JP2013542747A - 3‐ヒドロキシプロピオン酸生産用の組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、コンピューターが読取可能な形式で配列表を含んでおり、そしてそれを参照により本明細書中に援用する。
3‐ヒドロキシプロピオン酸(3‐HP)は、米国エネルギー省によって、発酵により作ることができる有望なビルディングブロック化学物質トップ12のうちの1に挙げられた三炭素カルボン酸である。乳酸(2‐ヒドロキシプロピオン酸)の異性体である3‐HPの別名には、エチレン乳酸や3‐ヒドロキシプロピオナートがある。3‐HPは、グルコースからの100%の理論収率、さまざまな化学反応に参加することを可能にする複数の官能基、及び低毒性を有する魅力的な再生可能なプラットフォーム化学物質である。3‐HPは、例えば、1,3‐プロパンジオール、マロン酸、アクリルアミド、及びアクリル酸などのいくつかの汎用化学製品を形成するための基質として使用できる。アクリル酸は、アクリラートエステルや超吸水性高分子を作るのに使用される大規模化学物質(>70億ポンド(約350万t)/年)であり、現在、プロピレンの触媒酸化によってもたらされている。3‐HPの発酵生産は、これらの商業的に重要な化学物質の原料として石油化学品に対する持続可能な代替品を提供し、それにより、エネルギー消費量、外国産オイルへの米国の依存度、及び地球温暖化ガスの産生を減少させると思われる。
PEP、ピルバート、及び/又はグリセロールから3‐HPへの活性な3‐HP発酵経路を含んでいる遺伝子組み換え酵母細胞を、特定の実施形態で本明細書中に規定する。特定の実施形態において、本明細書中で規定する細胞は、PPC、PYC、AAT、ADC、BAAT、gabT、3‐HPDH、HIBADH、4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ACC、AAM、アラニンデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、BCKA、KGD、4‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ、Co‐Aアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、CoAシンテターゼ、CoAトランスフェラーゼ、グリセロールデヒドラターゼ、IPDA、LDH、ラクチル‐CoAデヒドラターゼ、リンゴ酸デカルボキシラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マロニル‐CoAレダクターゼ、OAAギ酸リアーゼ、OAAデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ、PDH、2‐ケト酸デカルボキシラーゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、又は3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする1若しくは複数の3‐HP経路遺伝子を含んでいる。
S.アベルミチリス(S. avermitilis)、C.アセトブチリカム(C. acetobutylicum)、H.ピロリ(H. pylori)、B.リチェニフォルミス(B. licheniformis)、若しくはC.グルタミクムから得られる細菌ADC遺伝子;I.オリエンタリス若しくはS.クルイベリ(S. kluyveri)から得られる酵母BAAT遺伝子、又はS.アベルミチリスから得られる細菌BAAT遺伝子;S.セレビシエから得られる酵母gabT遺伝子又はS.アベルミチリスから得られる細菌gabT遺伝子;I.オリエンタリス若しくはS.セレビシエから得られる酵母3‐HPDH遺伝子又はE.コリ若しくはM.セデュラ(M. sedula)から得られる細菌3‐HPDH遺伝子;A.フェカリス(A. faecalis)、P.プチダ(P. putida)、若しくはP.エルギノーサ(P. aeruginosa)から得られる細菌HIBADH遺伝子;C.クルイベリから得られる酵母4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子又はR.ユートロファ(R. eutropha)から得られる細菌4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでいてもよい。
特定の実施形態において、3‐HP経路遺伝子1若しくは複数のは外来性であり、そしてこれらの実施形態において、該遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類起源から得ることもできる。
以下の本発明の説明は、本発明の様々な実施形態を例示することを意図したにすぎない。そのため、議論した具体的な改変は、本発明の範囲に対する制限と解釈されるものではない。様々な同等物、変更、及び改変が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者にとって明らかであろうから、係る同等の実施形態が、本明細書中に含まれるべきことも理解されている。
3‐HP、3‐ヒドロキシプロピオン酸;3‐HPA、3‐ヒドロキシプロピオンアルデヒド;3‐HPDH、3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ;AAM、アラニン2,3アミノムターゼ;AAT、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ;ACC、アセチル‐CoAカルボキシラーゼ;ADC、アスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼ;AKG、α‐ケトグルタル酸;ALD、アルデヒドデヒドロゲナーゼ;BAAT、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ;BCKA、分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼ;bp、塩基対;CYB2、L‐(+)‐乳酸シトクロムcオキシドレダクターゼ;CYC、イソ‐2‐シトクロムc;EMS、エタンスルホン酸メチル;ENO、エノラーゼ;gabT、4‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ;GAPDH、グリセルアルデヒド‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼ3;GPD、グリセロール3‐リン酸デヒドロゲナーゼ;GPP、グリセロール3‐リン酸ホスファターゼ;HIBADH、3‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ;IPDA、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ;KGD、α‐ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ;LDH、乳酸デヒドロゲナーゼ;MAE、リンゴ酸酵素;OAA、オキサロ酢酸;PCK、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;PDC、ピルビン酸デカルボキシラーゼ;PDH、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ;PEP、ホスホエノールピルビン酸;PGK、ホスホグリセリン酸キナーゼ;PPC、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ;PYC、ピルビン酸カルボキシラーゼ;RKI、リボース5‐リン酸ケトールイソメラーゼ;TAL、トランスアルドラーゼ;TEF1、翻訳延長因子‐1;TEF2、翻訳延長因子‐2;TKL、トランスケトラーゼ;XDH、キシリトールデヒドロゲナーゼ;XR、キシロースレダクターゼ;YP、酵母抽出物/ペプトン。
3‐HP生産用の遺伝子組み換え酵母細胞、これらを酵母細胞の作製方法、及び3‐HPを生産するためのこれらの細胞の使用方法を、本明細書中に規定する。本明細書中で使用される「3‐HP」としては、塩及び酸形態の3‐ヒドロキシプロピオン酸が挙げられる。
3‐HP発酵経路の各反応を触媒するのに必要とされる活性な酵素を産生するので、そのため、少なくとも1種類の発酵性糖の存在する発酵条件下で培養されると、計測可能な収量で3‐HPを産生することができる。活性な3‐HP発酵経路を持つ酵母細胞は、1若しくは複数の3‐HP経路遺伝子を含んでいる。本明細書中で使用される「3‐HP経路遺伝子」は、3‐HP発酵経路に関与する酵素をコードするヌクレオチド配列のコード領域を指す。
3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、それらがNAD(H)補因子を利用するなら、EC1.1.1.59に分類され、そして、それらがNADP(H)補因子を利用するなら、EC1.1.1.298に分類される。あるいは、EC1.1.1.298に分類される酵素は、マロン酸セミアルデヒドレダクターゼとも呼ばれる。
TEは、10mMのTris塩基及び1mMのEDTA、pH8.0から構成された。
2× YT+ampプレートは、16g/Lのトリプトン、10g/Lの酵母抽出物、5g/LのNaCl、100mg/Lのアンピシリン、及び15g/LのBactoアガーから構成された。
ura選択プレートは、6.7gの硫酸アンモニウム含有酵母窒素塩基、5gのカザミノ酸、100mLの0.5M コハク酸pH5、20gのNobleアガー、及び855mLの脱イオン水から構成された。
オートクレーブ滅菌後に、40mLの無菌の50%のグルコース及び2mLの10mg/mL クロラムフェニコールを加え、そしてプレートに注ぎ入れた。
ura選択培地は、6.7gの硫酸アンモニウム含有酵母窒素塩基、5gのカザミノ酸、100mLの0.5M コハク酸pH5、及び855mLの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、40mLの無菌の50%グルコース及び2mLの10mg/mL クロラムフェニコールを加えた。
YP+10%グルコース培地は、500mLのYPブロスと100mLの無菌の50%グルコースから構成された。
YPブロスは、10g/Lの酵母抽出物、20g/Lのペプトンから構成された。
YPDプレートは、10gの酵母抽出物、20gのペプトン、20gのバクトアガー、及び960mLまでの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、40mLの無菌の50%グルコースを加え、そして、プレートに注ぎ入れた。
TAEは、4.84g/LのTris塩基、1.14mL/Lの氷酢酸、及び2mL/Lの0.5M EDTA pH8.0から構成された。
TBEは、10.8g/LのTris塩基、5.5g/Lのホウ酸、及び4mL/Lの0.5M EDTA pH8.0から構成された。
LiOAc/TE溶液は、8部の滅菌水、1部の1M LiOAc、及び1部の10× TEから構成された。
PEG/LiOAc/TE溶液は、8部の50% PEG3350、1部の1M LiOAc、及び1部の10× TEから構成された。
50%のPEG3350は、100gのPEG3350を150mLの水に加え、加熱し、そして溶解するまで撹拌することによって調製された。そして、水で体積を200mLに合わせ、そしてオートクレーブで滅菌処理した。
ScD FOAプレートは、275mLの2×‐ScD 2× FOA液体培地及び275mLの2×‐ScD 2× FOAプレート培地から構成され、溶解させ、そして、65℃まで冷やした。
2×‐ScD 2× FOA液体培地は、6.66gのアミノ酸不含酵母窒素塩基、1.54gのura‐DOサプリメント(Clontech、Mountain View, CA, USA)、20gのデキストロース、50mgのウラシル、2mgのウリジン、2gの5‐FOA(5‐フルオロオロチン酸、一水和物;Toronto Research Chemicals, North York, ON, Canada)、及び1Lまでの水から構成された。得られた溶液を、滅菌するために濾過した。
2×‐ScD 2× FOAプレート培地は、11gのバクトアガーと275mLの水から構成された。得られた溶液を、滅菌するためにオートクレーブ処理した。
微量元素溶液は、EDTA(15.0g/L)、硫酸亜鉛7水和物(4.5g/L)、無水塩化マンガン(1.0g/L)、塩化コバルト(II)六水和物(0.3g/L)、硫酸銅(II)五水和物(0.3g/L)、無水モリブデン二ナトリウム(0.4g/L)、無水塩化カルシウム(4.5g/L)、硫酸鉄七水和物(3g/L)、ホウ酸(1.0g/L)、及びヨウ化カリウム(0.1g/L)から構成された。
ビタミン溶液は、ビオチン(D−;0.05g/L)、パントテン酸カルシウム(D+;1g/L)、ニコチン酸(5g/L)、ミオイノシトール(25g/L)、塩酸ピリドキシン(1g/L)、p‐アミノ安息香酸(0.2g/L)、及び塩酸チアミン(1g/L)から構成された。
Butterfieldsリン酸バッファーは、1.25mL/Lの原液(26.22g/Lのリン酸二水素ナトリウムと7.78g/Lの炭酸ナトリウム)及び5mL/Lの塩化マグネシウム溶液(81.1g/LのMgCl2‐6H2O)から構成された。得られた溶液を、滅菌するためにオートクレーブ処理し、そして、pHを7.2に調整した。
CNB1振盪フラスコ培地は、尿素(2.3g/L)、硫酸マグネシウム七水和物(0.5g/L)、リン酸二水素カリウム(3.0g/L)、微量元素溶液(1mL/L)及びビタミン溶液(1mL/L)、グルコース(120.0g/L)、2‐(N‐モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)(97.6g/L)から構成された。すべての培地成分を溶解させた後に、培地のpHを、適当な塩基(例えば、KOH)を使用して5.8の初期pHに調整した。
プロモーター:実施例に記載のPDC、TDH3、ENO1、及びPGK1プロモーターをそれぞれ、配列番号244、245、246、及び247のI.オリエンタリス配列から得た。ターミネータ:実施例に記載のTAL、TKL、RKI、及びPDCターミネータをそれぞれ、配列番号248、249、250、及び251のI.オリエンタリス配列から得た。実施例に記載のURA3プロモーター、ORF、及びターミネータを、配列番号252のI.オリエンタリス配列から得た。
一群の野生型酵母株を、3‐HPの存在下で成長するそれらの能力について試験した。
一次スクリーニング手順のために、89種の野生型酵母株を、範囲を見つけるために使用したのと同じプロトコールを使用して、0g/L、75g/L、100g/L、又は125g/Lの3‐HP(pH3.9)のマイクロタイタープレートにおける成長についてスクリーニングした。新しいYPDプレートを各株に使用し、そして約4のOD600を有するスラリーを、YPD培地、pH3.0中に作製した。そのスラリーを、0.05のOD600までの各ウェルに植菌に使用した。プレートを、ガス浸透性膜によって覆い、30℃/300RPMの振盪機内で一晩インキュベートした。各ウェルの吸光度を、GENiosモデルプレートリーダにより600nmの波長で計測し、そしてプレートを目視により成長について観察した。同様のプロトコールを、0g/L、30g/L、45g/L、及び60g/Lの乳酸濃度における成長を評価するために実行した。表1に成長が観察された最高濃度の3‐HP又は乳酸をまとめた。
含んでいるが、が制限されない、例えば、米国特許第7,629,162号に記載のような、選択条件下での頻回連続継代培養である。そうした方法を、使用するか、又は先に記載したグルコース制限ケモスタット法の使用の代わりに又はそれに加えて使用できる。当業者によって理解され得るように、菌株は、改善された3‐HP耐性を作製するために乳酸よりむしろ3‐HPの存在下で同様の進化手順を用いて作り出される場合がある。さらに、菌株は、本明細書中に記載したように、選択前に突然変異誘発される場合がある(例えば、実施例1Bを参照のこと)。
二次スクリーンの第1部に関して、増殖速度を、pH3.9にて、0g/L、35g/L、又は75g/Lの3‐HPを含むYPD培地中で計測した。振盪フラスコに、6〜10のOD600まで一晩培養した種菌用フラスコから集菌したバイオマスを植菌した。250mLのバッフル付き増殖速度フラスコ(50mLの作業容量)に、0.1のOD600まで植菌し、250rpm及び30℃にて培養した。サンプルを、アッセイの時間経過の至るところで採取し、そして、OD600によってバイオマスの成長を分析した。得られたOD600データをプロットし、そして増殖速度を確立した。
実施例1Aで選択した酵母細胞を、高い3‐HP耐性を有する突然変異体を同定するために、突然変異誘発にかけ、そして選択圧に晒す。
以下の実施例に記載の改変酵母菌株を作り出すための酵母宿主ゲノム内へのDNA形質転換を、以下の具体的な手順に基づいておこなった。
