이에, 본 발명자들은 3-HP 생산효소의 발현을 효율적으로 유지하기 위하여 3-HP 에 의해 발현이 유도(induction)되는 특이한 유전자 전사 프로모터 시스템을 다양한 미생물에서 발견하고 이들의 유전적, 생화학적 특징을 조사하였다. 이 프로모터 시스템은 아직 문헌에 한 번도 보고된 적이 없는 특이한 시스템으로 3-HP와 결합하는 전사촉진 단백질과 이 단백질이 특이적으로 결합하는 DNA 서열로 이루어져 있었다. 본 발명자들은 이 프로모터 시스템을 사용하여 DhaB, GdrAB 및 KGSADH를 과발현함으로써 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 고농도로 생산할 수 있는 재조합 균주로 개발하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 또는 이의 유사체에 반응하는 LysR 단백질과의 결합 부위를 포함하는 3-HP 또는 이의 유사체 유도성 프로모터를 제공한다.
또한, 본 발명은 3-HP 또는 이의 유사체 유도성 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 3-HP 또는 이의 유사체 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수도 있다. 보다 바람직하게는, 상기 외래 단백질은 글리세롤 디하이드라테이즈(glycerol dehydratase; DhaB), 글리세롤 디하이드라테이즈 재활성화 효소(DhaB reactivase; GdrAB) 또는 α-케토글루타릭 세미알데하이드 디하이드라지네이즈(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase; KGSADH)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 바람직하게는 상기 미생물은 3-HP 생산능을 가진 미생물일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 미생물은 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas
denitrificans)일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 미생물은 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas
denitrificans) 균주에서 3-HP 분해에 관련된 3hpdh, 3hibdh
및 mmsadh 유전자가 결실된 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) Δ3hpdhΔ3hibdhIV△3hibdhI 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-HP 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP) 또는 이의 유사체에 반응하는 LysR 단백질을 코딩하는 lysR 유전자, 상기 LysR 단백질과의 결합 부위를 포함하는 프로모터 및 발현 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 3-HP 또는 이의 유사체 반응성 재조합 유전자 발현 카세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 3-HP 또는 이의 유사체 반응성 재조합 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 3-HP 또는 이의 유사체 반응성 재조합 유전자 발현 카세트가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 재조합 유전자 발현 카세트를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명에서 상기 재조합 유전자 발현 카세트를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 발현 목적 단백질 생산방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 3-HP를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 LysR 단백질 또는 상기 프로모터는 3-HP 분해능을 가진 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter
denitrificans), 아시도보락스 아베네(Acidovorax
avenae) subsp., 아시도보락스(Acidovorax
sp
.), 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter
baumannii), 에로모나스 하이드로필리아(Aeromonas
hydrophilia), 아그로박테리움(Agrobacterium
sp
.), 알칼리제네스 패칼리스(Alcaligenes
faecalis), 알칸니보락스 홍덴젠시스(Alcanivorax
hongdengensis), 알리시클리필러스 데니트리피칸스(Alicycliphilus
denitrificans), 알테로모나스 마리나(Alteromonas
marina), 아미코라톱시스(Amycolatopsis
sp
.), 안에로믹소박터 디할로제난스(Anaeromyxobacter
dehalogenans), 아조스피릴럼 브라질렌스(Azospirillum
brasilense), 아조토박터 비네란디(Azotobacter
vinelandii), 바이예린키아 인디카(Beijerinckia
indica), 보르데텔라 아비움(Bordetella
avium), 브라디라조비움 자포니컴(Bradyrhizobium
japonicum), 버크홀데리아 암비파리아(Burkholderia
ambifaria), 카테눌리스포라 애시디필리아(Catenulispora
acidiphilia), 카울로박터(Caulobacter
sp
.), 카스텔라니엘라 디프라그란스(Castellaniella
defragrans), 크로모박테리움 비오라세움(Chromobacterium
violaceum), 콜리모나스 아레네(Collimonas
arenae), 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas
testosteroni), 코리네박테리움 비타에러미니스(Corynebacterium
vitaeruminis), 쿠프리아비더스 네카터(Cupriavidus
necator), 커비박터 그라실러스(Curvibacter
gracilus), 델프티아 액시도보란스(Delftia
acidovorans), 페리모나스 바레아리카(Ferrimonas
balearica), 글라시에코라 니트라티레듀센스(Glaciecola
nitratireducens), 고르도니아 브론치알리스(Gordonia
bronchialis), 하헬라 치유엔시스(Hahella
chijuensis), 할로모나스 에롱가타(Halomonas
elongata), 히르치아 리토레아(Hirschia
litorea), 이디오마리나(Idiomarina
sp.), 잔티노박테리움 리비덤(Janthinobacterium
lividum), 키타사토스포라 세타에(Kitasatospora
setae), 쿠츠네리아 알비다(Kutzneria
albida), 메틸로박테리움(Methylobacterium
sp
.), 메틸로시스티스(Methylocystis sp.), 노보스핑고비움(Novosphingobium
sp.), 오셔니모나스 스미르노비(Oceanimonas
smirnovii), 파라코커스(Paracoccus
sp
.), 파비바큘럼 라바멘티보란스(Parvibaculum
lavamentivorans), 페닐로박테리움 쿤샤넨시스(Phenylobacterium
kunshanensis), 포토박테리움 가에트불레다(Photobacterium
gaetbuleda), 폴리뉴클레오박터 네세사리어스 아심비오티커스(Polynucleobacter
necessarius
asymbioticus), 슈도알테로모나스 카라지노보라(Pseudoalteromonas
carrageenovora), 슈도굴벤키아니아(Pseudogulbenkiania sp.), 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas
denitrificans) ATCC13867, 슈도모나스 크낵뮤시(Pseudomonas
knackmussii), 슈도모나스 프로테젠스(Pseudomonas
protegens), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas
fluorescens), 슈도잔토모나스 스파딕스(Pseudoxanthomonas
spadix), 사이크로박스 페닐피루비커스(Psychrobacter
phenylpyruvicus), 랄스토니아 옥살라티카(Ralstonia
oxalatica), 로도마이크로비움 반니엘리(Rhodomicrobium
vannielli), 세그닐리파러스 로턴더스(Segniliparus
rotundus), 세와넬라 원이덴시스(Shewanella
oneidensis), 시미두이아 아가로보란스(Simiduia
agarovorans), 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium
meliloti), 스핑고비움 클로로페놀리컴(Sphingobium
chlorophenolicum), 스핑고모나스 위티치(Sphingomonas
wittichii), 스핑고픽시스 알라스켄시스(Sphingopyxis
alaskensis), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas
maltophilia), 스트렙토마이시스 노도서스(Streptomyces
nodosus), 타틀록키아 믹다데이(Tatlockia
micdadei), 타라소스피라 시아메넨시스(Thalassospira
xiamenensis), 배리오보락스 파라독서스(Variovorax
paradoxus), 버미네프로박터 에이세니에( Verminephrobacter
eiseniae), 비브리오 퍼니시(Vibrio
furnissii), 잔토박터 오토트로피커스(Xanthobacter
autotrophicus), 잔토모나스 캄페스트리(Xanthomonas
campestri) 및 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 LysR 단백질은 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 구조로 이루어져 DNA와 결합하는 N-말단 도메인, 3-HP 또는 이의 유사체와 결합하는 C-말단 도메인 및 LysR 단백질 이합체 안정화에 기여하는 C-말단 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 구조로 이루어져 DNA와 결합하는 N-말단 도메인은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 3-HP 또는 이의 유사체와 결합하는 C-말단 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 LysR 단백질 이합체 안정화에 기여하는 C-말단 도메인은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 4에 기재된 "X" 또는 "Xaa"는 특정 아미노산이 아니라, 어떠한 아미노산도 포함될 수 있음을 의미한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 LysR 단백질은 표 4 및 표 5에 기재된 Genebank ID를 가진 LysR 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 LysR 단백질과의 결합 부위는 LysR 단백질 이량체(dimer)가 2개 결합할 수 있으며, 서열번호 5 내지 서열번호 43으로 이루어진 군에 선택된 어느 하나로 표시된 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 43으로 이루어진 군에 선택된 어느 하나로 표시된 염기서열로 이루어진 역반복(Inverted Repeat) 서열 및 이와 쌍을 이루는 역반복 서열이 2번 반복될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 LysR 단백질과의 결합 부위는 서열번호 44 또는 서열번호 45로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.
상기 서열번호 5 내지 서열번호 43에 기재된 "n"은 특정 염기가 아니라, 어떠한 염기도 포함될 수 있음을 의미한다.
상기 서열번호 44 또는 서열번호 45는 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans) ATCC13867에서 유래한 프로모터 염기 서열이다.
바람직하게는, 상기 유사체는 3-하이드록시이소뷰티레이트(3-hydroxyisobutyrate; 3HIB) 또는 3-하이드록시뷰티레이트(3-hydroxybutyrate; 3-HB) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 3-하이드록시프로피온산에 의한 유전자 발현 시스템 규명
1. 재료
아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans), 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii)을 포함한 다수의 균주는 한국미생물보존센터 KCCM으로부터 획득하였다. 아시도보락스 아베네(Acidovorax avenae) subsp., 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)을 포함한 다수 균주에 대해서는 한국 미생물 자원센터 KCTC에서 구매하였다. 알리시클리필러스 데니트리피칸스(Alicycliphilus denitrificans), 안에로믹소박터 디할로제난스(Anaeromyxobacter dehalogenans)카를 포함한 다수의 균주는 독일의 DSM에서 획득하였다. 에어로모나스 하이드로필리아(Aeromonas
hydrophilia), 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas
denitrificans) ATCC13867를 포함한 다수의 균주는 미국의 ATCC에서 구매하였다. 프라이머는 코스모진텍(서울, 한국)에서 합성하였다. 3-HP는 일본에 도쿄 카세이 코교 (TCI America, Portland, OR)에서 구입하였다. 효모추출물 (Cat. 212750), 트립톤 (Cat. 211705)은 Difco에서 구입하였다 (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ). 언급하지 않은 모든 화학물질 및 효소는 시그마 알드리치에서 구입하였다 (St. Louis, MO).
2. 증식세포에서의 3-HP 동화 및 휴지세포에서의 3-HP 분해
Shake flask 실험은 250mL non-baffled 삼각플라스크에 30mL의 부피로 진탕배양기에서 온도 37℃, 교반속도 200rpm 조건으로 수행하였다. 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)에 의한 3-HP 동화에 대한 실험은 250mL non-baffled 삼각플라스크에 30mL의 부피로 개량된 M9 배지를 넣고 진탕배양기에서 온도 37℃, 교반속도 200rpm 조건으로 수행하였다. 균주를 배양하기 위해 사용한 개량된 M9 배지의 조성은 100mM 인산염 완충용액 (pH 7.0), MgSO4·7H2O 0.25 g/L, NaCl 1.0 g/L, NH4Cl 1.0 g/L, 3-HP 25 mM 으로 하였다.
휴지세포 실험은 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)를 포함 총 69종의 미생물에서 3-HP 분해에 대해 알아보기 위해 수행되었으며, 이 실험에 사용된 박테리아들은 표 1에 나타내었다. 활성 세포를 준비하기 위해 각 균주에 따라 명시된 영양강화 배지에 3-HP를 포함하여 250mL non-baffled 삼각플라스크에 50mL의 부피로 배양하였다. 균주 배양은 37℃에서 이루어졌으며, 세포의 OD600가 1-1.5 정도 되었을 때 5000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수득하였다. 침전된 세포는 100mM 인산염 완충용액 (pH 7.0)을 이용하여 세척한 후, 동일한 완충용액 안에 3-HP 25±2 mmol/L를 넣고 재현탁하였다. 앞서 언급한 세포 수득, 세척 및 재현탁 과정은 3-HP 분해 실험 전에 이루어졌다. 시료는 3-HP 농도를 조사하기 위해 주기적으로 채취되었다.
본 발명에 사용된 균주
Genus No.
|
균주
|
배지
|
배양
온도
|
호기
조건
|
구입처
|
1
|
Achromobacter denitrificans
|
Nutrient medium |
26℃ |
Aerobic |
KCCM |
2
|
Acidovorax avenaesubsp.
|
Nutrient medium |
25℃ |
Aerobic |
KCTC |
|
Acidovorax sp
|
Tryptone soya broth |
28℃ |
Aerobic |
DSM |
3
|
Acinetobacter baumannii
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
4
|
Aeromonas hydrophilia
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
ATCC |
5
|
Agrobacterium sp.
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
6
|
Alcaligenes
faecalis
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
7
|
Alcanivorax
hongdengensis
|
Nutrient medium |
26℃ |
Aerobic |
KCTC |
8
|
Alicycliphilus
denitrificans
|
Nutrient medium |
26℃ |
Aerobic |
DSM |
9
|
Alteromonas
marina
|
Marine broth 2216 (DIFCO 0791) |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
10
|
Amycolatopsis
sp
.
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
11
|
Anaeromyxobacter
dehalogenans
|
R2A medium |
28℃ |
Microaerobic |
DSM |
12
|
Azospirillum
brasilense
|
Azospirillum medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
13
|
Azotobacter
vinelandii
|
Azotobacter medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
14
|
Beijerinckia
indica
|
Beijerinckia medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
15
|
Bordetella
avium
|
Trypticase soy broth |
37℃ |
Aerobic |
KCCM |
16
|
Bradyrhizobium
japonicum
|
Rhizobium medium |
26℃ |
Aerobic |
KCCM |
17
|
Burkholderia
ambifaria
|
Trypticase soy broth |
28℃ |
Aerobic |
KCCM |
18
|
Catenulispora
acidiphilia
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
19
|
Caulobacter
sp
.
