CN112368384A - 3-羟基丙酸的生产与分离 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于生产3‑羟基丙酸或其盐，用于从水溶液(例如，水性培养液)中取出3‑羟基丙酸以及采用它来制造各种化学品的方法和设备。

Description

3-羟基丙酸的生产与分离
相关申请的交叉引用
本申请要求35U.S.C.§119(e)条款下2017年10月26日提交的美国临时申请62/577,361和2017年12月4日提交的美国临时申请62/594,318的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
本公开涉及3-羟基丙酸的生产，包括通过重组菌株从甘油生产，以及从水溶液(例如水性培养液)中取出，及其在生产各种化学品中的用途。
背景
3-羟基丙酸(3-HP)和3-羟基丙酸盐(3-HP的盐)被用于各种化学品例如丙烯酸的工业生产，这些化学品可用作聚合物涂料的交联剂，金属润滑剂和纺织品用抗静电剂。
概要
本公开提供了用于生产3-HP或其盐、从水溶液(例如，水性培养液)中取出3-HP以及用于制造各种化学品的方法和设备。
在一些实施方案中，本公开提供了使用脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)的基因修饰菌株从甘油生产3-HP或其盐的方法。
在某些实施方案中，本公开提供了产生可以在无需外部补充辅酶B12的情况下以高效价产生3-HP或其盐的假单胞菌菌株的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了用于假单胞菌属菌株的表达系统(例如，表达模块或表达构建体)。这种表达系统尤其可以包括串联启动子系统，其包括可操作地连接以控制下游基因表达的两个或多个启动子。这样的启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。任选地，表达系统包括至少一个诱导型启动子。表达系统可用于产生靶蛋白/酶或增强代谢途径，以通过最小化有毒中间产物和/或增加维生素B12(3-HP合成途径的第一个反应中的辅因子)的产生来以高效价产生靶产物，例如3-HP或其盐。
在一些实施方案中，本公开提供了编码这些系统的核酸、表达这些系统的重组细菌和/或培养细菌以产生3-HP或其盐的方法。这些细菌已被修饰而包括对培养基中的目标产物水平(在这种情况下为3-HP或其盐)发生响应的一个或多个表达系统，并表达用于生产目标产物例如3-HP或其盐的基因。在某些情况下，这些细菌还已经被修饰而包括一个或多个表达系统，以增加用于生产B12的基因的表达。本文还提供了培养所述细菌以增加3-HP产量(或其盐)的条件。
在一个方面，本公开提供了一种表达系统，其包含可以由小分子诱导的第一启动子、第二启动子、编码参与3-HP(或其盐)或B12合成的蛋白质的第一基因、被修饰的UTR和编码来自天然脱氮假单胞菌蛋白质N端的多达20个氨基酸的天然序列，由它们所组成或者基本上由它们所组成，其中所述天然序列可操作地连接至所述经修饰的UTR的3'端以及可操作地连接所述第一基因的5'-末端，并且所述第一和第二启动子在所述经修饰的UTR的上游串联地可操作连接。
在所有方面的一些实施方案中，表达系统进一步包含第三启动子和编码被配置为调节所述第一基因的表达的转录调节子的第二基因，由它们所组成或者基本上由它们所组成，其中所述第三启动子可操作地连接第二基因。在某些情况下，第二启动子可被小分子诱导。在某些情况下，所述天然序列与第一基因的5'末端可操作连接以定义融合基因，第二启动子为天然脱氮假单胞菌蛋白的天然启动子，并且第二启动子可操作地与融合基因的5’末端连接。在一些实施方案中，第一启动子可操作地连接第二启动子的5'-末端，第二启动子可操作地连接经修饰的UTR的5'-末端，并且所述经修饰的UTR可操作地连接融合基因的5'末端。
在一个方面，本公开提供了一种核酸，其包含第一启动子和第二启动子，由其组成或基本上由其组成，其中所述第一启动子是诱导型启动子，并且可被小分子诱导；所述第一和第二启动子与第一基因可操作地连接；并且所述第一基因编码参与3-羟基丙酸(3-HP)(或其盐)或辅酶B12合成的蛋白质。
在所有方面的一些实施方案中，第一基因编码参与3-羟基丙酸(3-HP)(或其盐)的合成的蛋白质，并且选自甘油脱水酶、甘油脱水酶再活化酶和醛脱氢酶。在一些情况下，第一基因包含选自由dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、gdrB和kgsA组成的组中的至少一个基因。在某些情况下，第一个基因包含dhaB1基因、dhaB2基因、dhaB3基因、gdrA基因和gdrB基因。
在一些实施方案中，所述第一基因是dhaB1，并且其序列包含与SEQ ID NO：1至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一基因是dhaB2，并且该序列包含与SEQ ID NO：2具有至少95％同一性的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一基因是dhaB3，并且其序列包含与SEQ ID NO：3至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第一基因是gdrA，并且所述序列包含与SEQID NO：4至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一基因是grdB。并且所述序列包含与SEQ ID NO：5至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第一基因包含醛脱氢酶基因、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述醛脱氢酶是kgsA。在一些情况下，kgsA包含与SEQ IDNO：6至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述小分子是酸或醇。在某些情况下，所述小分子酸或醇选自L-乳酸(LAC)、乙酸(AcOH)、丙酸(PA)、3-羟基丙酸(3-HP)、3-羟基丁酸(3-HB)、1,3-丙二醇(1,3-PDO)、2,3-丁二醇(2,3-BDO)、L-缬氨酸(L-val)和3-羟基异丁酸(3-HIB)或其盐。在某些情况下，所述小分子酸或醇选自3-羟基丙酸(3-HP)、3-羟基丁酸(3-HB)、L-缬氨酸(L-val)和3-羟基异丁酸(3-HIB)。在一些情况下，所述小分子是3-羟基丙酸(3-HP)(或其盐)。
在所有方面的一些实施方案中，所述核酸包含与SEQ ID NO：65至少85％相同的序列、由其组成或基本上由由组成。在一些情况下，所述核酸包含SEQ ID NO：65、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第二启动子可操作地连接第一启动子的3'末端，并且所述第一基因可操作地位于第二启动子的下游。在所有方面的一些实施方案中，所述第一启动子可操作地连接第二启动子的3'末端，并且所述第一基因可操作地位于第二启动子的下游。
在所有方面的一些实施方案中，所述第二启动子是组成型启动子。在一些情况下，所述第二启动子是第二诱导型启动子。在一些情况下，第一和第二启动子之间的基因间空间不包括终止子序列。在一些情况下，所述第一启动子和第二启动子调节所述第一基因的表达。
在所有方面的一些实施方案中，第一启动子衍生自PmmsA启动子，PhpdH-1启动子，PhpdH-4启动子或PhpdH启动子。在一些情况下，所述第一启动子包含与SEQ ID NO：14(PmmsA启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一启动子包含与SEQ ID NO：13(PhbdH-1启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一启动子包含与SEQ ID NO：11(PhbdH-4启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一启动子包含与SEQ IDNO：12(PhpdH启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一启动子包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列，由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，第一启动子包含PmmsA启动子、由其组成或基本上由其组成，并且所述核酸进一步包含与PmmsA启动子的5′-末端可操作地连接的操作子位点。在一些情况下，本文描述的核酸包含与SEQ ID NO：15有95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，本文描述的核酸包含与SEQ ID NO：16(MmsA操作子的O1)具有95％同一性的序列和与SEQ ID NO：17(MmsA操作子的O2)具有95％同一性的序列、由其组成或基本上由其组成。在所有方面的一些实施方案中，本文描述的核酸包含与SEQ ID NO：18(PmmsA和操作子，图3)具有95％同一性的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，本文所述的核酸包含选自SEQ ID NO：15、18、19(PmmsA2a)、20(PmmsA2b)和21(PmmsA2ab)的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，第二启动子衍生自PmmsA启动子、PhpdH-1启动子、PhpdH-4启动子、PhpdH启动子或Pzwf启动子。在一些情况下，第二启动子包含与SEQ ID NO：11(PhbdH-4启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第二启动子包含与SEQ ID NO：12(PhpdH启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在所有方面的一些实施方案中，所述第二启动子包含与SEQ ID NO：14(PmmsA启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第二启动子包含与SEQ ID NO：13(PhbdH-1启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在所有方面的一些实施方案中，所述第二启动子包含与SEQ ID NO：7(Pzwf)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第二启动子包含与SEQ ID NO：8(Pzwf-1)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，第二启动子包含与SEQ ID NO：9(Pzwf-7)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在所有方面的一些实施方案中，所述第二启动子包含与SEQ ID NO：62(较短的Pzwf-7)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第二启动子包含与SEQ ID NO：10(Pzwf-12)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，第二启动子包含选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、52-60、61、62和63(例如Pzwf启动子)的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第一启动子包含PmmsA启动子、由其组成或基本上由其组成，并且所述第二启动子包含PhbdH-4启动子、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一启动子包含与SEQ ID NO：14(PmmsA启动子序列)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成，并且所述第二启动子包含与SEQ ID NO：11(PhbdH-4启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一启动子包含PhpdH-1启动子、由其组成或基本上由其组成，并且所述第二启动子包含PhpdH启动子、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一启动子包含与SEQ ID NO：13(PhbdH-1启动子序列)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成，并且所述第二启动子包含与SEQ ID NO：12(PhpdH启动子)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第二启动子包含PhbdH启动子、由其组成或基本上由其组成，并且所述核酸进一步包含与PhpdH启动子的N端可操作连接的操纵子位点、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述操纵子位点包含与SEQ ID NO：RBS-1、RBS-2、ABS-1、ABS-2和ABS-3至少95％相同的一个或多个序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述操纵子位点包含与SEQ ID NO：RBS-1位点和ABS-2至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述操纵子位点包含SEQ ID NO：RBS-1位点和ABS-2、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述核酸进一步包含编码调节第一基因表达的转录调节子的基因、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述转录调节子与第一或第二启动子结合。在某些情况下，所述转录调节因子是LysR型转录调节子(LysR-typetranscriptional regulator，LTTR)。在一些实施方案中，所述转录调节子是MmsR或HpdR。在某些情况下，所述转录调节子是MmsR。
在所有方面的一些实施方案中，所述转录调节子与第一启动子结合。在某些情况下，所述转录调节子衍生自mmsR蛋白，并且所述第一启动子衍生自PmmsA启动子。在一些情况下，所述转录调节子包含mmsR蛋白、由其组成或基本上由其组成，并且所述第一启动子包含PmmsA启动子、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，本文所述的核酸进一步包含操作子位点(operator site)、由其组成或基本上由其组成，其中MmsR蛋白结合该操作子位点。在一些情况下，本文描述的核酸包含与SEQ ID NO：19(PmmsA2a)至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，本文描述的核酸包含选自SEQ ID NO：19-21(PmmsA2a，A2b，A2ab)的序列、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述转录调节子与第二启动子结合。在所有方面的一些实施方案中，所述第二启动子是组成型启动子。在某些情况下，所述转录调节子是HpdR蛋白，并且所述第二启动子衍生自hpdH启动子。在一些情况下，所述第二启动子包含与PhpdH SEQ ID NO：12的序列至少95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述转录调节子与第一启动子结合并且在所述小分子存在下与第一启动子的结合增强。在一些情况下，所述转录调节子与第二启动子结合并且在所述小分子存在下与第二启动子的结合增强。在某些情况下，所述转录调节子是自我调节的。在某些情况下，本文所述的核酸进一步包含与编码第一转录调节子的基因可操作连接的第三启动子、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第三启动子包含与选自SEQ ID NO：7-10和52-63的序列95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述第二组成型启动子选自SEQ ID NO：9、10、57-60、62和63；所述转录调节子包含MmsR蛋白、由其组成或基本上由其组成；并且所述第一启动子包含PmmsA、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第二组成型启动子选自SEQ ID NO：9、10、57-60、62和63；所述转录调节子包含HpdR蛋白、由其组成或基本上由其组成；并且所述第一启动子包含PhbdH、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述第三启动子包含、由其组成或基本上由其组成SEQ ID NO：10组成。在某些情况下，第三启动子包含SEQ ID NO：62、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第一基因包含所述基因的经修饰的5'UTR、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一基因包含选自SEQ ID NO：22-28和64(UTR 0-6)的序列、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述5'UTR包含SEQ ID NO：28(UTR-6)、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述第一基因包含编码kgsA的基因、由其组成或基本上由其组成，并且所述5'UTR包含SEQ ID NO：28(UTR-6)、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第一基因的5′末端的至少10个密码子被优化以用于在脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)中翻译。在某些情况下，所述第一基因的5'末端的多达10个密码子被优化以用于在脱氮假单胞菌中翻译。在某些情况下，密码子优化包括下述、由其组成或基本上由其组成：测量编码天然脱氮假单胞菌蛋白质的基因中每种氨基酸的密码子频率；使用天然蛋白质的密码子频率用优化的10个密码子替换第一基因的5'末端的所述10个密码子，其中所述优化的10个密码子的每个氨基酸的密码子均以与天然蛋白质中的密码子频率相同的频率存在。在某些情况下，所述优化的后10个密码子中每个氨基酸的密码子频率均大于0。在某些情况下，测量了在编码天然脱氮假单胞菌蛋白的基因的5'端的10个密码子中每个氨基酸的密码子频率。
在所有方面的一些实施方案中，所述核酸包含与选自SEQ ID NO：29、30和31(Opt1-3)的序列95％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第一基因包含编码kgsA的基因、由其组成或基本上由其组成，并且包含选自SEQ ID NO：29-31的序列、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述第一基因在其5'端与衍生自编码天然脱氮假单胞菌蛋白的第二个基因的5'端的编码多达20个氨基酸的序列融合，从而形成融合基因。在某些情况下，融合基因的mRNA比所述第一基因单独的mRNA具有更高的稳定性。在某些情况下，与单独的第一基因相比，融合基因增加了基因翻译。在所有方面的一些实施方案中，融合基因的mRNA比单独第一基因的mRNA更耐核糖核酸酶降解。在某些情况下，与单独的第一基因相比，融合基因增加了基因翻译。
