccccaact cgaccgagca gcgcatcatg gaagccggcc 5760
aggtgtggta ccccaactca gcgtacaaga ctgcccaagc catctgggac tttgacaaag 5820
agggtctgcc tttggtcatc cttgccaact ggcgtggatt ttcgggtggc cagcaggaca 5880
tgtacgacga gatcctcaag cagggctcca agatcgtcga cggtctgtcg tcgtacaagc 5940
agcccgtgtt tgttcacatt ccacctatgg gtgagcttcg cggtggttcg tgggtcgtgg 6000
tcgactctgc gatcaacgac aacggtatga tcgagatgtc ggccgatgtc aacagcgcac 6060
gaggtggtgt gctggaagcc tcaggtctgg tcgagatcaa gtaccgtgcc gacaagcaac 6120
gtgctaccat ggagcgactc gacagcgtct atgccaagtt gagcaaggaa gctgccgaag 6180
cgaccgactt caccgcgcag accaccgctc gtaaggcgtt ggcagagcga gagaagcagc 6240
tcgcacctat ctttacggcg atcgctaccg agtatgcaga tgcacacgac cgtgcaggac 6300
gcatgcttgc gactggagtg ctgcgatcgg cgctgccatg ggagaacgcg cgtcgatact 6360
tctactggcg tctcaggaga aggttgaccg aggtcgctgc tgaacgcacg gttggcgagg 6420
ccaacccgac gctgaagcat gttgagaggc tggctgtatt gcgacagttt gttggtgctg 6480
ctgcgagcga tgacgacaag gcggtggctg agcacttgga ggcttcggcc gaccagctgt 6540
tggccgcatc caaacagttg aaggcacagt acatcttggc tcagatctcg acattggacc 6600
ctgaactgcg cgctcaacta gccgcttcgc tcaagtaa 6638
<210> 3
<211> 3660
<212> DNA
<213> 橙色绿屈挠菌
<400> 3
atgagcggaa caggacgact ggcaggaaag attgcgttaa ttaccggtgg cgccggcaat 60
atcggcagtg aattgacacg tcgctttctc gcagagggag cgacggtcat tattagtgga 120
cggaatcggg cgaagttgac cgcactggcc gaacggatgc aggcagaggc aggagtgccg 180
gcaaagcgca tcgatctcga agtcatggat gggagtgatc cggtcgcggt acgtgccggt 240
atcgaagcga ttgtggcccg tcacggccag atcgacattc tggtcaacaa tgcaggaagt 300
gccggtgccc agcgtcgtct ggccgagatt ccactcactg aagctgaatt aggccctggc 360
gccgaagaga cgcttcatgc cagcatcgcc aatttacttg gtatgggatg gcatctgatg 420
cgtattgcgg cacctcatat gccggtagga agtgcggtca tcaatgtctc gaccatcttt 480
tcacgggctg agtactacgg gcggattccg tatgtcaccc ctaaagctgc tcttaatgct 540
ctatctcaac ttgctgcgcg tgagttaggt gcacgtggca tccgcgttga tacgatcttt 600
cccggcccga ttgaaagtga tcgcatccgt acagtgttcc agcgtatgga tcagctcaag 660
gggcggcccg aaggcgacac agcgcaccat tttttgaaca ccatgcgatt gtgtcgtgcc 720
aacgaccagg gcgcgcttga acgtcggttc ccctccgtcg gtgatgtggc agacgccgct 780
gtctttctgg ccagtgccga atccgccgct ctctccggtg agacgattga ggttacgcac 840
ggaatggagt tgccggcctg cagtgagacc agcctgctgg cccgtactga tctgcgcacg 900
attgatgcca gtggccgcac gacgctcatc tgcgccggcg accagattga agaggtgatg 960
gcgctcaccg gtatgttgcg tacctgtggg agtgaagtga tcatcggctt ccgttcggct 1020
gcggcgctgg cccagttcga gcaggcagtc aatgagagtc ggcggctggc cggcgcagac 1080
tttacgcctc ccattgcctt gccactcgat ccacgcgatc cggcaacaat tgacgctgtc 1140
ttcgattggg ccggcgagaa taccggcggg attcatgcag cggtgattct gcctgctacc 1200
agtcacgaac cggcaccgtg cgtgattgag gttgatgatg agcgggtgct gaattttctg 1260
