KR101437042B1

KR101437042B1 - 포도당 및 글리세롤을 이용한 3-히드록시프로피온산의 생산방법

Info

Publication number: KR101437042B1
Application number: KR1020120155781A
Authority: KR
Inventors: 최인석; 김태한; 이충영; 김광욱
Original assignee: 삼성전자 주식회사
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-09-02
Also published as: KR20140085917A

Abstract

본 발명은 미생물 배양을 통한 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid) 생산시 포도당 및 글리세롤을 특정 비율로 함유하는 배지를 이용하여 3-히드록시프로피온산의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미생물 배양시 포도당을 첨가함으로써 균체량을 확보하고, 글리세롤과 포도당의 비율을 조절을 통해 정해진 탄소원을 이용하여 3-히드록시프로피온산의 생산량을 증가시키는 방법으로, 본 발명의 방법으로 3-히드록시프로피온산의 생산량과 생산성을 증가시킬 수 있다.

Description

포도당 및 글리세롤을 이용한 3-히드록시프로피온산의 생산방법{METHOD OF PRODUCITON FOR 3-HYDROXYPROPIONIC AICD BY USING GLYCEROL AND GLUCOSE}

본 발명은 미생물 배양을 통한 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid)의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 포도당 및 글리세롤을 사용하여 3-히드록시프로피온산의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

최근 석유 기반 산업의 확장에 따른 지구 온난화 문제와 석유 가격의 심한 변동 및 상승 등으로 인한 석유 기반 산업의 문제점들이 논의되기 시작하였고, 이에 바이오를 기반으로 한 화학, 에너지 산업이 주목을 받게 되었다. 바이오 연료의 하나인 바이오 디젤은 식물성 기름이나 동물성 지방으로부터 트리글리세리드의 에스테르 교환반응에 의하여 생산되고 있다. 바이오 디젤의 대량생산으로 인하여 부산물인 글리세롤의 생산이 급증하게 되었고, 대량으로 생산되는 글리세롤은 가격이 낮아지는 추세에 있다. 앞으로 바이오 디젤의 시장 수요가 증가하여 시장이 커질수록 부산물인 글리세롤의 생산량은 급격하게 증가할 것이며 글리세롤의 가격도 현재보다 더욱 낮아질 것으로 예측된다. 글리세롤은 유지, 섬유, 피혁의 대전 방지제, 세제용 유화제의 원료로 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 미생물의 탄소원으로 사용가능하여 이를 활용하여 미생물 기반으로 다양한 케미칼을 만들 수 있다.

그 중 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP)은 젖산, 숙신산과 더불어 다양한 케미칼의 원료로 사용될 수 있는 유망 플랫폼 화학원료 중의 하나로, 글리세롤을 기반으로 미생물 발효에 의해 생산될 수 있다. 3-히드록시프로피온산은 광학적으로 활성이 있는 물질의 합성을 위해 중요한 역할을 하는 2개의 작용기를 가지고 있는데, 이는 화학산업에서 3-히드록시프로피온산이 중요한 전구체로 각광을 받게 하는 요소이다. 3-히드록시프로피온산을 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물로는 아크릴산 (acrylic acid, MW 72.06), 말론산 (malonic acid, MW 104.06), 1,3-프로판디올(1,3-propanediol, MW 76.06) 등이 있다.

생물학적으로 두 종의 효소가 촉매하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 생산할 수 있다. 첫 번째 효소인 글리세롤 데하이드라타제(Glycerol dehydratase)로 글리세롤을 탈수반응시켜 3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)로 전환하고, 두 번째 효소인 3-히드록시프로피온알데히드 데하이드로게나아제(3-HPA dehydrogenase)로 3-HPA를 산화시켜 3-히드록시프로피온산을 생성하게 된다.

위에서 언급된 생물학적 반응을 이용하여 3-히드록시프로피온산을 생산할 때 글리세롤을 탄소원으로 주로 이용하게 된다. 글리세롤을 탄소원으로 이용할 경우 글리세롤 데하이드라타제와 3-히드록시프로피온알데히드 두 가지 효소가 관여하는 비교적 간단한 반응을 통해 3-히드록시프로피온산을 생산할 수 있기 때문이다. 그러나 글리세롤을 탄소원으로 사용하게 될 경우 대부분의 미생물의 대사속도가 감소되는 현상을 보이고, 이는 생산성의 감소로 직결된다. 따라서, 생물공학적인 방법을 이용하여 물질을 생산할 때 생산성은 생산원가를 결정하는 중요한 요소로서 3-히드록시프로피온산의 생산성을 증가시킬 수 있는 방법이 요구된다.