在所有方面的一些实施方案中，所述第一基因在其5'末端与衍生自编码天然脱氮假单胞菌蛋白的第二基因的5'末端的编码至多20个(5、10、15或20个)氨基酸的序列融合，从而产生融合基因，并且第二启动子衍生自第二基因的天然启动子。在一些情况下，第二启动子衍生自PmmsA启动子，并且融合基因包含编码天然MmsA蛋白的N-末端至少5、10、15或20个氨基酸的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述第二启动子包含PmmsA启动子、由其组成或基本上由其组成，并且所述融合基因包含编码来自天然MmsA蛋白的N-末端的五个或更多个氨基酸的序列、由其组成或基本上由其组成，并且所述融合基因可操作地连接至PmmsA启动子的3'端。在一些情况下，该核酸包含选自SEQ ID NO：32-35的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，第一基因在其5'末端与编码衍生自编码天然脱氮假单胞菌MmsA蛋白N末端的序列的至多20个(5、10、15或20个)氨基酸的序列融合。在一些情况下，本文所述的核酸包含选自SEQ ID NOs：32-35(Pcm-mmsA(5)(10)(15)(20))的序列、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第一基因编码参与维生素B12合成的蛋白质。在某些情况下，所述第一基因包含选自下述的基因、由其组成或基本上由其组成：cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobNcobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM和cobV。在一些情况下，所述第一基因包含bgpM、由bgpM组成或基本上由bgpM组成。在某些情况下，所述第一基因源自选自下述的假单胞菌属物种：脱氮假单胞菌(P.denitrifcans)；铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；食虫假单胞菌(P.entomophila)；恶臭假单胞菌(P.putida)；丁香假单胞菌(P.syringae)；荧光假单胞菌(P.fluorescens)；门多萨假单胞菌(P.mendocina)和施氏假单胞菌(P.stutzeri)。
在另一方面，本公开内容提供了一种核酸，其包含与编码参与辅酶B12合成的蛋白质的第一基因可操作地连接的第一启动子、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，第一启动子是组成型启动子。在一些情况下，所述核酸包含选自SEQ ID NO：7-10和52-63的序列、由其组成或基本上由其组成。在所有方面的一些实施方案中，所述第一基因包含选自以下的一个或多个基因、由其组成或基本上由其组成：cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM和cobV。在某些情况下，所述第一基因来自选自下述的假单胞菌属的种：脱氮假单胞菌、铜绿假单胞菌、食虫假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌、荧光假单胞菌、门多萨假单胞菌和施氏假单胞菌。
在所有方面的一些实施方案中，本文所述的核酸进一步包含与所述第一启动子可操作地连接的第二启动子、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述第一和第二启动子调节所述第一基因的表达。在某些情况下，所述第一启动子不是所述第一基因的天然启动子。
在另一方面，本公开内容提供了一种核酸，其包含cobG基因、Pedd启动子、PsucA启动子和cobL基因；其中所述Pedd启动子与cobG基因和PsucA启动子可操作地连接，并且所述PsucA启动子与所述cobL基因可操作地连接。在一些情况下，所述Pedd启动子包含序列SEQ ID NO：36、由其组成或基本上由其组成；所述PsucA启动子包含序列SEQ ID NO：37、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，本文所述的核酸包含序列SEQ ID NO：38、由其组成或基本上由其组成。
一方面，本公开提供了一种核酸，其包含cobG基因、Psp9启动子、Pzwf启动子和cobL基因，由其组成或基本上由其组成；其中所述Psp9启动子与所述cobG基因和Pzwf启动子可操作地连接，并且所述Pzwf启动子与cobL基因可操作地连接。在一些情况下，所述Psp9启动子包含SEQ ID NO：39、由其组成或基本上由其组成；并且所述Pzwf启动子包含SEQ ID NO：40。在某些情况下，本文所述的核酸包含SEQ ID NO：41、由其组成或基本上由其组成。
一方面，本公开内容提供了一种核酸，其包含cobW基因、Pzwf启动子、Psp9启动子和cbtB基因，由其组成或基本上由其组成，其中所述Pzwf启动子与所述cobW基因和所述Psp9启动子可操作地连接，并且所述Psp9启动子与所述cbtB基因可操作地连接。在某些情况下，所述Pzwf启动子包含SEQ ID NO：42；并且所述Psp9启动子包含SEQ ID NO：43。在某些情况下，本文所述的核酸包含SEQ ID NO：44、由其组成或基本上由其组成。
一方面，本公开内容提供了一种核酸，其包含cobW基因、Ptkt启动子、Psp2启动子和cbtB基因，由其组成或基本上由其组成，其中所述Ptkt启动子可操作地连接至cobW基因和Psp2启动子，并且所述Psp2启动子可操作地连接到cbtB基因。在一些情况下，所述Ptkt启动子包含SEQ ID NO：45、由其组成或基本上由其组成；所述Psp2启动子包含SEQ ID NO：46、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，本文所述的核酸包含SEQ ID NO：47、由其组成或基本上由其组成。
一方面，本公开提供了一种核酸，其包含可操作地连接至tonB基因(例如butB基因)的Pzwf启动子、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述Pzwf启动子包含SEQID NO：48、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，本文所述的核酸包含SEQ ID NO：49、由其组成或基本上由其组成。
一方面，本公开内容提供了一种核酸，其包含可操作地连接至tonB基因(例如butB基因)的Psp9启动子、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述Psp9启动子包含SEQID NO：50、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，本文所述的核酸包含SEQ ID NO：51、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述核酸包含衍生自脱氮假单胞菌的一个或多个序列、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述第一或第二启动子衍生自脱氮假单胞菌。在一些情况下，所述核酸包含衍生自肠杆菌、乳杆菌、假单胞菌或固氮螺旋菌细菌的一个或多个序列、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述第一基因衍生自肠杆菌、乳杆菌、假单胞菌或固氮螺旋菌。
一方面，本公开内容提供了包含DhaB表达模块的核酸，所述DhaB表达模块包含与SEQ ID NO：66(DhaB表达模块)至少85％相同的序列，由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO：66至少90％相同。在一些情况下，本文所述的核酸包含SEQ IDNO：66、由其组成或基本上由其组成。
一方面，本公开内容提供了包含DhaB表达模块的核酸，所述DhaB表达模块包含与SEQ ID NO：67(kgsA表达模块)至少85％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO：67至少90％相同。在一些情况下，该序列包含SEQ ID NO：67、由其组成或基本上由其组成。
一方面，本公开内容提供了包含DhaB表达模块的核酸，该模块包含gdrA基因的UTR和gdrB基因的UTR、由其组成或基本上由其组成，其中所述gdrA基因的UTR包含SEQ ID NO：68、由其组成或基本上由其组成，所述gdrB基因的UTR包含SEQ ID NO：69、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述核酸包含与选自SEQ ID NO：70-72的序列至少85％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述核酸包含选自SEQ ID NO：70-72的序列、由其组成或基本上由其组成。
一方面，本公开内容提供了包含辅酶B12感受器(sensor)的核酸，所述辅酶B12感受器包含与选自SEQ ID NO：73和74的序列至少85％相同的序列、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，本文所述的核酸包含选自SEQ ID NO：73和74的序列、由其组成或基本上由其组成。
在一个方面，本公开内容提供了一种核酸，其包含辅酶B12表达模块、由其组成或基本上由其组成，其中所述辅酶B12表达模块包含参与辅酶B12的合成的第一基因、通过小分子诱导的“第一启动子”以及第二启动子，由其组成或基本上由其组成，其中所述第一和第二启动子以串联形式在所述第一基因的上游可操作地连接，从而它们调节所述第一基因的表达。在一些情况下，所述核酸进一步包含参与辅酶B12合成的第二基因、由小分子诱导的第三启动子以及第四启动子、由其组成或基本上由其组成，其中所述第三和第四启动子以串联形式可操作地连接在所述第二基因的上游，从而它们调节所述第二基因的表达。在所有方面的一些实施方案中，所述核酸进一步包含参与辅酶B12合成的第三基因、由小分子诱导的第五启动子以及第六启动子，由其组成或基本上由其组成，其中所述第五启动子和第六启动子以串联形式可操作地连接在所述第三基因的上游，从而它们调节第三基因的表达。在一些情况下，该核酸进一步包含参与辅酶B12的合成有关的第四基因、由小分子诱导的第七启动子以及第八启动子，由其组成或基本上由其组成，其中所述第七和第八启动子以串联形式可操作地连接在第四基因的上游，使得它们调节第四基因的表达。在某些情况下，所述第一、第二、第三和第四基因各自包含一个或多个选自下述的基因、由其组成或基本上由其组成：cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM和cobV。在某些情况下，第一基因包含bgpM、由bgpM组成或基本上由bgpM组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述核酸不包括调节参与辅酶B12的产生的基因的任何天然核糖开关(riboswitches)。在一些情况下，该核酸不包括SEQ ID NO：75或76。
在另一方面，本公开内容提供了重组细菌，其包含本文所述的核酸、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述细菌是假单胞菌属的种。在某些情况下，所述细菌是脱氮假单胞菌。
在所有方面的一些实施方案中，所述核酸位于表达质粒上。在某些情况下，所述核酸被整合到细菌的染色体中。在某些情况下，所述核酸位于附加体上。
在另一方面，本公开内容提供了一种重组细菌，该重组细菌包含第一核酸和第二核酸、由其组成或基本上由其组成，其中所述第一核酸包含DhaB表达模块、由其组成或基本上由其组成，所述第二核酸包含ALDH表达模块、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述DhaB表达模块包含本文描述的任何一种核酸、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述ALDH表达模块包含本文所述的任何一种核酸、由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，所述第一和第二核酸位于表达质粒上。在某些情况下，所述第一和第二核酸位于附加体上。在某些情况下，所述第一和第二核酸被整合到细菌的染色体中。在某些情况下，所述第一核酸整合到细菌的染色体中，并且所述第二核酸位于表达质粒上。在某些情况下，所述第一核酸位于表达质粒上，并且所述第二核酸被整合到细菌的染色体中。在所有方面的一些实施方式中，所述第一核酸被整合到细菌的染色体中，并且所述第二核酸位于附加体上。在某些情况下，所述第一核酸位于附加体上，并且所述第二核酸被整合到细菌的染色体中。
在所有方面的一些实施方式中，所述第一核酸在第一位置被整合到细菌的染色体中，而所述第二核酸在第二位置被整合到细菌的染色体中，其中所述第一和第二位置彼此相距2500千碱基对以内。在某些情况下，所述第一和第二位置彼此之间相距100千碱基对以内。在某些情况下，所述第一位置和第二位置彼此相距50千碱基对以内。在一些情况下，所述第一和第二位置彼此相距1000个碱基对以内。
在所有方面的一些实施方式中，所述第一核酸在所述复制起点的4000个碱基对以内的第一位置处被整合到细菌的染色体中。在某些情况下，所述第一位置位于所述复制起点的1000个碱基对之内。
在另一方面，本公开内容提供了重组细菌，其包含辅酶B12表达模块、由其组成或基本上由其组成，其中所述表达模块包含参与辅酶B12的合成的第一基因、由小分子诱导的第一启动子以及第二启动子，由其组成或基本上由其组成，其中所述第一和第二启动子以串联形式可操作地连接在所述第一基因的上游。
在所有方面的一些实施方案中，所述细菌是脱氮假单胞菌细菌。在一些情况下，所述细菌在调节第一基因表达的第一核糖开关的第一位置上包含缺失、由其组成或基本上由其组成，其中所述第一和第二启动子在所述第一位置处整合入细菌的染色体中，从而他们调节所述第一基因的表达。在一些情况下，所述细菌进一步包含位于调节参与辅酶B12合成的第二基因的表达的第二核糖开关的第二位置处的第二缺失、位于调节参与辅酶B12合成的第三基因的表达的第三核糖开关的第三位置处的第三缺失、以及位于调节参与辅酶B12合成的第四基因的表达的第四核糖开关的第四位置处的第四缺失，由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，所述重组细菌进一步包含串联地可操作地连接并在第二位置处整合到染色体中从而它们调节第二基因的表达的第三启动子和第四启动子、串联地可操作地连接并在第三位置处整合到染色体中从而它们调节第三基因的表达的第五启动子和第六启动子、以及串联地可操作地连接并在第四位置处整合到染色体中从而它们调节第四基因的表达的第七启动子和第八启动子。在所有方面的一些实施方案中，所述细菌比天然脱氮假单胞菌产生更多的辅酶B12。在所有方面的一些实施方案中，本文所述的重组细菌还包含辅酶B12表达模块、由其组成或基本上由其组成。
在另一方面，本公开提供了产生3-HP或其盐的方法，其包括在足以产生3-HP或其盐的条件下培养本文所述的重组细菌，由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，所述条件足以产生至少85g/L的3-HP或其盐。在某些情况下，所述条件足以产生至少90g/L的3-HP或其盐。在所有方面的一些实施方案中，所述条件足以产生至少95g/L的3-HP或其盐。在某些情况下，所述条件足以产生至少100g/L的3-HP或其盐。
在所有方面的一些实施方案中，培养细菌不包括添加外部辅酶B12。在某些情况下，培养细菌包括向培养物中添加外部辅酶B12。
在一些情况下，培养包括在包含选自甘油、葡萄糖、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐和柠檬酸的碳源的培养基中生长所述细菌、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，培养包括通过添加甘油来诱导细菌以产生3-HP或其盐，或由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，甘油在对数中期添加。
在所有方面的一些实施方案中，培养包括在包含选自酵母提取物、玉米浆粉末(corn steep liquor powder)和玉米浆糊(corn steep liquor paste)的氮源的培养基中生长所述细菌，由其组成或基本上由其组成。
在所有方面的一些实施方案中，培养包括在6.8至7.8之间的pH下生长所述细菌、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，培养包括添加一种或多种选自NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3和Na2CO3的碱、由其组成或基本上由其组成。在一些情况下，培养包括添加至少一种选自NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3和Na2CO3的碱，由其组成或基本由其组成。在某些情况下，培养包括稀释所述碱浓度和增加所述酸浓度、由其组成或基本上由其组成(参见图46和图49)。
在所有方面的一些实施方案中，培养包括在28至40摄氏度之间的温度下生长所述细菌、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，培养包括在33摄氏度下生长所述细菌、由其组成或基本上由其组成。
在另一方面，本公开内容提供了产生3-HP或其盐的方法，该方法包括：在适合于所述细菌生长和产生3-HP或其盐的培养基中提供本文所述的重组细菌、由其组成或基本上由其组成。在某些情况下，本文所述的方法包括从所述细菌或培养基中分离3-HP或其盐、由其组成或基本上由其组成。
在一些情况下，所述培养基包含约2-20％溶解氧的溶解氧浓度、由其组成或基本上由其组成。在所有方面的一些实施方案中，所述溶解氧浓度不超过20％。在某些情况下，所述溶解氧的浓度至少为2％。
此外，本发明涉及提供3-羟基丙酸并使之反应的方法。
本公开提供了从水溶液中取出3-羟基丙酸(3-HP)的方法。该方法可以相对简单且便宜地进行。该方法可以提供相对较高的3-HP产率。
本公开内容还提供了制备丙烯酸的方法。该方法可以相对简单且便宜地进行。该方法可以在很少或不发生丙烯酸聚合的情况下进行。该方法可以提供相对较高的丙烯酸产率。
一方面，本公开提供了一种在不使用逆流液流的情况下从水溶液中取出3-HP的方法。
在另一方面，本公开内容提供了一种方法，该方法包括蒸发第一溶剂，使所述蒸发的第一溶剂冷凝，以及引导第一溶剂的流以从所述水溶液中取出3-HP。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括使用与水不混溶的溶剂以至少50％的产率从水溶液中取出3-HP。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括使用包含至少两种溶剂的有机液体以从水溶液中取出3-羟基丙酸(3-HP)。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括使用液体从水溶液中取出3-HP，其中该液体包括两种不同的溶剂(例如，与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂)。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括从水溶液中去除3-HP，其中水溶液的pH为至少约3。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括使3-HP在小于约一个大气压的压力下反应以形成丙烯酸。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括使3-HP反应以在反应混合物中形成丙烯酸，以及从反应混合物中取出气态丙烯酸。