gccgatgaaa tcaccgggac aattgtgatt gccagtcgcc tggcccgtta ctggcagtcg 1320
caacggctta cccccggcgc acatgcgcgt gggccgcgtg tcatttttct ctcgaacggt 1380
gccgatcaaa atgggaatgt ttacggacgc attcaaagtg ccgctatcgg tcagctcatt 1440
cgtgtgtggc gtcacgaggc tgaacttgac tatcagcgtg ccagcgccgc cggtgatcat 1500
gtgctgccgc cggtatgggc caatcagatt gtgcgcttcg ctaaccgcag ccttgaaggg 1560
ttagaatttg cctgtgcctg gacagctcaa ttgctccata gtcaacgcca tatcaatgag 1620
attaccctca acatccctgc caacattagc gccaccaccg gcgcacgcag tgcatcggtc 1680
ggatgggcgg aaagcctgat cgggttgcat ttggggaaag ttgccttgat taccggtggc 1740
agcgccggta ttggtgggca gatcgggcgc ctcctggctt tgagtggcgc gcgcgtgatg 1800
ctggcagccc gtgatcggca taagctcgaa cagatgcagg cgatgatcca atctgagctg 1860
gctgaggtgg ggtataccga tgtcgaagat cgcgtccaca ttgcaccggg ctgcgatgtg 1920
agtagcgaag cgcagcttgc ggatcttgtt gaacgtaccc tgtcagcttt tggcaccgtc 1980
ggttatctga tcaacaacgc cgggatcgcc ggtgtcgaag agatggttat cgatatgcca 2040
gttgagggat ggcgccatac cctcttcgcc aatctgatca gcaactactc gttgatgcgc 2100
aaactggcgc cgttgatgaa aaaacagggt agcggttaca tccttaacgt ctcatcatac 2160
tttggcggtg aaaaagatgc ggccattccc taccccaacc gtgccgatta cgccgtctcg 2220
aaggctggtc agcgggcaat ggccgaagtc tttgcgcgct tccttggccc ggagatacag 2280
atcaatgcca ttgcgccggg tccggtcgaa ggtgatcgct tgcgcggtac cggtgaacgt 2340
cccggcctct ttgcccgtcg ggcgcggctg attttggaga acaagcggct gaatgagctt 2400
cacgctgctc ttatcgcggc tgcgcgcacc gatgagcgat ctatgcacga actggttgaa 2460
ctgctcttac ccaatgatgt ggccgcacta gagcagaatc ccgcagcacc taccgcgttg 2520
cgtgaactgg cacgacgttt tcgcagcgaa ggcgatccgg cggcatcatc aagcagtgcg 2580
ctgctgaacc gttcaattgc cgctaaattg ctggctcgtt tgcataatgg tggctatgtg 2640
ttgcctgccg acatctttgc aaacctgcca aacccgcccg atcccttctt cacccgagcc 2700
cagattgatc gcgaggctcg caaggttcgt gacggcatca tggggatgct ctacctgcaa 2760
cggatgccga ctgagtttga tgtcgcaatg gccaccgtct attaccttgc cgaccgcaat 2820
gtcagtggtg agacattcca cccatcaggt ggtttgcgtt acgaacgcac ccctactggt 2880
ggcgaactct tcggcttgcc ctcaccggaa cggctggcgg agctggtcgg aagcacggtc 2940
tatctgatag gtgaacatct gactgaacac cttaacctgc ttgcccgtgc gtacctcgaa 3000
cgttacgggg cacgtcaggt agtgatgatt gttgagacag aaaccggggc agagacaatg 3060
cgtcgcttgc tccacgatca cgtcgaggct ggtcggctga tgactattgt ggccggtgat 3120
cagatcgaag ccgctatcga ccaggctatc actcgctacg gtcgcccagg gccggtcgtc 3180
tgtaccccct tccggccact gccgacggta ccactggtcg ggcgtaaaga cagtgactgg 3240
agcacagtgt tgagtgaggc tgaatttgcc gagttgtgcg aacaccagct cacccaccat 3300
ttccgggtag cgcgcaagat tgccctgagt gatggtgcca gtctcgcgct ggtcactccc 3360
gaaactacgg ctacctcaac taccgagcaa tttgctctgg ctaacttcat caaaacgacc 3420