3-히드록시프로피온산 생물학적 제조공정에 있어 글리세롤을 단독으로 탄소원으로 사용할 경우 3-히드록시프로피온산의 생산에는 적합하나 트리카르복실산 사이클(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)을 통해 생성되는 에너지의 양이 포도당에 비해 적다. 이러한 이유로 균체내의 전반적인 대사능이 떨어지게 되고 균체수의 확보가 어렵게 된다.

3-히드록시프로피온산을 효율적으로 생산하고 위하여, 한국공개특허 10-2012-0108358호는 말로닉세미알데히드의 환원경로를 이용한 새로운 합성 경로를 설계하였고, 한국공개특허 10-2011-0129070은 코엔자임 B₁₂ 생성능력을 갖는 재조합 미생물을 사용하였고, 한국공개특허 10-2012-0041826호는 비타민 B₁₂ 생성능력을 갖는 재조합 미생물을 사용하였을 뿐, 현재까지 하이드로피온산의 생산 효율을 증가시키지 위한 최적의 배양방법에 대한 기술은 알려진 바 없다.

1. 한국공개특허 10-2012-0108358호 2. 한국공개특허 10-2011-0129070 3. 한국공개특허 10-2012-0041826호

본 발명의 목적은 3-히드록시프로피온산의 농도 및 생산성이 향상된 3-히드록시프로피온산의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기 목적의 달성하기 위하여 본 발명은 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법에 있어서, 상기 배양은 포도당 대 글리세롤의 배양 초기 함량이 1:2 내지 1:16의 중량비로 함유된 배양배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 배양 초기에 상기 포도당은 5 g/ℓ 내지 40 g/ℓ로 포함되고, 상기 글리세롤은 40 g/ℓ 내지 120 g/ℓ로 포함되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 배양배지에 글리세롤을 포함하는 피딩용액을 공급하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 글리세롤을 포함하는 피딩 용액을 공급하여 배양배지 내의 글리세롤 함량을 20 g/ℓ 내지 60 g/ℓ로 유지하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 피딩용액의 글리세롤 함량은 상기 초기 배양배지의 글리세롤 함량 대비 1 내지 10배인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 피딩용액은 포도당을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 피딩용액의 포도당 함량은 상기 피딩용액의 글리세롤 함량 대비 0.001 내지 1인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 특정한 조성의 글리세롤 및 포도당을 함유하는 배지에서 미생물을 배양하여 3-히드록시프로피온산을 생산할 경우, 글리세롤을 단독으로 탄소원으로 사용한 생산방법에 비해 3-히드록시프로피온산의 생산성 및 농도를 향상시킬 수 있으며, 생산을 위한 배양 시간을 단축할 수 있다.

또한 배양과정에서 글리세롤 및 포도당을 비율을 조절하여 3-히드록시프로피온산을 보다 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 배양배지 내 포도당 및 글리세롤의 초기 함량에 따른 균체 성장을 측정한 결과이다.
도 2는 배양배지 내 포도당 및 글리세롤의 초기 함량에 따른 3-히드록시프로피온산 합성양을 측정한 결과이다.
도 3은 배양 중 첨가되는 피딩용액 내 포도당 함량에 따른 균체 성장을 측정한 결과이다.
도 4는 배양 중 첨가되는 피딩용액 내 포도당 함량에 따른 3-히드록시프로피온산 합성양을 측정한 결과이다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산의 방법에 있어서, 상기 미생물을 포도당 대 글리세롤의 초기 중량비율이 1:2 내지 1:16인 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 이하 첨부된 도면을 이용하여 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 살펴보도록 한다.

본 발명은 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법에 있어서, 상기 배양은 포도당 대 글리세롤의 배양 초기 함량이 1:2 내지 1:16의 중량비로 함유된 배양배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.

3-히드록시프로피온산의 제조시 포도당과 글리세롤의 농도비를 조절하는 것이 필요한데, 이는 두 가지 탄소원이 서로 경쟁관계에 있어 각각의 탄소원이 배지 내에 존재하는 농도에 따라 미생물에 의해 이용되는 탄소원의 비율이 변화될 수 있기 때문이다.