宿主酵母細胞内に外来遺伝子を組み入れるための好適な挿入部位は、酵母宿主細胞内で欠失する3‐HP産生に有益であるか又は中立の効果を持つ遺伝子の遺伝子座であり得る。選択した酵母菌株の好適な挿入部位の制限されることのない例は、本明細書中の実施例に記載されている。当業者は、これら及び他の挿入部位、例えば、PDC(例えば、配列番号49に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号48に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスPDC遺伝子)、ADH(例えば、配列番号106、108、又は110に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号105、107、又は109に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスADH遺伝子)、GAL6(例えば、配列番号112に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号111に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスGAL6遺伝子)、CYB2A(例えば、配列番号114に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号113に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスCYB2A遺伝子)、CYB2B(例えば、配列番号116に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号115に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスCYB2B遺伝子)、GPD(例えば、配列番号118に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号117に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスGPD遺伝子)、ALD(例えば、配列番号120に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号119に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスALD相同性遺伝子5680、配列番号122に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号121は規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスALD相同性遺伝子42026、配列番号124に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号123に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスALD相同性遺伝子42426、あるいは、配列番号126に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号125は規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスALD相同性遺伝子42727)、又はPCK(例えば、配列番号128に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号127に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスPCK遺伝子)遺伝子又はその相同体の1若しくは複数の遺伝子座、の使用に関する本明細書中の教示を容易に適用できる。これら遺伝子の配列が未発表である場合、それらは、例えば、ゲノム配列決定、ゲノム又はcDNAライブラリーのプローブハイブリダイゼーション、又は公知の相同体配列に基づく縮重プライマーを使用する遺伝子断片の増幅と、それに続く完全な配列を得るためのゲノムウォーキングなどの標準手続きを使用して得られる。挿入部位のための他の好適な位置としては、オープンリーディングフレームを含まない遺伝子間領域が挙げられる。
挿入部位ベクターを、1若しくは複数の外来性遺伝子を宿主酵母細胞内に組み込むために作製する。宿主酵母細胞は、実施例1に記載の選択過程を受けた細胞であってもよいし、それらは、突然変異誘発及び/又は選択を受けていない細胞であってもよい。
プラスミドpMIBa107を、選択マーカーとしてURA3を使用して、PDCプロモーターとターミネータの制御下でI.オリエンタリスadh1202遺伝子座における単一遺伝子の組み込みを可能にするために作製した。ura選択マーカーを伴ったPDCプロモーターとターミネータを、以下で記載するようにPCR増幅し、そしてpCR4(商標)BLUNT TOPO(登録商標)(Invitrogen、La Jolla, CA, USA)内にクローン化した。PDCプロモーター、ターミネータ、及びURA3選択マーカーを含むPCR断片を、SOE PCRによって組み立てた。PDCプロモーターを、PCR産物の3’末端にPDCターミネータに対する相同性を持つプライマーで増幅し、そして、PDCターミネータ及びURA3選択マーカーを、産物の5’末端にPDCプロモーターに対する相同性を有するプライマーを使用して増幅した。そして、これらの2つの断片を、SOE PCRを介して組み立てた。
以下の挿入ベクター断片を、内在性I.オリエンタリスPDC遺伝子を、複数の遺伝子、例えば、PDC、ENO1、及びTDH3プロモーターから発現される本明細書中に記載した3つ遺伝子を発現するカセットに置き換える設計DNA構築物を作り出すのに使用できる。左の構築物(pMhCt068及び誘導体)と右の構築物(pMhCt069及び誘導体)の間の相同組み換えは、URA3タンパク質の発現をもたらし、そしてそれは、菌株のウラシル栄養要求性からウラシル原栄養性への転換をもたらして、所望の組み込み体の選択を可能にする。それぞれの左側構築物の5’末端は、PDC遺伝子座のDNA上流に相同であるのに対して、それぞれの右側構築物の3’末端は、PDC遺伝子座のDNA下流に相同である。これらの相同領域は、PDC遺伝子座に発現カセットを標的化するのに役立つ。この標的化アプローチを、図3に図式的に示し、そして、いずれかの好適な遺伝子座を標的とするために、本明細書中に記載した複数の遺伝子のいずれかの組み合わせ、例えば、先に記載したいずれかの遺伝子座、例えば、ADH遺伝子座(以下の例を参照のこと)又はALD遺伝子座など、を使用するように改変できる。
空ベクターである左側構築物(pMhCt068)を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。
PCRを、98℃にて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98℃にて10秒間、56℃にて20秒間、そして72℃にて2分と45秒間を34サイクル、それと72℃にて10分間の最終伸長をでをプログラムしたEppendorf(登録商標)MASTERCYCLER(登録商標)(Eppendorf Scientific)で実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、2460塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9%アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
空ベクターである右側構築物(pMhCt069)を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。
以下の挿入ベクター断片を、内在性I.オリエンタリスadh9091遺伝子を本明細書中に記載した着目の複数の遺伝子を発現するカセットに置き換えるために、実施例2Eに記載のものと同様のアプローチを使用して設計した。
空ベクターである左側構築物(pGREr125)を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。
PDCプロモータ領域、TALターミネータ、ENO1プロモータ領域、RKIターミネータ、I.オリエンタリスURA3プロモーター、対応するURA3マーカーの5’末端、及びI.オリエンタリスadh9091遺伝子座の5’フランキング領域を含んでいる。
空ベクターである右側構築物(pGREr121)を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。
I.オリエンタリスCNB1を、以下で記載するように、I.オリエンタリスCD1822から構築した(I.オリエンタリスATCC PTA‐6658からI.オリエンタリスCD1822の作出に関する実施例1Aを参照のこと)。菌株CD1822に含まれているURA3遺伝子の両方のコピーを、遺伝子工学の選択マーカーとしてこの遺伝子の使用できるように欠失させた。遺伝子の存在(ウラシル欠乏培地での成長による)と不存在(5‐フルオロオロチン酸の存在下での成長による)の両方に利用可能な選択であるため、URA3は酵母遺伝学の多目的マーカーである。
URA3遺伝子のうちの1つの破壊を、反復DNA配列が隣接するMEL5選択マーカーを含んでいる選択カセットでの置き換えによっておこなった。次に、MEL5選択カセットについての検査で陽性であった菌株を、MEL5マーカー遺伝子の欠失についてスクリーニングした。そして、第2のURA3遺伝子の欠失を、5‐フルオロオロチン酸の存在下での成長によって選択した。
分間5、そして、チューブを、20℃にて30分間置いておき、16100×gで遠心分離し、そして液体をデカンテーションにより除いた。DNAを、風乾し、そして500μLのTE中に再懸濁した。
前掲に記載したように、URA3遺伝子のホモ接合欠失のため、本明細書中に使用したCNB1と呼ばれたI.オリエンタリス菌株は、ウリジン栄養要求変異菌株であった。URA3遺伝子座の異型接合修復を、691bpの5’隣接DNA、及び1500bpの3’隣接DNAを含んでいるURA3遺伝子を含むuraフィックスカセットを含むuraフィックスベクター、pJLJ62(図26)を使用しておこなった。uraフィックスカセットは、5’NotI制限部位及び3’ApaI制限部位によって隣接する。NotI及びApaIを使用した制限消化を実施し、ベクター骨格から2796bpのuraフィックスカセットを切り出した。消化産物を、製造業者によって指定されているとおりQIAquick PCR Purificationキット(Qiagen)を使用して精製した。DNAを、ガラス蒸留水で溶出し、そして1μgを、I.オリエンタリスCNB1の形質転換に使用した。形質転換体を、ura選択プレート上で選択し、そしてウリジン追加を必要としなかったシングルコロニーを、MBin500と呼んだ。
組み込みカセット内に存在している2つのURA3プロモータ領域の組み換えによって、URA3選択マーカー遺伝子を取り除いた菌株を単離するために、着目のura+菌株を、3mLのYP+10% グルコース培地中に植菌し、そして250rpmで振盪しながら37℃にて少なくとも4時間、そして最長一晩培養した。50‐100μLの培養物を、ScD FOAプレート上で平板培養し、そしてコロニーが現れるまで37℃にて48〜60時間培養した。FOAはURA3タンパク質によって毒性化合物に転換され、そしてura+細胞の死滅をもたらすので、FOA上での培養は、URA3マーカーの除去について選択した。いくつかのFOA耐性コロニーを、37℃にてYPDプレート上で培養することによって二度精製した。次に、これらの精製単離菌株を、本明細書中に記載したように、PCRによって適当なURA3ループアウトについてスクリーニングした。
4mLのura選択培地を14mL容Falconチューブに加え、そして所望の菌株を、無菌の白金耳を使用してこの培地に植菌した。培養物を、250rpmで振盪しながら37℃にて一晩(〜16時間)培養した。I.オリエンタリス遺伝子座の少なくとも1種類の野生型コピーを持つ菌株については、500μLの一晩培養物を、25mLのYP+10% グルコース培地の入った125mL容バッフル付きフラスコに加えた。pdcΔ/pdcΔ菌株については、1mLの一晩培養物を、25mLの液体YP+100g/L デキストロース培地の入った125mL容バッフル付きフラスコに加えた。フラスコを、250rpmで振盪しながら37℃にて培養した。培養物の少量アリコートを、ほとんど1時間おきの間隔で取り出し、そしてOD600を計測した。OD600が4〜6になるまで、培養物を培養した。
菌株を、シングルコロニー用にUra Selection Plates上に画線接種し、30℃にて1〜2日間インキュベートした。種菌用培養物を、Ura Selection Plateからの1〜2個のコロニーを植菌した50mLのCNB1振盪フラスコ培地の入った250ml容バッフル付きフラスコ内に調製した。種菌用培養物を、200rpmで振盪しながら30℃にて約18時間培養した。次に、4〜6のOD600に達するまで、培養物の少量アリコートをOD600を計測するために取り出した。残留グルコースの存在を、Uristix(登録商標)Reagent Strip(Bayer、Elkhart, IN, USA)を使用して計測した。種菌用フラスコ培養物を、50mLのCNB1振盪フラスコ培地の入った125ml容バッフル付きフラスコにOD600=0.2まで植菌するのに使用した。培養物を、30℃にて140rpmで20時間振盪しながらインキュベートした。ブロスのサンプルを、分析のために以下で記載するように取り出した。サンプルのアリコートを、培養物の吸光度(OD)を計測するのに使用し、そして、残留グルコースの存在を、Uristix(登録商標)Reagent Stripを使用して計測した。次に、サンプルの残りを遠心分離し、そして上清を産物分析に使用した。
本明細書中に記載した菌株を、種子繁殖期を使用して培養し、それに続いて2L容バイオリアクター(Applikon、Foster City, CA, USA)でのシングルステップ発酵をおこなった。
培養物のサンプルを、1%のギ酸中への10×希釈で酸性化し、そして0.46μmの96ウェルフィルタープレートを通して濾過した。サンプル中の被分析物濃度によっては、水で更なる希釈をした。更なる10×希釈を、1mMのNH4Ac、0.1%のNH3、及び5mg/Lの13C均一標識3‐HP(3‐HPの内部標準として)、又は1%のギ酸及び3mg/Lの13C均一標識β‐アラニン(β‐アラニンの内部標準として)のサンプルバッファー中でおこなった。総希釈係数は、β‐アラニン又は3‐HPの濃度によって約100〜1000を使用した。
様々な3‐HP発酵経路に関与する酵素をコードする1若しくは複数の遺伝子を、酵母宿主細胞内で単独又は組み合わせで発現させることができる。3‐HP経路酵素は、外来遺伝子から発現されても、内在性遺伝子から発現されても、又はその組み合わせから発現されてもよい。発現されるべき外来遺伝子は、遺伝子発現構築物、例えば、実施例2に記載の発現構築物、を使用して酵母細胞内に導入してもよい。外来遺伝子は、単独の部位にも、複数の位置にも宿主酵母ゲノム内に組み込まれることができ、且つ、外来遺伝子の組み込みは、以下で記載するように、挿入部位における標的遺伝子の欠失又は破壊と対にされてもよい。
経路に関与する1若しくは複数の酵素を発現することによって、PEP及び/又はピルバート、OAA、アスパラタート、β‐アラニン、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を操作できる。発現遺伝子には、PPC、PYC、AAT、ADC、BAAT、gabT、3‐HPDH(マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む)、HIBADH、又は4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数が含まれ得る。
酵素アッセイ用の未精製無細胞抽出物(CFE)の調製:
振盪フラスコ又はバイオリアクタ培養からの本明細書中に示した細胞を、遠心分離で回収し、上清を捨て、そして、細胞ペレットを、先に記載したように−80℃にて保存した。CFEの調製のために、細胞ペレットを、解凍し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、そして再び遠心分離で回収した。上清を捨て、そして細胞ペレットを、2.0mL容微小遠心管内で、1%のProtease Inhibitor Cocktail、P8215(Sigma)を含んでいる約等量の溶解バッファー中に再懸濁した。約300μLの0.5mm ジルコニアビーズ(BioSpec)を加え、そして、細胞分解を、6/20秒の設定にて3ラウンド、FastPrep(登録商標)‐24破壊器(MP Biomedicals)で実施した。各ラウンドの間、サンプルチューブを氷で5分間冷やした。溶解後に、サンプルを、最高速度の微小遠心分離器により4℃にて15分間遠心分離した。上清を新しい1.5mL容チューブに移し、そして氷上に維持した。溶解物中の総タンパク質濃度、及び標準としてのウシ血清アルブミンを、製造業者によって規定される取扱説明書に従って、Bio‐Radタンパク質分析試薬(ブラッドフォードアッセイ)を使用して測定した。