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
20
|
Castellaniella
defragrans
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
21
|
Chromobacterium
violaceum
|
Nutrient medium |
26℃ |
Aerobic |
ATCC |
22
|
Collimonas
arenae
|
Nutrient medium with 5g/L NaCl |
28℃ |
Aerobic |
DSM |
23
|
Comamonas
testosteroni
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
24
|
Corynebacterium
vitaeruminis
|
Corynebacterium broth |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
25
|
Cupriavidus
necator
|
Nutrient medium |
26℃ |
Aerobic |
KCCM |
26
|
Curvibacter
gracilus
|
Peptone, yeast extract with magnesium sulfate |
30℃ |
Aerobic |
ATCC |
27
|
Delftia
acidovorans
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
28
|
Ferrimonas
balearica
|
Triple-sugar-iron medium(Difco) |
28℃ |
Aerobic |
KCTC |
29
|
Glaciecola
nitratireducens
|
Broth Medium Marine Broth 2216 (BD 279110) |
25℃ |
Aerobic |
KCTC |
30
|
Gordonia
bronchialis
|
Trypticase soy broth |
28℃ |
Aerobic |
KCCM |
31
|
Hahella
chijuensis
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
32
|
Halomonas
elongata
|
Halomonas medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
33
|
Hirschia
litorea
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
34
|
Idiomarina
sp
.
|
Bactomarine broth(Difco 2216) |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
35
|
Janthinobacterium
lividum
|
Nutrient medium |
25℃ |
Aerobic |
KCTC |
36
|
Kitasatospora
setae
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
37
|
Kutzneria
albida
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
38
|
Methylobacterium
sp
.
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
39
|
Methylocystis
sp
.
|
NMS medium for Methanotrophs with 20% methane(v/v) in the air head space |
28℃ |
Aerobic |
ATCC |
40
|
Novosphingobium
sp
.
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
41
|
Oceanimonas
smirnovii
|
Marine Broth 2216 (BD 279110) |
23℃ |
Aerobic |
ATCC |
42
|
Paracoccus
sp
.
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
43
|
Parvibaculum
lavamentivorans
|
Peptone 10.0 g /L; NaCl 5.0 g/L; CaCl2H2O 0.1 g/L; Tween 80 10.0 g/L |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
44
|
Phenylobacterium
kunshanensis
|
R2A medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
45
|
Photobacterium
gaetbuleda
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
46
|
Polynucleobacter
necessarius asymbioticus
|
R2A medium |
28℃ |
Aerobic |
DSM |
47
|
Pseudoalteromonas
carrageenovora
|
Sea water yeast peptone broth |
20℃ |
Aerobic |
KCCM |
48
|
Pseudogulbenkiania sp
.
|
Nutrient medium |
37℃ |
Aerobic |
DSM |
49
|
Pseudomonas
denitrificans ATCC13867
|
Minimal medium |
37℃ |
Aerobic |
ATCC |
|
Pseudomonas
knackmussii
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
DSM |
|
Pseudomonas
protegens
|
Nutrient medium |
28℃ |
Aerobic |
DSM |
|
Pseudomonas
fluorescens
|
1213 King medium B |
28℃ |
Aerobic |
ATCC |
50
|
Pseudoxanthomonas
spadix
|
R2A medium |
35℃ |
Microaerobic |
KCTC |
51
|
Psychrobacter
phenylpyruvicus
|
Trypticase soy broth |
30℃ |
Aerobic |
ATCC |
52
|
Ralstonia
oxalatica
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
53
|
Rhodomicrobium
vannielli
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
54
|
Segniliparus
rotundus
|
Bacto Middle brook7H10 medium(Difco 262710) |
28℃ |
Aerobic |
DSM |
55
|
Shewanella
oneidensis
|
Trypticase soy broth |
30℃ |
Aerobic |
ATCC |
56
|
Simiduia
agarovorans
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
57
|
Sinorhizobium
meliloti
|
Rhizobium medium |
26℃ |
Aerobic |
KCCM |
58
|
Sphingobium
chlorophenolicum
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
59
|
Sphingomonas
wittichii
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
60
|
Sphingopyxis
alaskensis
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
61
|
Stenotrophomonas
maltophilia
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
62
|
Streptomyces
nodosus
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
63
|
Tatlockia
micdadei
|
BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract) medium |
37℃ |
Microaerophilic |
DSM |
64
|
Thalassospira
xiamenensis
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
65
|
Variovorax
paradoxus
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCTC |
66
|
Verminephrobacter
eiseniae
|
R2A medium |
28℃ |
Aerobic |
DSM |
67
|
Vibrio
furnissii
|
Bactomarine broth(Difco 2216) |
28℃ |
Aerobic |
KCCM |
68
|
Xanthobacter
autotrophicus
|
Nutrient medium |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
69
|
Xanthomonas
campestri
|
Nutrient medium |
26℃ |
Aerobic |
KCCM |
|
Xanthomonas
oryzae
|
IFO medium 802 |
30℃ |
Aerobic |
KCCM |
3. RNA 추출 및 역전사 중합효소 연쇄반응
슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) ATCC 13567 균주 배양에는 M9 배지가 사용되었으며, 표 1에 나타낸 다른 미생물들의 배양에는 각 균주에 따라 명시된 영양 배지가 사용되었다. 3-HP에 따른 영향을 조사할 때는 제시된 배지 안에 25mM의 3-HP가 첨가되었다. 모든 균주는 진탕배양기에서 온도 37℃, 교반속도 200rpm으로 호기성 조건이 되도록 하여 배양되었으며, 배양세포가 지수성장기에 도달하였을 때 세포를 수득하였다. 세포의 양이 대략 5×108이 되도록 채취한 뒤 5000g에서 10분 동안 원심분리를 수행하였다. 침전된 세포에 즉시 RNA later 용액 (Ambion,, UK) 500 μl넣고 재현탁하였다. RNA는 total RNA isolation kit (Macherey-Nagel, Germany)로 추출하였다. 20 μl first-strand cDNA 합성을 위해 1 μg의 total RNA가 사용되었으며, cDNA 합성을 위해 Invitrogen에서 제공하는 SuperScript Ⅲ first-strand synthesis system이 이용되었다.
역전사 중합효소 연쇄 반응은 SYBR green step를 이용하여 One Real Time PCR system (Applied Biosystems, USA) 장비로 수행되었다. 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 반응액 20μL에는 300ng cDNA, 10μL 2×Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK), 5pmol of forward and reverse primers, DEPC treated water가 포함되었다. 역전사 중합효소 연쇄반응을 위한 조건은 다음과 같이 결정하였다: denaturation, 1 cycle of 95℃ for 30 s; amplification, 40 cycles of 95℃ for 15 s, 62℃ for 30 s, and 72℃ for 30 s. 역전사 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 전 정확한 mRNA 수준 측정을 위해 실험에 사용된 프라이머 효율 확인은 PCR을 통해 이루어졌으며, mRNA 수준에 대한 relative quantification은 ΔΔCT 방법을 사용해 계산되었다.
4. LysR 단백질의 유전자 클로닝, 단백질 생산, 분리 정제
슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)의 경우 3-HP를 분해하는데 관여하는 2개의 operon, 즉 3HPDH (이하 C3 시스템) 및 3HIBDH-IV (이하 C4 시스템)이 존재하였고 이들의 전사를 조절하는 LysR 단백질, C3-LysR 과 C4-LysR이 존재하였다. 이 중 C4-LysR에 대하여 단백질 생산을 시도하였다. E.
coli BL21 (DE3)를 숙주(host)로 그리고 플라스미드 클로닝, 유지 등을 위해서는 E.
coli Top10을 사용하였다. C4 LysR 유전자를 P.
denitrificans genome 에서 PCR로 증폭하여 pET30b(+) 프라스미드에 클로닝한 후 E.
coli Top10에 넣어 염기서열(sequence)을 확인하고 E.
coli BL21 (DE3)에 넣어주었다. 단백질 정제를 위해 C-말단(C-terminus) 부위에 His tag을 붙여주었다. LysR 단백질을 활성이 있는 수용성(soluble) 형태로 발현하기 위해 pG-KJE8, pGRO7, pG-TF2, pTF-16 등 여러 샤페론 플라스미드(chaperone plasmid)와 함께 co-expression 시켰다. 배지로는 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), L-아라비노오스(L-arabinose) 등이 적절히 포함된 LB 배지를 사용하였고 호기적 조건에서 배양하였다. 세포농도가 0.6 OD에 이르렀을 때 0.1 mM의 IPTG를 추가하여 LysR 단백질의 생산을 유도하였다. 단백질의 수용성 발현을 위해 여러 배양 조건을 검토한 후 최종적으로 25℃, 150 rpm 에서 10시간 배양하였다. 배양된 세포는 원심분리하여 얻고 100 mM (pH 7) 인산 완충액(buffer)으로로 세척한 후 결합 완충액(binding bufffer)에 재현탁시키고 French Press로 파쇄하였다. 이후 다시 원심분리하여 고형분과 미파쇄 세포를 제거하고 용액부분을 Ni-affinity column을 이용하여 정제하였다. 이후 20% 글리세롤(glycerol) 용액에서 80℃에 보관하였다.
5. in vitro 조건에서 단백질-DNA 결합 조사를 위한 전기영동 이동거리 변화 측정(Electrophoretic Mobility Shift Assay; EMSA)
분리한 C4-LysR 과 프로모터 부위의 결합을 in vitro 에서 연구하기 위하여 프로모터 부위의 DNA 단편(fragment)를 합성하였다(도 7). 3 가지 종류의 단편(fragment)을 합성하였는데 첫째, C4-LysR 유전자와 mmsadh 유전자 사이 전체 DNA 단편(fragment)으로 전사조절 단백질이 결합(binding) 한다고 예상되는 O1 및 O2 operator 2개가 모두 포함된 것 (F12로 명명), 둘째, O1 operator 부분만 포함하는 단편(fragment) (F12M으로 명명), 셋째, O2 operator 부분만 포함하는 단편(fragment) (F1M2로 명명) 등이었다. EMSA 실험은 Invitrogen 사의 Molecular Probes Fluorescence-based Mobility Shift Assay kit (fluorescence-EMSA)를 사용하여 진행되었다. 먼저 프로모터 부위 DNA 단편(fragment)을 glass fiber column 으로 정제한 후 결합 완충액(binding buffer)에서 정제한 LysR 단백질과 혼합하여 30분간 상온에서 반응시켰다. 이후 6% non-denaturing polyacrylamide gel에 로딩(loading) 한 후 30분간 220 V에서 pH 8의 TBE 완충액(buffer)에서 전개하였다. 이 후 gel을 fixing 한 후 DNA band를 확인하기 위해 SYBR Green EMSA로 염색(staining) 하고 gel documentation system (Bio-Rad)로 band intensity를 정량하였다. 단백질을 관찰할 경우 DNA-protein band를 SYPRO Ruby EMSA 용액으로 염색(staining) 하였다.
6. 분석 방법
세포 농도는 10mm 길이를 가지는 큐벳을 이용하여 양선 분광광도계 (Lambda 20, Perkin-Elmer, Norwalk, CT)로 측정하였다. 3-HP 농도는 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 측정하였다(Raj et al, 2008). HPLC 분석을 위해 채취한 시료는 10,000×g로 10분 동안 원심분리를 통해 세포 침전물을 제거하고, tuffryn 멤브레인 필터 (Acrodisc; Pall Life Sciences, Port Washington, NY)를 사용하여 시료 안에 남아 있는 세포를 제거하여 준비되었다. HPLC 분석에 사용된 컬럼은 300 mm × 7.8 mm Aminex HPX-87H (Bio-Rad, USA)로 65℃에서 2.5mmol/L의 H2SO4를 이동상으로 사용하였다.
7. 결과
(1) 슈도모나스
데니트리피칸스(
P. denitrificans
)에서
3-HP 유도성 프로모터의 스크리닝
3-하이드록시프로피온산은 자연환경에서 거의 존재하지 않는 탄소 화합물로, 탄소기질로서의 사용이나 생물학적 분해에 관한 보고가 거의 없다. 최근, 본 발명자들은 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)가 성장 및 비성장 상태에서 3-HP를 빠르게 분해하는 것을 발견하였다. 세포 성장 동안 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)는 3-HP를 단독 탄소원 및 에너지원으로 사용할 수 있었다 (도 1A). 세포가 성장하지 않는 동안에도 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)는 3-HP를 산소 존재 하에 분해하는 특성을 보여주었다(도 1B). 생물학적으로 3-HP의 분해는 환원성 경로 혹은 산화성 경로를 이용한다고 알려져 있다(도 2). 유전체 분석과 기체 크로마토그래피-질량분석법에 의한 대사체 분석을 통해 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)에서 3-HP의 분해는 산화경로를 이용하는 것으로 추정되었다. 이 경로에 따르면 3-하이드록시프로피오네이티드 디하이드로지네이즈(3HPDH)와 (메틸) 말로네이트-세미알데하이드 디하이드로지네이즈 (MMSADH)로 추정되는 두 효소가 연속적으로 3-HP를 메틸말로네이트 세미알데하이드로, 그리고 메틸 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다(도 2). 3HPDH 외에도 3-HP 및 비슷한 3-하이드록시산을 분해할 수 있는 것으로 추정되는 여러 가지 3-하이드록시부틸레이트 디하이드로지네이즈가 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)에서 확인되었다. 3-HP에 대해 활성을 가지는 여러 가지 효소들의 발현이 3-HP로 인해 유도되어 질 수 있을 가능성이 있었다. 3-HP 이화 작용 유전자들로 추정된 세 가지 유전자 (3hpdh, 3hibdhIV, mmsadh)의 mRNA 수준을 RT-PCR을 통하여 비교하였다(도 3). 이때 시그마 인자 70을 암호화하며 항존 유전자로 알려진 rpoD를 참조 유전자로 사용하였다. 그 결과 흥미롭게도 3-HP 분해에 관련한다고 추정된 이들 유전자들의 발현이 3-HP에 의하여 상당히 증가하는 것으로 관찰되었다. 세포가 3-HP에 노출되었을 때 3hpdh의 경우 46배 증가하였으며, 3hibdhIV는 146배, mmsadh는 137배까지 증가하였다. 이와 같은 유전자들의 상향 조절은 3-HP에 의해 유전자들의 프로모터가 유도되는 성질로 설명될 수 있다.