본 발명의 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물은 3-히드록시프로피온산 생산능력을 갖는 단리된 천연 미생물 또는 재조합 미생물이면 제한되지 않으며, 상기 미생물은 글리세롤 탈수효소(dehydratase), 알데히드 탈수소효소(dehydrogenase) 및 추가로 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자 및 이들을 암호화하는 유전자를 포함한다. 따라서, 재조합미생물인 경우 글리세롤 탈수효소 및 알데히드 탈수소효소를 암호화하는 유전자로 구성된 재조합 벡터를 형질도입한 것일 수 있다. 또한 상기 재조합 벡터는 글리세롤 탈수효소 재활성인자를 암호화하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 글리세롤 탈수효소는 글리세롤을 3-히드록시프로피온알데히드로(3-HPA) 전환시키는 효소를 의미하며, 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase) 또는 디올 탈수효소(Diol dehydratases) 등이 포함된다. 본 발명의 글리세롤 탈수효소는 비타민 B₁₂ 의존 또는 비의존성일 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소는 이에 제한되는 것은 아니나, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium) 또는 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 등 유래일 수 있다. 구체적으로는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 DhaB1, DhaB2 및 DhaB3 또는 클로스트리디움 부티리쿰 유래의 DhaB1을 들 수 있다.

상기 본 발명의 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자는, 글리세롤 탈수효소가 작용하는 동안 글리세롤 단독 또는 1,3-프로판디올과의 상호작용에 의해 비가역적으로 불활성화되는 것을 다시 활성화시켜주는 폴리펩타이드이다. 본 발명의 미생물은 글리세롤 탈수효소를 활성화시키기 위한 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 염기서열을 포함한다. 상기 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 염기서열 역시 상기 클렙시엘라, 클로스트리디움 등으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 글리세롤 탈수 효소를 암호화하는 염기서열을 제공하는 미생물과 동종의 미생물이다.

본 발명의 알데히드 탈수소효소는 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피오산으로 전환하는 활성을 가지며, 3-히드록시프로피온알데히드 탈수소효소, 숙신산 세미알데히드 탈수소효소, 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제 등일 수 있다. 본 발명에서 3-히드록시프로피온알데히드 탈수소효소로는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래의 ALDH2, 효모(S. cerevisiae) 유래의 ALD4, 대장균(E. coli) 유래의 AldA, AldB 또는 AldH 유전자 에서 선택될 수 있고, 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제, 숙신산 세미알데히드 탈수소효소는 쿠프리아비두스 네카터 (Cupriavidus necator) 유래의 gabD4 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 미생물은 상기 염기서열을 포함하는 재조합 벡터와 같은 발현카세트로 숙주 세포에 도입하는 형질전환 방법에 의하여 만들어질 수 있으며, 상기 상술한 염기서열로 이루어진 핵산분자 중 어느 하나 이상을 BAC, 플라스미드, 포스미드 등의 적절한 벡터에 클로닝하여 제조될 수 있으며, 이를 적당한 숙주세포에 도입하여 형질전환한다. 상기 도입 방법 역시 공지의 기술, 예컨데 염화칼슘법, 열 충격법, 전기충격법 등의 형질전환방법이나 재조합 파지 바이러스를 통한 형질주입방법을 통해 도입할 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.

본 발명의 재조합 미생물의 제조에 사용 가능한 숙주세포는 에스케리키아 (Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속으로 이루어진 미생물에서 선택될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나 글리세롤 및 포도당의 적정 조합으로부터 대사 효율을 높이기 위해서는 상기 중에서도 대장균(Escherichia coli)이 가장 바람직하다.

본 발명에 사용될 수 있는 재조합 미생물로는 특허출원 10-2011-0130386, 특허출원 10-2011-0138193, 특허출원 10-2012-0071376, 특허출원 10-2012-0071380, 10-2012-149270 등에 기재된 재조합 미생물 등이 있으며, 해당 출원에 기재되어 있는 재조합 미생물의 구체적인 제조공정은 모두 본 특허발명에 적용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 배지는 통상의 기술자가 미생물 배양에 적용할 수 있는 것이면 제한되지 않으며, 구체적으로 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB) 배지, 리젠버그(Liesenberg) 배지, MRS 배지 등이 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 배지의 기본 조성에 탄소원으로 글리세롤을 포함하고 있는 것이 3-히드록시프로피온산의 합성면에서 바람직하다.