本明細書中に示した細胞のCFEのピルビン酸カルボキシラーゼ活性を、以下の通り測定した。アッセイ反応混合物においてCFEに組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製した:Tris(pH8.0)、100mM;NaHCO3、10mM;MgCl2、5mM;NADH、0.2mM;ATP、1mM;アセチルCoA、1mM;ピルバート、1mM;ビオチン(アッセイするPYC酵素に必要であれば)、5μM;ウシ心臓リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、0.02単位/mL。270μLのこの混合物を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして30μLの適切に希釈したCFEを加えて、反応物を開始させる。NADHの消費を、SpectraMax 340 PCプレートリーダを使用して340nmにて観察した。
ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を、nmol NADH消費/秒/mgタンパク質と表現する。
CFEのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PPC)活性を、以下の通り測定し得る。アッセイ反応混合物においてCFEと組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製する:Tris(pH8.0)、100mM;NaHCO3、10mM;MgCl2、5mM;NADH、0.1mM;アセチルCoA、0.5mM;ホスホエノールピルビン酸、3.3mM;ウシ心臓(又はブタ心臓)リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、0.02単位/mL。270μLのこの混合物を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして、30μLの適切に希釈したCFEを加えて、反応を開始させた。NADHの消費を、SpectraMax 340 PCプレートリーダを使用して340nmにて観察する。
本明細書中に示した細胞のCFEのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、以下の通り測定した。アッセイ反応混合物においてCFEと組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製した:100mMのTris(pH8.0)、100mM;NaHCO3、10mM;MgCl2、5mM;NADH、0.1mM;アスパラタート、1mM;ケトグルタル酸、1mM;リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、0.02単位/mL。いくつかのアッセイにおいて、ストック反応混合物はまた、ピリドキサール5’‐リン酸(0.1mM)も含んでいた。270μLのこの混合物を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして、30μLの適切に希釈したCFEを加えて、反応を開始させた。NADHの消費を、SpectraMax 340 PCプレートリーダを使用して340nmにて観察した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、nmol NADH消費/秒/mgタンパク質と表現する。
本明細書中に示した細胞のCFEのアスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を、以下の通り測定した。165μLの100mM NH4Acバッファー(pH6.8)及び25μLの80mM アスパラタートを、37℃に温度設定した96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応を、10μLのCFEを加えることによって開始させた。異なった時間間隔(5、10、15、20、25、30、40、60分)に、20μLのサンプルを、反応混合物から取り出し、そして180μLのクエンチングバッファー(2%のギ酸+内部標準としての2mg/Lの13C標識β‐アラニン)に加えた。濾過後に、サンプル中のβ‐アラニンを、LC/MS/MSによって分析した。β‐アラニン対時間のプロットからスロープを得た。活性は、反応物中の総細胞タンパク質濃度でスロープを割ることによって計算した。ADC活性を、μmol 形成されたβ‐アラニン/秒/gタンパク質と表現する。
CFEのβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼ(BAAT)活性を、以下の通り測定した。100mMのNH4HCO3(pH7.6)、8mMのα‐ケトグルタル酸、0.5mMのアセチル‐CoA、0.1mMのピリドキサール‐5’‐リン酸、及び200mMのβ‐アラニンを含む190μLの反応混合物を、室温にて96ウェルマイクロタイタープレートに加えた。反応を、10μLのCFEを加えることによって開始した。それぞれ20μLのサンプルを、2、4、6、8、10、12、15、及び20分に取り出し、そして75μLのクエンチングバッファー(2.5%のギ酸)に加えた。サンプルを、中和し、そして5μLの10M NaOH及び50μLの100mM NaCO3(pH10)を加えることによって、pHを制御した。濾過したサンプルを、注入時にOPA(o‐フタルジアルデヒド)試薬10mg/mL(Agilent Technologies 5061‐3335)と混合することによって誘導体化した。OPAで誘導体化したグルタミン酸を、HPLC分離後に蛍光検出(340nmの励起;460nmの発光)によって定量化した。15μLのサンプルを、5μmパッキング(Phenomonex 150×4.6mm)を用いた分析逆相Gemini C18カラムに注入した。カラムを、62.5%の20mM リン酸緩衝液(pH7.8)(A)及び37.5%のメタノール(B)で平衡化した。線形グラジエントは、以下の通りであった:40%のBに勾配、0〜0.3分;40%のB、0.3〜1分;85%のBに勾配、1〜1.75分;85%のB、1.75〜2.25分;37.5%に勾配、2.25〜3分;37.5%のB、3〜4分。流量は2mL/分であった。反応バッファー中のグルタミン酸の検量線を、サンプルの濃度を決定するのに使用した。スロープを、[グルタミン酸]対時間プロットから得た。活性を、スロープを反応物中の総細胞タンパク質濃度で割ることによって計算した。
本明細書中に示した細胞のCFEの3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を、以下の通り測定した。100mMのNH4HCO3(pH7.6)中の希釈(典型的に100×希釈)CFE190μL、及びNADPHを、37℃に温度設定した96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応を、10μLの60mM マロン酸セミアルデヒド(MSA、10mMのH2SO4中の200mMのMSAストック溶液から10mMのH2SO4中に新たに調製した)を加えることによって開始した。それぞれ20μLのサンプルを、1、2、4、6、8、10、及び12分に取り出し、そして80μLの熱湯中でクエンチした。冷却後に、75μLの冷却混合物を、75μLのバッファーの含有の2mMのNH4Ac(pH6.8)及び3mg/Lの13C標識3‐HPと混合する。濾過後に、サンプル中の3‐HPを、LC/MS/MSによって定量化した。スロープを、3‐HP対時間プロットから得た。活性を、スロープを反応物中の総細胞タンパク質濃度で割ることによって計算した。3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を、nmol 形成されたNADPH/秒/mgタンパク質と表現する。
いくつかのアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化し、そしてGeneArt(登録商標)(Burlingame、CA, USA)によって合成し、表7で列挙したプラスミドを得た。合成遺伝子は、ベクターpMA‐Tに至り、そしてXbaI及びPacI制限消化によってベクターから取り出せる。次に、制限断片を、遺伝子をPDCプロモーター及びターミネータの制御下に置くpMIBa107の同じ部位内にクローン化できるので、組み込みがI.オリエンタリスadh1202遺伝子座で起こるようにできる。
バチルス・リケニホルミスpanD遺伝子(菌株MIBa338)対ストレプトマイセス・アベルミチリスpanD遺伝子(菌株MIBa337)を使用したとき、結果は、改善されたADC活性及び3‐HP生産能力を示す。
S.アベルミチリスからのBAAT、S.セレビシエからのUGA1、S.クルイベリからのPYD4、S.セレビシエからのYMR226c、及びE.コリからのydfGのI.オリエンタリスのコドン最適化バージョンを、GeneArt(登録商標)によって合成し、そして以下で列挙したプラスミドを得た。合成遺伝子は、ベクターpMA‐Tに至り、そしてXbaIとPacIを使用した消化によってベクターから取り出せる。次に、消化断片を、pMIBa107の同じ部位にクローン化し、PDCプロモーターとターミネータの制御下にその遺伝子を置き、そしてadh1202遺伝子座において組み込みが起こるようにできる。
左側断片を含んでいるS.アベルミチリスADC(配列番号130)及びS.アベルミチリスBAAT(配列番号140)
S.アベルミチリスADC(配列番号130)及びS.クルイベリBAAT(配列番号142)を含んでいる左側断片
4μLのpMhCt083のミニプレップを、XbaIとPacIで消化し、37℃にて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼ(New England Biolabs)で処理し、TAEバッファー中での0.9%アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約6.5kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したサッカロマイセス・セレビシエgabT(UGA1、配列番号141)を含んでいる、XbaI及びPacI消化した断片を、以下の通りpMhCt083切断ベクターに連結した:連結反応物(20μL)は、1× Quick Ligation反応バッファー(New England Biolabs)、1μLのXbaIとPacIで消化した精製pMhCt083ベクター、3μLのコドン最適化S.セレビシエUGA1のXbaI及びPacI消化挿入物、及び1μLのQuick T4 DNA Ligase(New England Biolabs)を含んでいる。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、チューブを氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells(Agilent Technologies)を形質転換するのに使用した。形質転換体を、2× YT+ampプレート上で平板培養し、そして37℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI及びBglII消化によって、所望のBAAT ORFの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらしたクローンを、pMhCt087と呼んだ(図9)。
E.コリ3‐HPDHを含む右側断片(配列番号143)
I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したE.コリ3‐HPDH遺伝子を含むXbaI及びPacIで消化した断片(ydfG、配列番号143)を、以下の通りpMhCt069切断ベクターに連結した:連結反応物(20μL)は、1× Quick Ligation反応バッファー(New England Biolabs)、2μLのXbaIとPacIで消化した精製pMhCt069ベクター、4μLのXbaIとPacIで消化したコドン最適化E.コリydfG挿入物、及び1μLのQuick T4 DNA Ligase(New England Biolabs)が含まれた。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPack Gold SuperCompetent Cells(Agilent Technologies)を形質転換するのに使用した。形質転換体を、2× YT+ampプレート上で平板培養し、そして室温にて3日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI、PacI、及びEcoRV消化によって、所望のydfG ORFの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、本明細書中に記載したように、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt075と呼んだ(図10)。
サッカロマイセス・セレビシエ3‐HPDHを含む右側断片(配列番号144)
先の実施例3A‐3及び実施例3A‐4は、I.オリエンタリスPDC遺伝子座に対する、3つの異所性遺伝子の同時ターゲッティング発現のための様々な左側又は右側構築物の構築を記載している。形質転換前に、約10μgのそれぞれの構築物(1つの所望の左側構築物と1つの所望の右側構築物)をNotIで消化し、pUC18骨格ベクターから所望の形質転換DNAを切り出した;ほとんどの消化について、制限酵素PvuIもまた、NotI消化に含まれていた。制限酵素PvuIは、pUC18ベクター断片を約半分に消化し、ゲル電気泳動によるより大きな、所望のDNA断片の分離をより容易にする。より大きな発現カセットを含んでいるバンドを、ゲル電気泳動によってpUC18骨格DNAと分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。30μLの溶出バッファーを溶出ステップに使用した。合計で10μLの等モル比の1の左側構築物と1の右側構築物を、I.オリエンタリス菌株CNB1又は適当な誘導体を形質転換するのに使用した。形質転換体を、ura選択プレート上で選択し、培養のために37℃に置いた。翌日、約12の形質転換体を、釣り出し、そしてシングルコロニー用にura選択プレートに再び画線接種し、そして37℃にて培養した。翌日、シングルコロニーを、それぞれの最初の形質転換体によって作り出されたそれぞれの画線から釣り出し、そしてシングルコロニー用にura選択プレートに再び画線接種した。37℃にてもう一晩の培養後に、最終的なシングルコロニーを、各画線から釣り出し、そしてura選択プレート上に再び画線接種し、37℃にて一晩培養した。この第2ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖後に、ゲノムDNAを、先に記載した通り所望の標的組み込みが起こったのを確かめるためのPCRでの使用のために調製した。左側及び右側構築物を使用したPDCに対する標的化のために、所望の組み込み事象の検証を、プライマー0611814、0611554、及び0611555を使用して判断した。プライマー0611554は、右側PDCターゲッティング構築物内に存在しているI.オリエンタリスゲノムDNAのちょうど3’のPDCターミネータ領域に結合し;プライマー0611555は、PDC ORF内に結合し、終止に向かって増幅をおこない;そしてプライマー0611814は、右側構築物内に存在しているTDH3プロモータ領域の3’末端の近くに結合し、3’方向に増幅する。プライマー0611814及び0611554を含んだPCRからの約1.9kbpのバンドの発生は、PDC遺伝子座における所望の組み込み事象の出現を示した。プライマー0611555及び0611554を含んだPCRからの約1.4kbpのバンドの発生は、野生型PDC遺伝子座の存在を示した。この組み込み事象は二倍体I.オリエンタリスCNB1における第1のターゲッティング事象であるので、所望の組み込み体は、プライマー0611814及び0611554に関して1.9kbpのバンド、及びプライマー0611555及び0611554から1.4kbpのバンドの両方を示す。各プラスミドに所望のバンドパターンをもたらす2つの独立した形質転換体を、表15に示すように呼んだ。
828bpのバンドの存在は、所望されるura3瘢痕部位(親菌株における2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーター)だけが存在することを示した。828bpのバンドだけを示した単離菌株を、本明細書中に記載したように、プライマー0611555と0611554を使用してさらにスクリーニングした。プライマー0611555と0611554を含んだPCRからの約1.4kbpのバンドの発生は、野生型PDC遺伝子座の存在を示した。両染色体上のPDC遺伝子座が欠失したことを示す、このバンドを欠く単離菌株を、yMhCt010と呼んだ。