在另一方面，本公开提供了一种方法，其包括使包含3-HP的液体反应以形成丙烯酸。
在另一方面，本公开提供了一种方法，该方法包括使3-HP反应以至少约70％的产率形成丙烯酸。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本公开的方法和材料。也可以使用本领域已知的其他合适方法和材料。这些材料、方法和示例仅是说明性的，而无意于限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用全文并入本文。在有冲突的情况下，以本公开(包括定义)为准。
根据以下详细描述和附图以及权利要求，本公开的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1A-B是显示在脱氮假单胞菌的3-羟基丙酸降解途径中由LysR型转录激活蛋白MmsR调节基因表达的示意图。(图1A)基于MmsR的调控的假想示意图。hpdH，3-羟基丙酸脱氢酶；mmsA，丙二酸甲酯半醛脱氢酶；hbdH-4，3-羟基异丁酸脱氢酶IV。(图1B)在多种诱导剂分子存在下mmsA(灰色条)和hbdH-4(黑色条)的相对mRNA丰度。
图2A-B是显示通过实时PCR在野生型(WT)和突变的脱氮假单胞菌菌株中mmsA(白条)和hbdH-4(黑条)基因的转录分析的图。(图2A)缺乏3-HP降解酶的缺失突变体脱氮假单胞菌ΔhpdHΔhbdH4ΔhbdH1(称为ΔΔΔ)中的mRNA水平。(图2B)在转录激活子MmsR缺失和互补时的mRNA水平。ΔmmsR，脱氮假单胞菌mmsR缺失突变体；和mmsR-C，具有来自质粒的mmsR-互补的脱氮假单胞菌ΔmmsR。
图3A-B是具有启动子区的mmsR-mmsA基因间区的示意图，并鉴定了调节蛋白，MmsA结合位点。(图3A)mmsR-mmsA基因间区的DNA序列和启动子区中的突变，用于体内和体外表征。(图3A)PmmsA(图3B)MmsA结合位点(O1和O2)的5'端作图。
图4A-B是显示体内研究以揭示O1和O2位点对于mmsR启动子(PmmsR)(图4A)和mmsA启动子(PmmsA)(图4B)中转录激活的重要性的示意图和图表。将O1或/和O2位点随机化，并使用GFP作为报告蛋白检查在O1或/和O2位点内具有突变的启动子强度。这些突变被引入脱氮假单胞菌ΔhpdHΔhbdH1ΔhbdH4ΔmmsR，并用作表达宿主。
图5A-E是SDS-PAGE分析的照片，借助于各种伴侣质粒例如pG-KJE8(图5A)、pGro7(图5B)、pKJE7(图5C)、pG-Tf2(图5D)和pTf16(图5E)在重组大肠杆菌BL21中研究重组带C-His-标签的MmsR蛋白的溶解度。分析了具有MmsR和分子伴侣的重组菌株的细胞裂解物(T)和无细胞提取物(S)。
图6A-C是显示重组MmsR蛋白的表达，纯化和寡聚形式的凝胶图片。在N-或C-末端带有his标签的重组MmsR的(图6A)SDS-PAGE，(图6B)蓝色天然-PAGE和(图6C)相对mRNA水平。泳道1，宿主大肠杆菌BL21(无细胞提取物)；泳道2，未经IPTG诱导培养的重组大肠杆菌BL21(无细胞提取物)；泳道3、4、5和7分别对应于重组大肠杆菌BL21的无细胞提取物，可溶级分，不可溶级分和纯化蛋白；泳道9、11和13分别对应于65、220、550nM的纯化的MmsR蛋白。
图7A-B是用于研究MmsR蛋白与操作子位点结合的体外电动迁移率测定法(EMSA)的图片。包含mmsA启动子(PmmsA)的DNA片段是完整的(F12)，或在O2位点(F12M)或O1位点(F1M2)中突变。在3-HP(25mM)不存在(上图)和存在(下图)的情况下进行实验。泳道1-10，增加量的MmsR蛋白0、0.36、0.73、1.45、2.9、5.8、11.6、14.5和24.2nM；并且DNA片段固定在0.4nM(图7A)，来自具有增加量的MmsR的反应的电泳图(图7B)。MmsR保护操作子区域不受DNase I消化的影响。底部是标度，给出相对于MmsR转录起始位点的核苷酸位置。
图8是在低DNA浓度下电泳迁移率变动分析的图片，以估计MmsR和PmmsA启动子之间的解离常数。(F12)具有完整的操作子O1和O2的DNA片段，(F12M)带有突变的O2操作子，以及(F1M2)带有突变的O1操作子。
图9是显示MmsR蛋白-DNA结合等温曲线和结合解离常数的图和表。使用含有完整启动子序列(F12)或突变序列的DNA片段。
图10A-B是hpdR-hpdH基因间区域的分析的示意图。(图10A)hpdR-hpdH基因间区的DNA序列，显示推定的启动子和操纵子区。(图10B)操作子回文位点的共有序列。
图11A-B是显示hpdR和hpdH的相对转录的图。(图11A)HpdR是控制hpdH表达的转录因子，(图11B)在两个3-HP诱导系统HpdR和MmsR之间没有串扰。
图12A-D是显示在各种酸存在下hpdH转录和GFP荧光的相对诱导性的图。(图12A)在染色体水平上的转录，(图12B)在质粒水平上的GFP荧光，(图12C)在不同时间间隔的GFP荧光，以及(图12D)在各种3-HP浓度下的灵敏度。
图13A-B是显示PC3 3-HP诱导型启动子突变随机化的位置的示意图，以及显示各种启动子的标准化GFP水平的图。
图14A-B是一组图，显示了在质粒和基因组水平上mmsA和kgsA转录和酶活性的比较。(图14A)mRNA(转录)和(图14B)KgsA活性的比较。
图15A-C是显示如何将MmsR操纵子位点随机化应用于KgsA过表达的一组示意图。(图15A)操纵子诱变的示意图，(图15B)kgsA mRNA表达水平，(图15C)具有选择的操纵子突变PmmsA2a的GFP荧光。
图16A-B是一组图，显示了MmsR过表达对具有各种组成性合成启动子的KgsA转录的影响，(图16A)Pzwf启动子文库，(图16B)KgsA转录。
图17A-D是显示天然MmsA蛋白融合对KgsA的表达和酶活性的影响的一组图。对应于5、10、15和20个氨基酸长的各种长度的mmsA N末端序列(分别命名为Hyb-5，Hyb-10，Hyb-15和Hyb-20)与kgsA 5'-末端DNA序列连接。(图17A)KgsA的酶活性。(图17B)表达融合蛋白的粗细胞提取物的SDS-PAGE分析。还测量了转录物的稳定性(图17C和17D)。
图18A-C是一组示意图和图表，其显示了串联启动子在mRNA和酶活性水平对kgsA表达的影响。(图18A)串联启动子及其转录物的排列；TSS，转录起始位点；RBS，核糖体结合位点；UTR，5'-非翻译区，(图18B)mRNA表达和(图18C)KgsA活性。
图19A-C是显示5’UTR对kgsA表达的影响的表和图。(图19A)预测kgsA表达系统的5’UTR强度。(图19B)UTR构建体的KgsA比活性，在0、0.25和25mM 3-HP下不同诱导。(图19C)在不同的3-HP浓度下，5’UTR强度的理论预测值和实验测量值之间的比较。
图20A-B是通过hbdH-4将3-HP降解为丙二酸半醛，并且通过mmsA进一步降解为乙酰-CoA的示意图(图20A)，以及mmsR-mmsA基因间区域的遗传结构及其调控的示意图(图20B)。
图21A-B是显示针对KgsA的前10个密码子最优化的菌株的KgsA表达水平的酶活性(图21A)和SDS-PAGE(图21B)分析的图和图像。就密码子频率水平(高，中和低)而言开发了三种不同的构建体，分别命名为Opt-1，Opt-2和Opt-3。
图22是一组SDS-PAGE图像，显示了UTR设计对KgsA表达的影响。测试了UTR设计者电脑预测具有各种强度的UTR。
图23是脱氮假单胞菌中维生素B12(辅酶B12)基因簇和核糖开关的示意图。
图24是显示来自各种假单胞菌属物种的辅酶B12基因的组织的比较性分析的示意图。
图25A-D是显示维生素B12核糖开关的结构的示意图。图25A示出了cobG之前的RS1的结构。图25B示出了在cobW前面的RS2的结构。图25C示出了cbtB前面的RS3的结构。图25D示出了btuB前面的RS4的结构。
图26是显示脱氮假单胞菌中染色体水平的cob基因转录的图。
图27是一组图表，描述了脱氮假单胞菌中维生素B12基因间区域的体内特征。
图28是表示B12浓度与来自脱氮假单胞菌的基因cobG和cbtB的基因间区域的维生素B12核糖感受器的GFP荧光的相关性的图。
图29A-B是一组图，(图29A)显示基因必需性概况，其揭示了仅编码bgpM的基因对于辅酶B12生物合成是必需的。使用不同浓度的氯化钴来了解cob基因簇中几个未表征或了解较少的基因的必要性。(图29B)使用鼠伤寒沙门氏菌metE-cbiB-和基于B12核糖开关的生物感受器来定量辅酶B12的浓度。
图30A-B是显示dhaB-gdrAB表达盒的开发的一组示意图。(图30A)表达盒构建的示意图，(图30B)将kgsA基因整合到ΔmmsA突变株中hbdH-4基因的位点中。
图31A-B是显示用于开发DhaB-GdrAB表达系统(图31A)的转录和翻译修饰的组合的示意图，以及用于整合的DhaB-GdrAB(DhaB)表达系统在染色体中的示意图(图31B)。
图32是一组动画片，其显示基因组位置对KgsA表达的影响(例如，染色体整合后kgsA基因的位置和KgsA的活性(P2-0，P2-10，P2-20，P2-30；没有DhaB质粒的菌株)。数字表示用25mM 3-HP诱导后4小时的KgsA活性。
图33是一组动画片，其显示了DhaB表达盒的基因组整合到P2-20菌株的染色体中以产生P4-1，或整合到P2-10中以产生P4-2。随后削弱P4-1和P4-2中DhaB-GdrAB表达盒的启动子(DhaB降低)，以产生菌株P4-3和P4-4。
图34是示出用于3-HPA通道化的菌株开发的示意图(P4-5)。P4-5在DhaB附近有一个拷贝的KgsA。
图35是显示各种中和碱对3-HP生产的影响的图。
图36是显示在补充有各种3-HP浓度的培养基中重组菌株的修饰的图。
图37是显示3-HP修饰的重组菌株(80g/L)在补充有50g/L浓度的各种有机酸的培养基中的生长的图。
图38是显示在不同pH的培养基中培养3-HP修饰的重组菌株(80g/L)的图。
图39是显示3-HP(80g/L)耐受性重组菌株的修饰以提高在较高pH下的比生长速率的图。
图40是显示在不同pH下培养适应pH 7.6的3-HP(80g/L)耐受性重组菌株的图。
图41是从甘油适应重组菌株的3-HP合成途径的示意图。第一种酶对氧敏感，而第二种反应在氧的存在下得到增强。
图42是显示不同溶解氧浓度对3-HP产生的影响的图。
图43是示出不同温度对3-HP生产的影响的图。
图44是显示不同诱导OD600对3-HP产生的影响的图。
图45是显示各种浓度的NH4OH对3-HP产生和比生长速率的影响的图。
图46是显示NH4OH(％)对相对3-HP效价(％)和量(％)的影响的图。
图47是说明中心碳代谢中的回补反应(anapleurotic reactions)的示意图。PPC，PEP羧化酶；PEPK，PEP羧激酶，ME，苹果酸酶；和PC，丙酮酸羧化酶。
图48是说明各种中和剂对3-HP产生(％)的影响的图。
图49是说明各种浓度的NH4HCO3对3-HP效价和量(％)的影响的图。
图50是显示通过顺序破坏B12核糖开关、启动子替换并最终通过使用串联启动子来提高辅酶B12生产并由此将3-HP生产提高到商业水平的效果的图。
图51是示出底物通道化对3-HP生产的影响的图。
图52是显示各种中和剂如NH4OH和NaOH对3-HP(％)产生的影响的图。在其中一种条件下，将NH4OH用作中和剂直到发酵的24小时，然后用NaOH直至发酵的48小时。
图53是在生物反应器的不同阶段的甘油脱水酶(DhaB)和KgsA体外酶活性。
图54是显示各种毒性中间体对甘油脱水酶(DhaB)体外酶活性的影响的图。
图55A-B显示了3-HP诱导型串联启动子文库的开发，该文库用于以各种表达水平进行DhaB的控制表达。(图55A)串联启动子构建的示意图，(图55B)各种串联启动子文库构建体的比DhaB活性。
图56是说明PC3启动子区的序列的示意图。
图57是显示天然和合成组成型启动子在脱氮假单胞菌中的作用的图。
图58示出了使用密度小于水的与水不混溶的溶剂从水溶液中提取3-HP的一种示例性系统。
图59示出了使用比水致密的与水不混溶的溶剂从水溶液中提取3-HP的一种示例性系统。
图60示出了通过反应性蒸馏从3-HP生产丙烯酸的示例性系统。
图61是说明使用乙酸乙酯从去细胞化发酵中提取3-HP期间溶剂容器中3-HP浓度的增加的示例性线图。
详细说明
本公开内容提供了具有增强的从甘油生产3-HP或其盐的表达系统的工业微生物菌株(包括，例如假单胞菌菌株)。涉及3-HP或其盐的生产的酶及其调节区被整合到工业菌株的染色体中。鉴定、表征了3-HP诱导型启动子，并将其与参与3-HP或其盐生产的酶可操作地连接。通过将3-HP诱导型启动子与组成型、诱导型和/或合成启动子组合，从而建立串联启动子系统，可以提高3-HP酶的表达。串联启动子系统可以与UTR(天然的或合成的)和控制或增强表达以改善系统表达的其他调节域融合。串联启动子系统(例如，与UTR合并的串联启动子系统)也可以与编码高度表达的天然基因的起始氨基酸的序列(例如，编码多达二十个氨基酸的序列)融合。这些修饰可以增加参与3-HP生产(或其盐的生产)的酶的表达，在这种情况下为下游基因。此外，研究了这些表达系统在工业菌株染色体中的定位，并评估了对3-HP(或其盐)生产的影响。表达系统的设计定位可以避免有毒的3-HPA积累，并可以通过通道化增加3-HP的产量。
另外，本公开内容提供了无需外部补充辅酶B12(B12)即可在高效价下产生3-HP的工业菌株。鉴定和表征了控制B12生产途径中酶表达的调控区。去除许多这些调节区(包括例如二级结构)改善了B12酶的表达。本文所述的组成型或3-HP诱导型表达系统的整合可增加天然B12酶的表达并增加B12产生。这允许生产3-HP(或其盐)而无需外部添加B12。
本公开还提供了从水溶液中取出3-HP的方法。例如，可以通过溶剂萃取从水溶液中取出3-HP。本公开内容还提供了用于纯化3-HP的方法(例如，从水溶液中取出后)。此外，本公开内容还提供了由3-HP制备丙烯酸的方法(例如从水溶液中取出后，以及任选地纯化后)。此外，本公开提供了纯化丙烯酸的方法。
重组细菌生产3-羟基丙酸
本文所述的组合物和方法可用于使用重组微生物从碳源生产3-羟基丙酸(3-HP)(或其盐)。在某些情况下，碳源是甘油。甘油/二醇脱水酶(例如DhaB)通过涉及辅酶B12的反应将甘油转化为3-羟基丙醛(3-HPA)。然后，在需要NAD(P)(+)的反应中，通过醛脱氢酶(ALDH)(例如KgsA，EaldH，KaldH)将3-HPA转化为3-HPA。甘油向3-HP的转化涉及几个限速因素，这些因素可能会阻碍高效价下3-HP(或其盐)的产生。这些因素包括例如辅酶B12，途径中酶的复杂性质，NAD+再生以及3羟基丙醛(3-HPA)和3-HP对细胞的毒性。在该研究中，以高效价产生3-HP(或其盐)，例如足以使3-HP商业化的效价。
3-HP生产(或其盐的产生)过程中由于有毒中间体的积累而导致的酶活性损失对于生产高效价的3-HP(或其盐)是一个挑战性的问题。3-HPA是一种有毒中间体，在3-HP生产过程中累积。研究表明，将3-HP途径酶与3-HPA一起孵育时，酶活性呈剂量依赖性下降。已知醛通过分别靶向ε-氨基(NH3+)、巯基(-SH)和咪唑基与氨基酸残基如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸反应。3-HPA的积累会破坏蛋白质，包括例如甘油脱水酶或二醇脱水酶，后者是甘油向3-HPA合成的途径中负责3-HPA合成的酶。3-HPA使甘油或二醇脱水酶失活导致3-HP(或其盐)生成减少，且效价低。克服毒性中间体使酶失活的潜在方法尤其包括开发对3-HPA毒性具有高度抗性的酶或连续合成新酶。本文所述的组合物和方法可减少由甘油产生的3-HP过程中毒性中间体(例如3-HPA)的积累，从而增加了重组细菌可产生的3-HP或其盐的量。
在一些实施方案中，如本文所述的重组微生物可以表达编码催化从碳源产生3-HP或其盐的酶的一种或多种基因，例如编码甘油脱水酶、二醇脱水酶和/或醛脱氢酶的一种或多种基因。在一些实施方案中，参与化合物合成的蛋白质可以是催化从碳源产生所述化合物的一种或多种酶。参与3-HP或其盐合成的蛋白质可以是例如构成甘油脱水酶、二醇脱水酶和/或醛脱氢酶中的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，碳源是甘油，但是可以使用其他碳源，例如葡萄糖、谷氨酸盐、葡萄糖酸盐和柠檬酸。重组生物可以表达甘油脱水酶(例如，DhaB)或二醇脱水酶，其将甘油催化成3-羟基丙醛(3-HPA)。DhaB是具有三个亚基的复合酶，编码复合的甘油/二醇脱水酶(dhaBCD)。DhaB与辅酶B12复合。在其催化活性(将甘油转化为3-HPA)中，辅酶B12受到破坏，该受损的辅酶B12将被另一种酶甘油脱水酶再激活因子(GdrAB)或二醇脱水酶再激活因子替换为新的活性辅酶B12。GdrAB是具有两个亚基GdrA和GdrB的复合酶。所述重组生物还可以表达编码醛脱氢酶(ALDH)的基因，然后将3-HPA催化为3-HP。这种催化作用涉及NAD(P)(+)。醛脱氢酶(ALDH酶)的表达可以包括kgsA基因的表达。因此，在一些实施方案中，所述重组微生物表达DhaB酶和ALDH酶，其中DhaB酶将甘油催化成3-HPA，然后ALDH酶将3-HPA转化成3-HP。
本文所述的重组微生物可以是细菌或真菌。在一些实施方案中，所述重组微生物是细菌。所述重组细菌可以是能够在培养条件下，例如在生物处理器或生物反应器中，从碳源产生3-HP的任何基因工程细菌。在一些实施方案中，细菌在有氧条件下生长。在一些实施方案中，细菌在厌氧条件下生长。在一些实施方案中，细菌的基因组天然含有可用于从碳源例如甘油产生3-HP的基因，例如编码甘油脱水酶或二醇脱水酶(例如DhaB)和/或醛脱氢酶(例如ksgA)的基因。在一些实施方案中，所述细菌的基因组并不天然地包含可用于从碳源例如甘油产生3-HP的基因。在一些实施方案中，可以将天然不包含或不表达用于从甘油生产3-HP的基因的细菌进行基因修饰以表达至少一个用于生产3-HP的基因。例如，可以对不表达甘油脱水酶(DhaB)、二醇脱水酶和/或醛脱氢酶(ALDH)的细菌进行基因改造以表达DhaB和/或ALDH。
在一些实施方案中，所述重组细菌是假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，克雷伯菌属(Klebsiella)菌株或埃希氏菌属(Escherichia)菌株。在一些实施方案中，所述重组细菌是脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)或大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的菌株。在一些实施方案中，所述重组细菌是脱氮假单胞菌的菌株。脱氮假单胞菌是一种需氧微生物，可以天然地合成辅因子辅酶B12。辅酶B12是从甘油生产3-HP的重要辅因子。此外，脱氮假单胞菌可以有效地再生NAD+。NAD+再生对于不间断生产3-HP非常重要。因此，推定脱氮假单胞菌是用于3-HP生产(或其盐的生产)的合适微生物。
在一些实施方案中，所述重组细菌表达来自肠杆菌属(Enterobacter)细菌(例如，克雷伯菌属(Klebsiella)或沙门氏菌属(Salmonella)或柠檬酸杆菌属(Citrobacter))或乳杆菌属(Lactobacillus)细菌或丙酸杆菌属(Propionibacterium)、变形杆菌属(Proteus)或沙雷氏菌属(Serratia)或梭菌属(Clostridium)的至少一种甘油脱水酶和/或二醇脱水酶，例如来自肠杆菌属(例如克雷伯菌，沙门氏菌或柠檬酸杆菌)或乳酸杆菌或丙酸杆菌或变形杆菌或沙雷氏菌或梭菌属的种的至少一种甘油脱水酶(例如DhaB)。在一些实施方案中，所述重组细菌表达两种或更多种甘油脱水酶(例如，DhaB)和/或二醇脱水酶，其中每种脱水酶(例如，DhaB)可以来自不同的肠杆菌属(例如，克雷伯氏菌，或沙门氏菌或柠檬酸杆菌)或乳酸杆菌属或丙酸杆菌属或变形杆菌属或沙雷氏菌属或梭菌属的种。在一些实施方案中，所述重组细菌表达来自肠杆菌属细菌(例如克雷伯菌、沙门氏菌或柠檬酸杆菌)或乳杆菌或丙酸杆菌或变形杆菌或沙雷氏菌或梭菌属的种的至少一种醛脱氢酶(ALDH)，例如至少一种ALDH酶。在一些实施方案中，所述重组细菌表达两种或更多种ALDH酶，其中每种ALDH酶可以来自不同的肠杆菌属或乳杆菌属菌株。在一些实施方案中，所述重组细菌表达来自肠杆菌属细菌(例如克雷伯菌或沙门氏菌)或乳杆菌的至少一种甘油脱水酶(例如，DhaB)和/或来自肠杆菌属细菌(例如克雷伯菌或沙门氏菌)或乳杆菌属细菌的二醇脱水酶，以及来自肠杆菌细菌(例如克雷伯菌或沙门氏菌)或乳杆菌属细菌的至少一种醛脱氢酶(ALDH)酶。