3hpdh, 3hibdhIV, mmsadh
유전자의 발현이 3-HP와 비슷한 크기를 갖는 그러나 구조적으로 다른 화합물에 의해 증폭될 가능성에 대하여 조사하였다(도 4 및 도 5). 이들 유전자는 모두 3-HP, 3-하이드록시이소뷰티레이트(3-hydroxyisobutyrate; 3HIB), 3-하이드록시뷰티레이트(3-hydroxybutyrate; 3-HB)에 의해 증폭이 유도되었다. 그러나 젖산(lactic acid), 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid), 1,3-프로판디올(1,3-propanediol), 2,3-부탄디올(2,3-butandiol) 등에 의해서는 증폭이 유도되지 않았다. 특이하게도 L-발린(L-valine)에 의해 증폭이 유도되었는데 이는 L-발린(L-valine)이 대사되는 과정에 3-HIB로 전환되기 때문인 것으로 추정되었다. 이로 미루어 전사 조절 단백질은 3-HP, 3-HIB, 3-HB 등에 특이적으로 반응하는 것으로 판단되었다.
(2) 3-HP 유도성 유전자 발현 시스템 분석
LysR 패밀리 전사조절자(LysR-type transcriptional regulators; LTTRs)는 방향족 화합물의 분해 경로와 같은 이화 과정을 조절하는 전사 활성인자로 알려져 있다. 일반적으로 LTTRs를 암호화하는 유전자는 방향족 화합물 분해에 관련된 유전자 집단의 앞부분에 존재하면서 화합물 분해 작용을 조절한다. 3-HP 분해 경로를 규명하기 위해서 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)의 3HPDH 및 3HIBDH-IV에 관련된 오페론의 유전자 구조 분석이 이루어졌다. 그 결과 3-HP 분해 유전자들의 앞쪽 부분에 LTTRs가 비슷한 유전자 배열로 위치하고 있음을 확인하였다(도 6). 이는 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)에서 3-HP 분해 유전자들의 발현이 LysR 단백질에 관련되어 있을 가능성을 나타낸다. 특징적으로 lysR 유전자와 LysR 단백질(이하, C4 화합물인 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase 유전자와 결합하는 LysR을 C4-LysR, 그리고 C3 화합물인 3-HP dehydrogenase의 유전자와 결합하는 LysR을 C3-LysR 이라고 칭함)에 의해 전사가 조절되는 유전자 (mmsadh, 3hibdh4, 3hpdh) 는 서로 반대되는 orientation으로 위치하였고, 두 가지 특정 결합 부위 즉, 보존적 T-N11-A 모티프를 가지는 조절결합위치(regulatory binding site; RS)와 35 RNA 중합효소 결합 위치 (-35 RNA polymerase binding site) 근처에 있는 활성결합위치 (activation binding site; AS)가 확인되었다 (도 6). 또한 이들 RS 및 AS는 LysR 단백질을 coding 하는 유전자의 10, -35 부위와 서로 overlap 되는 것이 확인되었다. 이로 미루어 lysR 유전자의 발현은 산물인 LysR에 의해 억제(repression) 되는 것으로 추정되었다.
P. denitrificans에 존재하는 C4 LysR 유도 프로모터에 대하여 보다 자세한 분석을 실시하였다. LysR 유전자와 mmsadh 유전자 사이에 존재하는 O1 및 O2 operator는 각각 mmsadh 전사 개시 사이트(transcription start site) 기준으로 -58 및 -9 위치에 존재하였고 역반복(inverted repeat) 서열을 가지고 있었다(도 7). 역반복(inverted repeat) 서열 혹은 palindromic 구조는 원핵세포의 operator 부위에 종종 나타나며 전사조절 단백질의 결합부위가 된다고 알려져 있다. O1 및 O2 site의 거리는 약 50 bp 정도이며 나선형 DNA 5바퀴에 해당하므로 LysR 단백질이 O1, O2 부위에 결합할 때 같은 방향에서 결합할 수 있을 것으로 추정되었다. O1 site의 한 쌍(dyad)은 15 bp 거리를 두고 9개의 염기로 구성되는데 단지 1개의 mismatch 만이 있어서 고도로 대칭적(symmetrical)이라는 것을 알 수 있었다. 반면 O2 site의 역반복(inverted repeat) 서열은 역시 9 bp 씩 반복되어 구성되었고 그 사이 간격은 11 bp로 다소 짧았다. 9개 중 6개가 mismatch 일 정도로 대칭(symmetry) 정도는 약하였다. 한편 O1, O2 operator에 존재하는 4개의 palindromic fragment의 상동성을 조사한 결과 TA
CGTGTAA 로 나타났으며 3, 4, 5번 위치의 염기(굵은 글씨)는 모든 fragment 에서 보존되어 있었고 2, 8 번 위치의 염기(밑줄)는 3개의 fragment에서 보존되어 있어서 이들 염기가 C4 LysR 단백질과의 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 추정되었다.
O1, O2 operator가 C4-LysR 단백질 생합성과 mmsadh 발현에 미치는 영향을 녹색형광단백질(green fluorescent Protein; GFP)를 리포터(reporter)로 사용하여 조사하였다(표 2). 표 2에서는 C4-LysR 단백질 및 O1, O2 operator가 C4-LysR 및 mmsadh 발현에 미치는 영향을 나타냈다. GFP의 상대적 크기를 3-HP 부재시 야생형(wildtype)과 비교하여 표시하였다. C4-LysR 단백질은 아예 존재하지 않거나 항시적 프로모터(constitutive promoter)에 의하여 생산되도록 하였고 GFP의 발현은 O1, O2 operator를 갖는 원래의 프로모터(promoter)에 의해 조절되도록 플라스미드(plasmid)를 만들고 이 플라스미드(plasmid)를 C4-LysR과 mmsadh 사이의 유전자가 결실된 P.
denitrificans 숙주에 삽입하여 실험을 진행하였다. GFP의 발현은 C4-LysR 단백질 자신에 의해 억제되었다. 즉 C4-LysR이 발현될 때 GFP 발현은 10배 이상 감소되었다. 또한 이 발현 조절은 3-HP의 존재 유무와 관계없이 일정하게 나타났다. 이를 통하여 C4-LysR mRNA의 전사는 C4-LysR 단백질에 의해 음성적으로(negative) 조절된다는 것을 알 수 있었다. 이 실험은 O1, O2 operator를 임의추출(randomize) 하여 대칭 쌍(symmetrical dyad)이 없어지도록 한 프로모터(promoter)를 이용하여 반복되었다. 그 결과 O1이나 O2 operator 부위가 임의추출(randomize) 되었을 경우 GFP의 발현이 C4-LysR 단백질에 의해 조절되지 않는 것으로 나타났다. 이 결과는 P.
denitrficans 균주 내에서 C4-LysR 단백질은 자기 자신에 의해 음성적으로(negative) 제어된다는 것을 보여준다.
한편 mmsadh 유전자 발현에 미치는 O1, O2 operator의 영향을 비슷한 방법으로 조사하였다. 즉 C4-LysR 단백질은 항시적으로(constitutive) 발현되도록 하고 O1, O2 프로모터를 갖는 프로모터 뒤에 GFP가 위치하도록 플라스미드를 제작하였다. 그리고 이때 O1 혹은 O2 site의 대칭 쌍(symmetrical dyad)이 임의추출(randomize) 되도록 O1 혹은 O2 operator를 돌연변이(mutation) 시켰다. 그 결과 O1, 혹은 O2 부위가 돌연변이(mutation)된 경우 3-HP에 의해 전사(transcription)가 상향조절(upregulation) 되는 현상이 없어졌다. 즉 O1, O2 operator 모두 3-HP에 의해 발현이 상향조절(upregulation) 되도록 하는데 필수적인 부위라는 뜻이다. 이로써 본 프로모터(promoter)는 O1, O2 operator 존재가 반드시 필요한 프로모터(promoter) 라는 것이 밝혀졌다.
Genes tested1
|
3-HP addition2
|
wildtype |
ΔC4-LysR |
O1 mutation3
|
O2 mutation3
|
O1 & O2 mutation3
|
C4-LysR |
w/o 3-HP |
1 |
10 |
10 |
1 |
10 |
w 3-HP |
1 |
10 |
10 |
1 |
10 |
mmsadh |
w/o 3-HP |
1 |
3 |
3 |
3 |
3 |
w 3-HP |
55 |
3 |
3 |
3 |
3 |
1리포터 단백질로 GFP가 사용되었다. 즉 C4-LysR 이나 mmsadh 위치에 GFP 유전자를 삽입한 플라스미드를 사용하였다.
23-HP는 25 mM 농도로 넣어 주었다.
3O1, O2를 임의추출(randomize)한 경우 C4-LysR은 약하지만 항시적으로(constitutive) 발현되는 프로모터를 사용하였다.
한편 LTTRs 단백질은 DNA 결합 도메인 (heslix-turn-gelix motif)인 N-terminal, 기질 결합 도메인인 C-terminal, 그리고 이들을 연결하는 링커(linker)로 이루어져 있는 것으로 알려져 있다. LysR 단백질은 homodimer를 형성하여 각각 RS와 AS에 결합하며, 작동 분자(effector molecule) (본 발명의 경우 3-HP)이 각각의 LysR 단백질이 결합할 경우 두 개의 LTTR 이합체 (dimer) 사이에 단백질-단백질 상호 작용에 의해 LTTR이 사합체 (tetramer)를 형성하게 되고 이 때 LysR과 결합한 DNA에 구조적 변화를 일으킨다. LTTR 사합체에 특정적으로 결합하는 유도체는 LysR 단백질의 구조적 변화를 야기시키고 이어 promoter region DNA의 구조를 변화시켜 궁극적으로 RNA 중합효소가 프로모터(promoter)에 결합하는 것을 돕는다고 알려지고 있다(도 8).
본 발명에서 중점적으로 다루어지고 있는 C4-LysR 단백질에 대해 구조를 조사한 결과 역시 DNA 결합 도메인 (helix-turn-helix motif)인 N-말단(terminal), 기질 결합 도메인인 C-말단(terminal), 그리고 이들을 연결하는 링커(linker)를 확인할 수 있었다(도 9). DNA 결합 도메인에는 Thr-31, Arg-34, Glu-40, 그리고 Leu-47 등 4개의 아미노산이 핵심적인 역할을 하는 것으로 파악되었고, 기질 결합 도메인(substrate binding domain)에서는 3-HP와 결합하는데 중요한 아미노산과 이합체 형성 등에 중요한 역할을 하는 아미노산 등이 확인되었다. 이중 3-HP와 결합하는데 중요한 역할을 하는 아미노산은 Asp-159, Thr-160, Pro-237 그리고 Phe-239 등이었고 이합체 형성 등에 중요한 역할을 하는 아미노산은 Ala-60, Gly-91, Arg-94, Pro-118, Glu-137 등이었다. 특히 이합체 형성 등에 중요한 역할을 하는 아미노산들은 Pro-118을 제외하고 모두 단백질 표면에 위치하였다.
LysR 단백질이 전사조절 인자인지 확인하기 위해 C3 및 C4 LysR 단백질을 암호화하는 유전자를 P.
denitrficans 염색체에서 제거하고 전사가 조절되는 유전자 (mmsadh, 3hibdhIV, 3hpdh)의 전사 유도 여부를 조사하였다. 먼저 C4 LysR 유전자가 제거되었을 경우 3-HP의 존재 여부에 관계없이 mmsadh, 3hibdhIV 유전자의 발현은 낮았고 3-HP를 넣어주어도 발현이 증대되지 않았다. 또한 C3 LysR 유전자가 제거되었을 경우 3hpdh 유전자의 발현이 3-HP의 첨가에 의해 증폭되지 않았다. 반면 C3 LysR 혹은 C4 LysrR 유전자가 제거된 균주에 이들 유전자를 플라스미드를 이용하여 다시 발현시켜주었을 때(보상 실험; complementation experiment), 야생균주와 같은 수준으로 3-HP에 의한 발현 증폭 현상이 다시 회복되었다. 이를 통해 C3 LysR 및 C4 LysR 단백질이 세포내에서 각각 mmsadh, 3hibdhIV 및 3hpdh 유전자의 발현을 제어하는 전사조절 단백질임을 확인할 수 있었다.
(3) C4-
LysR
단백질과 O1, O2 operator 부위의 결합특성에 대한 in vitro 조사
C4-LysR 단백질의 in vitro 특성 조사를 위해 C 말단에 히스티딘 태그(histidine tag)를 갖는 C4-LysR 단백질을 대장균에서 생산하고 정제하였다. 먼저 C 말단과 N 말단에 His Tag을 달고 앞서 언급한 보상(complementation) 실험을 진행하였다. 그 결과 두 경우 모두 His tag을 갖지 않는 야생형(wildtype) LysR 과 동일한 성능을 보여주었다. 따라서 두 가지 재조합(recombinant) LysR 중에서 C-His tag LysR 만을 대상으로 생화학적(biochemical) 실험을 진행하게 되었다. 재조합(recombinant) LysR은 대장균 내에서 대부분 불용성(insoluble) 형태로 발현되었다. 발현조건(온도, pH, 배지 조성, IPTG 농도)에 대하여 세밀한 최적화(optimization) 실험이 진행되었다. 또한 각종 샤페론 단백질(chaperon protein)의 영향도 조사되었다. 그 결과 비교적 낮은 온도인 25℃, 그리고 0.1 M IPTG, LB 배지, GroEL-ES 샤페론(chaperon) 공동 발현 조건에서 실험에 필요한 정도의 수용성(soluble) C4-LysR을 대장균으로부터 생산할 수 있었다(도 10). 순수 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. C4-LysR의 크기는 약 33 kDa 으로 추정되었고 이는 유전자 크기로부터 예측된 크기와 잘 일치하는 것이었다. 한편 native gel electrophoresis를 실시한 결과 단백질의 농도가 높을 때 완충용액 내에서 이량체(dimer)를 형성하는 것을 알 수 있었다(도 11).