構築物を、I.オリエンタリスadh1202遺伝子座にADCをコードするヌクレオチド(配列番号17)を4コピー組み込むように設計した。PDC遺伝子座に関して本明細書中に記載したものと同様のアプローチにおいて、相同組み換えを可能にするように、左側構築物と右側構築物を設計した。組み込みベクターの全体的な設計と所望の組み換え事象を図3に示す。このアプローチはまた、以下の実施例に記載の代替ADC(配列番号139)の発現にも使用した。
I.オリエンタリスURA3 ORFの3’断片を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングDNAと共に含むPCR産物を、プライマー0612275と0612276で増幅した。PCR反応物(50μL)は、1μLのpMhCt069ミニプレッププラスミドDNA(前掲)の1〜50倍希釈物、1× iProof(商標)HFバッファー(Bio-Rad Laboratories)、それぞれ100pmolのプライマー0612275と0612276、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、及び1単位のiProof(商標)High Fidelity DNAポリメラーゼ(Bio-Rad Laboratories)を含んでいた。PCRを、98℃にて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98℃にて10秒間、59℃にて20秒間、そして72℃にて45秒間を32サイクル、それと72℃にて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf(登録商標)MASTERCYCLER(登録商標)(Eppendorf Scientific)で実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1155bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
先の実施例3A‐7及び3A‐8は、adh1202遺伝子座における、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスADC遺伝子の4つのヌクレオチド多型の発現を標的化するための左側及び右側構築物の作製を説明している。I.オリエンタリスCNB1への形質転換の前に、10μgのpMhCt095を、HpaIとSacIIで消化して、pUC19骨格ベクターから所望の形質転換DNAを切り出した。同様に、10μgのpMhCt096を、EcoRIとSacIIで消化して、pUC19骨格ベクターから所望の形質転換DNAを切り出した。〜5kbpの発現カセット含有バンドを、ゲル電気泳動によってpUC19骨格DNAと分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。30μLの溶出バッファーを溶出ステップに使用した。合計で10μLになる等モル比のpMhCt095及びpMhCt096線形形質転換DNAを、菌株yMhCt010(前掲)を形質転換するのに使用した。形質転換体を、ura選択プレート上で選択し、培養のために37℃に置いた。12個位の形質転換体を、翌日釣り出し、シングルコロニーのためにura選択プレートに再び画線接種し、そして37℃にて一晩培養し、次に、それぞれの最初の形質転換体及びura選択プレートへの再画線接種によって生じた画線のそれぞれからシングルコロニーを釣り出した。37℃にてのもう一晩の培養後に、最終的なシングルコロニーを、各画線から釣り出し、ura選択プレートに再び画線接種し、そして37℃にて一晩培養した。この第2ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後、本明細書中に記載したように起こった所望の標的組み込みを確かめるためのPCRに使用するために、ゲノムDNAを調製した。adh1202遺伝子座へのpMhCt095及びpMhCt096断片の正しいターゲッティングを、プライマー0611718と0611632(前掲)を使用して検証した。プライマー0611718は、pMhCt096内に存在しているPDCターミネータ領域に結合するのに対して、プライマー0611632は、標的とした領域のadh1202遺伝子座DNAの3’側に結合し、そしてアンチセンス方向に増幅する。これらのプライマーを用いたPCRからの約727bpのバンドの発生は、adh1202遺伝子座における所望の組み込み事象の出現を示した。
追加の構築物を、adh1202遺伝子座においてB.リチェニフォルミスからの代替のADCをコードするヌクレオチド(配列番号139)4コピーを組み込むように設計した。先に記載したものと同様のアプローチにおいて、左側構築物及び右側構築物を、I.オリエンタリスadh1202遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。
プラスミドpMhCt095(前掲)を、本明細書中に記載したように、XbaI及びPacIで消化し、そしてTBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
プラスミドpMhCt096(前掲)を、XbaI及びPacIで消化し、そしてTBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。約4.8kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
プラスミドpMeJi310‐2を、本明細書中に記載したように、HpaI及びSacIIで消化し、そしてプラスミドpMeJi312‐2を、EcoRI及びSacIIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約5kbpのバンド2本を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
配列番号14のI.オリエンタリスのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AAT)をコードするヌクレオチド配列(配列番号13)を、I.オリエンタリスゲノムDNAからプライマー0611268と0611269を使用してPCR増幅した。PCR反応物(50μL)は、50ngの菌株I.オリエンタリスゲノムDNA、1× Phusion HFバッファー(New England Biolabs)、それぞれ50pmolのプライマー0611268と0611269、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100% DMSO(New England Biolabs)、及び1単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を含んでいた。PCRを、98℃にて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98℃にて30秒間、55℃にて30秒間、そして72℃にて1分と30秒間を35サイクル、それと72℃にて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf(登録商標)MASTERCYCLER(登録商標)(Eppendorf Scientific)で実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1278bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した。得られたPCR断片の全長は、約1278bpであり、そして5’末端にNruI制限部位を有し、且つ、3’末端にPacI制限部位を有する。
配列番号2のI.オリエンタリスのピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)をコードするヌクレオチド配列を、I.オリエンタリスゲノムDNAからプライマー0611266と0611267を使用してPCR増幅した。PCR反応物(50μL)は、50ngのI.オリエンタリスゲノムDNA、1× Phusion HFバッファー(New England Biolabs)、それぞれ50pmolのプライマー0611266と0611267、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100% DMSO(New England Biolabs)、並びに1単位のPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を含んでいた。PCRを、98℃にて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98℃にて30秒間、55℃にて30秒間、そして72℃にて1分と30秒間を35サイクル、それと72℃にて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf(登録商標)MASTERCYCLER(登録商標)(Eppendorf Scientific)で実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約3557bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8%アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した。得られたPCR断片は、その断片の5’末端にXbaI制限部位を、そして3’末端にPacI制限部位を持っていた。
I.オリエンタリスadh9091遺伝子座の5’隣接部、I.オリエンタリスPDCプロモーター及びTALターミネータの制御下にあるI.オリエンタリスPYC遺伝子発現カセット(配列番号1)、I.オリエンタリスENO1プロモーター/RKIターミネータを有する空の発現カセット、及びURA3プロモーターの制御下にあるI.オリエンタリスURA3マーカー遺伝子の切断5’断片を含んでいる。
上記の連結反応物の5μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、One Shot(登録商標)TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞(Invitrogen)内に形質転換した。形質転換体を、2× YT+ampプレート上で平板培養し、そして37℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BamHI消化によって所望の挿入物についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、選択し、そしてpGMEr137と呼んだ(図18)。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AAT)、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ(BAAT)、及び3‐HPデヒドロゲナーゼ(3‐HPDH)を既に過剰発現している菌株でピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AAT)活性を増強するために、菌株yMhCt010(前掲)を、先に記載したように、pGMEr137(前掲)及びpGMEr126(前掲)の線状断片で形質転換した。2ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後に、所望の標的組み込みが記載するように起こったの立証するために、ゲノムDNAをPCRにおける使用のために調製した。adh9091遺伝子座へのpGMEr137及びpGMEr126断片の正しいターゲッティングを、プライマー0611814と0612055を使用して確認した。プライマー0611814は、pGMEr126のTDH3プロモーターの3’末端にアニールし、そして3’方向に増幅する。プライマー0612055は、pGMEr126内に存在しているadh90913の3’フランキング相同部にアニールする、したがって、組み込みDNAが相同組み換えによって正しい遺伝子座路に標的化された場合にだけ、このプライマー対を用いたPCR産物の増幅が起こる。プライマー0611814と0612055を含むPCRからの約3066bpのバンドの存在は、pGMEr126及びpGMEr137断片の所望の組み込みがadh9091遺伝子座で起こったことを示す。
配列番号139(前掲)のB.リチェニフォルミスADCをコードする4コピーのヌクレオチドを含むMeJi409‐2のura3−誘導体を、先に記載したFOA対抗選択ループアウトプロトコールを使用して単離した。親菌株MeJi409‐2のいくつかのFOA耐性コロニーのゲノムDNAを、所望のループアウト事象について、プライマー0611815と0611817を用いたPCRによってスクリーニングした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてura3プロモーターに向かって増幅する。プライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、そしてura3カセットに向かって戻る方向に増幅する。828bpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位(親菌株における2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーター)のみの存在を示すのに対して、約2.2kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3 ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。Crimson Taq(商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いたPCR反応物を、先に記載したようにおこなった。MeJi411と呼ばれる、親菌株MeJi409‐2からの1つのFOA耐性コロニーは、所望の828bpのバンドを得た。
本明細書中に記載したように、プラスミドpMeJi310‐2を、HpaI及びSacIIで消化し、そして、プラスミドpMeJi312‐2を、EcoRI及びSacIIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製し、2本の約5kbpのバンドをゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
この実施例では、I.オリエンタリスPDCプロモーター制御下にある2つのコピー及びI.オリエンタリスTDH3プロモーターの制御下にある2つのコピーを含んでいる、adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピー4を組み込むように設計した構築物を説明する。先に記載したものへの同様のアプローチにおいて、左側及び右側構築物を、I.オリエンタリスCNB1のadh1202遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。
プラスミドpMeJi310‐2(前掲;図14を参照のこと)を、XbaIとStuIで消化し、続いてCIPで処理し、そして本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。約6.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した。
プラスミドpMeJi312‐2(前掲)を、XbaIとStuIで消化し、続いてCIPで処理し、そして本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。約6.8kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した。
本明細書中に記載したように、プラスミドpMIBa137をHpaI及びSacIIで消化し、そしてプラスミドpMIBa136をEcoRI及びSacIIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製し、約5kbpのバンド2本を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した。