본 발명의 미생물의 배양방법은 통상의 기술자가 3-하이드로프로피온산의 생산에 적용할 수 있는 방법이면 제한되지 않고, 배양방법은 배치식, 유가식, 연속식이 가능하며, 바람직하게는 유가식 또는 연속식이다.

상기 포도당과 글리세롤의 중량비에서, 포도당 대 글리세롤의 초기 함량비율이 1:16인 경우보다 포도당의 비율이 낮아지면 균주 성장이 느려 3-히드록시프로피온산의 생산성 향상을 기대하기 어렵고, 포도당 대 글리세롤의 초기 함량비율이 1:2인 경우보다 포도당의 비율이 높아지면 3-하이드록시피온산의 합성에 관여하는 유전자의 발현에 보인자로 사용되는 사이클릭에이엠피(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)가 생성되지 않기 때문에, 3-히드록시프로피온산 생산에 필요한 글리세롤 탈수효소와 3-히드록시프로피온알데히드의 합성량이 적어지거나 발현이 되지 않아 3-히드록시프로피온산의 생산량이 감소하게 된다.

따라서 배양 시작시 배지내 포도당 대비 글리세롤의 중량 비율은 2 내지 16인 것이 바람직하며, 그 중에서도 2 내지 6인 것이 3-히드록시프로피온산의 합성면에서 더 바람직하다. 특히, 포도당 대 글리세롤의 중량 비율이 1:4인 경우 3-히드록시프로피온산의 합성이 가장 바람직하다.

본 발명의 배양배지의 배양 초기 글리세롤 함량은, 배지 부피를 기준으로 40 내지 120 g/ℓ, 바람직하게는 60 내지 100 g/ℓ일 수 있다. 글리세롤이 상기 범위 내로 포함되는 경우 3-히드록시프로피온산의 합성 및 미생물의 균체 성장이 우수하다.

상기 포도당은 배양 초기 배양배지 부피 대비 5 내지 60 g/ℓ, 바람직하게는 5 내지 40 g/ℓ 로 포함될 수 있다.

또한 본 발명에서는 배양 중 글리세롤을 포함하는 피딩용액을 공급하여 배양 동안 배양배지 내 글리세롤 함량을 적절한 농도를 유지하는 것이 바람직하다. 배양 중 글리세롤은 배양배지 부피를 기준으로 20 내지 60g/ℓ, 그 중에서도 40 내지 50g/ℓ를 유지하는 것이 3-히드록시프로피온산의 합성 및 미생물의 균체 성장면에서 가장 바람직하다.

상기 피딩용액의 글리세롤 함량은 상기 배양배지의 초기 글리세롤 함량 대비하여 1 내지 10배일 수 있다. 즉, 피딩 용액 내 글리세롤의 함량은 40 내지 1200 g/ℓ, 바람직하게는 300 내지 800 g/ℓ 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 500 내지 700g/ℓ일 수 있다. 배양과정 동안 적절한 글리세롤 함량을 유지해야 3-히드록시프로피온산의 합성 및 균체 성장이 우수한데, 상기 농도를 유지하기 위해 투여하는 피딩용액의 글리세롤 함량이 40 g/ℓ이상인 경우 배양액 내 3-히드록시프로피온산 생산을 위한 기질인 글리세롤의 제공면에서 바람직하고, 피딩용액의 글리세롤 함량이 1200 g/ℓ 이하인 경우 고농도 글리세롤의 삼투압으로 인한 세포 성장 억제 방지면에서 바람직하다.

상기 피딩용액은 포도당을 포함하지 않아도 되나, 피딩용액의 글리세롤의 함량 대비 중량비율로 0.001 내지 1, 바람직하게는 0.001 내지 0.5에 해당하는 포도당을 추가로 포함할 수 있다.

상기 피딩용액을 공급하는 시기 및 횟수는 특별히 제한되지는 않으며, 상기 농도 범위를 유지하기 위한 적절한 범위 내에서 일회, 또는 수회로 나누어 공급할 수 있다. 예를 들어, 배양 초기 배양배지의 글리세롤의 함량이 80 g/ℓ, 포도당의 함량이 20g/ℓ인 배양배지에서 3-히드록시프로피온산 합성 미생물을 배양하다가 글리세롤의 함량이 50 g/ℓ되었을 때, 피딩용액을 수회로 나누어 공급하면서 배양배지의 글리세롤 함량을 50 g/ℓ로 유지할 수 있다.