유전자 재조합 C4-LysR과 프로모터 DNA의 결합을 EMSA 실험을 통하여 조사하였다(도 12). 이를 위하여 3가지 DNA 단편(fragment)을 합성하였다. F12 (135 bp) 는 C4-Lys와 mmsadh 유전자 사이 전체 프로모터 부위(promoter region)로 O1, O2 operator를 모두 포함하는 DNA 단편(fragment); F12M (135 bp) 은 O1 operator 부위(region)만 포함하는 DNA 단편(fragment); 그리고 F1M2 (135 bp)는 O2 operator 부위(region)만 포함하는 DNA 단편(fragment)이었다. 대조군(control)으로 1개의 단편(fragment)을 합성하여 사용하였는데 이들은 F12와 동일한 크기를 가지고 있으나 O1, O2 부위(region)가 모두 임의추출(randomize) 되어 palindrome 구조를 갖지 않도록 제작된 단편(fragment) 이었다. C4-LysR 단백질을 DNA 단편(fragment) (F12, F12M, F1M2)와 반응시켜 전기영동을 실시한 결과 DNA 단편(fragment)의 이동성(mobility)이 감소하는 것이 관찰되었다(도 12). 이는 C4-LysR 단백질이 in vitro 조건에서 이들 DNA 단편(fragment)과 결합한다는 뜻이다. 이러한 이동성(mobility)의 감소는 대조군 단편(control fragment)에서는 관찰되지 않았다. 즉 C4-LysR 과 DNA 단편(fragment)과의 결합은 DNA 단편(fragment)의 염기서열, 보다 정확하게는 O1, O2 operator 서열(sequence)이 있어야 가능하다는 뜻이다. 3종류 단편(fragment) 중에서 F12가 가장 LysR 단백질에 대하여 친화도(affinity)가 높았고, 다음이 F12M, F1M2 순이었다. EMASA 실험을 3-HP가 존재하는 조건에서 반복하였다. 3-HP의 존재는 친화도(affinity)를 변화시켰다. F12에 대해서는 친화도(affinity)를 향상시켰고, F1의 경우에는 거의 변화가 없었고, 반면 F2는 친화도(affinity)가 오히려 다소 감소하는 것으로 나타났다.
F12가 F12M 혹은 F1M2 단편(fragment)에 비해 높은 친화도(affinity)를 갖는다는 것은 LsyR 단백질의 O1, O2 결합이 서로 상호 협조적(cooperative)이라는 것을 의미한다. 즉, 친화도(affinity)가 높은 O1 site에 LysR 단백질이 결합하면 O2 site 결합을 촉진한다는 뜻이다. EMSA실험 결과 F12는 F12M 혹은 F1M2 단편(fragment)에 비해 항상 낮은 이동성(mobility)을 보여주었다. 그리고 낮은 LysR 농도에서도 단지 한 개의 shift 된 band만을 보여 주었다. 이는 F12 단편(fragment)에 항상 더 많은 LysR 단백질이 결합되어 있음을 의미한다. 즉 LysR 단백질이 F12 단편(fragment)에 결합할 때는 항상 O1, O2 site 두 개 모두에 결합한다는 뜻이다. F12 단편(fragment)이 F12M 혹은 F1M2 보다 높은 친화도(affinity)를 갖고 또한 F12M이나 F1M2 보다 낮은 이동성(mobility)을 갖는다는 것은 F12 단편(fragment) 내 O1, O2 site에 대한 LysR 단백질의 결합이 상호협조적(cooperative)이다는 사실을 보여준다. 이러한 EMSA 실험 결과로부터 3-HP 유도성 프로모터의 중요한 성질을 다음과 정리할 수 있었다. (i) 프로모터는 각각 9개의 염기로 이루어지는 역반복(Inverted Repeat) 서열 쌍을 2개 혹은 그 이상 갖는 것을 특징으로 하고 LysR 단백질의 결합부위를 제공한다. (ii) LysR 단백질은 유도성 분자(inducer molecule)와의 결합 여부에 관계없이 프로모터에 결합할 수 있으나, 전사효율의 향상은 유도성 분자(inducer molecule)와 결합한 LysR 단백질에 의해서만 나타나며 유도성 분자(inducer molecule)로는 3-HP 외에도 3-HP와 구조적으로 유사한 3-HIB, 3-HB 등이 사용될 수 있다. (iii) 프로모터는 LysR 단백질 이량체가 2개 결합하는 부위를 제공하며 이 결합은 서로 상호협동적(cooperative)이다. (iv) 프로모터는 RNA 중합효소가 결합할 경우 LysR 단백질과 상호작용(interaction) 할 수 있는 구조를 제공한다. (v) 프로모터에는 O1, O2 operator가 존재하며 각각의 operator는 9개의 염기로 이루어지는 역반복(Inverted Repeat) 내 염기서열이 잘 보존되어 있다.
(4) 3-HP 유도성 유전자 발현 시스템의 가상 탐색 및 발현 시스템의 특성 분석
새로운 3-HP 유도성 유전자 발현 시스템을 찾기 위해 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) 유전자 상동성에 기초하여 추정적 LysR 조절 유전자 및 mmsadh, 3hipdh, 3hpdh 등을 여러 미생물에서 스크리닝하였다. BlastP 유사성 조사결과 다른 여러 미생물들에서도 비슷한 3-HP 유도성 유전자 발현 시스템이 존재하는 것으로 나타났으며, 잘 알려진 미생물들 중에서 3HIBDH(C4 시스템)와 3HPDH(C3 시스템)으로 추정되는 유전자 집단이 있는 것으로 밝혀졌다(도 13, 표 4 및 표 5). 유전자들의 구조 분석 및 비교 결과 미생물들 마다 다양한 유전적 구조를 가지는 것으로 확인되었다.
총 150여 종 이상의 미생물에서 3-HP 유도성 유전자 발현 시스템이 발견되었고 이들은 C3-LysR 과 C4-LysR의 존재 유무와 유전자 배열 특징에 따라 총 16개의 그룹으로 나눌 수 있었다. 이 중 9개의 그룹은 C4 및 C3 시스템을 모두 가지고 있었고 7개의 그룹은 C4 시스템만 가지고 있었다. C3 시스템만 가지는 그룹은 전혀 발견되지 않았다. 또한 C3 시스템의 경우 LysR 단백질을 암호화하는 유전자와 LysR 단백질에 의해 발현이 조절되는 유전자는 모두 전사 방향이 반대라는 특징이 있었다. C4 시스템의 경우에도 LysR 단백질을 암호화하는 유전자 LysR 단백질에 의해 발현이 조절되는 유전자는 대부분 전사 방향이 반대라는 특징이 있었으나 Group 15과 Group 16에 속하는 미생물에서는 이 방향이 서로 동일하였다.
C3 및 C4 LysR 단백질에 반응하는 프로모터 시퀀스 특징을 분석하였다. P. denitrificans의 경우와 마찬가지로 두 개의 tandem operator sites (O1 및 O2로 명명)가 모두 존재하였다. 두 개의 operator 는 한 쌍의 대칭(dyad symmetry) 구조를 가지고 있었고 각각의 역반복(inverted repeat) 서열은 9개의 염기로 구성되어 있었다. 한 쌍의 대칭(dyad symmetry) 중심 간의 거리는 50개 염기거리를 가지고 있어서 LysR 단백질이 O1 및 O2 operator site에 결합할 때 동일한 방향에서 결합하도록 간격을 유지하였다. 또한 역반복(inverted repeat) 서열 내 9개 염기는 많은 미생물에서 잘 보존되어 있었다.
3-HP에 반응하는 LysR과의 결합 부위(Palindromic)는 다양한 미생물에서 보존되어 있었는데, 각각의 종에 따라서, O1 operator 즉 1차/억제 결합 사이트(Primary/Repression Binding Site; PBS/RBS)만이 보존되어 있었다(표 3). 또한, 모든 종에 있어서, 보존된 T-N11/12-A motif를 포함하는 높은 친화도를 보이는 PBS는 전사 개시 사이트(transcription start site; TSS)로부터 -65 내지 -75 부위 근처에 존재하였다. O2 operator 즉 2차/활성 결합 사이트(Secondary/Activation Binding Site; SBS/ABS) motif에서는 서열 보존성이 낮기 때문에, ABS motif의 in silico 예측은 복잡하고 어렵다. RBS 및 ABS 사이트는 각각 자가-억제 및 활성화에 있어 핵심적인 역할을 담당하는 것으로 보고되고 있다. 3-HP에 반응하는 단백질들로서 공통적인 기능을 갖는데도 불구하고, 3-HP-LysR 단백질은 다른 속(genus) 간에는 낮은 서열 유사성을 갖고, 동일 속 내에서는 높은 서열 유사성을 갖는다. 따라서, LysR 단백질과 결합하는 operator 부위 DNA 시퀀스가 다른 속(genus) 간에 서로 다르다는 것이 논리적으로 틀리지 않는 것으로 판단된다. 전사 인자(Promoters; -10 and -35 regions)는 BPROM 및 BDGP tools을 사용하여 예측하였다.
아래 표 3에 기재한 9개의 염기서열은 각각의 종(genus)에서 3-HP에 반응하는 LysR과의 결합 부위에 해당하는 보존 영역으로서, 대문자는 확인 대상 모두에서 보존된 것으로 나타나는 염기이다.
Genus |
Repressive Binding Site(T-N11/12-A motif) |
# Representatives |
Achromobacter
|
CAcAcATct |
4 |
Acidovorax
|
TcGCAcAcC |
3 |
Acinetobacter
|
GTcaAaGAT |
7 |
Advenella
|
TTGCAaATT |
4 |
Aeromonas
|
GGGcAaaCA |
2 |
Alcaligenes
|
CAcAcATct |
5 |
Alcanivorax
|
AgCAGCATG |
2 |
Alicycliphilus
|
TGCaAAGcc |
2 |
Anaeromyxobacter
|
GGGaCGacG |
3 |
Azospirillum
|
gTGCCcGCG |
4 |
Azotobacter
|
gTatcGAGC |
4 |
Beijerinckia
|
ATTgcCgTG |
3 |
Bordetella
|
gTTtCGTtG |
6 |
Bradyrhizobium
|
AtATATcaG |
3 |
Brucella
|
AaaAAtGCa |
3 |
Burkholderia
|
GCCtACacT |
16 |
Corynebacterium
|
CACCTtTgC |
6 |
Cupriavidus
|
AGTtCAgcG |
3 |
Delftia
|
GCAAAAAcg |
3 |
Ferrimonas
|
GCGGTTTTa |
2 |
Glaciecola
|
TgAaTtGAC |
3 |
Gordonia
|
GAaaCCGGC |
2 |
Halomonas
|
tACACacAA |
3 |
Janthinobacterium
|
TtCGcATTa |
3 |
Marinobacter
|
CAgaAgGcT |
2 |
Methylocystis
|
CGAtCgACC |
2 |
Phenylobaculum
|
GTcCCGCtC |
2 |
Pseudomonas
|
TTGCAcatC |
24 |
Ralstonia
|
GCCtACacT |
5 |
Shewanella
|
gTTcGcgTA |
6 |
Sinorhizobium
|
TcGgAAaTT |
2 |
Sphingobium
|
CgcACaAcC |
2 |
Stenotrophomonas
|
GgcCaGATT |
2 |
Tistrella
|
CCGGcgGcG |
3 |
Variovorax
|
gTcTATTgT |
2 |
Verminephrobacter
|
CgTGgcCGA |
2 |
Vibrio
|
TGcaCcgTT |
6 |
Xanthobacter
|
CTgtGCACa |
2 |
Xanthomonas
|
GcgGTGGgC |
6 |
#Representitives: Genus 내에서 동일한 Repressive Binding Site (RBS)를 가지는 것으로 확인된 종의 숫자.
C4-LysR, MMSADH, 3HIBDH에 대한 효소 단백질 서열 상동성 비교
Enzyme Source |
C4-LysR |
MMSADH |
3HIBDH |
Genbank ID |
Size(AA) |
Identity (%) |
Size (AA) |
Identity (%) |
Size (AA) |
Identity (%) |
C4-LysRMMSADH3HIBDH |
Achromobacter sp.
|
306 |
47 |
497 |
67 |
296 |
56 |
WP_013392250.1 WP_020924676.1WP_046807163.1 |
Acidovorax
avenae subsp.
|
295 |
59 |
507 |
82 |
299 |
54 |
WP_019701544.1WP_019701545.1WP_019701549.1 |
Acidovorax sp.
|
301 |
60 |
507 |
82 |
296 |
55 |
WP_005799303.1WP_008905850.1WP_026437393.1 |
Acinetobacter baumannii
|
293 |
49 |
505 |
70 |
296 |
59 |
WP_005014261.1WP_039237888.1WP_005025914.1 |
Aeromonas hydrophilia
|
304 |
36 |
503 |
58 |
306 |
55 |
WP_029302009.1WP_042863805.1WP_017784754.1 |
Agrobacterium sp.
|
293 |
37 |
518 |
47 |
294 |
45 |
NA |
Alcaligenes faecalis
|
297 |
45 |
497 |
60 |
298 |
55 |
WP_026483089.1WP_045930222.1WP_026483274.1 |
Alcanivorax hongdengensis
|
302 |
39 |
498 |
56 |
287 |
48 |
WP_008927645.1WP_008929937.1WP_040297229.1 |
Alicycliphilus denitrificans
|
304 |
58 |
505 |
81 |
298 |
53 |
WP_013519376.1WP_013519377.1WP_013519381.1 |
Alteromonas
marina
|
294 |
35 |
496 |
48 |
291 |
62 |
WP_039223538.1WP_039216373.1WP_039223543.1 |
Anaeromyxobacter
dehalogenans
|
313 |
31 |
491 |
53 |
293 |
29 |
WP_012631783.1ABC82015.1WP_011419642.1 |
Azospirillum
brasilensse
|
291 |
33 |
499 |
51 |
296 |
53 |
EZQ04117.1WP_014241748.1WP_035679372.1 |
Azotobacter
vinelandii
|
296 |
72 |
501 |
92 |
297 |
79 |
WP_012699721.1WP_012699726.1WP_012699724.1 |
Beijerinckia
indica
|
301 |
43 |
509 |
50 |
295 |
52 |
WP_012383627.1WP_012383190.1WP_012383623.1 |
Bordetella
avium
|
307 |
48 |
497 |
66 |
294 |
58 |
WP_012416822.1WP_012416824.1WP_012417430.1 |
Bradyrhizobium
japonicum
|
302 |
42 |
498 |
49 |
296 |
50 |
WP_024338218.1WP_024338217.1WP_028153398.1 |
Burkholderia
ambifaria
|
319 |
47 |
509 |
74 |
300 |
65 |
WP_012365776.1WP_012366631.1WP_006761413.1 |
Catenulispora
acidiphila
|
296 |
35 |
504 |
42 |
301 |
41 |
NA |
Caulobacter
sp
.