cttcacgctt ttacggctac gattggtgtc gagagcgaaa gaactgctca gcgcattctg 3480
atcaatcaag tcgatctgac ccggcgtgcg cgtgccgaag agccgcgtga tccgcacgag 3540
cgtcaacaag aactggaacg ttttatcgag gcagtcttgc tggtcactgc accactcccg 3600
cctgaagccg atacccgtta cgccgggcgg attcatcgcg gacgggcgat taccgtgtaa 3660
<210> 4
<211> 1554
<212> DNA
<213> 埃氏巨球菌
<400> 4
atgagaaaag tagaaatcat tacagctgaa caagcagctc agctcgtaaa agacaacgac 60
acgattacgt ctatcggctt tgtcagcagc gcccatccgg aagcactgac caaagctttg 120
gaaaaacggt tcctggacac gaacaccccg cagaacttga cctacatcta tgcaggctct 180
cagggcaaac gcgatggccg tgccgctgaa catctggcac acacaggcct tttgaaacgc 240
gccatcatcg gtcactggca gactgtaccg gctatcggta aactggctgt cgaaaacaag 300
attgaagctt acaacttctc gcagggcacg ttggtccact ggttccgcgc cttggcaggt 360
cataagctcg gcgtcttcac cgacatcggt ctggaaactt tcctcgatcc ccgtcagctc 420
ggcggcaagc tcaatgacgt aaccaaagaa gacctcgtca aactgatcga agtcgatggt 480
catgaacagc ttttctaccc gaccttcccg gtcaacgtag ctttcctccg cggtacgtat 540
gctgatgaat ccggcaatat caccatggac gaagaaatcg ggcctttcga aagcacttcc 600
gtagcccagg ccgttcacaa ctgtggcggt aaagtcgtcg tccaggtcaa agacgtcgtc 660
gctcacggca gcctcgaccc gcgcatggtc aagatccctg gcatctatgt cgactacgtc 720
gtcgtagcag ctccggaaga ccatcagcag acgtatgact gcgaatacga tccgtccctc 780
agcggtgaac atcgtgctcc tgaaggcgct accgatgcag ctctccccat gagcgctaag 840
aaaatcatcg gccgccgcgg cgctttggaa ttgactgaaa acgctgtcgt caacctcggc 900
gtcggtgctc cggaatacgt tgcttctgtt gccggtgaag aaggtatcgc cgataccatt 960
accctgaccg tcgaaggtgg cgccatcggt ggcgtaccgc agggcggtgc ccgcttcggt 1020
tcgtcccgca atgccgatgc catcatcgac cacacctatc agttcgactt ctacgatggc 1080
ggcggtctgg acatcgctta cctcggcctg gcccagtgcg atggctcggg caacatcaac 1140
gtcagcaagt tcggtactaa cgttgccggc tgcggcggtt tccccaacat ttcccagcag 1200
acaccgaatg tttacttctg cggcaccttc acggctggcg gcttgaaaat cgctgtcgaa 1260
gacggcaaag tcaagatcct ccaggaaggc aaagccaaga agttcatcaa agctgtcgac 1320
cagatcactt tcaacggttc ctatgcagcc cgcaacggca aacacgttct ctacatcaca 1380
gaacgctgcg tatttgaact gaccaaagaa ggcttgaaac tcatcgaagt cgcaccgggc 1440
atcgatattg aaaaagatat cctcgctcac atggacttca agccgatcat tgataatccg 1500
aaactcatgg atgcccgcct cttccaggac ggtcccatgg gactgaaaaa ataa 1554
<210> 5
<211> 945
<212> DNA
<213> 橙色绿曲挠菌
<400> 5
atgagtgaag agtctctggt tctcagcaca attgaaggcc ccatcgccat cctcaccctc 60
aatcgccccc aggccctcaa tgcgctcagt ccggccttga ttgatgacct cattcgccat 120
ttagaagcct gcgatgccga tgacacaatc cgcgtgatca ttatcaccgg cgccggacgg 180
gcatttgctg ccggcgctga catcaaagcg atggccaatg ccacgcctat tgatatgctc 240
accagtggca tgattgcgcg ctgggcacgc atcgccgcgg tgcgcaaacc ggtgattgct 300