MIBa351のura−誘導体を、先に記載したように単離した。MIBa351のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、プライマー0611815と0611817を用いたPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてura3プロモーターに向かって増幅する。プライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、そしてura3カセットに向かって戻る方向に増幅する。828bpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位のみ(親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーター)の存在を示すのに対して、約2.2kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3 ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起きなかったことを示す。Crimson Taq(商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いたPCR反応物を、先に記載したように実施した。上記のプライマーにより828bpの断片をもたらしたFOA耐性コロニーを、配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードする配列番号138のヌクレオチド配列の4つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認するために、(2.7kbp産物をもたらす)プライマー0612794と0611245、及び(4kbpの産物をもたらす)プライマー0611815と0612795を用いて試験した。MIBa353と呼ばれる親菌株MIBa351からの1つのFOA耐性コロニーは、3つのプライマーセットのすべてで所望のPCR産物をもたらした。
プラスミドpMIBa136は、前進の方向に進行する2個の発現カセットを含んでいる。ホモ接合菌株のスクリーニングを簡単にするために、pMIBa136のpanDbl発現カセットを逆方向に置いた新しいプラスミドを構築した。プラスミドpMIBa136(前掲)を、本明細書中に記載したように、NotIとPmeIで消化し、続いてクレノーを用いた補充反応に供し、そしてTBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。約3.4及び4.4kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した。pMIBa136からの4.4kbpの断片を、CIPで処理し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)PCR Purification Kit(Qiagen)を使用して精製した。
共に本明細書中に記載したように、プラスミドpMIBa137を、HpaIとSacIIで消化し、そしてプラスミドpMIBa138を、EcoRIとSacIIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製し、約5kbpのバンド2本をゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した。
菌株MeJi409‐2、MeJi412、MIBa351、及びMIBa355を、振盪フラスコで培養し、そして本明細書中に記載したように、CFEを調製し、そしてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼ(ADC)活性についてアッセイした。結果を表26に示す。各菌株の活性は、2つの独立した振盪フラスコ培養物の平均である。菌株MeJi409‐2、MeJi412、MIBa351、及びMIBa355もまた、本明細書中に記載した方法を使用して、3‐HP生産についてバイオリアクター内で試験した。これらのバイオリアクター実験からの結果もまた、表26に示す。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するために、表26に示した3‐HP生産能力を、単位細胞質量あたりの3‐HP濃度として表現した([g/L 3‐HP]/[g/L 乾燥細胞重量]として表現した)。結果は、細胞内のADC活性のレベルが増強するのに従って3‐HP生産能力が増強されることを示している。
PDC遺伝子座における組み込みのための(配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードする)配列番号1のヌクレオチド配列を含むプラスミドpANN28を、以下で記載するように構築した。
この実施例は、adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピー及びpdc遺伝子座において配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードするヌクレオチドを発現する酵母菌株の構築を説明する。
MeJi412のura−誘導体を、先に記載したように単離した。MeJi412のいくつかのFOA耐性コロニーを、0611815と0611817プライマーを用いたコロニーPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてura3プロモーターに向かって増幅する。プライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、そしてura3カセットに向かって戻る方向に増幅する。869bpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位のみ(親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーター)の存在を示すのに対して、約2.6kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3 ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。Phire(登録商標)Plant Direct PCR kit(Finnzymes)を用いたPCR反応を、先に記載したように実施した。上記のプライマーにより869bpの断片をもたらしたFOA耐性コロニーを、(3.8kbpの産物をもたらす)プライマー0612794と0611817、及び(3.7kbpの産物をもたらす)プライマー611815と612795を用いてさらに試験して、配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードする配列番号138のヌクレオチド配列の4つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認した。MeJi413と呼んだ、親菌株MeJi412からの1つのFOA耐性コロニーは、3つのプライマーセットすべてで所望のPCR産物をもたらした。
プラスミドpANN28(前掲)を、AscIとSacIで消化し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.1kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル精製キット(Qiagen)を使用して精製した。
この実施例は、adh1202遺伝子座における配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピー(PDCプロモーター制御下の2つのコピーとTDH3プロモーター制御下の2つのコピーによる)及びpdc遺伝子座において配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードするヌクレオチドを発現する酵母菌株の構築を説明する。
MIBa355のura−誘導体を、先に記載したように単離した。MIBa355のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、プライマー0611815と0611718を用いたPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。約500bpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位のみの(親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーター)の存在を示すのに対して、約1.9kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3 ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。PCRを、製造業者の取扱説明書に従ってPhire(登録商標)Plant Direct PCR kit(Finnzymes)を使用して実施した。上記のプライマーにより約500bpの断片をもたらしたFOA耐性コロニーを、(3.5kbpの産物をもたらす)プライマー0611631と0611245、及び(4.5kbpの産物をもたらす)プライマー0611815と0611632を用いてさらに試験し、配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードする配列番号138のヌクレオチド配列の4つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認した。それらをまた、adh1202における第1の改変が存在していることを確認するために、プライマー0611815と0611817を使用したPCRを用いて試験した。これらのPCRプライマーは、828bpの断片をもたらした。MIBa357と呼ばれる、親菌株MIBa355からの1つのFOA耐性コロニーは、4つのプライマーセットすべてで所望のPCR産物をもたらした。
発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、McTs241と呼んだ。
菌株MeJi412、yANN35、yANN41、MIBa355、McTs241、及びMcTs253を、振盪フラスコで培養し、CFEを調製し、そして本明細書中に記載したように、ピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)活性、アスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼ(ADC)活性についてアッセイした。結果を表27に示す、菌株MeJi412、yANN35、yANN41、MIBa355、McTs241、及びMcTs253はまた、本明細書中に記載した方法を使用して、3‐HP生産についてバイオリアクター内で試験した。これらのバイオリアクター実験からの結果もまた、表27に示す。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するため、示した3‐HP生産能力は、([g/L 3‐HP]/[g/L 乾燥細胞重量]と表現される)細胞質量単位あたりの3‐HP濃度として表現されている。結果は、細胞のPYC活性レベルに増強に従って3‐HP生産能力が増強したことを示している。
この実施例は、adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピーを発現し、且つ、配列番号20のBAAT(PYD4)をコードする天然I.オリエンタリス遺伝子の欠失がある酵母菌株の構築と能力を説明する。
プラスミドpMIBa123(前掲)は、本明細書中に記載したように、NotI、KpnI、ApaIで消化し、そしてTBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動法によって精製した。約3.6kbpと3.8kbpの2本のバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。これらの2つのピースが、プラスミド骨格及び配列番号144のS.セレビシエ3‐HPDH遺伝子(YMR226c)を持つura選択カセットを含んでいた。
プラスミドpMcTs64(前掲;図30を参照のこと)を、ApaI、NcoI、KpnIで消化し、1%TBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約3.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
この実施例は、adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピーを発現し、且つ、配列番号26の3‐HPDH(PYD4)をコードする天然I.オリエンタリス遺伝子を欠失した酵母菌株の構築と能力を説明する。
プラスミドpMIBa123(前掲)は、本明細書中に記載したように、NotI、KpnI、ApaIで消化し、そしてTBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動法によって精製した。約3.6kbpと3.8kbpの2本のバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。これらの2つのピースが、プラスミド骨格及び配列番号144のS.セレビシエ3‐HPDH遺伝子を持つura選択カセットを含んでいた。
プラスミドpMcTs65(前掲;図31を参照のこと)を、ApaI、SphI、KpnIで消化し、1%TBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約2.9kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
菌株MIBa372とMcTs259のg/L 3‐HP/g/L 乾燥細胞重量は、それぞれ1.66と<0.1であった。これらの結果は、I.オリエンタリス内の天然3‐HPDH遺伝子がマロン酸セミアルデヒドから3‐HPへの転換に関与することを示す、なぜならば、この遺伝子の欠失が3‐HP生産を止めるからである。
追加構築物を、adh1202遺伝子座に配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードする4つのコピーのヌクレオチドも含む菌株のI.オリエンタリスpdc遺伝子座に、配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードするヌクレオチド配列配列番号1、配列番号14のI.オリエンタリスAATをコードするヌクレオチド配列配列番号13、配列番号21のS.クルイベリBAATをコードするヌクレオチド配列配列番号142、及び配列番号129のS.セレビシエ3‐HPDHをコードするヌクレオチド配列配列番号144を組み込むように設計した。先に記載したものへの同様のアプローチでは、左側構築物と右側構築物を、I.オリエンタリスCNB1pdc遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。これらの構築物を調製し、そして以下に記載したようにMIBa357内に形質転換した。
配列番号14のI.オリエンタリスAATをコードするヌクレオチド配列配列番号13を、製造業者の取扱説明書に従って鋳型としてプラスミドpGMEr126(図16)を使用したPCRによって増幅した(Pfuポリメラーゼ、Stratagene)。プライマーのoANN1とoANN2は、遺伝子コード配列に隣接する独特な制限部位の取り込みを可能にした。PCR産物を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。約1.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット(Qiagen)を使用して精製した。精製したPCR産物を、ApaI及びNruIで消化し、そして本明細書中に記載したようにゲル精製した。
プラスミドpANN02を、本明細書中に記載したように、PmeIで消化し、そしてTBEバッファーでアガロースゲル電気泳動によって精製した。約10.3kbpのバンド及び約2.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キット(Qiagen)を使用して精製した。pANN2からの10.3kbpのベクター断片を、CIP(New England Biolabs)で脱リン酸化し、そして製造業者の取扱説明書に従って、精製キット(Qiagen)で精製した。pANN02からの2.7kbpの断片を、pANN02からの脱リン酸化した10.3kbpの線状ベクターを、36ngのベクター、28ngの挿入物、1μLの10mM ATP(New England Biolabs)含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼ(New England Biolabs)から構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼ(New England Biolabs)を使用して連結した。反応物を、間室温にて30分インキュベートした、そして製造業者の取扱説明書に従って、反応物の2μLのアリコートを電気的コンピテントE.コリTOP10細胞(Invitrogen)内に形質転換した。形質転換体を、LB+カナマイシンプレート上で平板培養し、そして37℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、プライマーoJY44とoHJ1(約1.3kbpのバンドをもたらす)を用いたコロニーPCRによってスクリーニングした。正しい挿入をもたらしたクローンを、pANN5と呼んだ。