在一些实施方案中，所述重组细菌表达来自细菌的编码至少一种甘油脱水酶和/或二醇脱水酶的至少一种基因，例如在肺炎克雷伯氏菌的情况下为来自肺炎克雷伯氏菌的dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA和/或gdrB。在一些实施方案中，所述重组细菌表达编码来自巴西固氮螺菌(Azospirullum brasilense)的至少一种醛脱氢酶的至少一种基因，例如来自巴西固氮螺菌的kgsA。在一些实施方案中，所述重组细菌表达编码来自肺炎克雷伯氏菌的至少一种甘油脱水酶的至少一种基因，例如来自肺炎克雷伯氏菌的dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA和/或gdrB，或编码至少一种二醇脱水酶的至少一种基因，以及编码来自巴西固氮螺菌的至少一种醛脱氢酶的至少一种基因，例如来自巴西固氮螺菌的kgsA。在一些实施方案中，所述重组细菌是表达编码来自肺炎克雷伯氏菌的至少一种甘油脱水酶和/或二醇脱水酶的至少一种基因(例如来自克雷伯氏菌的dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA和/或gdrB)以及编码来自巴西固氮螺菌的至少一种醛脱氢酶的至少一种基因(例如来自巴西固氮螺菌的kgsA)的脱氮假单胞菌菌株。
在一些实施方案中，所述重组细菌具有包含来自肠杆菌属细菌(例如克雷伯氏菌或沙门氏菌)或乳酸杆菌属细菌的至少一个甘油脱水酶基因和/或二醇脱水酶基因(例如DhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA和/或gdrB基因)的至少一种核酸，例如来自肺炎克雷伯氏菌的至少一个甘油/二醇脱水酶基因(例如dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA和/或gdrB基因)。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有来自肠杆菌属细菌(例如克雷伯氏菌或沙门氏菌)或乳酸杆菌属细菌的至少两个甘油脱水酶基因和/或二醇脱水酶基因(例如dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA和/或gdrB基因中的两个或更多个)的至少一种核酸，例如来自肺炎克雷伯氏菌的至少两个甘油脱水酶基因(例如dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA和/或gdrB基因中的两个或更多个)或二醇脱水酶基因。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有来自固氮螺菌属细菌的至少一个醛脱氢酶基因(kgsA基因)(例如来自巴西固氮螺菌菌株的至少一个醛脱氢酶基因(kgsA基因))的至少一种核酸。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有来自固氮螺菌属细菌的至少两个醛脱氢酶基因(kgsA基因)(例如来自巴西固氮螺菌菌株的至少两个醛脱氢酶基因(kgsA基因))的至少一种核酸。在一些实施方案中，所述重组细菌具有包含来自肠杆菌属细菌(例如克雷伯氏菌或沙门氏菌)或乳酸杆菌属细菌的至少一个甘油脱水酶基因和/或二醇脱水酶基因(例如，DhaB1，dhaB2，dhaB3，gdrA和/或gdrB基因)(例如来自肺炎克雷伯氏菌的至少一个甘油脱水酶基因，例如dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA和/或gdrB基因)的至少一种核酸，以及包含来自固氮螺菌属细菌的至少一个醛脱氢酶基因(kgsA基因)(例如来自巴西固氮螺菌菌株的至少一个醛脱氢酶基因(kgsA基因))的至少一种核酸。
dhaB1w SEQ ID NO:1
ATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTACTGGCCCAGCGCCCCGTCAATCAGGACGGGCTGATTGGCGAGTGGCCTGAAGAGGGGCTGATCGCCATGGACAGCCCCTTTGACCCGGTCTCTTCAGTAAAAGTGGACAACGGTCTGATCGTCGAGCTGGACGGCAAACGCCGGGACCAGTTTGACATGATCGACCGATTTATCGCCGATTACGCGATCAACGTTGAGCGCACAGAGCAGGCAATGCGCCTGGAGGCGGTGGAAATAGCCCGCATGCTGGTGGATATTCACGTCAGTCGGGAGGAGATCATTGCCATCACTACCGCCATCACGCCGGCCAAAGCGGTCGAGGTGATGGCGCAGATGAACGTGGTGGAGATGATGATGGCGCTGCAGAAGATGCGTGCCCGCCGGACCCCCTCCAACCAGTGCCACGTCACCAATCTCAAAGATAATCCGGTGCAGATTGCTGCTGACGCCGCCGAGGCCGGGATCCGCGGCTTCTCAGAACAGGAGACCACGGTCGGTATCGCGCGCTATGCGCCGTTTAACGCCCTGGCGCTGTTGGTCGGTTCGCAGTGCGGCCGCCCCGGCGTTTTGACGCAGTGCTCGGTGGAAGAGGCCACCGAGCTGGAGCTGGGCATGCGTGGCTTAACCAGCTACGCCGAGACGGTGTCGGTCTACGGCACCGAAGCGGTATTTACCGACGGCGATGATACTCCGTGGTCAAAGGCGTTCCTCGCCTCGGCCTACGCCTCCCGCGGGTTGAAAATGCGCTACACCTCCGGCACCGGATCCGAAGCGCTGATGGGCTATTCGGAGAGCAAGTCGATGCTCTACCTCGAATCGCGCTGCATCTTCATTACCAAAGGCGCCGGGGTTCAGGGGCTGCAAAACGGCGCGGTGAGCTGTATCGGCATGACCGGCGCTGTGCCGTCGGGCATTCGGGCGGTGCTGGCGGAAAACCTGATCGCCTCTATGCTCGACCTCGAAGTGGCGTCCGCCAACGACCAGACTTTCTCCCACTCGGATATTCGCCGCACCGCGCGCACCCTGATGCAGATGCTGCCGGGCACCGACTTTATTTTCTCCGGCTACAGCGCGGTGCCGAACTACGACAACATGTTCGCCGGCTCGAACTTCGATGCGGAAGATTTTGATGATTACAACATCCTGCAGCGTGACCTGATGGTTGACGGCGGCCTGCGTCCGGTGACCGAGGCGGAAACCATTGCCATTCGCCAGAAAGCGGCGCGGGCGATCCAGGCGGTTTTCCGCGAGCTGGGGCTGCCGCCAATCGCCGACGAGGAGGTGGAGGCCGCCACCTACGCGCACGGTAGCAACGAGATGCCGCCGCGTAACGTGGTGGAGGATCTGAGTGCGGTGGAAGAGATGATGAAGCGCAACATCACCGGCCTCGATATTGTCGGCGCGCTGAGCCGCAGCGGCTTTGAGGATATCGCCAGCAATATTCTCAATATGCTGCGCCAGCGGGTCACCGGCGATTACCTGCAGACCTCGGCCATTCTCGATCGGCAGTTCGAGGTGGTGAGTGCGGTCAACGACATCAATGACTATCAGGGGCCGGGCACCGGCTATCGCATCTCTGCCGAACGCTGGGCGGAGATCAAAAATATTCCGGGCGTGGTTCAGCCCGACACCATTGAATAA
DhaB1 SEQ ID NO:77
MKRSKRFAVLAQRPVNQDGLIGEWPEEGLIAMDSPFDPVSSVKVDNGLIVELDGKRRDQFDMIDRFIADYAINVERTEQAMRLEAVEIARMLVDIHVSREEIIAITTAITPAKAVEVMAQMNVVEMMMALQKMRARRTPSNQCHVTNLKDNPVQIAADAAEAGIRGFSEQETTVGIARYAPFNALALLVGSQCGRPGVLTQCSVEEATELELGMRGLTSYAETVSVYGTEAVFTDGDDTPWSKAFLASAYASRGLKMRYTSGTGSEALMGYSESKSMLYLESRCIFITKGAGVQGLQNGAVSCIGMTGAVPSGIRAVLAENLIASMLDLEVASANDQTFSHSDIRRTARTLMQMLPGTDFIFSGYSAVPNYDNMFAGSNFDAEDFDDYNILQRDLMVDGGLRPVTEAETIAIRQKAARAIQAVFRELGLPPIADEEVEAATYAHGSNEMPPRNVVEDLSAVEEMMKRNITGLDIVGALSRSGFEDIASNILNMLRQRVTGDYLQTSAILDRQFEVVSAVNDINDYQGPGTGYRISAERWAEIKNIPGVVQPDTIE
dhaB2 SEQ ID NO:2
ATGCAACAGACAACCCAAATTCAGCCCTCTTTTACCCTGAAAACCCGCGAGGGCGGGGTAGCTTCTGCCGATGAACGCGCCGATGAAGTGGTGATCGGCGTCGGCCCTGCCTTCGATAAACACCAGCATCACACTCTGATCGATATGCCCCATGGCGCGATCCTCAAAGAGCTGATTGCCGGGGTGGAAGAAGAGGGGCTTCACGCCCGGGTGGTGCGCATTCTGCGCACGTCCGACGTCTCCTTTATGGCCTGGGATGCGGCCAACCTGAGCGGCTCGGGGATCGGCATCGGTATCCAGTCGAAGGGGACCACGGTCATCCATCAGCGCGATCTGCTGCCGCTCAGCAACCTGGAGCTGTTCTCCCAGGCGCCGCTGCTGACGCTGGAAACCTACCGGCAGATTGGCAAAAACGCCGCGCGCTATGCGCGCAAAGAGTCACCTTCGCCGGTGCCGGTGGTGAACGATCAGATGGTGCGGCCGAAATTTATGGCCAAAGCCGCGCTATTTCATATCAAAGAGACCAAACATGTGGTGCAGGACGCCGAGCCCGTCACCCTGCACGTCGACTTAGTTAGGGAGTAA
DhaB2 SEQ ID NO:78
MQQTTQIQPSFTLKTREGGVASADERADEVVIGVGPAFDKHQHHTLIDMPHGAILKELIAGVEEEGLHARVVRILRTSDVSFMAWDAANLSGSGIGIGIQSKGTTVIHQRDLLPLSNLELFSQAPLLTLETYRQIGKNAARYARKESPSPVPVVNDQMVRPKFMAKAALFHIKETKHVVQDAEPVTLHVDLVRE
dhaB3 SEQ ID NO:3
ATGAGCGAGAAAACCATGCGCGTGCAGGATTATCCGTTAGCCACCCGCTGCCCGGAGCATATCCTGACGCCTACCGGCAAACCATTGACCGATATTACCCTCGAGAAGGTGCTCTCTGGCGAGGTGGGCCCGCAGGATGTGCGGATCTCCTGCCAGACCCTTGAGTACCAGGCGCAGATTGCCGAGCAGATGCAGCGCCATGCGGTGGCGCGCAATTTCCGCCGCGCGGCGGAGCTTATCGCCATTCCTGACGAGCGCATTCTGGCTATCTATAACGCGCTGCGCCCGTTCCGCTCCTCGCAGGCGGAGCTGCTGGCGATCGCCGACGAGCTGGAGCACACCTGGCATGCGACAGTGAATGCCGCCTTTGTCCGGGAGTCGGCGGAAGTGTATCAGCAGCGGCATAAGCTGCGTAAAGGAAGCTAA
DhaB3 SEQ ID NO:79
MSEKTMRVQDYPLATRCPEHILTPTGKPLTDITLEKVLSGEVGPQDVRISCQTLEYQAQIAEQMQRHAVARNFRRAAELIAIPDERILAIYNALRPFRSSQAELLAIADELEHTWHATVNAAFVRESAEVYQQRHKLRKGS
gdrA SEQ ID NO:4
ATGCCGTTAATAGCCGGGATTGATATCGGCAACGCCACCACCGAGGTGGCGCTGGCGTCCGACGACCCGCAGGCGAGGGCGTTTGTTGCCAGCGGGATCGTCGCGACGACGGGCATGAAAGGGACGCGGGACAATATCGCCGGGACCCTCGCCGCGCTGGAGCAGGCCCTGGCGAAAACACCGTGGTCGATGAGCGATGTCTCTCGCATCTATCTTAACGAAGCCGCGCCGGTGATTGGCGATGTGGCGATGGAGACCATCACCGAGACCATTATCACCGAATCGACCATGATCGGTCATAACCCGCAGACGCCGGGCGGGGTGGGCGTTGGCGTGGGGACGACTATCGCCCTCGGGCGGCTGGCGACGCTGCCGGCGGCGCAGTATGCCGAGGGGTGGATCGTACTGATTGACGACGCCGTCGATTTCCTTGACGCCGTGTGGTGGCTCAATGAGGCGCTCGACCGGGGGATCAACGTGGTGGCGGCGATCCTCAAAAAGGACGACGGCGTGCTGGTGAACAACCGCCTGCGTAAAACCCTGCCGGTGGTAGATGAAGTGACGCTGCTGGAGCAGGTCCCCGAGGGGGTAATGGCGGCGGTGGAAGTGGCCGCGCCGGGCCAGGTGGTGCGGATCCTGTCGAATCCCTACGGGATCGCCACCTTCTTCGGGCTAAGCCCGGAAGAGACCCAGGCCATCGTCCCCATCGCCCGCGCCCTGATTGGCAACCGTTCAGCGGTGGTGCTCAAGACCCCGCAGGGGGATGTGCAGTCGCGGGTGATCCCGGCGGGCAACCTCTACATTAGCGGCGAAAAGCGCCGCGGAGAGGCCGATGTCGCCGAGGGCGCGGAAGCCATCATGCAGGCGATGAGCGCCTGCGCTCCGGTACGCGACATCCGCGGCGAACCGGGCACTCACGCCGGCGGCATGCTTGAGCGGGTGCGCAAGGTAATGGCGTCCCTGACCGACCATGAGATGAGCGCGATATACATCCAGGATCTGCTGGCGGTGGATACGTTTATTCCGCGCAAGGTGCAGGGCGGGATGGCCGGCGAGTGCGCCATGGAAAATGCCGTCGGGATGGCGGCGATGGTGAAAGCGGATCGTCTGCAAATGCAGGTTATCGCCCGCGAACTGAGCGCCCGACTGCAGACCGAGGTGGTGGTGGGCGGCGTGGAGGCCAACATGGCCATCGCCGGGGCGTTAACCACTCCCGGCTGTGCGGCGCCGCTGGCGATCCTCGACCTCGGCGCCGGCTCGACGGATGCGGCGATCGTCAACGCGGAGGGGCAGATAACGGCGGTCCATCTCGCCGGGGCGGGGAATATGGTCAGCCTGTTGATTAAAACCGAGCTGGGCCTCGAGGATCTTTCGCTGGCGGAAGCGATAAAAAAATACCCGCTGGCCAAAGTGGAAAGCCTGTTCAGTATTCGTCACGAGAATGGCGCGGTGGAGTTCTTTCGGGAAGCCCTCAGCCCGGCGGTGTTCGCCAAAGTGGTGTACATCAAGGAGGGCGAACTGGTGCCGATCGATAACGCCAGCCCGCTGGAAAAAATTCGTCTCGTGCGCCGGCAGGCGAAAGAGAAAGTGTTTGTCACCAACTGCCTGCGCGCGCTGCGCCAGGTCTCACCCGGCGGTTCCATTCGCGATATCGCCTTTGTGGTGCTGGTGGGCGGCTCATCGCTGGACTTTGAGATCCCGCAGCTTATCACGGAAGCCTTGTCGCACTATGGCGTGGTCGCCGGGCAGGGCAATATTCGGGGAACAGAAGGGCCGCGCAATGCGGTCGCCACCGGGCTGCTACTGGCCGGTCAGGCGAATTAA
GdrA SEQ ID NO:80
MPLIAGIDIGNATTEVALASDDPQARAFVASGIVATTGMKGTRDNIAGTLAALEQALAKTPWSMSDVSRIYLNEAAPVIGDVAMETITETIITESTMIGHNPQTPGGVGVGVGTTIALGRLATLPAAQYAEGWIVLIDDAVDFLDAVWWLNEALDRGINVVAAILKKDDGVLVNNRLRKTLPVVDEVTLLEQVPEGVMAAVEVAAPGQVVRILSNPYGIATFFGLSPEETQAIVPIARALIGNRSAVVLKTPQGDVQSRVIPAGNLYISGEKRRGEADVAEGAEAIMQAMSACAPVRDIRGEPGTHAGGMLERVRKVMASLTDHEMSAIYIQDLLAVDTFIPRKVQGGMAGECAMENAVGMAAMVKADRLQMQVIARELSARLQTEVVVGGVEANMAIAGALTTPGCAAPLAILDLGAGSTDAAIVNAEGQITAVHLAGAGNMVSLLIKTELGLEDLSLAEAIKKYPLAKVESLFSIRHENGAVEFFREALSPAVFAKVVYIKEGELVPIDNASPLEKIRLVRRQAKEKVFVTNCLRALRQVSPGGSIRDIAFVVLVGGSSLDFEIPQLITEALSHYGVVAGQGNIRGTEGPRNAVATGLLLAGQAN
gdrB SEQ ID NO:5
ATGTCGCTTTCACCGCCAGGCGTACGCCTGTTTTACGATCCGCGCGGGCACCATGCCGGCGCCATCAATGAGCTGTGCTGGGGGCTGGAGGAGCAGGGGGTCCCCTGCCAGACCATAACCTATGACGGAGGCGGTGACGCCGCTGCGCTGGGCGCCCTGGCGGCCAGAAGCTCGCCCCTGCGGGTGGGTATTGGGCTCAGCGCGTCCGGCGAGATAGCCCTCACTCATGCCCAGCTGCCGGCGGACGCGCCGCTGGCTACCGGACACGTCACCGATAGCGACGATCATCTGCGTACGCTCGGCGCCAACGCCGGGCAGCTGGTTAAAGTCCTGCCGTTAAGTGAGAGAAACTGA
GdrB SEQ ID NO:81
MSLSPPGVRLFYDPRGHHAGAINELCWGLEEQGVPCQTITYDGGGDAAALGALAARSSPLRVGIGLSASGEIALTHAQLPADAPLATGHVTDSDDHLRTLGANAGQLVKVLPLSERN
kgsA SEQ ID NO:6