|
295 |
31 |
498 |
45 |
295 |
43 |
NA |
Castellaniella
defragrans
|
303 |
46 |
497 |
64 |
297 |
59 |
WP_043685951.1 WP_043680927.1 WP_043682533.1 |
Chromobacterium
violaceum
|
305 |
41 |
500 |
79 |
296 |
58 |
WP_043617011.1WP_045051895.1WP_043613761.1 |
Collimonas
arenae
|
319 |
47 |
502 |
67 |
297 |
54 |
AIY40998.1 WP_038487725.1WP_038487728.1 |
Comamonas
testosteroni
|
300 |
54 |
507 |
83 |
298 |
52 |
WP_034389635.1WP_003075837.1WP_043003783.1 |
Corynebacterium
vitaeruminis
|
304 |
28 |
504 |
51 |
291 |
42 |
WP_025251982.1WP_025251535.1 WP_025251536.1 |
Cupriavidus
necator
|
308 |
40 |
507 |
73 |
296 |
66 |
WP_042881289.1WP_042878263.1WP_042878261.1 |
Carvibacter
gracilus
|
296 |
60 |
505 |
82 |
294 |
54 |
WP_027474562.1WP_027474565.1WP_027474567.1 |
Delftia
acidovorans
|
300 |
54 |
507 |
82 |
298 |
53 |
WP_034393435.1WP_012205523.1WP_016453478.1 |
Ferrimonas
balearica
|
284 |
25 |
497 |
55 |
296 |
51 |
ADN76259.1WP_013344534.1WP_013344538.1 |
Glaciecola
nitratireducens
|
281 |
28 |
496 |
56 |
295 |
47 |
WP_014109619.1WP_014108982.1WP_014108979.1 |
Gordonia
bronchialis
|
298 |
32 |
513 |
48 |
289 |
46 |
WP_041920477.1WP_012835581.1WP_012835579.1 |
Hahella
chejuensis
|
302 |
28 |
498 |
51 |
296 |
51 |
NA |
Halomonas
elongata
|
315 |
44 |
499 |
67 |
300 |
53 |
WP_013331269.1WP_013331270.1WP_013332181.1 |
Hirschia
sp
.
|
294 |
37 |
498 |
43 |
293 |
45 |
NA |
Idiomarina
sp
.
|
312 |
28 |
499 |
57 |
297 |
52 |
WP_007420015.1WP_034729012.1WP_007419652.1 |
Janthinobacterium
lividum
|
305 |
46 |
502 |
75 |
297 |
53 |
WP_034757572.1WP_034778805.1WP_034757584.1 |
Kitasatospora
setae
|
304 |
31 |
508 |
43 |
298 |
40 |
NA |
Kutzneria
albida
|
300 |
35 |
501 |
45 |
284 |
44 |
NA |
Methylobacterium
sp.
|
302 |
41 |
499 |
47 |
297 |
47 |
NA |
Methylocystis
sp
.
|
294 |
30 |
498 |
48 |
295 |
46 |
WP_036241816.1WP_036286001.1WP_036289118.1 |
Novosphingobium
sp
.
|
316 |
39 |
499 |
45 |
289 |
45 |
NA |
Oceanimonas
smirnovii
|
288 |
28 |
497 |
58 |
297 |
47 |
WP_019933245.1WP_019933168.1WP_019933171.1 |
Paracoccus
sp
.
|
297 |
38 |
533 |
46 |
302 |
45 |
NA |
Parvibaculum
lavamentivorans
|
304 |
30 |
500 |
52 |
296 |
57 |
WP_041536697.1WP_041536463.1WP_012111823.1 |
Phenylobacterium
koreense
|
282 |
32 |
498 |
52 |
298 |
49 |
WP_041374440.1WP_012520768.1WP_012522231.1 |
Photobacterium
gaetbuleda
|
303 |
26 |
502 |
53 |
303 |
44 |
NA |
Polynucleobacter
necessarius asymbioticus
|
291 |
49 |
500 |
79 |
298 |
66 |
ABP34774.1ABP34773.1ABP34771.1 |
Pseudoalteromonas
carrageenovora
|
299 |
29 |
496 |
55 |
299 |
52 |
WP_009840151.1WP_010381506.1WP_033103466.1 |
Pseudogulbenkiania
sp.
|
320 |
46 |
500 |
79 |
298 |
59 |
WP_008953966.1WP_008954515.1WP_014086932.1 |
Pseudomonas denitrificans ATCC13867 |
298 |
100 |
501 |
100 |
291 |
100 |
WP_015477414.1WP_015477415.1WP_015477416.1 |
Pseudomonas
knackmussii
|
298 |
95% |
504 |
93 |
291 |
92 |
WP_043252263.1WP_043252261.1WP_043252259.1 |
Pseudomonas
protegens
|
316 |
45 |
508 |
73 |
295 |
62 |
WP_041751937.1WP_011059111.1WP_015634046.1 |
Pseudomonas
fluorescens
|
315 |
45 |
505 |
73 |
295 |
60 |
WP_034128788.1WP_046055588.1WP_034128786.1 |
Pseudoxanthomonas
spadix
|
297 |
27 |
501 |
79 |
297 |
57 |
WP_014159583.1WP_014159749.1WP_014159753.1 |
Psychrobacter
phenylpyruvicus
|
302 |
27 |
495 |
71 |
314 |
52 |
WP_028859590.1WP_028859166.1WP_028859170.1 |
Ralstonia
oxalatica
|
298 |
30 |
515 |
73 |
301 |
65 |
NA |
Rhodomicrobium
vannielli
|
296 |
30 |
496 |
48 |
296 |
48 |
NA |
Segniliparus
rotundus
|
300 |
25 |
509 |
51 |
300 |
46 |
WP_013137524.1WP_013137611.1WP_013137610.1 |
Shewanella
oneidensis
|
291 |
24 |
499 |
55 |
300 |
51 |
WP_011072126.1WP_011071828.1WP_011071832.1 |
Simiduia
agarivorans
|
297 |
29 |
505 |
55 |
296 |
47 |
NA |
Sinorhizobium
meliloti
|
315 |
40 |
498 |
50 |
298 |
52 |
WP_018099720.1WP_027990465.1 WP_027991426.1 |
Sphingobium
chlorophenolicum
|
292 |
43 |
499 |
49 |
294 |
48 |
WP_037446180.1WP_037456635.1WP_037446174.1 |
Sphingomonas
wittichi
|
325 |
43 |
503 |
44 |
296 |
46 |
NA |
Sphingopyxis
alaskensis
|
310 |
36 |
497 |
45 |
291 |
44 |
NA |
Stenotrophomonas
maltophilia
|
289 |
32 |
501 |
80 |
296 |
57 |
WP_044569661.1WP_019185504.1WP_005407687.1 |
Tatlockia
micdadei
|
293 |
22 |
499 |
45 |
295 |
47 |
WP_045099921.1WP_045098082.1WP_045098081.1 |
Thalassospira
xiamenensis
|
295 |
38 |
499 |
45 |
296 |
48 |
NA |
Variovorax
paradoxus
|
298 |
60 |
507 |
82 |
300 |
55 |
WP_018905631.1WP_012748355.1WP_012748351.1 |
Verminephrobacter
eiseniae
|
298 |
26 |
507 |
78 |
299 |
51 |
WP_011807819.1WP_011811243.1WP_011811250.1 |
Vibrio
furnissii
|
304 |
25 |
520 |
57 |
300 |
49 |
WP_014257826.1 WP_041943477.1WP_004727845.1 |
Xanthobacter
autotrophicus
|
307 |
44 |
498 |
50 |
299 |
51 |
WP_012114222.1WP_012114221.1WP_041575420.1 |
Xanthomonas
campestri
|
301 |
29 |
501 |
77 |
295 |
58 |
WP_044099340.1WP_003488244.1 WP_003488236.1 |
Xanthomonas
oryzae
|
304 |
27 |
501 |
77 |
300 |
57 |
WP_024711534.1WP_044750113.1 WP_024744051.1 |
C3-LysR, 3HPDH에 대한 효소 단백질 서열 상동성 비교
Enzyme Source |
C3-LysR |
3HPDH |
Genbank accession no |
|
Size(AA) |
Identity (%) |
Size (AA) |
Identity (%) |
C3-LysR3HPDH |
Achromobacter sp.
|
306 |
45 |
547 |
65 |
WP_006223849.1WP_006225226.1 |
Acidovorax avenae
|
295 |
45 |
564 |
59 |
WP_013595009.1WP_013592873.1 |
Acidovorax sp.
|
301 |
44 |
556 |
61 |
WP_020229646.1WP_020229941.1 |
Acinetobacter baumannii
|
293 |
40 |
534 |
39 |
WP_000861803.1WP_032868291.1 |
Alcaligenes faecalis
|
297 |
42 |
555 |
64 |
WP_026483089.1ADT64694.1 |
Alcanivorax hongdengensis
|
290 |
27 |
531 |
42 |
WP_008929468.1WP_008927596.1 |
Alicycliphilus denitrificans
|
304 |
44 |
560 |
60 |
WP_013519376.1WP_013721241.1 |
Alteromonas marina
|
294 |
36 |
550 |
43 |
WP_039223538.1WP_039222748.1 |
Azospirillum brasilense
|
391 |
35 |
537 |
36 |
WP_040137273.1WP_035676856.1 |
Bordetella avium
|
307 |
45 |
540 |
66 |
WP_012416822.1WP_012415815.1 |
Bradyrhizobium japonicum
|
302 |
41 |
539 |
57 |
WP_024338218.1WP_028143201.1 |
Burkholderia ambifaria
|
323 |
38 |
567 |
60 |
WP_006754369.1WP_011659279.1 |
Castellaniella defragrans
|
303 |
42 |
537 |
63 |
WP_043685951.1WP_043679553.1 |
Chromobacterium violaceum
|
305 |
54 |
556 |
68 |
WP_043617011.1WP_043617013.1 |
Collimonas arenae
|
319 |
44 |
541 |
61 |
AIY40998.1WP_038494339.1 |
Comamonas
testosteroni
|
300 |
39 |
555 |
69 |
WP_043003771.1WP_012836757.1 |
Cupriavidus
necator
|
308 |
38 |
554 |
61 |
WP_042881289.1WP_042883575.1 |
Carvibacter
gracilus
|
296 |
45 |
575 |
57 |
WP_027474562.1WP_027477384.1 |
Delftia
acidovorans
|
300 |
41 |
575 |
59 |
WP_034393435.1WP_043780341.1 |
Glaciecola
nitratireducens
|
310 |
23 |
533 |
41 |
WP_014110217.1WP_014110368.1 |
Gordonia
bronchialis
|
298 |
24 |
443 |
42 |
WP_041920477.1WP_012835455.1 |
Halomonas
elongata
|
315 |
42 |
551 |
61 |
WP_013331269.1WP_013332997.1 |
Idiomarina
sp
.
|
303 |
25 |
564 |
37 |
WP_008487425.1WP_034821838.1 |
Janthinobacterium
lividum
|
305 |
44 |
541 |
62 |
WP_034788899.1WP_010393822.1 |
Parvibaculum
lavamentivorans
|
304 |
28 |
548 |
40 |
WP_041536697.1WP_041536013.1 |
Polynucleobacter
necessarius asymbioticus
|
291 |
41 |
539 |
58 |
ABP34774.1ABP33573.1 |
Pseudogulbenkiania
sp
.
|
320 |
42 |
547 |
42 |
WP_014086927.1WP_014087291.1 |
Pseudomonas denitrificans ATCC13867 |
304 |
100 |
554 |
100 |
WP_015478424.1WP_015478425.1 |
Pseudomonas
knackmussii
|
301 |
89 |
552 |
85 |
WP_043249755.1WP_043249752.1 |
Pseudomonas
protegens
|
297 |
71 |
548 |
75 |
WP_041117574.1WP_011060785.1 |
Pseudomonas
fluorescens
|
294 |
72 |
548 |
76 |
WP_046048946.1WP_038984218.1 |
Pseudoxanthomonas
spadix
|
307 |
28 |
545 |
43 |
WP_043290476.1WP_014160845.1 |
Psychrobacter
phenylpyruvicus
|
302 |
25 |
565 |
40 |
WP_028859810.1WP_028859590.1 |
Segniliparus
rotundus
|
300 |
26 |
516 |
37 |
WP_013139368.1WP_013137524.1 |
Sinorhizobium
meliloti
|
315 |
37 |
531 |
77 |
WP_018094277.1WP_010970328.1 |
Sphingobium
chlorophenolicum
|
292 |
38 |
544 |
40 |
WP_037446180.1WP_037446228.1 |
Stenotrophomonas
maltophilia
|
289 |
29 |
534 |
44 |
WP_037590748.1WP_044569661.1 |
Variovorax
paradoxus
|
298 |
44 |
544 |
61 |
WP_018905631.1WP_042580440.1 |
Verminephrobacter
eiseniae
|
306 |
28 |
556 |
59 |
WP_011812258.1 WP_011808703.1 |
Vibrio
furnissii
|
295 |
27 |
573 |
39 |
WP_004729245.1WP_004724290.1 |
Xanthobacter
autotrophicus
|
307 |
43 |
556 |
56 |
ABS68474.1WP_012114222.1 |
Xanthomonas
campestris
|
304 |
30 |
556 |
53 |
WP_033484874.1WP_011038502.1 |
LysR 단백질에 대한 분석도 동일하게 실시하였다. non-redundant NCBI 데이터베이스로부터 C4 LysR과 C3 LysR 시퀀스에 대해 BLAST 검색 결과, DNA 결합 Helix-turn-Helix 영역과 상동성을 갖는 시퀀스가 각각 126개, 132개로 존재하는 것을 확인하였다. 도 14 및 도 15에 이 시퀀스들에 대한 다중서열배치(multiple sequence alignment)를 나타내었다. 시퀀스 얼라이먼트(sequence alignment) 결과 LysR 시퀀스의 상당 부분이 높게 보존되어 있는 것으로 확인되었으며, 이 분석에 사용된 다른 미생물들에서도 LysR 시퀀스가 높은 수준으로 보존되어 있는 것으로 나타났다. 이는 대부분의 미생물들이 세포 내에서 LysR을 이용하고 있음을 말해준다. 또한 모든 C4 LysR과 C3 LysR 시퀀스에서 프로모터 3-HP 발현 프로모터 내 operator 부위(region)의 역반복 서열(Inverted Repeat sequence)과 강하게 결합하는 것으로 추정되는 Helix-turn-Helix 영역이 발견되었고 이 영역에서는 Thr-31, Arg-34, Glu-40, 그리고 Leu-47 등 4개의 잔기들이 잘 보존되어 있었다. 보존된 아미노산 잔기들은 LysR 단백질이 DNA와 결합할 때 강하게 상호작용하는데 중요한 부분일 것으로 생각된다(도 9).