2つのB.リチェニフォルミスADCコード領域、及びI.オリエンタリスPDC遺伝子座3’ターゲッティングフランキングDNAを含む右側構築物を、以下の通り構築した。pMhCt071プラスミド(S.セレビシエ3‐HPDH ORFがI.オリエンタリスに最適化したコドンでないことを除いて、先のpMhCt077と同一のプラスミド)を、PmeIとPacIで消化し、10単位の仔ウシ腸ホスファターゼ(New England Biolabs)で処理し、TAEバッファー中での0.9%アガロースゲル電気泳動によって精製して、そして約4.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kitを使用して精製した。
本明細書中に記載したように、プラスミドpANN5を、NotIとNheIで消化し、そしてプラスミドpMIBa144を、NotIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製し、pANN5からの8.2kbpの断片とpMIBa144からの6kbpの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
MIBa360のura−誘導体を、先に記載したように単離した。MIBa360のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、所望のループアウト事象について、プライマー0611815と0613689を用いたPCRによってスクリーニングした。約1.9kbpのバンドの存在が、所望される、ura3瘢痕部位(親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーター)によるuraマーカーの除去を示すのに対して、約3.3kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3 ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。PCRを、製造業者の取扱説明書に従ってPhire(登録商標)Plant Direct PCR kit(Finnzymes)を使用して実施した。上記のプライマーにより約1.9kbpの断片をもたらした2つのFOA耐性コロニーを、保存し、そしてMIBa363及びMIBa364と呼んだ。
プラスミドpMIBa144は、順方向に進む所望のADC及び3‐HPDH発現カセットを含んでいる。ホモ接合菌株のスクリーニングを簡単にするために、pMIBa144のADC発現カセットが逆の方向に置かれた新しいプラスミドを構築した。プラスミドpMIBa144(前掲)を、本明細書中に記載したように、StuIとPmeIで消化し、そしてTBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製した。約6.1kbpと2.8kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製した。pMIBa144からの6.1kbpの断片を、CIPで処理し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)PCR Purification Kit(Qiagen)を使用して精製した。
本明細書中に記載したように、プラスミドpANN5を、NotIとNheIで消化し、そしてプラスミドpMIBa146を、NotIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1%アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてpANN5からの8.2kbpの断片とpMIBa146からの6.2kbpの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従って、QIAQUICK(登録商標)PCR Purification Kit(Qiagen)によって精製した。
MIBa372のura−誘導体を、先に記載したように単離した。MIBa372のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、所望のループアウト事象について、プライマー0611815と0613688を用いたPCRによってスクリーニングした。約2.1kbpのバンドの存在が、所望される、ura3瘢痕部位(親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーター)によるuraマーカーの除去を示すのに対して、約3.3kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3 ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。MIBA372のFOA耐性コロニーもまた、第1の染色体の改変を確認するために、プライマー0611815と0613689(1.9kbpの断片を増幅する)及びpdc遺伝子座の欠失を確認するために、0611552と0611553(pdc遺伝子座が存在していれば、850bpの断片を増幅する)を用いたPCRによってスクリーニングした。PCRを、製造業者の取扱説明書に従って、Phire(登録商標)Plant Direct PCR kit(Finnzymes)を使用して実施した。0611815と0613689で約1.9kbpの断片をもたらすが、0613688と0611815又は0611552と0611553で断片を増幅しないFOA耐性コロニーを、保存し、そしてMIBa375と呼んだ。
菌株MIBa375におけるGPD遺伝子の欠失
追加の構築物を、宿主I.オリエンタリスゲノムから両コピーのグリセロール3‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(配列番号117、配列番号118のGPDをコードする)を欠失するように設計した。これらの構築物は、中間にクローン化されたTPDC‐URA3マーカーカセット(PDCターミネータ‐URA3プロモーター‐URA3遺伝子-URA3ターミネータ‐URA3プロモーター)を含む、GPD遺伝子の上流配列に相同な約1003bpのヌクレオチド配列とGPD遺伝子の下流配列に相同な約852bpの配列を含んでいた。
プライマーoACN54が、GPDの上流フランキング配列の約37bp上流の領域にアニールするのに対し、oACN55は、下流隣接部の約24bp下流の領域にアニールする。GPDの両コピーが欠失すれば、前者の反応は約900と1050bpのバンドを生じ、そして後者の反応は約1025と1200bpのバンドを生じる。GPDノックアウトの2つのコピーを有するコロニーは、1コピーの欠失があるものよりScD‐uraプレート上でゆっくり増殖した。GPD遺伝子の両方のコピーを欠失した菌株を、yHJN7(yHJN3由来)及びyHJN8(yHJN4由来)と命名した。
adh9091遺伝子座におけるI.オリエンタリス3‐HPDHの組み込みのためのプラスミドの構築
配列番号26のI.オリエンタリス3‐HPDHをコードする配列番号25のヌクレオチド配列、及び配列番号20のI.オリエンタリスBAAT(PYD4)をコードする配列番号19のヌクレオチド配列を、以前に記載したように、プライマー0611954と0611957(3‐HPDHのため)又は0611997と0611998(PYD4)を使用して調製したMBin500のI.オリエンタリスゲノムDNAから増幅した。増幅中に、プライマー0611954は、5’末端にkozak配列(TAAA)とNheI部位を加え、そしてプライマー0611957は、3‐HPDHの3’末端にPacI部位を加える。増幅中に、プライマー0611997は、5’末端にkozak配列(TAAA)とPacI部位を加え、そしてプライマー0611998は、PYD4の3’末端にPacI部位を加える。50pmolのそれぞれのプライマーを、50μLの終量中に、50ngの鋳型としてMBin500ゲノムDNA、0.2mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP、1× Expand High Fidelityバッファー(Roche)、及び2.6単位のExpand High Fidelity DNA Polymerase(Roche)を含むPCR反応物に使用した。PCRを、95℃にて3分間を1サイクルと続く、それぞれ95℃にて1分間、55℃にて1分間、そして72℃にて1分間(3‐HPDH PCR)又は2分間(PYD4 PCR)を30サイクル、それと72℃にて5分間最終伸長をプログラムしたEppendorf(登録商標)MASTERCYCLER(登録商標)(Eppendorf Scientific)で実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約831bpの3‐HPDH PCR産物又は1.4kbpのPYD4 PCR産物をゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK(登録商標)Gel Extraction Kit(Qiagen)を使用して精製する、TAEバッファー中での1.0%アガロースゲル電気泳動によって分離した。精製した3‐HPDH又はPYD4の5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってTOPO‐TA Cloning Kit(Invitrogen)を使用してpCR2.1(Invitrogen)内にクローン化した。形質転換体を、2× YT+ampプレート上で平板培養し、そして37℃にて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、EcoRIでの消化によってスクリーニングした。所望の挿入物サイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認した。3‐HPDH含む1つのクローンを、pMBin190と呼び、そしてPYD4を含む別のクローンを、pMBin193と呼んだ。
配列番号129のS.セレビシエ3‐HPDHをコードする826bpの野生型ヌクレオチド配列を、JGI69ゲノムDNAからPCR増幅し、そして遺伝子の5’末端のXbaI部位及び遺伝子の3’末端のPacI部位で修正した。増幅反応物は、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum(登録商標)Pfx DNAポリメラーゼ(InVitrogen)を使用して実施した。Master PCR反応物は、200μLの終量中に1.125μlのS.セレビシエゲノムDNA、それぞれ112.5pMのプライマー611191と611199、1× Pfx増幅バッファー(InVitrogen)、2mMのMgSO4、0.2mMのdNTPミックス、5単位のPlatinum(登録商標)Pfx DNAポリメラーゼ(InVitrogen)を含んでいた。混合物を、8本のチューブに等分し、そしてグラジエントPCRを実施した。増幅反応を、95℃にて2分間を1サイクル;それぞれ95℃にて30秒間、勾配40‐55℃にて30秒間、そして72℃にて2分間を30サイクル;及び72℃にて3分間を1サイクルとプログラムしたEppendorf(登録商標)MASTERCYCLER(登録商標)(Eppendorf Scientific Inc.)でインキュベートした。
配列番号29のM.セデュラ3‐HPDHをコードする配列番号343のI.オリエンタリスコドン最適化ヌクレオチド配列を、GeneArt(登録商標)によって合成し、そしてプラスミド11AAE2APを得た。合成遺伝子を、本明細書中に記載したように、XbaIとPacIを用いてプラスミドから消化し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約959bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
配列番号27のE.コリ3‐HPDHをコードする配列番号143のI.オリエンタリスコドン最適化ヌクレオチド配列を、GeneArt(登録商標)によって合成し、そしてプラスミド1045168を得た。合成遺伝子を、本明細書中に記載したように、XbaIとPacIを用いてプラスミドから消化し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約761bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN(登録商標)Extract II Kit(Macherey-Nagel)を使用して精製した。
McTs259のadh9091における3‐HPDH断片の組み込み
PEP、OAA、及びリンゴ酸中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PPC、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及びリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
PEP、OAA、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PPC、2‐ケト酸デカルボキシラーゼ、KGD、BCKA、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ、3‐HPDH(マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む)、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
PEP、OAA、マロニル‐CoA、及び任意にマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PPC、OAAギ酸リアーゼ、マロニル‐CoAレダクターゼ、CoAアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、3‐HPDH(マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む)、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
ピルバート、アセチル‐CoA、マロニル‐CoA、及び任意にマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PDH、アセチル‐CoAカルボキシラーゼ、マロニル‐CoAレダクターゼ、CoAアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、3‐HPDH(マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む)、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
ピルバート、アラニン、β‐アラニン、及び任意にマロン酸セミアルデヒド、β‐アラニル‐CoA、アクリロイル‐CoA、及び3‐HP‐CoA中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン2,3アミノムターゼ、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ、BAAT、3‐HPDH(マロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む)、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
ピルバート、ラクタート、ラクチル‐CoA、アクリロイル‐CoA、及び3‐HP‐CoA中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、この経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、LDH、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、ラクチル‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、及び3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
グリセロールと3‐HPA中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、この経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、グリセロールデヒドラターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
PEP若しくはピルバート、β‐アラニン、β‐アラニル‐CoA、アクリロイル‐CoA、3‐HP‐CoA、並びに任意に、OAA、アスパラタート、及びアラニン中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、この経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PPC、PYC、AAT、ADC、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ、及びAAM遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。