ATGAGAGGATCGGGATCCGCTAACGTGACTTATACGGATACGCAACTGCTGATCGACGGTGAGTGGGTCGACGCCGCGAGCGGCAAGACGATCGACGTCGTGAACCCGGCGACCGGCAAGCCGATCGGCAGGGTGGCCCATGCGGGCATCGCCGATCTCGACCGTGCGCTCGCCGCCGCGCAAAGCGGCTTCGAGGCATGGCGCAAGGTGCCCGCGCACGAGCGCGCGGCGACGATGCGCAAGGCGGCCGCGCTGGTGCGTGAACGCGCCGACGCGATCGCGCAGCTGATGACGCAGGAGCAGGGCAAGCCGCTCACCGAAGCGCGCGTCGAAGTGCTGTCGTCCGCGGACATCATCGAATGGTTCGCGGACGAAGGCCGCCGCGTGTACGGCCGGATCGTGCCGCCGCGCAACCTCGGCGCACAGCAGACGGTCGTGAAGGAGCCGGTCGGCCCGGTCGCCGCGTTCACGCCGTGGAATTTCCCGGTCAACCAGGTCGTGCGCAAGCTGAGCGCCGCGCTGGCAACCGGCTGTTCGTTCCTCGTGAAAGCGCCGGAAGAAACCCCCGCGTCGCCGGCCGCGCTGCTGCGCGCCTTCGTCGACGCAGGCGTGCCGGCCGGCGTGATCGGCCTCGTGTACGGCGATCCGGCCGAAATCTCGTCGTACCTGATCCCGCACCCGGTGATCCGCAAGGTCACGTTCACGGGTTCGACGCCGGTCGGCAAGCAGCTCGCCTCGCTGGCGGGCCTGCACATGAAGCGCGCGACGATGGAGCTGGGCGGGCACGCACCGGTGATCGTGGCCGAAGACGCCGACGTTGCGCTCGCGGTGGCAGCGGCCGGCGGCGCGAAGTTCCGCAACGCGGGGCAGGTCTGCATCTCGCCGACGCGCTTCCTCGTGCACAACAGCATCCGCGACGAATTCACGCGCGCGCTGGTCAAGCATGCCGAAGGGCTGAAGGTCGGCAACGGCCTCGAGGAAGGCACGACGCTCGGCGCGCTCGCGAACCCGCGCCGGCTGACCGCGATGGCGTCGGTCATCGACAACGCGCGCAAGGTCGGTGCGAGCATCGAAACCGGCGGCGAGCGGATCGGCTCGGAAGGCAACTTCTTCGCGCCGACCGTGATCGCGAACGTGCCGCTCGATGCGGACGTGTTCAACAACGAGCCGTTCGGCCCGGTCGCGGCGATTCGCGGTTTCGACAAGCTCGAAGAGGCGATCGCGGAAGCGAACCGTTTGCCGTTCGGTCTTGCCGGCTACGCGTTCACGCGTTCGTTCGCGAACGTGCACCTGCTCACGCAGCGCCTCGAAGTCGGGATGCTGTGGATCAACCAGCCGCCGACTACATGGCCGGAAATGCCGTTCGGCGGCGTGAAGGACTCGGGCTACGGTTCGGAAGGCGGCCCGGAAGCGCTCGAGCCGTACCTCGTCACGAAGTCGGTGACGGTAATGGCCGTCTGA
KgsA SEQ ID NO:82
MANVTYTDTQLLIDGEWVDAASGKTIDVVNPATGKPIGRVAHAGIADLDRALAAAQSGFEAWRKVPAHERAATMRKAAALVRERADAIAQLMTQEQGKPLTEARVEVLSAADIIEWFADEGRRVYGRIVPPRNLGAQQTVVKEPVGPVAAFTPWNFPVNQVVRKLSAALATGCSFLVKAPEETPASPAALLRAFVDAGVPAGVIGLVYGDPAEISSYLIPHPVIRKVTFTGSTPVGKQLASLAGLHMKRATMELGGHAPVIVAEDADVALAVKAAGGAKFRNAGQVCISPTRFLVHNSIRDEFTRALVKHAEGLKVGNGLEEGTTLGALANPRRLTAMASVIDNARKVGASIETGGERIGSEGNFFAPTVIANVPLDADVFNNEPFGPVAAIRGFDKLEEAIAEANRLPFGLAGYAFTRSFANVHLLTQRLEVGMLWINQPATPWPEMPFGGVKDSGYGSEGGPEALEPYLVTKSVTVMAV
在一些实施方案中，所述二醇脱水酶基因来自克雷伯氏菌属细菌，例如肺炎克雷伯氏菌。在一些实施方案中，所述二醇脱水酶来自肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种MGH78478。在一些实施方案中，所述二醇脱水酶基因可以是pduC、pduD、pduE、pduG和/或pduH中的一种或多种。在一些实施方案中，所述重组细菌表达至少一种二醇脱氢酶，包括例如PduC、PduD、PduE、PduG和/或PduH。
在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有选自SEQ ID NO：1-6或SEQ ID NO：83-87中的至少一个序列的至少一种核酸。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有选自SEQID NO：1-5中的至少一个序列的至少一种核酸。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有选自SEQ ID NO：83-87中的至少一个序列的至少一种核酸。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有SEQ ID NO：6的至少一种核酸。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有选自SEQ ID NO：1-5和/或SEQ ID NO：83-87中的至少一个序列的至少一种核酸，以及具有SEQID NO：6的另一种核酸。
在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有与SEQ ID NO：1-6和SEQ ID NO：83-87中的任一个至少80％相同的至少一个序列的至少一种核酸。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有与SEQ ID NO：1-6和SEQ ID NO：83-87中的任何一个至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的至少一个序列的至少一种核酸。在一些实施方案中，所述重组细菌包含具有与SEQ ID NO：1-6和SEQ ID NO：83-87中任一个的核酸序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个或30个或更多核苷酸的至少一个序列的至少一种核酸。
在一些实施方案中，所述重组细菌表达具有选自SEQ ID NO：77-82和88-92的氨基酸序列的至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述重组细菌表达与SEQ ID NO：77-82和88-92中的任一个至少80％相同的氨基酸序列的至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述重组细菌表达与SEQ ID NO：77-82和88-92中的任何一个至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述重组细菌表达与SEQ ID NO：77-82和88-92中任一个的氨基酸序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更多个氨基酸的氨基酸序列的至少一种蛋白质。
启动子
如本文所用，术语“启动子”是指含有用于表达可操作连接的基因的调节核酸序列的DNA序列。核心启动子包含启动子功能所必需的核苷酸序列，包括TATA框和转录起始位点。根据该定义，在没有特定序列例如可能增强活性或赋予组织特异性活性的情况下核心启动子可以具有或可以不具有可检测的活性。启动子可以是组成型的或诱导型的。组成型启动子在细胞生命中以恒定的速率控制基因的转录。诱导型启动子的活性根据特定诱导剂的存在(或不存在)，例如细胞外或环境因子的存在(或不存在)来确定。“3-HP诱导型启动子”是这样的启动子，其在带有这样的启动子的细胞暴露于3-HP(例如，带有3-HP启动子的细胞暴露于细胞培养基或生物反应器中存在的3-HP)后增加一个或多个可操作连接的基因的表达。在某些情况下，启动子包括一个或多个操作子位点。
本文所述的重组微生物在至少一种启动子的控制下表达用于从甘油生产3-HP(或其盐)的至少一种基因。在一些实施方案中，所述表达系统包括至少一个诱导型启动子，其响应刺激(即诱导剂，例如3-HP)而增加基因的表达。一旦所述刺激接触诱导型启动子，启动子就开启或上调所述基因的表达。在一些实施方案中，所述诱导型启动子由3-HP诱导。导致表达系统中至少一个诱导型启动子上调基因表达的刺激或诱导剂是3-HP。在一些实施方案中，在表达系统中通过至少一个诱导型启动子引起基因表达上调的刺激或诱导剂在化学和/或结构上类似于3-HP。在一些实施方案中，在表达系统中通过至少一个诱导型启动子引起基因表达上调的刺激或诱导剂是小分子，例如小的有机分子，例如酸或醇。在一些实施方案中，所述小分子在结构上类似于3-羟基丙酸(3-HP)或3-羟基丙醛(3-HPA)。3-HP是一种羧酸，其化学结构为C3H6O3，分子量为90.08。在一些实施方案中，在结构上类似于3-HP的小的各种酸或在L-缬氨酸降解途径和中心碳代谢中出现的中间体。在一些实施方案中，所述小分子酸或醇可以是但不限于L-乳酸(LAC)、乙酸(AcOH)、丙酸(PA)、3-羟基丁酸(3-HB)、1,3-丙二醇(1,3-PDO)、2,3-丁二醇(2,3-BDO)、L-缬氨酸(L-val)和3-羟基异丁酸(3-HIB)中的任何一种。在一些实施方案中，所述诱导型启动子可以由两种或更多种诱导剂诱导。
本文提出了可以被C3平台化学物质3-HP诱导的新型启动子。本公开报道了3-HP通过这些新的启动子激活/启动基因表达的机制。在我们的实验中，我们观察到当假单胞菌属菌株被提供了3-HP作为唯一碳源时，这些菌株会主动消耗3-HP并显示出生长。我们鉴定了几种酶，即推定的3-羟基异丁酸脱氢酶IV(HbdH-4)，3-羟基丙酸脱氢酶(HpdH)和/或甲基丙二酸半醛脱氢酶(methylmalonatesemialdehydedehydrogenase，MmsA)参与了3-HP降解。有趣的是，我们发现编码这些酶的基因的转录基本上以高水平上调，但仅在3-HP或类似的小酸存在下如此。对这些3-HP降解基因附近的基因排列的分析表明存在推定的转录调节蛋白，即相应的mmsA、hbdH-4或hpdH。这些转录调节蛋白与3-HP复合后会激活mmsA、hpdH和其他蛋白的转录。
本文所述启动子的可诱导性质及其高诱导效率使它们可用于表达用于3-HP合成的途径酶、开发用于3-HP响应的生物感受器和/或用于表达用于辅酶B12产生的途径酶。在这里，我们阐明了不同的3-HP诱导型基因调控系统。在细胞水平上，使用结构上与3-HP相似的各种酸或L-缬氨酸降解途径和中央碳代谢中出现的中间体研究了这些小分子诱导剂的特异性和/或谱。
使用这些启动子，产生了启动子文库，其中所述启动子可被小酸诱导并显示出不同的表达水平。该文库与其他天然或合成启动子结合使用以开发串联启动子系统。在这里，我们尝试通过组合小型酸诱导型系统和天然/合成启动子文库表达目标基因(例如3-HP合成途径基因)来模拟串联启动子系统。
在一些实施方案中，所述诱导型启动子由3-HP诱导。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是天然存在的启动子，例如在细菌例如假单胞菌属(Pseudomonas)细菌中驱动基因表达的启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是存在于细菌例如假单胞菌属细菌(例如脱氮假单胞菌)中的天然存在的3-HP诱导型启动子。在假单胞菌属细菌例如脱氮假单胞菌中，驱动3-HP降解相关蛋白表达的一些天然启动子又被3-HP上调，包括驱动3-羟基异丁酸脱氢酶I(HbdH-1)、3-羟基异丁酸脱氢酶IV(HbdH-4)、3-羟基丙酸脱氢酶(HpdH)和甲基丙二酸半醛脱氢酶(MmsA)表达的启动子。在一些实施方案中，本文所述的重组细菌表达用于在脱氮假单胞菌的mmsA基因(PmmsA启动子)、hpdH基因(PhpdH启动子)或hbdH-4基因(PhbdH-1启动子)的至少一个天然启动子的控制下从甘油产生3-HP的至少一个基因。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是合成启动子。
PhbdH-4启动子(SEQ ID NO：11)
GCCCCCGCCTACCCGCCCCAGCCACCCCGGACTCAGCAAGGATGCTGGCCCGGGCCTGGGCGGAGACGTCTTTCGCGCCCGACCATCAGAACAAGAGGACAACCCC
PhpdH启动子(SEQ ID NO：12)
TGTGGGAGCGGGCGTGCCCGCGAAGAGGCCAGCACAGACTTACCACTGTGCTAAAACGCACAGCGGCTGCGCGAAATCTCGTGTTTCCTCCACGAAATTACTCACTAAGATGGATCGGGACAAGAATAATAATCAGGCCCGAGGTTGCAC
PhpdH-1启动子(SEQ ID NO：13)
TGCGTAATGCCCCACCGTTCTGCCAGGCAACGCGAAACCTGTAGGAGCGGCCTTGTGTCGCGATGGGCTGCGCAGCAGCCCCGGCATTTTTTGCATCGATGCGGAGATCTGGGGCTGCTGCGCAGCCCATCGCGACACAAGGCCGCTCCTACAGGTTCCTGGCCCGCATGGGTAAAGTTCGAACCAGTCAGGAGTCATTG
PmmsA启动子(SEQ ID NO：14)
CCTCGAATGTGCAAAAACGCAGACCATACTTGCACATCACCGCATTGAGTACATCAAAAATGCACTGTTAGGATCGATCCAGACAACAAAAAAGCCACAGGCTGGGAGAATCCCG
在一些实施方案中，所述重组细菌表达用于在由SEQ ID NO：11-14中的任一个表示的至少一个启动子的控制下从甘油生产3-HP(或其盐)的至少一个基因。在一些实施方案中，所述重组细菌在由SEQ ID NO：11-14表示的至少一个启动子的控制下表达来自dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、gdrB和/或kgsA中任一个的至少一个基因。
在一些实施方案中，所述重组细菌表达用于在至少一个启动子的控制下从甘油生产3-HP(或其盐)的至少一个基因，其中所述启动子具有与SEQ ID NO：11-14中的任何一个至少80％相同的序列。在一些实施方案中，所述重组细菌表达用于在至少一个启动子的控制下从甘油生产3-HP或其盐的至少一个基因，所述启动子具有与SEQ ID NO：11-14中的任何一个至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些实施方案中，所述重组细菌表达用于在至少一个启动子的控制下从甘油生产3-HP或其盐的至少一个基因，所述启动子具有与SEQ ID NO：11-14中的任何序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，本文所述的表达系统包括串联的至少两个启动子，其控制至少一个参与从碳源例如甘油生产3-HP或其盐的基因。在微生物中观察到串联启动子系统，其在各种生理或环境条件下控制下游基因的表达。这样的系统有助于在细胞生长的不同阶段受控调节靶基因表达。串联启动子对于微生物可以是天然的或内源的，例如细菌菌株中天然存在的启动子，或者可以是合成的。在一些实施方案中，一个或多个所述启动子可以是天然启动子。在一些实施方案中，一个或多个所述启动子可以是合成启动子。
本文描述的表达系统的串联启动子可以包括一个或多个诱导型启动子，和/或一个或多个组成型启动子。在一些情况下，所述串联启动子包括两个或更多个诱导型启动子。包含两个或更多个诱导型启动子的串联启动子可以具有两个相同的诱导型启动子，即所述诱导型启动子由相同的诱导剂或刺激诱导，或两个不同的诱导型启动子，即所述诱导型启动子由不同的诱导剂或刺激诱导。在一些实施方案中，所述串联启动子包括至少一个诱导型启动子和至少一个组成型启动子。例如，所述串联启动子可以组合3-HP诱导型启动子和组成型启动子来调节参与3-HP合成的基因的表达。
在一些实施方案中，在串联启动子之间，例如在表达系统中所述两个或更多个启动子的任何启动子之间没有终止子序列，使得每个启动子可以调节位于所述串联启动子下游的基因的表达。
在一些实施方案中，所述串联启动子包括至少两个3-HP诱导型启动子。在一些实施方案中，所述串联启动子包括为3-HP诱导型启动子的第一启动子和为3-HP诱导型启动子的第二启动子。在一些实施方案中，所述第一3-HP诱导型启动子和所述第二3-HP诱导型启动子各自可以是PmmsA启动子(SEQ ID NO：14)、PhpdH-1启动子(SEQ ID NO：13)、PhbdH-4启动子(SEQ ID NO：11)或PhpdH启动子(SEQ ID NO：12)。
在一些实施方案中，所述串联启动子包括为3-HP诱导型启动子的第一启动子和为组成型启动子的第二启动子，其中所述第一3-HP诱导型启动子位于所述第二组成型启动子的5'或上游。在一些实施方案中，所述第一3-HP诱导型启动子是PmmsA启动子(SEQ ID NO：14)、PhpdH-1启动子(SEQ ID NO：13)、PhpdH-4启动子(SEQ ID NO：11)或PhpdH启动子(SEQ IDNO：12)。在一些实施方案中，所述第二组成型启动子是Pzwf(SEQ ID NO：7)启动子。在一些实施方案中，所述第二组成型启动子的序列与SEQ ID NO：7至少80％相同。在一些实施方案中，所述第二组成型启动子的序列与SEQ ID NO：7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，所述第二组成型启动子的序列与SEQ ID NO：7的差别在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述第二组成型启动子的序列是SEQ ID NO:8(Pzwf-1)、SEQID NO:9(Pzwf-7)、SEQ ID NO:10(Pzwf-12)、SEQ ID NO:52(Pzwf-2)、SEQ ID NO:53(Pzwf-3)、SEQ ID NO:54(Pzwf-4)、SEQ ID NO:55(Pzwf-5)、SEQ ID NO:56(Pzwf-6)、SEQ ID NO:57(Pzwf-7)、SEQ ID NO:58(Pzwf-8)、SEQ ID NO:59(Pzwf-10)、SEQ ID NO:60(Pzwf-11)、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63。
Pzwf组成型启动子(SEQ ID NO：7)
GGCGACCAACAACGGCGCGAGGTGGCAAAAATATCTTGTTTAATTACTACATATTTGTCTTAATGCCGGCGTGTAAGGCTAACTATCGTTCAAAATTTAGTTGGTAACAACAA
Pzwf-1组成型启动子(SEQ ID NO：8)
GGCGACCAACAACGGCGCGAGGTGGCAAAAACGGTTTGACACAGTAATTAAAAAGACGTATAATTGCGTTGTGTAAGGCTAACTATCGTTCAAAATTTAGTTGGTAACAACAA
Pzwf-1较短的组成型启动子(SEQ ID NO：61)
ACGGTTTGACACAGTAATTAAAAAGACGTATAATTGCGTT
Pzwf-7组成型启动子(SEQ ID NO:9)
GGCGACCAACAACGGCGCGAGGTGGCAAAAGTATATTGACATTCCATGCGAAGGTCGTTATAATACAGTAGTGTAAGGCTAACTATCGTTCAAAATTTAGTTGGTAACAACAA
Pzwf-7较短(SEQ ID NO：62)
GTATATTGACATTCCATGCGAAGGTCGTTATAATACAGTA
Pzwf-12组成型启动子(SEQ ID NO：10)