LysR과 3-HP간의 상호 작용 (protein-ligand interaction)을 좀 더 자세히 알아보기 위해서 homology model과 docking 실험을 수행하였다. 먼저, PDB 데이터베이스에서 이용가능 한 구조를 이용하여 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)에서의 C4-LysR과 C3-LysR의 시퀀스 유사성을 비교한 결과 35% 이하의 낮은 유사성을 보였다 (PDB ID: 3SZP, 24 % identical). 따라서 C4-LysR과 C3-LysR의 모델링은 MUSTER과 LOMET server를 이용한 threading 방법으로 수행하였다. 그 결과 예측된 C4-LysR과 C3-LysR의 모델을 RAMPAGE를 이용하여 정제 및 검증하고, 이 모델의 아미노산 잔기 98%가 적합한 영역에 있음을 Ramachandran plot을 통해 확인하였다. C4-LysR과 C3-LysR에서 3-HP가 결합하는 활성부위가 COACH를 이용하여 예측되었다. 유효한 모델과 예측된 활성부위 잔기들은 SCHRODINGERTM에 있는 Maestro 프로그램에서 docking 실험을 수행하는데 사용되었다. 목표 단백질 (C4-LysR, C3-LysR)과 리간드 (3-HP)는 각각 Protein Preparation Wizard와 LigPrep Wizard를 사용하여 조사되었다. Grid box를 생성하기 위해 Receptor Grid Generation툴을 사용하였으며, 생성된 grid box안에서 SP (Standard Precision) 및 XP (eXtra Precision) docking setting을 이용하여 리간드 docking을 수행하였다. docking 결과, C4-LysR에 대해서는 5.01, C3-LysR에 대해서는 3.74의 docking 점수를 가질 때 가장 우수한 docking pose를 보여주었다. C4-LysR 및 C3-LysR이 3-HP와 여러 가지 분자 간의 상호작용을 가지는 것으로 확인되었다. C4-LysR의 아미노산 잔기들 중 Asp-159, Thr-160, Pro-237 및 Phe-239 등은 3-HP와 수소결합을 이루며, ARG24은 3-HP와 소수성 상호작용을 이루는 것으로 조사되었다(도 9). C3-LysR의 아미노산 잔기들 중 LEU74, THR190, THR28은 수소 결합을 이루며, THR73, VAL150, PRO167, PHE127, PHE169의 경우 소수성 상호작용을 이루는 것으로 조사되었다. 3-HP와 LysR 간의 상호작용이 없을 것이라는 예측과 달리, docking 결과 흥미롭게 3-HP가 C4-LysR에 존재하는 기질 결합 도메인(substrate binding domain) (ARG94, LYS96, GLU137)과 helix-turn-helix domain (ARG24) 사이에서 강한 상호작용하는 것을 보여주었다. 이와 비슷하게 C3-LysR의 THR28 (helix-turn-helix domain)이 3-HP와 강하게 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 특히 기질 결합 도메인(substrate binding domain)에서는 3-HP와 결합 외에도 이합체 형성 등에 중요한 역할을 하는 아미노산이 확인되었다. 이들은 아미노산은 Ala-60, Gly-91, Arg-94, Pro-118, Glu-137 등이었다. 특히 이합체 형성 등에 중요한 역할을 하는 아미노산들은 Pro-118을 제외하고 모두 단백질 표면에 위치하였다. 이로 미루어, 3-HP가 LysR에 직접적으로 영향을 미쳐 LysR을 이합체화반응이 일어나도록 하면, 이합체반응이 일어난 LysR은 DNA와 결합하여 LysR 유전자 아래쪽에 위치하는 3-HP 분해 유전자들의 전사를 높은 수준으로 조절하는 것이다.
(5) 3-HP 유도성 유전자를 갖는 미생물에 의한 3-HP 분해 및 3-HP 유도성 유전자의 발현
유전자 구조 분석에서 3-HP 분해 경로가 다양한 미생물에서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 다양한 미생물들의 3-HP 분해 능력을 평가하기 위해서 25mmol/L의 3-HP가 포함된 100mM 인산염 용액에 세포를 현탁하였고 24시간 동안 3-HP가 분해되도록 하였다(표 6). 그 결과 미생물에 따라 3-HP 분해 속도는 차이가 있었으나 모두 효과적으로 3-HP를 분해하는 것으로 나타났다. 3-HP 분해 유전자 (3hpdh, 3hibdh, mmsadh)의 전사수준을 3-HP 존재 유무에 따라 평가하였다(표 7). 표 7에서 보는 바와 같이, 3-HP는 이들 미생물에서 3hpdh, 3hibdh, mmsadh 유전자의 발현을 각각 6배, 14배, 16배 이상으로 높게 향상시켰다. 이 결과는 다양한 미생물 내에 3-HP 유도성 시스템이 공통적으로 존재한다는 것을 의미한다. 한편 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)와 비교하여 다른 미생물에서는 전사 증가 비율이 10배 정도 상대적으로 낮은데 이는 배양 조건의 차이에 기인하는 것으로 판단된다. 즉 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)를 제외하고 다른 미생물에서는 성장을 좋게 하기 위하여 복합 질소원이 다량 함유된 배지에서 미생물을 배양하였는데 이 경우 3-HP 이외에 복합 질소원에 포함된 아미노산이나 이들 아미노산 분해 산물이 3-HP 가 존재하지 않는 조건에서도 일정 부분 3hpdh, 3hibdh, mmsadh 의 전사를 활성화시켜 3-HP 가 존재하지 않는 조건에서 전사량을 높게 유지시켰기 때문이다.
휴지기 세포의 3-HP 분해
Genus No.
|
Strains |
3-HP degraded (mM)a
|
1 |
Achromobacter denitrificans
|
18.40 |
2 |
Acidovorax avenae subsp.
|
20.43 |
|
Acidovorax sp.
|
16.60 |
3 |
Acinetobacter baumannii
|
18.76 |
4 |
Aeromonas hydrophilia
|
17.88 |
5 |
Agrobacterium sp.
|
20.54 |
6 |
Alcaligenes faecalis
|
19.32 |
7 |
Alcanivorax hongdengensis
|
24.51 |
8 |
Alicycliphilus denitrificans
|
20.62 |
9 |
Alteromonas marina
|
20.42 |
10 |
Amycolatopsis sp.
|
21.13 |
11 |
Anaeromyxobacter dehalogenans
|
23.14 |
12 |
Azospirillum brasilensse
|
17.96 |
13 |
Azotobacter vinelandii
|
19.44 |
14 |
Beijerinckia indica
|
23.13 |
15 |
Bordetella avium
|
23.87 |
16 |
Bradyrhizobium japonicum
|
21.67 |
17 |
Burkholderia ambifaria
|
18.33 |
18 |
Catenulispora acidiphilia
|
19.45 |
19 |
Caulobacter sp.
|
22.34 |
20 |
Castellaniella defragrans
|
13.97 |
21 |
Chromobacterium violaceum
|
14.56 |
22 |
Collimonas arenae
|
16.11 |
23 |
Comamonas testosteroni
|
15.96 |
24 |
Corynebacterium vitaeruminis
|
17.35 |
25 |
Cupriavidus necator
|
18.46 |
26 |
Curvibacter gracilus
|
19.12 |
27 |
Delftia acidovorans
|
15.89 |
28 |
Ferrimonas balearica
|
17.32 |
29 |
Glaciecola nitratireducens
|
16.57 |
30 |
Gordonia bronchialis
|
18.41 |
31 |
Hahella chijuensis
|
17.59 |
32 |
Halomonas elongata
|
19.14 |
33 |
Hirschia litorea
|
18.47 |
34 |
Idiomarina sp.
|
17.86 |
35 |
Janthinobacterium lividum
|
18.02 |
36 |
Kitasatospora
setae
|
19.05 |
37 |
Kutzneria
albida
|
21.14 |
38 |
Methylobacterium
sp
.
|
23.04 |
39 |
Methylocystis
sp
.
|
16.97 |
40 |
Novosphingobium
sp
.
|
15.87 |
41 |
Oceanimonas
smirnovii
|
15.91 |
42 |
Paracoccus
sp
.
|
17.96 |
43 |
Parvibaculum
lavamentivorans
|
18.02 |
44 |
Phenylobacterium
kunshanensis
|
17.56 |
45 |
Photobacterium
gaetbuleda
|
19.04 |
46 |
Polynucleobacter
necessarius
asymbioticus
|
16.97 |
47 |
Pseudoalteromonas
carrageenovora
|
19.03 |
48 |
Pseudogulbenkiania
sp
.
|
7.36 |
49 |
Pseudomonas denitrificans ATCC13867 |
20.53 |
|
Pseudomonas
knackmussii
|
7.42 |
|
Pseudomonas
protegens
|
25.24 |
|
Pseudomonas
fluorescens
|
24.41 |
50 |
Pseudoxanthomonas
spadix
|
23.01 |
51 |
Psychrobacter
phenylpyruvicus
|
20.17 |
52 |
Ralstonia
oxalatica
|
18.09 |
53 |
Rhodomicrobium
vannielli
|
19.42 |
54 |
Segniliparus
rotundus
|
8.96 |
55 |
Shewanella
oneidensis
|
10.14 |
56 |
Simiduia
agarovorans
|
23.78 |
57 |
Sinorhizobium
meliloti
|
13.87 |
58 |
Sphingobium
chlorophenolicum
|
14.76 |
59 |
Sphingomonas
wittichii
|
21.04 |
60 |
Sphingopyxis
alaskensis
|
23.56 |
61 |
Stenotrophomonas
maltophilia
|
15.34 |
62 |
Streptomyces
nodosus
|
21.13 |
63 |
Tatlockia
micdadei
|
17.81 |
64 |
Thalassospira
xiamenensis
|
18.88 |
65 |
Variovorax
paradoxus
|
19.34 |
66 |
Verminephrobacter
eiseniae
|
17.04 |
67 |
Vibrio
furnissii
|
16.98 |
68 |
Xanthobacter
autotrophicus
|
15.92 |
69 |
Xanthomonas
campestri
|
14.37 |
|
Xanthomonas
oryzae
|
13.88 |
a The amount of 3-HP degraded was calculated between 0 and 24h.
3-HP 분해 유전자들의 상대적 mRNA 수준
Genus No.
|
Strains
|
3hpdh
|
3hibdh
|
mmsadh
|
-
3-HP
|
+
3-HP
|
-
3-HP
|
+
3-HP
|
-
3-HP
|
+
3-HP
|
1 |
Achromobacter denitrificans
|
0.04 |
0.24 |
0.31 |
6.40 |
0.24 |
6.34 |
2 |
Acidovorax avenae subsp.
|
0.05 |
0.28 |
0.34 |
5.97 |
0.21 |
5.98 |
|
Acidovorax sp. |
0.02 |
0.31 |
0.33 |
6.76 |
0.36 |
6.04 |
3 |
Acinetobacter baumannii
|
0.01 |
0.19 |
0.35 |
6.02 |
0.27 |
5.76 |
4 |
Aeromonas hydrophilia
|
- |
- |
0.37 |
6.17 |
0.32 |
6.14 |
5 |
Agrobacterium sp.
|
0.01 |
0.27 |
0.36 |
6.27 |
0.41 |
6.56 |
6 |
Alcaligenes faecalis
|
0.04 |
0.26 |
0.39 |
5.87 |
0.28 |
5.73 |
7 |
Alcanivorax hongdengensis
|
0.03 |
0.27 |
0.33 |
6.74 |
0.37 |
6.58 |
8 |
Alicycliphilus denitrificans
|
0.07 |
0.30 |
0.31 |
7.01 |
0.25 |
6.01 |
9 |
Alteromonas marina
|
0.06 |
0.34 |
0.34 |
6.09 |
0.22 |
5.73 |
10 |
Amycolatopsis sp.