[B1]
活性な3‐HP発酵経路を含む遺伝子組み換え酵母細胞であって、以下の:
外来性PPC遺伝子;
外来性PYC遺伝子;
外来性AAT遺伝子;
外来性ADC遺伝子;
外来性BAAT又はgabT遺伝子;及び
外来性3‐HPDH遺伝子、
から選択される1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子を含む細胞。
[B2]
外来性AAT遺伝子を含む、段落B1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B3]
外来性PYC遺伝子を含む、段落B1又はB2に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B4]
外来性ADC遺伝子を含む、段落B1〜B3のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B5]
外来性BAAT又はgabT遺伝子を含む、段落B1〜B4のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B6]
外来性3‐HPDH遺伝子を含む、段落B1〜B5のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B7]
以下の:
外来性PYC遺伝子;
外来性AAT遺伝子;
外来性ADC遺伝子;
外来性BAAT又はgabT遺伝子;及び
外来性3‐HPDH遺伝子、
を含む、段落B1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B8]
外来性PPC遺伝子を含む、段落B1〜B7のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B9]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1〜B7のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B10]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B11]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B12]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B13]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B14]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B15]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B16]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B17]
前記外来性PYC遺伝子が、配列番号1のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1〜B16のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B18]
前記AAT遺伝子が、配列番号14、15、及び16から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1〜B17のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B19]
前記AAT遺伝子が、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B18に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B20]
前記AAT遺伝子が、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B18に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B21]
前記AAT遺伝子が、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B18に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B22]
前記AAT遺伝子が、配列番号13のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1〜B21のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B23]
前記ADC遺伝子が、配列番号17、18、133、135、137、及び139から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1〜B22のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B24]
前記ADC遺伝子が、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B25]
前記ADC遺伝子が、配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B26]
前記ADC遺伝子が、配列番号133のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B27]
前記ADC遺伝子が、配列番号135のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B28]
前記ADC遺伝子が、配列番号137のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B29]
前記ADC遺伝子が、配列番号139のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B30]
前記ADC遺伝子が、配列番号130、131、132、134、136、及び138から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1〜B29のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B31]
前記ADC遺伝子が、配列番号130のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B32]
前記ADC遺伝子が、配列番号131のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B33]
前記ADC遺伝子が、配列番号132のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B34]
前記ADC遺伝子が、配列番号134のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B35]
前記ADC遺伝子が、配列番号136のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B36]
前記ADC遺伝子が、配列番号138のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B37]
前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号20、21、22、23、及び24から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1〜B36のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B38]
前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号20のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B39]
前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B40]
前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B41]
前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B42]
前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B43]
前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号19、140、141、及び142から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1〜B42のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B44]
前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号19のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B43に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B45]
前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号140のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B43に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B46]
前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号141のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B43に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B47]
前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号142のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B43に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B48]
前記外来性BAAT遺伝子又は外来性gabTが、gabT遺伝子でもあるBAAT遺伝子である、段落B1〜B47のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B49]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号26、27、28、29、30、31、32、33、34、及び129から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1〜B48のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B50]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号26のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B51]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号27のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B52]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号28のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B53]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号29のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B54]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号30のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B55]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B56]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号32のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B57]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B58]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号34のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B59]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号129のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B60]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号25、143、144、及び343から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1〜B59のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B61]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号25のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B60に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B62]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号143のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B60に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B63]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号144のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B60に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B64]
前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号343のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B60に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B65]
前記3‐HPDH遺伝子が、HIBADH遺伝子でもある、段落B1〜B64のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B66]
前記3‐HPDH遺伝子が、4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子でもある、段落B1〜B65のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B67]
前記PPC遺伝子が、配列番号10、11、及び12から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1〜B66のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B68]
前記PPC遺伝子が、配列番号10のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B67に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B69]