GGCGCGAGGTGGCAAAATAATCTTGACAACTGGAGAGAATTGTGGTATAATGGGAGCGTGTAAGGCTAACTATCGTTCAAAATTTAGTTGGTAACAACAA
Pzwf-12较短的组成型启动子(SEQ ID NO：63)
TAATCTTGACAACTGGAGAGAATTGTGGTATAATGGGAGC
Pzwf#2组成型启动子(SEQ ID NO：52)
TCCACTTGACATACCCTAACATCGGGATTATAATGTCTGC
Pzwf#3组成型启动子(SEQ ID NO：53)
GTTGGTTGACATGGCGCTGTCGATCGGATATAATGTTTGT
Pzwf#4组成型启动子(SEQ ID NO：54)
GCGTCTTGACATCTTACTAGATTGTGCGTATAATAGTCGC
Pzwf#5组成型启动子(SEQ ID NO：55)
GGCGTTTGACATGTGGATGTAATCCTGTTATAATTTTTTA
Pzwf#6组成型启动子(SEQ ID NO：56)
GATCCTTGACAGCGAGGTATGAGTGAGGTATAATGTAACC
Pzwf#7组成型启动子(SEQ ID NO：57)
TGCGTTTGACAATTTGTTACGTTAGTGCTATAATCTAGTT
Pzwf#8组成型启动子(SEQ ID NO：58)
TACCCTTGACATAACGGCATTCTGGTGGTATAATCATGCC
Pzwf#10组成型启动子(SEQ ID NO：59)
GGGGGTTGACAACTGCGTGTTTGTCTGTTATAATATCCCG
Pzwf#11组成型启动子(SEQ ID NO：60)
GAGAATTGACAGATGACTTATTTCGTTGAATTCCTGC
在一些实施方案中，表达盒中的串联启动子的序列可以是SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72。在一些实施方案中，表达盒中的串联启动子的序列可以与SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72至少80％相同。在一些实施方案中，表达盒中的串联启动子的序列与SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72可以至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，表达盒中的串联启动子的序列可以与SEQ ID NO：70-72中的任何序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。
Pcm-Pc4串联启动子(SEQ ID NO：65)
CCTCGAATGTGCAAAAACGCAGACCATACTTGCACATCACCGCATTGAGTACATCAAAAATGCACTGTTAGGATCGATCCAGACAACAAAAAAGCCACAGGCTGGGAGAATCCCGGCCCCCGCCTACCCGCCCCAGCCACCCCGGACTCAGCAAGGATGCTGGCCCGGGCCTGGGCGGAGACGTCTTTCGCGCCCGACCATCAGAACAAGAGGACAACCCC
Pc3-Pc1串联启动子(SEQ ID NO：70)
CGTGGCGACTCTCATTGTTAGAAAACGCACAGCAGGTGACTTTAAACGTTCGTATTTTTATCGCGAACGAACGACTAGGCTCCATCGTCATACCCAAAAGAACAAGAACGACGAGGGACTTTCCGGCGTTTGACATGTGGATGTAATCCTGTTATAATTTTTTAGTGTAAGGCTAACTATCGTTCAAAATTTAGGTGGTAACAACAAATG
Pc1-Pc3串联启动子(SEQ ID NO：71)
GGCGTTTGACATGTGGATGTAATCCTGTTATAATTTTTTAGTGTAAGGCTAACTATCGTTCAAAATTTAGGTGGTAACAACAACGTGGCGACTCTCATTGTTAGAAAACGCACAGCAGGTGACTTTAAACGTTCGTATTTTTATCGCGAACGAACGACTAGGCTCCATCGTCATACCCAAAAGAACAAGAACGACGAGGGACTTTCCATG
Pc3-Pzwf串联启动子(SEQ ID NO：72)
CGTGGCGACTCTCATTGTTAGAAAACGCACAGCAGGTGACTTTAAACGTTCGTATTTTTATCGCGAACGAACGACTAGGCTCCATCGTCATACCCAAAAGAACAAGAACGACGAGGGACTTTCCGGCGACCAACAACGGCGCGAGGTGGCAAAAATATCTTGTTTAATTACTACATATTTGTCTTAATGCCGGCGTGTAAGGCTAACTATCGTTCAAAATTTAGTTGGTAACAACAAATG
转录调控因子
3-HP降解基因的调控区位于编码天然LysR家族转录调控因子(LTTR)蛋白的序列附近。当与3-HP复合时，所述LysR家族转录调控因子蛋白会激活转录。在细菌中，LTTR蛋白通过与RNA聚合酶相互作用来上调下游基因。因此LTTR蛋白的量会影响下游靶基因的转录水平。
在一些实施方案中，至少一种转录调控因子蛋白与至少一种本文所述的3-HP产生基因在重组微生物如细菌中表达。在一些情况下，至少一种转录调控因子蛋白是在至少一个组成型或诱导型启动子的控制下的LTTR蛋白。在一些情况下，所述转录调控因子蛋白与所述至少一种3-HP生产基因上游的位点结合并调节参与3-HP合成的所述至少一种基因的表达。
在一些实施方案中，如本文所述的重组细菌表达至少一种LTTR蛋白和至少一种用于产生3-HP或其盐的基因，例如至少一种甘油脱水酶、二醇脱水酶和/或醛脱氢酶。在一些实施方案中，所述LTTR蛋白是MmsR。在一些实施方案中，所述MmsR启动子在重组细菌中在组成型启动子的控制下表达。在一些实施方案中，所述组成型启动子是Pzwf启动子(SEQ IDNO：7)。在一些实施方案中，所述组成型启动子已经被突变从而相对于Pzwf启动子而言增加或减少MmsR的表达。在一些实施方案中，所述组成型启动子是Pzwf(SEQ ID NO：7)启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子的序列与SEQ ID NO：7至少80％相同。在一些实施方案中，所述组成型启动子的序列与SEQ ID NO:7至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，所述组成型启动子的序列与SEQ ID NO：7的差别在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述组成型启动子是SEQ ID NO:8(Pzwf-1)、SEQ ID NO:9(Pzwf-7)、SEQ ID NO:10(Pzwf-12)、SEQ ID NO:52(Pzwf-2)、SEQ ID NO:53(Pzwf-3)、SEQ ID NO:54(Pzwf-4)、SEQ ID NO:55(Pzwf-5)、SEQ ID NO:56(Pzwf-6)、SEQ ID NO:57(Pzwf-7)、SEQID NO:58(Pzwf-8)、SEQ ID NO:59(Pzwf-10)、SEQ ID NO:60(Pzwf-11)、SEQ ID NO:61、SEQID NO:62或SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，所述mmsR基因位于染色体上，例如在重组细菌的染色体表达的组成型启动子控制下。
5’UTR
在一些实施方案中，本文所述的表达系统可具有与目的基因(例如，参与3-HP合成的基因)可操作连接的5'UTR，其中所述5'UTR来自天然产生3-HP的细菌例如脱氮假单胞菌中的3-HP诱导型启动子调控的天然基因。在一些实施方案中，本文所述的表达系统具有脱氮假单胞菌的mmsA基因的5'UTR(SEQ ID NO：64)。
在某些情况下，5'UTR的突变可以提高mRNA转录物的翻译起始速率和/或提高表达系统产生的mRNA转录物的稳定性。在一些实施方案中，本文所述的表达系统可以具有其序列与SEQ ID NO：64至少80％相同的5'UTR。在一些实施方案中，本文所述的表达系统可以具有其序列与SEQ ID NO：64至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的5'UTR。在一些实施方案中，本文所述的表达系统可具有其序列与SEQ ID NO：64相差1、2、3、4、5、6、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个核苷酸的5'UTR。在一些实施方案中，本文所述的表达系统可具有包含选自SEQ ID NO：22-28的任何序列的5′UTR。
在一个非限制性实例中，具有PmAdH-4串联启动子、Opt-3、Hyb-20和染色体MmsR的表达系统具有mmsA基因的5′UTR。在一些实施例中，所述mmsA 5’UTR可以被突变。
mmsA 5’UTR(SEQ ID NO：64)
CGACGGCAAGCCCGTCGAGTCCACCATGGCTAACGTGACTTACACCGATACCCAACTGCT
mmsA 5’UTR突变UTR-0(SEQ ID NO：22)
CGACGGCAAGCCCAAGCAGGACACCATGGCTAACGTGACTTACACCGATACCCAACTGCT
mmsA 5’UTR突变UTR-1(SEQ ID NO：23)
CGACGGCAAGCCAACTGAACCCACCATGGCTAACGTGACTTACACCGATACCCAACTGCT
mmsA 5’UTR突变UTR-2(SEQ ID NO：24)
CGACGGCAAGCCCTAACTGGACACCATGGCTAACGTGACTTACACCGATACCCAACTGCT
mmsA 5’UTR突变UTR-3(SEQ ID NO：25)
CGACGGCAAGCCCTAACAGGACACCATGGCTAACGTGACTTACACCGATACCCAACTGCT
mmsA 5’UTR突变UTR-4(SEQ ID NO：26)
CGACGGCAAGCCCAAGCTGGACACCATGGCTAACGTGACTTACACCGATACCCAACTGCT
mmsA 5’UTR突变UTR-5(SEQ ID NO：27)
CGACGGCAAGCCCTAGCAGGACACCATGGCTAACGTGACTTACACCGATACCCAACTGCT
mmsA 5’UTR突变UTR-6(SEQ ID NO：28)
CGACGGCAAGCCCAAGCAGGACACCATGGCTAACGTGACTTACACCGATACCCAACTGCT
通过融合天然蛋白质的最初几个氨基酸来优化脱氮假单胞菌中的基因表达
为了优化脱氮假单胞菌中异源蛋白的表达，采用了一种新方法。将所述异源蛋白在目标蛋白N端与高表达的天然酶的一些初始氨基酸(5–20AA)融合(例如将所述天然蛋白的N端的5-20个氨基酸与所述异源蛋白质的N端融合)。例如，将各种长度(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长；分别命名为Hyb-5、Hyb-6、Hyb-7、Hyb-8、Hyb-9、Hyb-10、Hyb-11、Hyb-12、Hyb-13、Hyb-14、Hyb-15、Hyb-16、Hyb-17、Hyb-18、Hyb-19和Hyb-20)的mmsA N末端与所述全长异源kgsA基因连接，并由多拷贝质粒表达(图17)。用Hyb-20(+3-HP，9.3U/mg蛋白质；-3-HP，3.0U/mg蛋白质)获得了最高活性。另一方面，Hyb-5的表达或酶活性均未显示任何变化(图17A)。SDS-PAGE分析表明，当kgsA与N端mmsA片段融合时(添加了五个以上氨基酸)，蛋白质的产生增加(图17B)。为了了解在野生型和Hyb-20kgsA重组菌株中改善的表达和mRNA稳定性的机理，测量并比较了转录物。还确定了mmsA和mmsR转录物的稳定性(图17C和17D)。野生型kgsA转录物的半衰期(2.7分钟)比mmsA的半衰期(6.1分钟)短2.3倍；然而，通过融合最初的20aa的mmsA(20)，融合蛋白的mRNA的半衰期大大提高至5.7分钟，这与天然mmsA的mRNA的半衰期相当。这表明融合蛋白(mRNA转录物)变得不太容易受到内源核酸酶攻击。通过RT-PCR确定的杂合mmsA(20)kgsA基因的转录水平也比野生型kgsA基因的转录水平高两倍(数据未显示)。我们相信更高的mRNA稳定性以及改善的转录应该有助于杂合酶的改善的KgsA活性。在所检查的几个基因中，mmsA显示出最高的mRNA稳定性，半衰期为9.5分钟(数据未显示)。
重组细菌生产辅酶B12
在没有外部添加辅酶B12的情况下，由产生3-HP或其盐的微生物从甘油生成3-HP受到限制。辅酶B12是甘油/二醇脱水酶活性的重要辅助因子，可用于3-HP合成途径中的第一个反应，其中甘油被催化转化为3-羟基丙醛。因此，连续供应辅酶B12对于微生物例如细菌从甘油连续生产3-HP或其盐是必不可少的。辅酶B12可以在有氧或厌氧条件下通过有限数量的微生物自然合成(辅酶B12的厌氧生产者包括例如克雷伯菌属、链球菌属、沙门氏菌属的种。辅酶B12的需氧生产者包括例如假单胞菌属、根瘤菌属、红细菌属的种)。然而，已被评估为由甘油生产3-HP或其盐的潜在宿主的微生物似乎不能产生足够量的辅酶B12以便以高效价生产3-HP。进一步的分析表明，辅酶B12的产生受到转录和翻译调控。可在重组微生物例如细菌中对这些过程进行遗传修饰，以增加辅酶B12的产生，从而增加3-HP(或其盐)的效价，而无需对细菌补充外部辅酶B12。
如图23所示，两个基因簇(簇I和簇II)负责在脱氮假单胞菌中产生用于生成辅酶B12的蛋白质。已经在簇I和簇II中存在的操纵子的启动子区域中鉴定了核糖开关(riboswitches)和其他二级结构(见图23)。这些核糖开关似乎调节B12生物合成操纵子的表达，并可能抑制基因表达。在本文所述的一些实施方案中，可从脱氮假单胞菌的基因组中的簇I和/或簇II的一个或多个操纵子启动子区域去除一个或多个核糖开关或其他二级结构。在一些实施方式中，在脱氮假单胞菌的基因组中缺失核糖开关1、2、3和/或4中的一个或多个或其部分，如图23和图25A-D所示。在一些实施方案中，从脱氮假单胞菌的基因组中除去核糖开关1(SEQ ID NO：75)或核糖开关2(SEQ ID NO：76)的全部或部分DNA序列。在一些实施方案中，从脱氮假单胞菌的基因组中除去核糖开关1(SEQ ID NO：75)和核糖开关2(SEQID NO：76)的全部或部分DNA序列。
本文所述的任何表达系统可用于增加参与辅酶B12产生的基因的表达和/或增加辅酶B12的产生。本文所述的3-HP诱导型启动子系统可用于替代B12产生基因的调节区(例如，翻译和/或转录调节因子)。本公开内容提供了增加辅酶B12产生的方法，使得辅酶B12的补充不被生物体用于产生3-HP。本文提供了重组生物，其可以包括用于控制和/或上调用于生产3-HP的基因的表达系统和用于控制和/或上调用于生产辅酶B12的基因的表达系统。
核糖开关1(RS1)(SEQ ID NO：75)
Ccagatgccgacgatggtcagccagggcgtcatggggattcctctgaagggatgcgatgatcgatccgacgggcaggcttgttccgccctcgggcaaagcaggcataatacccgcatcgtcggtgctcgtaggacgcttcgctgtttgaaggcgatgcatccgagagccgaagagggaacacggaaaaaccgtggctgcccccgcaactgtaagcagcgagtccgcgcacttcgaccacagcgtctgttgtcgtcgatctggccactgggcaaccgggaaggccgtgccggatgaggacctgccagccaggagacctgccgacgaaaccagtcgcgcgtgcagacatcgagcggggtgtatcggtgtcgtgaagtcccctgtggggattcgcaggtcaccgcgacccagccctggtgacctca
核糖开关2(RS2)(SEQ ID NO：76)
ggcggatgaagggcgcgcgcgcgggttcgccgcgcaacgaaggtcgccaccggatcaccccgcccggttgtctgttgataacgaaccggttccggatctcgcgagctagagccaggcaaggcggaggatcgtcggggacgcggagttgactgtagtcaatgagcagtccacgacgatccgccaacgcagcatggccgacgcgcagcagatcgaaaaccagtcacgaggcaggtctcctggctcacagcccttgatcgtcctttcgccttcccgccgtagtcggcagtggcgtgtgaaagaacaggctgttcacagttgcgggggcagccgtggcgcatccgaagatttccacgttccctcttagctccggccagtgccggagaacctcgaagggaggaaggctacgcagcgtggccggggcggtcaatcgccggggatcgggcgacgcgcagttgacgctgcgggactgccgtggtcagctagcgcggtttcaggtgtctcgcgccgacgcgcgcgaggtgaaacgggaagccggtgcgtccgcaaggaccagtccggcgctgcccccgcaacggtaagcgcatcgagggtcgtcagtagccactgtgccaaggcatgggaaggctggcccatccggcgagagtctctcgctggcgtcgcaagcccggagaccggcctggaatcctcacattttggcaaacccgcggtgggcgggcgcaggccgtggcgcgaccgatccggcgcgttcgaatgcgttcaacctctgcgttctcactcttttcagagggaacgttcatgtccagcagcatcctgacgcaacaggcg
用于通道化(Channeling)的表达系统放置
可使用本领域熟知的任何方法将本文所述的表达系统遗传导入宿主微生物，例如细菌中。在某些情况下，可以使用质粒、人工染色体或其他载体将表达系统引入微生物。在一些实施方案中，表达系统可以被整合到微生物的基因组中，例如被整合到染色体中。
可以将表达系统的多个拷贝导入微生物例如细菌中。可以在至少一种质粒、人工染色体或其他载体上将表达系统的多个拷贝引入微生物例如细菌中。例如，表达系统的多个拷贝可以在单个质粒上或在两个或更多个不同质粒(即，具有不同序列、选择标记等的质粒)上被引入细菌中。表达系统的多个拷贝可以被整合到微生物的基因组中。在一些实施方案中，表达系统的多个拷贝可以被整合在基因组中的相同位置，例如在相同的染色体位置。在一些实施方案中，表达系统的多个拷贝可以被整合在不同位置，例如在不同染色体位置处。在一些实施方案中，表达系统的多个拷贝被整合在假单胞菌属细菌如脱氮假单胞菌中的不同位置。在一些实施方案中，调节参与从碳源产生3-HP的不同基因(例如一种或多种甘油脱水酶或二醇脱水酶基因以及醛脱氢酶基因)的两个或更多个表达系统被整合到假单胞菌属细菌的基因组中。在一些实施方案中，所述两个或更多个表达系统被整合在基因组的相同位置。在一些实施方案中，所述两个或更多个表达系统被整合在不同的染色体位置。
在一些实施方案中，将本文所述的一种或多种表达系统引入细菌，例如脱氮假单胞菌细菌中。在一些实施方案中，调节编码甘油脱水酶基因和/或二醇脱水酶基因的一个或多个基因(例如，dhaB1，dhaB2，dhaB3，gdrA和/或gdrB基因中的至少一个)的表达系统和调节一个或多个编码醛脱氢酶的基因(例如，至少一个ksgA基因)的表达系统被引入到脱氮假单胞菌细菌中，并任选地整合入所述细菌的基因组中。在一些实施方案中，调节甘油脱水酶(和/或二醇脱水酶)和醛脱氢酶基因的表达系统整合在不同的染色体位置。