본 발명의 3-히드록시프로피온산의 생산을 위한 배양조건은 통상의 미생물을 배양하는 조건이면 제한되지 않으나, 호기성 조건하에 pH 6.5 내지 7.5, 28℃ 내지 35℃에서, 30 내지 60시간 동안 배양하는 것이 미생물의 균체 확보 및 최종산물의 수율면에서 바람직하다. pH 7.0 내지 7.3, 30℃ 내지 33℃에서, 40 내지 60시간 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 3-히드록시프로피온산은 상술한 방법에 의하여 미생물을 배양한 후 그 배양액으로부터 3-히드록시프로피온산을 회수하는 과정을 통해 얻을 수 있다. 상기 3-히드록시프로피온산의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어 막분리, 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그래피, 용매추출, 반응추출 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로는 순도가 높은 물질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.

상기 제조된 3-히드록시프로피온산은 이를 전구체로 하여 아크릴산, 아크릴산 에스테르, 말론산, 1,3-프로판디올 등을 제조할 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

[ 제조예 ] 재조합 미생물의 제조

1) 쿠프리아비두스 네카터 ( Cupriavidus necator ) 유래의 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제 ( succinate semialdehyde dehydrogenase ) 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

한국특허출원 제2012-149270호에서와 같은 방법으로 3-히드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하였다.

쿠프리아비두스 네카터 ATCC 17699로부터 게놈 DNA를 추출하고 정방향 프라이머(AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC (NheI);서열번호 1) 및 역방향 프라이머(AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT (KpnI);서열번호 2)를 이용하여 PCR을 수행하여 gabD4 유전자를 증폭하고, NheI과 KpnI으로 절단하였다. 이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 1분 45초), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다. 증폭된 DNA를 동일 효소로 처리한 pTrcHisC 벡터(Invitrogen)에 도입하여 pTH-Cn-gabD4 벡터를 제작하였다.

2) 글리세롤 탈수효소 및 재활성화 인자의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제작

먼저, 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumonia DSM 2026)의 게놈 DNA로부터 dhaB123-gdrA 및 gdrB 유전자를 PCR 증폭하고 pET-Duet (Novagen)벡터의 NcoIEcoRI및 EcoRI-SalI 위치에 각각 삽입하여 pET-BAB 벡터를 제작하였다.

여기서, dhaB123-gdrA 유전자 증폭을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다: 정방향 프라이머(ATATCATGAAAAGATCAAAACGATTT (BspHI); 서열번호 3), 역방향 프라이머(AAAGAATTCCGCGAGCGCCCGTTTAATTC (EcoRI); 서열번호 4).

gdrB 유전자 증폭을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다: 정방향 프라이머(TTTGAATTCTAACGAGGGGACCGTCATGTC (EcoRI); 서열번호 5), 역방향 프라이머(ATAGTCGACTCAGTTTCTCTCACTTAACGG (SalI); 서열번호 6).

이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 5분(dhaB123-gdrA) 혹은 30초(gdrB)), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.

앞서 얻어진 pET-BAB 벡터에 pET-Duet 벡터로부터 pseudo-유전자를 PCR 증폭하여 삽입하는 방식으로 pET-BAB 벡터의 시작코돈을 포함하고 있는 NdeI 뒤에 NheI에 해당하는 염기서열(GCTAGC)을 추가하여 pET-BAB-(NheI) 벡터를 제작하였다.

이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초/ 72℃, 30초), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다. 사용된 프라이머쌍은 다음과 같다: 정방향 프라이머 (TTTCATATGGCTAGCGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTC (NdeI & NheI); 서열번호 7), 역방향 프라이머 (TTTGGTACCTTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTC (KpnI); 서열번호 8).

상기에서 제조한 pTH-Cn-gabD4를 NheI과 KpnI으로 절단한 다음 앞서 얻어진 pET-BAB-(NheI) 벡터에 각각 삽입하여 재조합 벡터 pET-BAB-gabD4를 제작하였다. 이렇게 제조된 재조합 벡터 pET-BAB-gabD4를 대장균BL21(DE3)에 형질전환시켜 본 발명에 따른 재조합 균주를 제작하였다.