前記PPC遺伝子が、配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B67に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B70]
前記PPC遺伝子が、配列番号12のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B67に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B71]
前記PPC遺伝子が、配列番号9のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1〜B70のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B72]
前記酵母細胞が、クラブトリー陰性である、段落B1〜B71のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B73]
前記酵母細胞が、イサタケンキア属、カンジダ属、クルイベロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、トルラスポラ属、チゴサッカロマイセス属、及びサッカロマイセス属から選択される属に属している、段落B1〜B72のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B74]
前記酵母細胞が、I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群及びサッカロマイセス分岐群から選択される分岐群に属している、段落B73に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B75]
前記酵母細胞が、I.オリエンタリス、C.ランビカ、及びS.ブルデリから選択される、段落B73に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B76]
前記細胞が、PDC、ADH、GAL6、CYB2A、CYB2B、GPD、GPP、ALD、及びPCK遺伝子から選択される天然遺伝子の1若しくは複数の欠失又は破壊をさらに含む、段落B1〜B75のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B77]
前記1若しくは複数の欠失又は破壊が、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子の挿入の結果である、段落B76に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B78]
1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子が、1若しくは複数の外来性調節要素に作動可能なように連結されている、段落B1〜B77のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B79]
前記1若しくは複数の調節要素が、1若しくは複数の3‐HP経路遺伝子にとって外来のものである、段落B78に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B80]
前記外来性PYC遺伝子が、PYC遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1〜B79のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B81]
前記外来性AAT遺伝子が、AAT遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1〜B80のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B82]
前記外来性ADC遺伝子が、ADC遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1〜B81のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B83]
前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、BAAT又はgabT遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1〜B82のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B84]
前記外来性3‐HPDH遺伝子が、3‐HPDH遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1〜B83のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B85]
前記外来性PPC遺伝子が、PPC遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1〜B84のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B86]
前記細胞が、75g/L以上の3‐HPを含む培地中、4未満のpHでも培養できる、段落B1〜B85のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B87]
前記細胞が、3‐HP耐性酵母細胞である、段落B1〜B86のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B88]
前記細胞が、突然変異及び/又は選択細胞が同種の野生型細胞より高い3‐HP耐性を有するように突然変異及び/又は選択を受ける、段落B1〜B87のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B89]
前記細胞が、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子を用いて遺伝子組み換えされる前に、突然変異及び/又は選択を受ける、段落B88に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B90]
前記細胞が、乳酸又は3‐HPの存在下で選択を受ける、段落B88又はB89に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B91]
前記選択が、ケモスタット選択である、段落B91に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
[B92]
以下の:
(i)少なくとも1種類の炭素源を含む培地の存在下で、段落B1〜B91のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を培養し;そして
(ii)培養物から3‐HPを単離すること、
を含む3‐HPの生産方法。
[B93]
前記炭素源が、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、グルコースオリゴマー、及びグリセロールから選ばれる、段落B92に記載の方法。
[B94]
培地が、5未満のpH、例えば、約1.5〜約4.5、約2.0〜約4.0、又は約2.0〜約3.5の範囲内のpHである、段落B92又はB93に記載の方法。
Claims (38)
- 活性な3‐HP発酵経路を含む遺伝子組み換え酵母細胞であって、
外来性PPC遺伝子;
外来性PYC遺伝子;
外来性AAT遺伝子;
外来性ADC遺伝子;
外来性BAAT又はgabT遺伝子;及び
外来性3‐HPDH遺伝子、
から選択される1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子を含む、細胞。 - 外来性PYC遺伝子を含む、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記PYC遺伝子が、配列番号2、3、4、5、6、7、8から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項2に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記PYC遺伝子が、配列番号1のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項2又は3に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 外来性AAT遺伝子を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記AAT遺伝子が、配列番号14、15、及び16から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項5に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記AAT遺伝子が、配列番号13のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項5又は6に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 外来性ADC遺伝子を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記ADC遺伝子が、配列番号17、18、133、135、137、及び139から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記ADC遺伝子が、配列番号130、131、132、134、136、及び138から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項8又は9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 外来性BAAT遺伝子又は外来性gabT遺伝子を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号20、21、22、23、及び24から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項11に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号19、140、141、及び142から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項11又は12に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記BAAT遺伝子又はgabTが、gabT遺伝子でもあるBAAT遺伝子である、請求項11〜13のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 外来性3‐HPDH遺伝子を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号26、27、28、29、30、31、32、33、34、及び129から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項15に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号25、143、144、及び343から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項15又は16に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 3‐HPDH遺伝子が、HIBADH遺伝子でもある、請求項15〜17のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 3‐HPDH遺伝子が、4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子でもある、請求項15〜18のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 外来性PPC遺伝子を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記PPC遺伝子が、配列番号10、11、及び12から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項20に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記PPC遺伝子が、配列番号9のヌクレオチド配列に対して少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項20又は21に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記酵母細胞が、クラブトリー陰性である、請求項1〜22のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記酵母細胞が、イサタケンキア属、カンジダ属、クルイベロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、トルラスポラ属、チゴサッカロマイセス属、及びサッカロマイセス属から選択される属に属している、請求項1〜22のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記酵母細胞が、I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群及びサッカロマイセス分岐群から選択される分岐群に属している、請求項24に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記酵母細胞が、I.オリエンタリス、C.ランビカ、及びS.ブルデリから選択される、請求項24に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記細胞が、PDC、ADH、GAL6、CYB2A、CYB2B、GPD、GPP、ALD、及びPCK遺伝子から選択される天然遺伝子の1若しくは複数の欠失又は破壊をさらに含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記1若しくは複数の欠失又は破壊が、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子の挿入に起因する、請求項27に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子が、1若しくは複数の外来性調節要素に作動可能なように連結されている、請求項1〜28のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記細胞が、75g/L以上の3‐HPを含む培地中、4未満のpHで増殖できる、請求項1〜29のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記細胞が、3‐HP耐性酵母細胞である、請求項1〜30のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記細胞が、突然変異及び/又は選択細胞が同種の野生型細胞より高い3‐HP耐性を有するように、突然変異及び/又は選択を受ける、請求項1〜31のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記細胞が、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子を用いて遺伝子組み換えされる前に、突然変異及び/又は選択を受ける、請求項32に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記細胞が、乳酸又は3‐HPの存在下で選択を受ける、請求項32又は33に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 前記選択が、ケモスタット選択である、請求項34に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
- 以下:
(i)少なくとも1種類の炭素源を含む培地の存在下、請求項1〜35のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を培養し;そして
(ii)培養物から3‐HPを単離すること、
を含む3‐HPの生産方法。 - 前記炭素源が、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、グルコースオリゴマー、及びグリセロールから選択される、請求項36に記載の方法。
- 前記培地が、5未満のpH、例えば、約1.5〜約4.5、約2.0〜約4.0、又は約2.0〜約3.5の範囲内である、請求項36又は37に記載の方法。
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