在一些实施方案中，调节甘油脱水酶(和/或二醇脱水酶)和醛脱氢酶基因的表达系统被整合在不同的染色体位置。具体的染色体整合位点可显著影响表达系统或模块的表达水平，使得一个整合位点处的基因表达水平将不同于另一整合位点处的基因表达水平。另外，途径中的特定基因插入染色体中的位置可以平衡合成途径酶的活性，并避免有毒中间体(例如3-羟基丙醛)的积累。例如，在许多原核生物中，编码一种途径的酶的基因聚集在一起。在细菌中观察到这种成簇的排列，据信这样避免了由该途径产生的中间体在细胞中的积累。在原核生物中，转录和翻译同时发生，并且在许多情况下，由第一基因编码的第一酶的产物将是由该途径中第二基因编码的第二酶的底物。如果这些基因彼此靠近，则途径中第二基因编码的第二酶的底物(其由第一基因编码的酶产生)将位于第二酶附近。这种机制通过允许中间体被途径中的下一个酶立即消耗而提高了途径的效率并避免了潜在毒性中间体的积累。这种彼此非常接近的基因的成簇被称为通道化(channeling)。
因此，可以通过整合调节在不同染色体位置上的这些酶的表达系统来调节甘油脱水酶(和/或二醇脱水酶)和醛脱氢酶的水平，从而调节重组细菌中3-HPA和3-HP的水平，从而甘油脱水酶和醛脱氢酶在染色体中的定位将产生通道化效应，例如通过导致3-HPA快速转化为3-HP。通过定位分别调节甘油脱水酶(和/或二醇脱水酶)和醛脱氢酶的不同表达系统来产生通道化效应，可以防止对细胞有毒的3-HPA在细菌细胞中的积累，从而使细胞得以存活和生长更长的时间，并产生更高效价的3-HP或其盐。
在一些情况下，第一表达系统的整合的第一位置与第二表达系统的整合的第二位置的相互关系影响3-HP或其盐的生产水平。在某些情况下，第一表达系统可以是表达甘油脱水酶或二醇脱水酶(例如，一个或多个dhaB和/或gdrAB基因)的表达系统。在某些情况下，第二表达系统可以是表达醛脱氢酶的表达系统(例如，一个或多个ALDH基因，例如kgsA，ealdH和/或kaldH基因)。在某些情况下，这种将所述两个表达系统彼此紧密相关的方式整合的系统可以减少毒性中间体(例如3-HPA)的积累，并减少其他酶对这些毒性中间体的暴露，从而提高3-HP或其盐的产量。
在一些实施方案中，如本文所述，编码至少一种甘油脱水酶(和/或一种或多种二醇脱水酶基因)的表达系统或模块在重组细菌、例如脱氮假单胞菌的染色体中位于编码例如本文所述至少一种醛脱氢酶的表达系统或模块的约500-2,500,000个核苷酸碱基对以内(例如，在约500个碱基对至2,500千碱基对之间)(例如，核苷酸或碱基对)，例如在彼此之间约500-2,500,000个碱基对内。在一些实施方案中，如本文所述，编码至少一种甘油脱水酶(或二醇脱水酶)和至少一种醛脱氢酶的表达系统位于彼此约2,500千核苷酸、1,500千核苷酸、500千核苷酸、250千核苷酸内、150千核苷酸、50,000个核苷酸、25,000个核苷酸、15,000个核苷酸、10,000个核苷酸、8,000个核苷酸、6,000个核苷酸、4,000个核苷酸、3,800个核苷酸、3,600个核苷酸、3,400个核苷酸、3,200个核苷酸、3,000个核苷酸、2,800个核苷酸、2,600个核苷酸、2,400个核苷酸、2,200个核苷酸、2,000个核苷酸、1,800个核苷酸、1,600个核苷酸、1,400个核苷酸、1,200个核苷酸、1,000个核苷酸、900个核苷酸、800个核苷酸、700个核苷酸、600个核苷酸、500个核苷酸、400个核苷酸、300个核苷酸、200个核苷酸、100个核苷酸、50个核苷酸、或更少核苷酸以内。在一些实施方案中，所述基因或表达系统的整合位点之间的距离为约4000个碱基对。在一些实施方案中，整合位点相距至少约1500个碱基对(例如，约1500个碱基对；2000个碱基对；2500个碱基对；3000个碱基对；3500个碱基对；4000个碱基对；4500个碱基对；5000个碱基对；5500个碱基对；6000个碱基对；6500个碱基对；7000个碱基对；7500个碱基对；8000个碱基对；8500个碱基对；9000个碱基对；9500个碱基对；10,000个碱基对；20,000个碱基对；50,000个碱基对；100,000个碱基对；200,000个碱基对；或500,000个碱基对)。在一些实施方案中，如本文所述的编码至少一种甘油脱水酶或二醇脱水酶的表达系统和如本文所述的编码至少一种醛脱氢酶的表达系统在所述细菌染色体中位于彼此约500个核苷酸内(例如，基因或表达系统的整合位点之间的距离约为500个碱基对)。
在一些实施方案中，整合到表达系统的细菌染色体中的位置影响所述表达系统的表达水平。在某些情况下，离复制起点越近，则表达系统的表达水平越高。在一些实施方案中，表达系统被整合在距复制起点约500-4000个核苷酸(例如，核苷酸或碱基对)之间的位置。在一些实施方案中，所述表达系统在距复制起点约4000个核苷酸处，约3000个核苷酸处，约2000个核苷酸处，约1000个核苷酸处，约750个核苷酸处或约500个核苷酸处整合。在一些实施方案中，最接近复制起点的整合位点距离复制起点约500个核苷酸。在一些实施方案中，最接近复制起点的整合位点是至少500个核苷酸(例如，大约500个核苷酸；600个核苷酸；700个核苷酸；800个核苷酸；900个核苷酸；1000个核苷酸；1100个核苷酸；1200个核苷酸；1300个核苷酸；1400个核苷酸；1500个核苷酸；2000个核苷酸；2500个核苷酸；4000个核苷酸；或5000个核苷酸)。在一些实施方案中，所述表达系统被整合在距复制起点约500个核苷酸处。
如上所述，创建了一种系统，可以通过DhaB和ALDH酶使3-HPA通道化，从而提高3-HP的产量和细胞活力。该系统减少了其他酶和细胞成分暴露于有毒的3-HPA，并增加了3-HP或其盐的产生。在一个实施方案中，dhaB、gdrAB基因和kgsA彼此相邻放置。在另一种情况下，kgsA的位置与DhaB和GdrAB编码基因相距2000bp以上。基因彼此之间以及相对于复制起点而言的整合位置影响表达和活性。
当将kgsA放置在不同位置时(靠近DhaB、GdrAB(菌株P4-20)，与DhaB、GdrAB相距2000bp(菌株P4-10))，我们会注意到酶活性的差异。为了研究通道化效应，在菌株P4-10和P4-20中使酶活性同步(通过改变基因调控模块，如启动子，UTR)。经过这些修饰，两种菌株(具有(P4-20)和没有(P4-10)通道化效应)都显示出相似的KgsA和DhaB活性。这两种菌株(有和没有通道化菌株)之间的唯一区别是kgsA基因相对于dhaB和gdrAB基因的位置(图51)。
在这些相同的菌株(P4-10和P4-20)中，比较了3-HP的产量。与其中所述基因(kgsA基因以及dhaB和gdrAB基因)没有被通道化(例如在染色体上所处位置相距2000bp)的P4-10菌株相比，其中所述基因(kgsA基因以及dhaB和gdrAB基因)被通道化(例如所处位置彼此靠近)的P4-20菌株显示出更高的3-HP生产率和改善的3-HP效价。在P4-20菌株中，3-HPA的积累水平低于P4-10。在某些情况下，这是由于紧邻的KgsA酶消耗了3-HPA。在P4-20菌株中，DhaB酶(产生3-HPA)紧靠KgsA酶，因此3-HPA在KgsA酶积累和/或影响所述酶之前被KgsA酶迅速消耗。
生物生产
最佳生理参数，例如培养基、通气、温度、pH和目标产物的诱导时间，无论是单独还是组合使用，都会对细胞生长和目标分子的产生产生实质性影响。
培养基是生物过程中的重要参数，其在维持细胞生存力和提高目标产物的效价中起着至关重要的作用，因此必须适当配制以适合有效生产3-HP。使用分析级化学品生产3-HP或其盐的生物过程在商业上不可行。因此，仔细选择和配制培养基成分非常重要。在这些成分中，用于DhaB酶活性的辅酶B12，碳源和氮源是用于3-HP生产的培养基中补充的昂贵成分，因此，鉴定和检查较便宜的培养基成分以及配制合适的培养基用于3-HP生产和商业化非常重要。
除工业培养基配方外，还研究并优化了生物反应器条件下的生物工艺条件，例如温度、pH、通气等。对3-HP的生产至关重要的细胞代谢和NAD+再生通过在受控条件下改变生理参数来进行分析研究。考察了pH的影响，它在提高重组菌株的耐酸性和3-HP生产途径的酶效率中起着至关重要的作用。仔细研究了通气、温度和诱导时间的优化，因为每个生理参数都会显著影响3-HP的产生。通过生物工艺优化，实现了重组菌株从甘油生产3-HP的性能改善。
如实施例中所述，研究了可支持重组菌株生长至更高细胞密度并以高效价产生3-HP的各种碳源，包括例如葡萄糖、谷氨酸盐、葡萄糖酸盐和柠檬酸。还研究了生长条件的pH，在某些情况下，在生物反应器中使用中和碱来维持pH。本文还提供了可以在更高的酸性浓度和/或更高的3-HP浓度下生长的细菌菌株。在某些情况下，可以控制生长培养物中的碳酸氢盐水平。
氮是培养基中的另一个重要组成部分。如以下实施例所示，还研究了使用各种氮源来生产3-HP，包括例如玉米浆、酵母提取物等。
通气是细胞生长的一个重要特性。培养条件的通气被用于细胞生长，但是通气过多会降低3-HP的产生水平。以下示例说明了3-HP生物生产的适当通气。
本公开还提供了鉴定重组微生物用于细胞生长和靶分子产生的最佳温度。这涉及细胞生长的最佳温度和靶分子产生的最佳温度之间的平衡。
生产3-HP的诱导时间安排也可以根据培养条件和重组细菌来调整。例如，通过在对数中期添加甘油(作为3-HP的来源)进行诱导，由重组菌株产生了高水平的3-HP。其他培养条件和/或重组菌株可通过在对数早期或晚期诱导而产生高水平的3-HP。
从水溶液中取出3-HP
在一些实施方案中，一种从水溶液中提取3-HP的方法包括：蒸发与水不混溶的溶剂；将气化的与水不混溶的溶剂冷凝成液态；使用与水不混溶的液体溶剂从含有3-HP的水相中提取3-HP，以提供3-HP在该与水不混溶的溶剂中的溶液；将在与水不混溶的溶剂中的3-HP溶液与水相分离开。通常，在和与水不混溶的液体溶剂接触之前，含有3-HP的所述水相还含有与水混溶的溶剂。
通常，任何合适的与水混溶或与水不混溶的溶剂，或它们的任何组合，可用于从水溶液中取出3-HP。在本公开的相应的“与水不混溶的溶剂”、“与水混溶的溶剂”、“溶剂的组合”部分中描述了这些溶剂及其组合的示例性实施方案。
通常，在从水溶液中去除3-HP的方法中可以使用任何适当的工艺条件。示例性的示例性工艺参数在下面标题为“工艺参数”的部分中公开。
一般而言，3-HP是一种极性有机酸，其在水中的溶解度较高，而在有机溶剂中的溶解度较差。3-HP是一种市售产品。例如，3-HP可以以30重量％的水溶液形式从Sigma-Aldrich购买(目录号792659)，而3-HP在乙酸乙酯中的5-6重量％的溶液是难以获得的。不希望受到理论的束缚，据信向3-HP的水溶液中加入与水混溶的溶剂(例如甲醇)会降低3-HP在所得水溶液中的溶解度，从而有利于通过与水不混溶的溶剂(例如乙酸乙酯)从水溶液中取出3-HP。
水溶液
如本文所用，术语“水溶液”是指至少一种溶质在包括一种或多种溶剂(例如，溶剂的混合物)的液体中的溶液，其中至少一种溶剂是水，并且水在溶剂或溶剂混合物中的重量百分比为至少约50％(例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少90％)。在一些实施方案中，水溶液是其中水是唯一溶剂的溶液。
在一些实施方案中，水溶液中3-HP的量为约10g/L至约150g/L(例如，约20g/L至约140g/L，约30g/L至约130g/L，约40g/L至约120g/L，约50g/L至约110g/L，约50g/L至约100g/L，约60g/L至约100g/L，约60g/L至约80g/L或约80g/L至约120g/L)。溶液中3-HP的浓度可以表示为在特定体积的包含3-HP的溶液中的3-HP的质量(效价)，在特定质量的溶剂中的3-HP的量(摩尔浓度)，或在指定体积的溶液中的3-HP的量(摩尔浓度)。表示溶液中溶质的浓度的任何其他方式可以另外或替代地用于描述水溶液中3-HP的浓度。例如，在一些实施方案中，水溶液中3-HP的效价为至少约40g/L(例如约50g/L、约60g/L、约70g/L、约80g/L、约90g/L、约100g/L或约120g/L)。
在一些实施方案中，水溶液是去细胞化后获得的发酵液。从发酵液中去除全细胞的任何方法都可以用于去细胞化。例如，可以使用离心机使发酵液去细胞化。在一些实施方案中，水溶液是在培养或生长微生物之后获得的发酵液(例如培养基)。在某些情况下，所述水溶液是去细胞化的。在一些实施方案中，可以通过培养产生3-HP的微生物来获得含有3-HP的发酵液。此类微生物的说明性实例包括革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌(E.coli)、低聚碳氧单胞菌(Oligotropha carboxidovorans)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)或假单胞菌属的种(Pseudomononas sp.)；以及革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳杆菌属的种(Lactobaccilus sp.)或乳球菌属的种(Lactococcussp.)。可能通过发酵产生3-HP的微生物包括梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、潘氏杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)或酵母属(Saccharomyces)。在一些实施方案中，产生3-HP的微生物是本文所述的重组细菌。产生3-HP的重组细菌的一些实例是假单胞菌属菌株，克雷伯氏菌属菌株或大肠埃希氏菌属菌株。可能通过发酵产生3-HP的微生物的一些实例包括真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)(Cupriavidusnecator)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
发酵液中的发酵培养基可包含通常在细菌或真菌生长培养基中有用的多种营养物和成分(例如碳和/或氮源)。这种营养物和成分的说明性和非限制性实例在本文中描述。碳源的一个例子是糖，例如葡萄糖、谷氨酸盐、葡萄糖酸盐、果糖、阿拉伯糖或半乳糖、柠檬酸或柠檬酸循环中间体例如丙酮酸或琥珀酸或其组合。碳源的另一个例子是甘油。示例性的氮源包括铵盐、玉米浆液(corn steep liquor)、酵母提取物和硝酸盐。可用于发酵培养基的其他成分的说明性实例还包括血清蛋白、维生素、核酸和氨基酸。
在一些实施方案中，发酵后含有3-HP的去细胞化发酵液含有约0.5重量％至约5重量％(例如，约1重量％至约3重量％)的碳源，例如甘油。
在一些实施方案中，去细胞化的发酵液包含总量为约0.5wt％至约20wt％(例如，约1wt％至约10wt％)的被微生物用来产生3-HP的附加成分(例如本文所述的那些)。
在一些实施方案中，发酵和去细胞化后的发酵液的pH为约7至约8(例如，约7至约7.5)。这样的发酵液可包含3-HP的盐，例如钠盐或钾盐。在一些实施方案中，可将酸添加至去细胞化的发酵液中以降低pH并在所述发酵液中获得3-HP的游离酸形式。任何合适的无机或有机酸均可用于调节发酵液的pH。示例性的无机酸包括HCl、H2SO4、HNO3和H3PO4。示例性的有机酸包括甲酸、草酸、乙酸、酒石酸、丙二酸、戊二酸、琥珀酸和三氟乙酸。在一些实施方式中，草酸的饱和水溶液用于调节水溶液的pH。在约室温下草酸的饱和溶液的浓度为例如约40g/L至约50g/L(例如约45g/L)。
在一些实施方案中，含有3-HP的水溶液的pH为约3至约7(例如约4至约7、约4至约5、约4至约6、约4.1至约4.9、约4.2至约4.7、约4.2至约4.8、约4.3至约4.6或约4.3至约4.5)。在一些实施方案中，水溶液的pH为至少约3(例如至少约3.5、至少约4或至少约4.1)和/或至多约7(例如至多约6.5、至多约6、至多约5.5、或至多约5.0)。在一些实施方案中，水溶液的pH为约4、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6或约4.7。
在一些实施方案中，随着从水溶液中取出3-HP，水溶液的pH逐渐增加。在这样的实施方案中，在取出过程中，可以通过向所述水溶液中连续或不连续地添加一种或多种酸来调节(连续或不连续)水溶液的pH值，以根据需要处理由于3-HP取出而导致的pH值的任何逐渐增加的问题。
在一些实施方案中，可以以至少约20％(例如至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)。在一些实施方案中，可以从水溶液中取出3-HP，使得仅痕量的3-HP可以在水溶液中检测到(例如通过HPLC或LCMS)。在一些实施方案中，可以从水溶液中完全取出3-HP(即取出过程的产率为100％)。
如本文所用，术语“产率”是指基于过程中使用的起始材料的量，所获得的产物的总量与通过用于获得所述产物的方法可以获得的产物的理论量的比率(表示为百分数)。
在一些实施方案中，可以在不使用逆流流体流(counter-current fluid flow)的情况下从水溶液中取出3-HP。如本文所用，术语“逆流流体流”是指在接触和相分离之后两种不混溶的液体的双向流。在一些实施方案中，液体的流速是相等的。在其他实施方案中，一种液体的流速大于另一种液体的流速。与水不混溶的溶剂从水性溶剂中逆流提取溶质只是逆流流体流动的一个实例。在其中不使用逆流从水溶液中去除3-HP的实施方案中，可以例如在不使用任何用于水溶液和有机溶剂的逆流流动的技术和设备的情况下，用有机溶剂从所述水溶液中提取3-HP。逆流技术和设备例如在PCT公开号WO 2005/003074，WO2013/192450和WO 2013/192451中描述。
在一些实施方案中，可通过使用有机溶剂或者两种或更多种有机溶剂的组合从水溶液中取出3-HP。在一些实施方式中，可以在(1)蒸发所述溶剂；和(2)使所述蒸发的溶剂冷凝之后使用用于从水溶液中取出3-HP的有机溶剂。在一些实施方案中，可以例如通过将溶剂流引导至所述水溶液中以实现溶剂和水相的有效混合，从而溶剂将3-HP从水相中萃取出来，由此引导冷凝的溶剂流从水溶液中去除3-HP。
本文所用，术语“蒸发”是指液体到气相(蒸气)的转化。当蒸气压等于周围大气施加在液体上的压力时，液体的蒸发被称为“沸腾”。在一些实施例中，当液体被加热时发生蒸发。通常，当液体在其沸点或高于其沸点被加热时，会发生液体沸腾。应当理解，当加热包含一种以上溶剂的液体时，首先具有较低沸点的溶剂蒸发，然后具有较高沸点的溶剂蒸发，除非两种溶剂形成共沸混合物并且同时蒸发。
如本文所用，术语“冷凝”是指将蒸气转化为液体的过程。通常，当蒸气被冷却到液体的沸点以下时，蒸气的冷凝发生。
与水不混溶的溶剂
在一些实施方案中，与水不混溶的溶剂(例如，与水不混溶的有机溶剂)可以用于从水溶液中取出3-HP的过程中。即，可以将所述与水不混溶的溶剂和所述溶液合并，从而在与水不混溶的溶剂中形成3-HP的溶液。然后可以将3-HP在与水不混溶的溶剂中的溶液与水相分离。
如本文所用，术语“与水不混溶的溶剂”是指不能与水混合以形成均质液体的溶剂。例如，与水不混溶的溶剂在水中的溶解度小于约3重量％(例如小于约2重量％或小于约1重量％)。例如，少于约3g(例如少于约2g，或少于约1g)与水不混溶的溶剂可溶于100mL水中。
在一些实施方案中，所述与水不混溶的溶剂的密度小于约1g/mL。在这样的实施方案中，所述与水不混溶的溶剂的密度小于水，并且当与水混合时，该溶剂在水相上方形成有机相。在一些实施方案中，所述与水不混溶的溶剂的密度为约0.5g/mL至约1g/mL(例如约0.5g/mL，约0.6g/mL，约0.75g/mL，约0.85g/mL，约0.9g/mL或约0.95g/mL)。
密度低于水的与水不混溶的溶剂的说明性实例包括C5-10烷烃，C5-8环烷烃，芳族烃溶剂，C1-6乙酸烷基酯，C4-6醇和C1-6烷基醚。可以使用这种与水不混溶的溶剂的组合。
说明性的C5-10烷烃包括正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷和异辛烷。
说明性的C5-8环烷烃包括环戊烷和环己烷。
示例性的芳族烃溶剂包括苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯和异丙苯(cumene)。
说明性的C1-6烷基乙酸酯包括乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正戊酯和乙酸正己酯。