[ 비교예 1]

액상 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB)배지(트립톤 10.0g/ℓ, 효모추출액 5.0g/ℓ, 염화나트륨 10.0g/ℓ) 50ml에, 상기 제조예의 재조합 균주를 접종하였다. 접종 후 진탕 배양기를 이용하여 33℃에서, 250 RPM 속도로 교반하며 약 12시간 배양하여 균체를 600nm에서 흡광도 측정시 약 2.0 이상이 될 때까지 배양하였다.

이후 1.5L 발효기를 이용하여, 상기 배양액 전부를 리젠버그 배지(Risenberg Medium) 600ml에 각각 접종하였으며, pH 7.0, 33℃ 상태로 배양하였다. 공기(Air)의 공급은 1 vvm, 교반속도는 800 rpm으로 하여 배양을 수행하였다. 이후 균체의 흡광도(600nm)가 0.6~0.8이 되었을 시 배지 내 0.05mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside) 첨가를 통해 도입효소의 발현유도(induction)를 실시하였으며 이와 동시에 보효소(vitamin B₁₂) 50μM를 배지 중에 보충하였다.

이후 배양액의 글리세롤 농도가 50 g/ℓ 에 도달하면, 표 2의 조성을 갖는 피딩용액(A) 액체 배지를 공급하여 배양액 내의 글리세롤 함량을 50~40 g/ℓ 내외로 유지시키는 방법으로 배양하면서 균체량 및 3-하이드록시프로피온산을 분석하였다.

LB (Luria-Bertani) 배지 조성

성분	g/ℓ
Tryptone	10.0
Yeast Extract	5.0
NaCl	10.0

리젠버그(Risenberg) 배지 및 피딩용액(Feedgin Solution)

성분	리젠버그(Risenberg) 배지	피딩용액(A)
Glycerol	80 g/ℓ	700 g/ℓ
KH₂PO₄	13.5 g/ℓ
Citric acid	1.7 g/ℓ
MgSO₄.7H₂O	1.35 g/ℓ	20 g/ℓ
FeSO₄.7H₂O	205.0 ㎎/ℓ
MnSO₄.5H₂O	75.0 ㎎/ℓ
CaCl.2H₂O	10.0 ㎎/ℓ
CuSO₄.5H₂O	8.0 ㎎/ℓ
ZnSO₄.7H₂O	70.0 ㎎/ℓ
H₃BO₃	6.0 ㎎/ℓ
Na₂MoO₄	5.0 ㎎/ℓ

[ 비교예 2]

비교예 1과 같이 배양하되 발현 유도 후 배양액의 글리세롤 농도가 50g/ℓ 에 도달하면, 표 3의 조성을 갖는 피딩용액(3) 액체 배지를 공급하여 배양액 내의 Glucose농도를 10 g/ℓ 내외, 글리세롤 함량을 50 g/ℓ 내외로 유지시키는 방법으로 배양하면서 균체량 및 3-하이드록시프로피온산을 분석하였다.

[ 실시예 1]

액상 루리아 베르타니(Luria Bertani, LB)배지(트립톤 10.0 g/ℓ, 효모추출액 5.0 g/ℓ, 염화나트륨 10.0 g/ℓ) 50ml에, 상기 제조예의 재조합 균주를 접종하였다. 접종 후 진탕 배양기를 이용 33℃, 교반속도 250 RPM 으로 약 12시간 배양하여 균체를 600nm에서 흡광도 측정시 약 2.0 이상이 될 때까지 배양하였다.

이후 1.5L 발효기를 이용하여, 상기 배양액 전부를 포도당이 5 g/ℓ로 포함된 리젠버그 배지(Risenberg Medium) 600ml에 접종하였으며, pH 7.0, 33℃ 상태로 배양하였다. 공기(Air)의 공급은 1 vvm, 교반은 800 rpm으로 배양을 수행하였다. 이후 균체의 흡광도(600nm)가 0.6~0.8이 되었을 시, 배지 내 0.05mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside) 첨가를 통해 도입효소의 발현유도(induction)를 실시하였으며 이와 동시에 보효소(vitamin B₁₂) 50μM를 배지 중에 보충하였다.

이후 발효조에 대하여 리젠버그 액체 배지의 글리세롤 농도가 50 g/ℓ 에 도달하면, 표 3의 조성을 갖는 피딩용액(3) 액체 배지를 공급하여 배양액 내의 포도담 함량을 10 g/ℓ 내외, 글리세롤 함량을 50~10 g/ℓ 내외로 유지시키는 방법으로 배양하면서 균체량 및 3-하이드록시프로피온산을 분석하였다.