gccgtgaatg ggtatgcgct cggtggtggt tgtgaattgg caatgatgtg cgacatcatc 360
atcgccagtg aaaacgcgca gttcggacaa ccggaaatca atctgggcat cattcccggt 420
gctggtggca cccaacggct gacccgcgcc cttggcccgt atcgcgcaat ggaattgatc 480
ctgaccggcg cgaccatcag tgctcaggaa gctctcgccc acggcctggt gtgccgggtc 540
tgcccgcctg aaagcctgct cgatgaagcc cgtcggatcg cgcaaaccat tgccaccaaa 600
tcaccactgg ctgtacagtt ggcgaaagag gcagtccgta tggccgccga aaccactgtg 660
cgcgaggggt tggctatcga gctgcgtaac ttctatctgc tgtttgccag tgctgaccaa 720
aaagagggga tgcaggcatt tatcgagaaa cgcgctccca acttcagtgg tcgttgatca 780
cgcgcagaac atggcagcag ggcaatacct gcacgtactg cctcctgccg ccatactacc 840
agatgatcga gcagtaaagg gtaatactct atcaatctgg ccagatagcg tgggtaacac 900
gcatgctcaa gagacgatca tgacatacac gagcgaatgc gatct 945
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggagtaaaaa tggttggtca ttaatccctg cgaacgaaga aactcagtgg gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
attacggtgt aagtcgaaga cgtggctaag atcgtggtga atatgtccgc attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 8
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atctcgaccc tacaaatgat aacaatgacg aggacaacat gagcgacaca gctggagctg 60
cttcgaagtt c 71
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttgctctcc cacatcaccg tttccaggcg atcggcgatg ttgtacatct attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggtactccat atgtcgatta aggacg 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccgctcgagt tacaacttgg ccaac 25
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctcggatcca tgagcggaac aggacgact 29
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cctaagctta cacggtaatc gcccgtcc 28
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccaatctcca tatgagaaaa gtagaaatca tta 33
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tatggatcct tattttttca gtcccatggg a 31
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccaatctcca tatgagtgaa gagtctctg 29
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tatggatcca gatcgcaatc gctcgtg 27

Claims (10)

1.包含丙酰辅酶A脱氢酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因和丙二酰辅酶A还原酶基因的重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1的重组大肠杆菌，其中所述丙酰辅酶A脱氢酶基因具有SEQ ID NO.1的序列。
3.根据权利要求1的重组大肠杆菌，其中所述乙酰辅酶A羧化酶基因具有SEQ ID NO.2的序列。
4.根据权利要求1的重组大肠杆菌，其中所述丙二酰辅酶A还原酶基因具有SEQ IDNO.3的序列。
5.根据权利要求1的重组大肠杆菌，还包含丙酸辅酶A转移酶基因和3-羟基丙酰辅酶A脱氢酶基因。
6.根据权利要求5的重组大肠杆菌，其中所述丙酸辅酶A转移酶基因具有SEQ ID NO.4的序列。
7.根据权利要求5的重组大肠杆菌，其中所述3-羟基丙酰辅酶A脱氢酶基因具有SEQ IDNO.5的序列。
8.根据权利要求1-7任一项的重组大肠杆菌，其中宿主菌为E.coli JM109(DE3)。
9.利用权利要求1-8任一项所述的重组大肠杆菌生产3-羟基丙酸方法，其中，以葡萄糖和丙酸为底物发酵。
10.权利要求1-8任一项所述的重组大肠杆菌在生产3-羟基丙酸中的用途。
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