|
- |
- |
0.32 |
5.96 |
0.24 |
6.05 |
11 |
Anaeromyxobacter dehalogenans
|
- |
- |
0.37 |
6.43 |
0.28 |
5.44 |
12 |
Azospirillum brasilensse
|
0.05 |
0.41 |
0.36 |
6.54 |
0.33 |
6.05 |
13 |
Azotobacter vinelandii
|
- |
- |
0.38 |
6.73 |
0.31 |
5.87 |
14 |
Beijerinckia
indica
|
- |
- |
0.34 |
6.59 |
0.29 |
5.01 |
15 |
Bordetella
avium
|
0.08 |
0.45 |
0.31 |
6.04 |
0.24 |
4.98 |
16 |
Bradyrhizobium
japonicum
|
0.07 |
0.52 |
0.41 |
7.21 |
0.34 |
5.49 |
17 |
Burkholderia
ambifaria
|
0.03 |
0.31 |
0.29 |
5.94 |
0.21 |
5.13 |
18 |
Catenulispora
acidiphilia
|
0.05 |
0.41 |
0.32 |
5.84 |
0.25 |
5.24 |
19 |
Caulobacter
sp
.
|
0.04 |
0.45 |
0.35 |
5.96 |
0.24 |
5.96 |
20 |
Castellaniella
defragrans
|
- |
- |
0.45 |
7.43 |
0.37 |
5.98 |
21 |
Chromobacterium
violaceum
|
0.02 |
0.25 |
0.38 |
7.02 |
0.32 |
6.31 |
22 |
Collimonas
arenae
|
- |
- |
0.37 |
7.20 |
0.30 |
5.87 |
23 |
Comamonas
testosteroni
|
0.04 |
0.24 |
0.28 |
5.88 |
0.21 |
4.96 |
24 |
Corynebacterium
vitaeruminis
|
0.03 |
0.28 |
0.47 |
6.99 |
0.34 |
5.89 |
25 |
Cupriavidus
necator
|
0.02 |
0.21 |
0.42 |
6.84 |
0.33 |
6.05 |
26 |
Curvibacter
gracilus
|
- |
- |
0.29 |
5.76 |
0.19 |
3.99 |
27 |
Delftia
acidovorans
|
- |
- |
0.33 |
6.34 |
0.26 |
4.03 |
28 |
Ferrimonas
balearica
|
- |
- |
0.41 |
7.04 |
0.34 |
5.17 |
29 |
Glaciecola
nitratireducens
|
0.05 |
0.30 |
0.36 |
7.11 |
0.29 |
4.81 |
30 |
Gordonia
bronchialis
|
0.04 |
0.29 |
0.45 |
6.99 |
0.33 |
5.21 |
31 |
Hahella
chijuensis
|
0.03 |
0.28 |
0.42 |
6.81 |
0.34 |
5.97 |
32 |
Halomonas
elongata
|
0.06 |
0.32 |
0.27 |
5.41 |
0.19 |
4.34 |
33 |
Hirschia
litorea
|
0.05 |
0.34 |
0.29 |
6.19 |
0.18 |
4.56 |
34 |
Idiomarina
sp
.
|
0.08 |
0.42 |
0.47 |
7.21 |
0.32 |
5.43 |
35 |
Janthinobacterium
lividum
|
0.03 |
0.33 |
0.41 |
6.98 |
0.29 |
5.01 |
36 |
Kitasatospora
setae
|
0.04 |
0.36 |
0.39 |
6.46 |
0.25 |
5.25 |
37 |
Kutzneria
albida
|
0.03 |
0.41 |
0.35 |
5.96 |
0.24 |
5.61 |
38 |
Methylobacterium
sp
.
|
0.05 |
0.45 |
0.33 |
6.02 |
0.23 |
598 |
39 |
Methylocystis
sp
.
|
- |
- |
0.32 |
6.51 |
0.21 |
4.91 |
40 |
Novosphingobium
sp
.
|
0.04 |
0.39 |
0.29 |
5.98 |
0.25 |
6.04 |
41 |
Oceanimonas
smirnovii
|
0.02 |
0.24 |
0.36 |
6.44 |
0.28 |
4.88 |
42 |
Paracoccus
sp
.
|
0.03 |
0.25 |
0.34 |
6.32 |
0.27 |
4.96 |
43 |
Parvibaculum
lavamentivorans
|
0.04 |
0.28 |
0.46 |
7.31 |
0.32 |
4.99 |
44 |
Phenylobacterium
kunshanensis
|
0.06 |
0.33 |
0.41 |
7.43 |
0.33 |
5.02 |
45 |
Photobacterium
gaetbuleda
|
- |
- |
0.36 |
7.02 |
0.29 |
5.06 |
46 |
Polynucleobacter
necessarius
asymbioticus
|
0.09 |
0.45 |
0.39 |
6.99 |
0.27 |
5.37 |
47 |
Pseudoalteromonas
carrgeenovora
|
- |
- |
0.29 |
5.76 |
0.21 |
5.03 |
48 |
Pseudogulbenkiania
sp
.
|
0.04 |
0.26 |
0.32 |
5.98 |
0.23 |
5.36 |
49 |
Pseudomonas
denitrificans
ATCC13867
|
0.03 |
0.23 |
0.39 |
6.20 |
0.26 |
5.43 |
|
Pseudomonas
knackmussii
|
0.03 |
0.25 |
0.41 |
6.81 |
0.35 |
5.96 |
|
Pseudomonas
protegens
|
0.02 |
0.19 |
0.28 |
5.62 |
0.21 |
5.01 |
|
Pseudomonas
fluorescens
|
0.04 |
0.27 |
0.26 |
5.81 |
0.18 |
4.70 |
50 |
Pseudoxanthomonas
spadix
|
- |
- |
0.31 |
5.99 |
0.27 |
4.96 |
51 |
Psychrobacter
phenylpyruvicus
|
0.08 |
0.37 |
0.43 |
7.04 |
0.31 |
5.03 |
52 |
Ralstonia
oxalatica
|
- |
- |
0.40 |
7.21 |
0.34 |
5.21 |
53 |
Rhodomicrobium
vannielli
|
0.05 |
0.41 |
0.39 |
7.01 |
0.32 |
6.02 |
54 |
Segniliparus
rotundus
|
0.07 |
0.27 |
0.25 |
5.81 |
0.19 |
4.32 |
55 |
Shewanella
oneidensis
|
0.05 |
0.28 |
0.25 |
5.81 |
0.19 |
4.07 |
56 |
Simiduia
agarovorans
|
0.03 |
0.29 |
0.23 |
5.76 |
0.21 |
4.87 |
57 |
Sinorhizobium
meliloti
|
- |
- |
0.24 |
5.79 |
0.16 |
4.07 |
58 |
Sphingobium
chlorophenolicum
|
0.06 |
0.33 |
0.33 |
5.99 |
0.23 |
4.86 |
59 |
Sphingomonas
wittichii
|
0.03 |
0.45 |
0.31 |
7.02 |
0.32 |
6.42 |
60 |
Sphingopyxis
alaskensis
|
- |
- |
0.35 |
7.00 |
0.35 |
6.94 |
61 |
Stenotrophomonas
maltophilia
|
0.04 |
0.31 |
0.29 |
6.02 |
0.24 |
5.21 |
62 |
Streptomyces
nodosus
|
0.07 |
0.39 |
0.43 |
6.72 |
0.34 |
5.14 |
63 |
Tatlockia
micdadei
|
- |
- |
0.47 |
6.61 |
0.36 |
5.65 |
64 |
Thalassospira
xiamenensis
|
- |
- |
0.32 |
7.02 |
0.33 |
6.10 |
65 |
Variovorax
paradoxus
|
- |
- |
0.38 |
6.59 |
0.28 |
4.97 |
66 |
Verminephrobacter
eiseniae
|
0.08 |
0.43 |
0.42 |
6.43 |
0.30 |
5.14 |
67 |
Vibrio
furnissii
|
0.05 |
0.39 |
0.39 |
6.03 |
0.27 |
4.91 |
68 |
Xanthobacter
autotrophicus
|
0.04 |
0.27 |
0.27 |
6.23 |
0.21 |
5.41 |
69 |
Xanthomonas
campestri
|
0.03 |
0.25 |
0.24 |
5.81 |
0.18 |
5.09 |
|
Xanthomonas
oryzae
|
0.02 |
0.19 |
0.45 |
6.43 |
0.34 |
5.19 |
이들 미생물에서 3-HP 유도성 프로모터에 대한 분석을 실시하였다. 앞서 P. denitrificans의 경우와 마찬가지로 모든 프로모터는 O1, O2 operator sequence를 가지고 있었다. 이 서열의 존재는 각각 9개의 염기로 이루어진 palindromic structure로 확인되었다. 이들 서열에 대한 추가적인 연구가 진행되지는 않았지만 이들 모두 P.
denitrificans의 경우와 같이 LysR 단백질과 결합할 것으로 예상되었다.
결론적으로, 생물학적으로 3-HP 생산을 향상시키려면 효소활성을 가지는 새로운 효소들을 계속적으로 생산해내는 것이 필요하다. 본 발명에서는 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans)를 비롯한 여러 미생물에서 3-HP에 반응하는 전사 조절자들과 프로모터들을 스크리닝하였다. 이들은 LysR 단백질과 이 단백질에 결합하는 특정 유전자 염기서열로 이루어져 있었다. 또한 LysR family transcriptional regulator는 3-HP가 존재할 때 해당 유전자의 발현을 상향조절하는 것으로 확인되었다. 분자 모델링과 docking 실험은 C4-LysR (ARG94, LYS96, GLU137, ARG24)과 C3-LysR(LEU74, THR190, THR28, THR73, VAL150, PRO167, PHE127, PHE169)에 중요한 잔기들이 존재함을 보여주었다. 3-HP 유도성 시스템은 3-HP 대사 경로를 조절하는데 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
<
실시예
2> 슈도모나스
데니트리피칸스(
P. denitrificans
)에서
3-
하이드록시프로피온산
생산 경로의 최적화
1. 균주, 플라스미드 및 실험 재료
이 연구에서 사용된 박테리아 종과 플라스미드는 표 8과 같다. 대장균(E.
coli)은 한국미생물자원센터(KCTC)에서, 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) 균주는 ATCC에서 분양받았다. E.
coli XL1-Blue 는 플라스미드 복제와 유지에 사용되었다. 게놈의 DNA 분리 키트와 pGEM-T 벡터는 Promega (Madison, WI, USA)에서, 고성능 pfx polymerase는 Invitrogen (서울, 대한민국)에서, DNA 변형 효소는 New England Bio-Labs (Beverly, MA, USA)에서, Miniprep과 DNA gel 추출 키트는 Qiagen (Mannheim, Germany)에서 구입하였다. 그리고 프라이머는 Cosmogenetech Co. Ltd.(서울, 대한민국), Bacto Tryptone과 yeast extract는 Difco (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ, USA)에서 기타 화학물질과 효소들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
본 발명에서 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드
|
분석내용
|
출처
|
Strains
|
|
|
E. coliDH5α |
Cloning host |
KCTC, Korea |
P. denitrificanswt |
P. denitrificans ATCC13867; Source for 3hibdhIV and 3hpdh promoters and terminators |
ATCC, America |
Δ3hpdhΔ3hibdhIV
|
P. dentirificans ATCC13867 Δ3hpdhΔ3hibdhIV double mutant strain |
Zhou et al. 2014 |
Δ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhI
|
P. dentirificans ATCC13867 Δ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhI triple mutant strain |
This study |
Plasmids
|
|
|
pGEM-T |
lacZa; cloning vector; pGEM 5zf(+) derivative; 3T-overhang; Ampr |
Promega |
pUCP19 |
ColE1-ori;pRO1614-ori;broad-host-range cloning vector; Ampr
|
West et al. 1994 |
pUCPK/ PC3-dhaB-gdrAB, PC4-KGSADH |
KGSADH gene amplified from pQKS1 were overlapped with 3hibdhIV promoter and terminator and cloned in pUCPK/PC3-dhaB-gdrAB; Kmr
|
This study |
pUCPK/ PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH |
gdrAB and dhaB gene order were switched and cloned in pUCPK/PC4-KGSADH, ; Kmr |
This study |
2. 슈도모나스
데니트리피칸스
(
P.
denitrificans
) △
3hpdh
△
3hibdhIV
△3hibdhI 결실 돌연변이 균주의 개발
3-HP 분해 유전자의 역할을 파악하기 위해 3hibdhI가 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) △3hpdh△3hibdhIV의 염색체로부터 제거되었다. 목적 유전자는 sacB negative counter-selection 시스템에 기초하여 결실되었다. pQE-80L 벡터의 NdeI과 XbaI 제한부위에 sacB-Km 카세트를 도입하여 pQSAK 플라스미드가 만들어졌으며, 이는 목적 유전자의 제거에 사용되었다. 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans) 게놈 DNA를 사용하여 목적 유전자의 ~700 bp 상부와 하부를 포함하는 DNA 단편이 PCR를 통해 얻어졌으며 이 부분은 DNA 시퀀스 확인 후 pGEM-T 벡터로 클로닝되었다. 그 후 pQSAK 플라스미드 안으로 다시 sub-cloning 되었으며 두 번의 재조합을 통해 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) 돌연변이주가 개발되었다. 이러한 돌연변이 균주들은 PCR 및 시퀀스 확인을 통해 재확인되었다. 그렇게 확보된 돌연변이 균주를 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) △3hpdh△3hibdhIV△3hibdhI라고 명명하였다.
3. 플라스미드의 개발
글리세롤 탈수효소와 재활성화효소를 암호화하는 유전자는 pUCPK'/PC3-dhaB-gdrAB, PC4-KGSADH 플라스미드를 이용하여 증폭되었고 발현카세트는 gdrAB와 dhab123 유전자 끝 측면의 5' 과 3'에 C3 프로모터와 C3 터미네이터를 각각 클로닝하면서 개발되었다. 이 발현카세트는 pUCPK'/PC3-dhaB-gdrAB, PC4-KGSADH 플라스미드의 XbaI와 SacI 제한부위에서 복제되었고 pUCPK'/PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH라고 명명되었다. 이렇게 개발된 플라스미드 pUCPK'/PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH는 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) △3hpdh△3hibdhIV△3hibdhI에 형질전환되었고, 최종적으로 Pd △3hpdh△3hibdhIV△3hibdhI (pUCPK'/PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH)이 개발되었다(도 16).