[ 실시예 2]

실시예 2는 초기 배지로 포도당을 10 g/ℓ 함유하는 리젠버그 배지(Risenberg Medium)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[ 실시예 3]

실시예 3은 초기 배지로 포도당을 20 g/ℓ 함유하는 리젠버그 배지(Risenberg Medium)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[ 실시예 4]

실시예 4는 초기 배지로 포도당을 40 g/ℓ 함유하는 리젠버그 배지(Risenberg Medium)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[ 실시예 5]

피딩용액의 글루코스 농도를 조절하면서 3-히드록시프로피온산을 생산하였다. 실시예 1과 같이 배양하되 초기 배지를 포도당이 20 g/ℓ로 포함된 리젠버그 배지(Risenberg Medium)를 사용하고, 표 3의 조성을 갖는 피딩용액(2)를 공급하여 배양하면서 균체 성장과 3-히드록시프로피온산 생산량을 측정하였다.

[ 실시예 6]

실시예 6은 표 3의 조성을 갖는 피딩용액(1)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하였다.

성분	피딩용액(1)	피딩용액(2)	피딩용액(3)
Glycerol	700 g/ℓ	525 g/ℓ	350 g/ℓ
Glucose	-	175 g/ℓ	350 g/ℓ
MgSO₄.7H₂O	20 g/ℓ	20 g/ℓ	20 g/ℓ

각 실시예와 비교예의 배양 조건을 정리하면 하기 표 4와 같다.

	초기 함량		피딩용액
	글리세롤(g/ℓ)	포도당(g/ℓ)	글리세롤(g/ℓ)	포도당(g/ℓ)
실시예1	80	5	350	350
실시예2	80	10	350	350
실시예3	80	20	350	350
실시예4	80	40	350	350
실시예5	80	20	525	175
실시예6	80	20	700	0
비교예1	80	0	700	0
비교예2	80	0	350	350

[ 실험예 ]

1. 균체 성장 및 3-히드록시프로피온산 합성 측정

균체의 성장 정도는 600nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 3-히드록시프로피온산은 반응액 1 ㎖를 취하여 HPLC(Waters e2695)를 사용하여 정량하였다. HPLC 분석에 있어 Aminex HPX-87H 컬럼과 9% 아세토니트릴(acetonitrile)을 포함한 0.5% 황산을 용매로 사용하였으며, 컬럼의 온도는 35℃였으며, 검출기는 RI 및 UV/VIS(210 nm) 듀얼모드를 이용하였다.

2. 실험결과

1) 배양배지 내 포도당 및 글리세롤의 초기 함량에 따른 영향

배양배지 내 포도당 및 글리세롤의 초기 함량에 따른 균체 성장 측정 결과 및 3-히드록시프로피온산 합성양의 측정 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타냈다.

배양 결과, 포도당을 첨가하지 않고 배양한 경우(비교예 1,2)보다, 포도당을 첨가한 경우(실시예 1 내지 4) 균체량 및 3-히드록시프로피온산 생산이 증가하고 배양시간이 단축되는 것을 확인하였다. 즉, 글리세롤만을 포함하는 배지로 배양하는 경우(비교예 1), 균주의 성장도 더디고 이에 따라 3-히드록시프로피온산의 생산량도 낮음을 알 수 있다.

또한, 초기배지에는 포도당을 포함하지 않는 경우 피딩용액에 포도당을 공급하더라도(비교예 2) 초기 배지에 포도당을 첨가한 실시예들보다 균주의 성장 및 3-히드록시프로피온산의 생산량이 낮았다.

또한, 초기 배지에 포도당이 20 g/ℓ 포함(글리세롤 80 g/ℓ)된 경우(실시예 3), 균체의 성장이 적절하고 3-히드록시프로피온산이 최대로 생산됨을 확인하였다.

2) 배양 중 첨가되는 피딩용액 내 포도당 함량에 따른 영향

피딩용액 내 포도당의 함량에 따른 균체 성장 측정 결과 및 3-히드록시프로피온산 합성양의 측정 결과를 각각 도 3 및 도 4에 나타냈다.