4. 효소 활성의 결정
DhaB 활성은 KGSADH 효소의 활성 측정을 통해 측정이 가능하다. 1 Unit의 DhaB 활성은 1분 동안 1μmol의 NAD+를 NADH로 환원하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다. 요약하건대, 우선 1mM DTT, 15uM coenzyme B12, 3mM MgCl2, 1.5mM ATP를 포함하고 있는 50 mM potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액 (총 부피 1 mL)에 20ul의 26 U/mg NAD+-dependent KGSADH를 37℃에서 5분간 배양한다. 이때 KGSADH는 25% 글리세롤을 함유하고 있다. 반응은 1.5mM NAD+와 37℃에서 예열된 DhaB를 포함하는 적절한 양의 세포 추출물을 추가함으로써 시작되었고, NADH의 흡광도 변화를 통해 관찰되었다. KGSADH 활성은 Raj 박사에 의해 보고된 방법을 사용하여 340nm에서 NAD+가 NADH로 환원되는 것을 측정하여 밝혀졌다. 50 mM potassium phosphate 완충용액(pH 8.0), 1 mM DTT, 적당량의 효소 추출물을 포함한 반응 혼합물이 37℃에서 5분간 배양되었고, 2.0 mM 3-HPA와 2.0 mM NAD+를 추가함으로써 반응이 시작되었다. NADH의 양은 6.22×103 M-1cm-1의 molar extinction coefficient (△ε340)를 사용하여 결정되었다. KGSADH의 1 Unit 활성은 1분에 1 μmol의 NAD+를 NADH로 환원시키는데 필요한 효소의 필요량에 따라 정의되었다. 모든 효소 활성은 원료 세포 추출물로 측정되었다.
5. 배양 배지와 배양 조건
따로 명시되지 않는 한 진탕배양은 20 mL의 배양액을 포함한 250 mL non-baffled Erlenmeyer 플라스크를 이용하여 200 rpm, 30℃에서 진행되었다. 리터당 MgSO4, 0.25 g; NaCl, 1.0 g; NH4Cl, 1.0 g; yeast extract, 1 g; glycerol, 100 mmol; L-glutamate, 5 g; tryptone, 2 g; glucose 2.5 g을 포함하는 M9 배양 배지가 사용되었다. 배지는 100 mM potassium phosphate 완충용액(pH 7.0)이 포함되었다. 필요시 12 μmol/L의 코엔자임 B12가 추가로 주입되었으며, 산소투과 스펀지 플러그로 플라스크를 막았다. 세포량, 잔류 기질, 대사산물의 측정을 위해 정기적으로 샘플링 되었으며 모든 진탕배양 실험은 3회 반복되었고 바이오매스와 대사산물의 표준편차는 10% 미만이었다. 바이오리액터 실험은 1.5-L 용량 Biotron-LiFlus GM 바이오리액터(Biotron, 서울, 대한민국)에서 1L 작업량으로 수행되었다.
바이오리액터 실험을 위한 M9 배양배지는 리터당 MgSO4·H2O, 0.25 g; NaCl, 1.0 g; NH4Cl, 1.0 g; yeast extract, 1 g; L-glutamate, 5 g; tryptone, 2 g; casamino acids, 2g; glucose 2.5 g, trace element solution, 10 mL/L를 포함하고 있으며 100 mM의 potassium phosphate 완충용액 (pH 7.0)을 포함한다. 배양은 30℃ 유가식 배양 모드로 농축된 글리세롤(10 M)과 7 mM 글루코스를 주기적으로 주입하면서 수행되었다. pH는 5 N NaOH와 2.5 N HCl을 사용하여 7.0±0.1로 유지되었다. 공기는 agitation 속도 650 rpm에 1 vvm으로 계속해서 공급되었다. 배양 중에는 Tryptone, 2 g/L; casamino acids, 2 g/L; L-glutamate, 5.0 g/L; yeast extract, 1 g/L를 포함하는 배지가 6시간마다 바이오리액터에 추가되었다. 샘플은 세포량, 잔류기질, 대사산물의 측정을 위해 정기적으로 분석되었다.
6. 분석방법
세포 농도는 분광광도계(Lambda 20, Perkin Elmer; Norwalk, CT, USA)를 사용하여 10-mm 길이의 큐벳으로 측정되었다. 600 nm (OD600) 흡광도의 1 unit은 리터당 0.3g의 건조 세포량과 일치한다. 단백질 농도는 소혈청알부민을 기준으로 하여 Bradford 방법으로 마이크로티터 플레이트 리더(1420, Wallac Victor 2; Perkin Elmer)에 의하여 분석되었다. 글리세롤, 3-HP 및 다른 대사산물의 농도는 HPLC에 의해 측정되었는데, 10분간 10,000×g로 배양 샘플의 원심분리에 의해 얻어진 상등액을 Tuffryn-membrane (Acrodisc, Pall Life Sciences)에 의해 여과하고 300 mm × 7.8 mm Aminex HPX-87H (Bio-Rad, USA) column에 의해 65℃에서 2.5 mM H2SO4를 이동상으로 사용하여 용출된다.
7. 결과
(1) 재조합 Pd
Δ3hpdhΔ3hibdhIV
△
3hibdhI
(
pUCPK
’/PC3-
gdrAB
-
dhaB
, PC4-KGSADH)의 진탕 플라스크 배양
본 발명자들은 이전 연구에서 글리세롤 전환이 일어날 때 DhaB에 의한 자멸적인 촉매 반응으로 인해 DhaB 활성이 매우 감소되는 것을 관찰하였다. 이는 DhaB를 재활성화시키는 GdrAB의 발현정도가 낮았을 가능성이 있다. 또 PC3 프로모터 바로 밑에 GdrAB와 DhaB를 순서대로 배열함으로써 GdrAB의 발현이 향상될 것으로 예상했다. 이러한 가설을 바탕으로, 플라스미드 pUCPK’/PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH이 개발되었고, 플라스미드는 다시 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans, 이후 Pd로 표기함) Δ3hpdhΔ3hibdhIV△3hibdhI 균주에 도입된 후 3-HP 생산에 사용되었다. 글리세롤로부터 3-HP 생산에 대한 GdrAB과 DhaB의 배열순서 변경에 대한 효과는 Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIV△3hibdhI (pUCPK’/PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH)에서 측정되었다. 코엔자임 B12의 공급 효과는 0h에 12μM를 공급함으로써 조사되었다. Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIV△3hibdhI (pUCPK’/PC3-dhaB-gdrAB, PC4-KGSADH)는 대조군으로 사용되었다. 도 17의 S1~S3는 재조합 Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIV△3hibdhI (pUCPK’/PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH)에 의한 글리세롤로부터 3-HP의 생산을 보여주고 있으며, 도 17의 O1~O3는 재조합 Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIV△3hibdhI (pUCPK’/ PC3-dhaB-gdrAB, PC4-KGSADH)에 의한 글리세롤로부터 3-HP의 생산을 나타낸다. 도 17의 S1과 O1는 글리세롤 공급이 없는 경우의 결과를 보여주고 있으며, 도 17이 S2과 O2는 코엔자임 B12의 공급이 없는 경우의 결과를 보여준다. 반면, 도 17의 S3과 O3는 코엔자임 B12가 공급된 결과이다. 두 균주 사이에 세포성장에는 큰 차이가 없었다. 그러나 코발트(cobalt)와 코엔자임 B12가 공급된 Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIV△3hibdhI (pUCPK’/PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH) 균주에 의한 3-HP 생산은 12h 후 각각 41%, 29%로 증가하였다. 이러한 결과는 DhaB 반응 속도가 코엔자임 혹은 코발트 양에 영향을 받는다는 것을 의미한다.
코발트(cobalt)의 추가 시 12h에 3-HPA과 1,3-PDO가 생산되는 것을 관찰하였지만 대조 균주에서는 3-HPA가 (코발트 있음) 축적되지 않는 것을 알 수 있었다(표 9). 글리세롤로부터 3-HP 생산 수율은 ~1이었으며, 이는 공급된 글리세롤이 완전히 3-HP 생산에 사용되었고 또한 생산된 3-HP는 다시 분해되지 않았음을 의미한다.
재조합 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans) Δ3hpdhΔ3hibdhIV△3hibdhI의 12-h 배양에서 탄소분포
|
S2
|
S3
|
O2
|
O3
|
substrates
|
|
|
|
|
Glucose (mM) |
0.58 |
0.91 |
0.67 |
0.88 |
Glycerol (mM) |
64.13 |
52.15 |
44.92 |
37.45 |
Biomass (g/L) |
1.51 |
1.36 |
1.66 |
1.17 |
Metabolites
|
|
|
|
|
3-HP (mM) |
64.83 |
49.51 |
45.93 |
38.24 |
3-HPA (mM) |
0.78 |
0.52 |
0 |
0.39 |
1,3-PDO (mM) |
3.55 |
4.95 |
1.37 |
1.42 |
Growth rate (μ
max, h-1) |
0.56 |
0.54 |
0.54 |
0.53 |
3-HP yield on glycerol (mol/mol) |
1.01 |
0.95 |
1.02 |
1.02 |
Glycerol carbon recovery (%) |
1.08 |
1.05 |
1.05 |
1.07 |
(2) 효소 활성
시간에 따른 DhaB와 KGSADH의 in vitro 효소활성이 측정되었다(도 18). DhaB 효소활성은 KGSADH 효소의 활성을 이용해 조사되었고, KGSADH 효소 활성은 프로피온알데히드를 기질로 사용하여 측정되었다. DhaB 와 GdrAB 유전자 순서가 바뀔 때 DhaB 활성이 낮아지는 것으로 관찰되었다. 한편 글리세롤, 코발트 또는 코엔자임 B12의 추가는 오히려 DhaB 효소의 심각한 활성 저하를 일으키는 것으로 관찰되었다. 3-HPA의 축적에 따른 효과인지 혹은 다른 요인에 의한 것이지 추가적인 실험이 필요하다. 그러나 한 가지 분명한 사실은 gdrAB와 DhaB 순서를 바꾸는 것만으로는 DhaB의 효소활성을 충분히 향상시키지 못한다는 것이다. 현재 사용한 재조합 균주에서 gdrB 발현이 향상되었는지 그 여부는 확실하지 않다. gdrB translation에 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella
pneumoniae)의 RBS가 사용되었고 추후 이 부분에 대한 검증이 필요하다.
(3)
GdrAB
,
DhaB
,
KGSADH
과발현 재조합 Pd
Δ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhI
(pUCPK’/ PC3- gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH)의 바이오리액터 배양
Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhI (pUCPK’/PC3-gdrAB-dhaB, PC4-KGSADH)과 Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhI (pUCPK’/PC3-dhaB-gdrAB, PC4-KGSADH) 균주를 이용한 글리세롤과 글루코스 유가식 바이오리액터 운전이 수행되었다. 바이오리액터 실험에서 글루코스와 글리세롤 농도는 각각 10, 150mM 보다 낮게 유지되었다. 6시간마다 글루타메이트(glutamate)가 세포성장을 위해 공급되었다. 배양결과 두 바이오리액터 모두에서 비슷한 세포성장이 관찰되었다. 두 배양 모두 성장이 9시간 후 감소하였고 그 후 세포성장은 반응 끝까지 지속되었다. 바이오리액터 A에서는 Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhI (pUCPK’/PC3-dhaB-gdrAB, PC4-KGSADH) 균주가 사용되었다 (도 19). 3-HP 생산은 36시간까지 대체로 증가하여 58 ± 2 g/L 이상, 생산율 1.2 g/L/h, 글리세롤로부터 0.9 mol/mol 이상의 3-HP 수율이 얻어졌다. 3-HP 생산속도는 36시간 후 감소하였다. 36h 부터 48h 사이에서는 단지 2 ± 0.5 g/L의 3-HP 생산에 머물렀다. 전체적으로 48h 동안 1.0 g/L/h의 생산성, 글리세롤로부터 3-HP 수율 0.93 mol/mol로 60 ± 2 g/L의 3-HP가 생산되었다. 이전 실험, 즉 3hibdhI가 결실되지 않은 균주의 발효실험과 비교할 때 3-HP 생산수율이 크게 향상되었는데, 이는 3hibdhI가 3-HP의 분해에 중요한 역할을 하고 있음을 확인시켜 준다. 3hibdhI의 영향은 발효시간이 짧은 플라스크 실험에서는 전혀 관찰되지 않았다.
바이오리액터 B에서 유전자(dhaB과 gdrAB) 순서가 바뀐 균주를 이용하였고, 그 결과 3-HP 생산이 발효 후반에 보다 향상되었다. 1.3 g/L/h의 생산성, 글리세롤로부터 3-HP 수율 0.95 mol/mol로 약 63 ± 2 g/L의 3-HP가 생산되었다. 바이오리액터 A에 비하여 3-HP 생산이 5% 증가하였다. 비록 효소활성 분석이나 플라스크 실험에서는 그 결과가 나타나지 않았으나 GdrAB 발현 정도가 3-HP 생산에서 매우 중요하다는 것을 의미한다.
결론적으로, 3-HP 생산 경로 효소인 DhaB, GdrAB와 KGSADH가 발현될 때 슈도모나스 데니트리피칸스(P.
denitrificans)는 글리세롤로부터 3-HP를 생산할 수 있었다. 재조합 플라스미드는 PC3와 PC4라는 두 개의 강력한 유도 프로모터를 사용하여 개발되었고, 3개의 유전자가 결실된 Pd Δ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhI가 숙주로 사용되었다. DhaB의 불활성화정도를 완화시켜주기 위해 gdrAB를 dhaB 앞에 위치하도록 하였고 이로 인해 gdrAB의 발현이 강화될 수 있었다. 효소 활성 분석과 SDS-PAGE를 통한 단백질 발현 분석은 이러한 위치변화를 통해 DhaB의 활성이 낮아지는 것을 보여주었다. 하지만 감소한 DhaB의 활성에도 불구하고 3-HP 생산은 향상되었다. 또 새로운 재조합 균주를 이용한 유가식 바이오리액터의 운전 결과, 더 높은 농도, 생산성 및 수율이 얻어졌다.