실험결과, 피딩용액내 포도당 농도가 감소함에 따라 3-히드록시프로피온산의 최종 생산 농도가 증가하여 포도당을 넣지 않은 경우(실시예 6)의 3-히드록시프로피온산 생산량이 40.08g/ℓ로 가장 높았다.

결론적으로, 본 발명은 포도당 첨가를 통하여 글리세롤만을 탄소원으로 사용하는 경우 나타나는 균체 성장저하 현상을 완화시켜 3-히드록시프로피온산 농도를 비교예 대비 27 % ~ 51 % 증가시켰으며, 생산성은 시간당 0.64 g/ℓ 수준에서 1.12~1.27 g/ℓ로 향상시켰음을 알 수 있다. 또한, 피딩용액 내 포도당 농도를 조절하여 최종 3-히드록시프로피온산 생산성을 글리세롤만 사용한 배양 결과 대비 약 60% 이상 증가시킬 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Samsung Petrochemical Co., Ltd. <120> METHOD OF PRODUCITON FOR 3-HYDROXYPROPIONIC AICD BY USING GLYCEROL AND GLUCOSE <130> DP120241 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for gabD4 of Cupriavidus necator <400> 1 aaagctagca tgtaccagga tctcgccc 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for gabD4 of Cupriavidus necator <400> 2 aatggtacct caggcctggg tgatgaactt 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for dhaB123-gdrA of Klebsiella pneumonia <400> 3 atatcatgaa aagatcaaaa cgattt 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for dhaB123-gdrA of Klebsiella pneumonia <400> 4 aaagaattcc gcgagcgccc gtttaattc 29 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for gdrB of Klebsiella pneumonia <400> 5 tttgaattct aacgagggga ccgtcatgtc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for gdrB of Klebsiella pneumonia <400> 6 atagtcgact cagtttctct cacttaacgg 30 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pseudo gene of pET-Duet vector <400> 7 tttcatatgg ctagcgctcg tcgtttggta tggcttc 37 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pseudo gene of pET-Duet vector <400> 8 tttggtacct tttgccttcc tgtttttgct c 31

Claims

글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법에 있어서, 상기 배양은 포도당 대 글리세롤의 배양 초기 함량이 1:2 내지 1:16의 중량비로 함유된 배양배지에서 수행되고,
배양 초기의 배지 내 글리세롤 함량은 40 내지 120 g/ℓ이고,
상기 배양배지에 글리세롤을 포함하는 피딩용액을 공급하여 배양배지 내의 글리세롤 함량을 20g/ℓ 내지 60g/ℓ로 유지하는 것을 특징으로 하며,
상기 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 합성하는 미생물은 글리세롤 탈수효소(dehydratase)를 암호화하는 유전자 및 알데히드 탈수소효소(dehydrogenase)를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물이고,
상기 재조합 미생물의 숙주세포는 에스케리키아 (Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속으로 이루어진 미생물에서 선택되며,
상기 글리세롤 탈수효소는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 또는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)에서 유래하는 것이고,
상기 알데히드 탈수소효소는 호모 사피엔스(Homo sapiens), 효모(S. cerevisiae), 또는 대장균(E. coli) 유래의 3-히드록시프로피온알데히드 탈수소효소, 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제, 또는 쿠프리아비두스 네카터 (Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 탈수소효소인,
3-히드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서,
배양 초기에 상기 포도당은 5g/ℓ 내지 60 g/ℓ로 포함되는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서
상기 재조합 미생물의 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)이고,
상기 글리세롤 탈수효소는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 DhaB1, DhaB2 및 DhaB3, 또는 클로스트리디움 부티리쿰 유래의 DhaB1이며,
상기 알데히드 탈수소효소는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래의 ALDH2, 효모(S. cerevisiae) 유래의 ALD4, 대장균(E. coli) 유래의 AldA, AldB 또는 AldH, 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제, 또는 쿠프리아비두스 네카터 (Cupriavidus necator) 유래의 gabD4인,
3-히드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 배양배지에 글리세롤을 포함하는 피딩용액을 공급하여 배양배지 내의 글리세롤 함량을 40g/ℓ 내지 50g/ℓ로 유지하는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 피딩용액의 글리세롤 함량은 상기 초기 배양배지의 글리세롤 함량 대비 1 내지 10배인 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 피딩용액이 포도당을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.
제6항에 있어서,
상기 피딩용액의 포도당 함량은 상기 피딩용액의 글리세롤 함량 대비 0.001 내지 1인 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법.