说明性的C4-6醇包括正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇和正己醇。
说明性的C1-6烷基醚包括二乙基醚、二丙基醚、乙基丙基醚、甲基叔丁基醚(MTBE)和甲基己基醚。
在一些实施方案中，所述与水不混溶的溶剂具有大于约1g/mL的密度。在这样的实施方案中，所述与水不混溶的溶剂的密度比水大，并且当与水混合时，该溶剂在水相下方形成有机相。在一些实施方案中，所述与水不混溶的溶剂的密度为约1g/mL至约1.5g/mL(例如约1.1g/mL，约1.15g/mL，约1.2g/mL，约1.25g/mL，约1.3g/mL或约1.4g/mL)。
在一些实施方案中，密度比水大的与水不混溶的溶剂是C1-4烷烃，C1-4烯烃，C4-6环烷烃，C4-6环烯烃，芳族烃溶剂，乙酸C1-6烷基酯，C2-6醇或C1-6烷基醚。任选地，这种溶剂被一个或多个(例如1、2、3、4或5个)独立选择的卤素原子取代，例如一个或多个Cl原子，一个或多个Br原子，一个或多个F原子或其组合。这种与水不混溶的溶剂的说明性实施方案包括C1-4卤代烷烃，C1-4卤代烯烃，C2-6卤代醇和卤代芳族烃溶剂。可以使用本段中所述的与水不混溶的溶剂的组合。
C1-6卤代烷烃的说明性实例包括氯仿，溴仿，氯氟烃，二氯甲烷，四氯化碳，1,1-二氯-1-氟乙烷，1,1,1-三氯乙烷和全氟萘烷。
C1-4卤代烯烃的说明性实例包括1,2-二氯乙烯、1,1-二氯乙烯和三氯乙烯。
卤代芳族烃溶剂的说明性实例包括氯苯、1,2-二氟苯、1,2,4-三氯苯和三氟甲苯。
C2-6卤代醇的说明性实例包括六氟-2-丙醇、2,2,2-三氟乙醇和三氯-2-甲基-2-丙醇。
当使用与水不混溶的溶剂从水溶液中取出3-HP时，可以选择条件，使得所述与水不混溶的溶剂中3-HP的浓度可以为约1g/L至约300g/L(例如约5g/L至约250g/L，约10g/L至约200g/L，约20g/L至约150g/L，约30g/L至约100g/L，约40g/L至约90g/L或约50g/L至约80g/L)。
通常，可以相对于水溶液的量适当选择与水不混溶的溶剂的量。在一些实施方案中，基于所述水溶液的量，与水不混溶的溶剂的量为约50v/v％至约150v/v％(例如，约80v/v％至约120v/v％或约90v/v％至约110v/v％)。例如，基于所述水溶液的量，与水不混溶的溶剂的量可以为约50v/v％，约60v/v％，约70v/v％，约80v/v％，约90v/v％，约100v/v％，约105v/v％，约110v/v％，约120v/v％，约125v/v％，约130v/v％或约140v/v％。
与水混溶的溶剂
在一些实施方案中，在从所述水溶液中取出3-HP的过程中可以使用与水混溶的溶剂(例如与水混溶的有机溶剂)。如本文所用，术语“与水混溶”是指可以与水以任何比例组合而形成均质液体的溶剂。
通常，在从水溶液中取出3-HP的过程中使用与水混溶的溶剂的实施方案中，将所述与水混溶的溶剂与所述水溶液混合以形成均质的水溶液。例如，可以将与水混溶的溶剂倒入水溶液中以形成均匀的液体。作为另一个例子，可以在以下步骤后将与水混溶的溶剂加入到水溶液中从而形成均质的液体：(1)蒸发所述与水混溶的溶剂；(2)冷凝所述蒸发的与水混溶的溶剂；(3)将冷凝的与水混溶的溶剂流引导至所述水溶液中。
在从水溶液中取出3-HP的过程中使用与水混溶的溶剂的实施方案中，可以使用单一的与水混溶的溶剂，或者可以使用与水混溶的溶剂的组合。
在一些实施方案中，与水混溶的溶剂是C1-3醇。C1-3醇的说明性实例包括甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇。
在一些实施方案中，与水混溶的溶剂是极性非质子溶剂。极性非质子溶剂的说明性实例包括四氢呋喃(THF)、二甲基亚砜(DMSO)、六甲基磷酸三酰胺(hexamethylphosphorictriamide，HMPT)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、二噁烷和丙酮。
通常，可以适当地相对于水溶液的量选择与水混溶的溶剂的量。在一些实施方案中，基于水溶液的量，与水混溶的溶剂的量为约1v/v％至约50v/v％(例如，约1v/v％至约40v/v％，约1v/v％至约30v/v％，约5v/v％至约50v/v％，约10v/v％至约40v/v％，约15v/v％至约35v/v％，或约20v/v％至约30v/v％)。例如，基于水溶液的量，与水混溶的溶剂的量可以为约5v/v％，约10v/v％，约15v/v％，约20v/v％，约25v/v％，约30v/v％，或约40v/v％。
与水不混溶的溶剂和与水混溶的溶剂的组合
在一些实施方案中，与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂都用于从水溶液中取出3-HP的过程中。在这样的实施方案中，通常，可以适当地选择与水不混溶的溶剂和与水混溶的溶剂的体积比。在一些实施方案中，与水不混溶的溶剂和与水混溶的溶剂的体积比为约10：1至约1：1(例如约9：1至约2：1，约8：1至约2：1，约7：1至约2：1，约6：1至约2：1或约5：1至约3：1)。例如，与水不混溶的溶剂和与水混溶的溶剂的体积比为约2：1，约3：1，约4：1，约4.5：1，约5：1，约8：1或约10：1。
通常，可以适当地选择1)所述与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比。在一些实施方案中，1)所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的组合体积与2)所述水溶液的体积之比可为约1：1至约2：1(例如约1：1至约1.5：1)，例如约1：1，约1.2：1，约1.3：1，约1.4：1或约1.5：1。
通常，可以适当地选择所述与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的相对沸点。在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂的沸点低于所述与水不混溶的溶剂的沸点。在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂的沸点高于所述与水不混溶的溶剂的沸点。
通常，可以适当地选择所述与水不混溶的溶剂和所述与水混溶的溶剂以及它们各自的量。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、THF、二甲基亚砜(DMSO)、六甲基磷酸三酰胺(HMPT)和二甲基甲酰胺(DMF)，并且所述与水不混溶的溶剂选自甲基乙酸酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸叔丁酯、苯、氯苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯和对二甲苯、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙醚、甲基叔丁醚(MTBE)、甲基己基醚、氯仿、二氯甲烷和四氯化碳。在这样的实施方案中，可以适当选择与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的量。例如，在这样的实施方案中，基于水溶液的量，与水混溶的溶剂的量可以为约5v/v％至约50v/v％，与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比可以是从大约1：1到大约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是C1-3醇(例如甲醇、乙醇或异丙醇)，并且所述与水不混溶的溶剂是芳烃溶剂(例如，苯，甲苯，邻二甲苯，间二甲苯，对二甲苯或氯苯)。在这样的实施方案中，可以适当选择所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的量。例如，在这样的实施方案中，基于水溶液的量，所述与水混溶的溶剂的量可以为约5v/v％至约50v/v％，与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比可以是从大约1：1到大约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是C1-3醇(例如甲醇，乙醇或异丙醇)，并且所述与水不混溶的溶剂是乙酸C1-6烷基酯(例如，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸正丙酯，乙酸异丙酯，乙酸正丁酯，乙酸异丁酯，乙酸仲丁酯或乙酸叔丁酯)。在这样的实施方案中，可以适当选择与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的量。例如，在这样的实施方案中，基于水溶液的量，所述与水混溶的溶剂的量可以为约5v/v％至约50v/v％，与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比可以是从大约1：1到大约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是C1-3醇(例如，甲醇，乙醇或异丙醇)，并且所述与水不混溶的溶剂是C1-6烷基醚(例如，二乙醚，甲基叔丁基醚(MTBE)或甲基己基醚)。在这样的实施方案中，可以适当选择与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的量。例如，在这样的实施方案中，基于水溶液的量，所述与水混溶的溶剂的量可以为约5v/v％至约50v/v％，与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比可以是从大约1：1到大约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂为C1-3醇(例如，甲醇，乙醇或异丙醇)，并且所述与水不混溶的溶剂为C1-6卤代烷(例如，氯仿，二氯甲烷或四氯化碳)。在这样的实施方案中，可以适当选择与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的量。例如，在这样的实施方案中，基于水溶液的量，所述与水混溶的溶剂的量可以为约5v/v％至约50v/v％，与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比可以是从大约1：1到大约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是甲醇，并且所述与水不混溶的溶剂是乙酸丁酯。在这样的实施方案中，可以适当选择甲醇和乙酸丁酯的量。例如，在这样的实施方案中，甲醇的量为水溶液的约5v/v％至约50v/v％，甲醇与乙酸丁酯的体积比可为约1:10至约1：2：，和/或1)甲醇和乙酸丁酯的总体积与2)水溶液的体积之比可以为约1：1至约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是甲醇，并且所述与水不混溶的溶剂是MTBE。在这样的实施方案中，可以适当选择甲醇和MTBE的量。例如，在这样的实施方案中，甲醇的量可以为水溶液的约5v/v％至约50v/v％，甲醇与MTBE的体积比可以为约1:10至约1∶2，和/或1)甲醇和MTBE的总体积与2)水溶液的体积之比可以为约1：1至约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是甲醇，并且所述与水不混溶的溶剂可以是异丁醇。在这样的实施方案中，可以适当选择甲醇和异丁醇的量。例如，在这样的实施方案中，甲醇的量可以为水溶液的约5v/v％至约50v/v％，甲醇与异丁醇的体积比可以为约1:10至约1∶2，和/或1)甲醇和异丁醇的合并体积与2)水溶液的体积之比可以为约1：1至约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是甲醇，并且所述与水不混溶的溶剂是叔丁醇。在这样的实施方案中，可以适当选择甲醇和叔丁醇的量。例如，在这样的实施方案中，甲醇的量可以为水溶液的约5v/v％至约50v/v％，甲醇与叔丁醇的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)甲醇和叔丁醇的总体积与2)水溶液的体积之比可以为约1：1至约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是甲醇，并且所述与水不混溶的溶剂是苯。在这样的实施方案中，可以适当选择甲醇和苯的量。例如，在这样的实施方案中，甲醇的量可以为水溶液的约5v/v％至约50v/v％，甲醇与苯的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)甲醇和苯的总体积与2)水溶液的体积之比为约1：1至约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是甲醇，并且所述与水不混溶的溶剂是甲苯。在这样的实施方案中，可以适当选择甲醇和甲苯的量。例如，在这样的实施方案中，甲醇的量可以为水溶液的约5v/v％至约50v/v％，甲醇与甲苯的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)甲醇和甲苯的总体积与2)水溶液的体积之比为约1：1至约2：1。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂是甲醇，并且所述与水不混溶的溶剂是氯仿。在这样的实施方案中，可以适当选择甲醇和氯仿的量。例如，在这样的实施方案中，甲醇的量可以为水溶液的约5v/v％至约50v/v％，并且甲醇与氯仿的体积比可以为约1:10至约1：2，和/或1)甲醇和氯仿的总体积与2)水溶液的体积之比为约1：1至约2：1。
在特定的示例性实施方案中，所述与水混溶的溶剂为甲醇，所述与水不混溶的溶剂为乙酸乙酯。在这样的实施方案中，可以适当选择甲醇和乙酸乙酯的量。例如，在这样的实施方案中，甲醇的量可以为水溶液的约15v/v％至约35v/v％，并且甲醇与乙酸乙酯的体积比为约1：9至约3：7，和/或1)甲醇和乙酸乙酯的合并体积与2)水溶液的体积之比可以为约1：1至约2：1。同样，在这样的实施方案中，水溶液中3-HP的浓度可以为约50g/L至约80g/L，水溶液的pH可以为约4至约5，从水溶液中取出3-HP的过程中水溶液的温度为约15℃至约40℃。
在一些实施方案中，从水溶液中提取3-HP的方法包括：(1)提供包含含有3-HP的去细胞化发酵液的提取容器，含有约90v/v％至约110v/v％(基于提取容器中发酵液的量)的乙酸乙酯的溶剂容器，和冷凝器；(2)从溶剂容器中蒸发乙酸乙酯；(3)在冷凝器中将汽化的乙酸乙酯冷凝成液态；(4)将乙酸乙酯流从冷凝器引导至萃取容器，从而在萃取容器中形成3-HP的乙酸乙酯溶液；(5)在萃取容器中分开发酵液和3-HP在乙酸乙酯中的溶液；(6)将3-HP在乙酸乙酯中的溶液流从萃取容器引导至溶剂容器。在一些实施方式中，提取容器还包含基于发酵液的量为约20v/v％至约30v/v％的甲醇。在这样的实施方案中，甲醇与发酵液完全可混溶，并在提取过程中保留在溶剂容器中。在该体系中乙酸乙酯的量与甲醇的量之比为约5∶1至约3∶1。
工艺参数
通常，在从水溶液中取出3-HP的过程中，可以将任何合适的流速用于溶剂(例如有机溶剂)。例如，在一些实施方案中，在从水溶液中取出3-HP的过程中溶剂的流量为约0.1L/h至约10L/h(例如约0.5L/h至约8L/h，约1L/h至约5L/h，或约1L/h至约3L/h。
通常，在从水溶液中取出3-HP的过程中可以使用任何合适的温度。例如，在一些实施方案中，在水溶液的温度为约15℃至约50℃(例如，约15℃至约40℃，约20℃至约30℃)下进行从水溶液中取出3-HP。。在一些实施方案中，在水溶液的温度至多约50℃(例如，约40℃或约30℃)下进行从水溶液中取出3-HP。任选地，在室温下从水溶液中取出3-HP。
在一些实施方案中，如方案1所示，在极性质子溶剂例如水或低级醇中加热3-HP导致3-HP分解。
方案1
Figure BDA0002464690110000741
参考方案1，在3位的羟基的氢原子可与3-HP的羰基形成氢键，从而形成6元环。极性质子溶剂可以促进6-元环的形成和3-HP的分解以形成乙烯，二氧化碳和水。在一个实例中，当3-HP在极性质子溶剂(例如水)中的溶液在高于50℃的温度下加热时，可能发生分解。因此，不希望受理论束缚，在一些实施方案中，在从水溶液中去找3-HP时将温度保持在50℃或以下可减少不希望的乙烯和/或二氧化碳的形成。
在某些实施方案中，3-HP在与水不混溶的溶剂中的溶液的温度等于或接近该与水不混溶的溶剂的沸点。例如，当在该方法中使用乙酸乙酯时，3-HP在乙酸乙酯中的溶液的温度可以为约78℃至约80℃。作为另一个例子，当在该方法中使用异丁醇时，3-HP在异丁醇中的溶液的温度可以为约105℃至约110℃。有利地，选择温度，使得当从水溶液中取出所述化合物期间将其在与水不混溶的溶剂中的溶液加热时，3-HP几乎不分解或不分解成不期望的产物。
在一些实施方案中，从水溶液中取出3-HP的过程导致回收的3-HP的产率相对较高，例如至少约70％(例如至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)。
从水溶液取出3-HP的示例性系统和方法
图58示出了使用密度小于水的与水不混溶的溶剂从水溶液中取出3-HP的示例性系统。参照图58，该系统包括溶剂容器100和经由侧管108流体连接至溶剂容器100的冷凝器110。冷凝器110也经由虹吸管112流体连接至萃取容器116。溶剂容器100包括搅拌器102，温度计124和加热元件104。萃取容器116包括搅拌器120，pH计122和入口管114。入口管114连接到蠕动泵126，蠕动泵126被配置为从酸存储容器130通过入口管114添加酸到萃取容器116。
在一些实施方案中，所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂都被放置在溶剂容器100中。通常在将所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂放置在溶剂容器100中之后将3-HP的水溶液(例如，含有3-HP的去细胞化发酵液)放置在萃取容器116中，尽管可选地可以在将与水混溶的溶剂放置在溶剂容器100中和/或将与水不混溶的溶剂放置在溶剂容器100中之前或同时将3-HP的水溶液放置在萃取容器116中。选择最初放置在萃取容器116中的3-HP水溶液的量，以使其不超过侧臂108，从而使3-HP的水溶液不会转移到溶剂容器100中。使用加热元件104加热溶剂容器100，直到包含在溶剂容器100中的液体的温度达到溶剂容器100中包含的具有较低沸点的溶剂(所述与水不混溶的溶剂或所述与水混溶的溶剂)的沸点为止，例如由温度计124确定的。通常，与水混溶的溶剂的沸点低于与水不混溶的溶剂。溶剂容器100中的与水混溶的溶剂蒸发(溶剂容器100中的与水不混溶的溶剂没有蒸发)，并且与水溶混的溶剂蒸气从溶剂容器100通过侧管108流到冷凝器110。冷凝器110在低于所述与水混溶的溶剂的沸点的温度(例如，约5℃至约25℃，约5℃，约10℃或约15℃)使用冷却剂。因此，汽化的与水混溶的溶剂在冷凝器110中冷凝成液态，并且液态的所述与水混溶的溶剂(例如，在大约室温)经由虹吸管112流到萃取容器116的底部。冷凝的与水混溶的溶剂与3-HP的水溶液合并，在萃取容器116中形成水相。选择最初放置在溶剂容器100中、然后转移到萃取容器116中的与水混溶的溶剂的量，从而容器116中的水相不会超过侧臂108，这样水相不会转移到溶剂容器100。溶剂容器100随后使用加热元件104加热到更高的温度，直到溶剂容器100中包含的液体的温度达到所述与水不混溶的溶剂的沸点，导致溶剂容器100中的与水不混溶的溶剂蒸发。所述与水不混溶的溶剂的蒸气从溶剂容器100通过侧管108流到冷凝器110。冷凝器110在低于所述与水不混溶的溶剂的沸点(例如，约5℃至约25℃，约5℃，约10℃或约15℃)的温度下使用冷却剂。因此，所述汽化的与水不混溶的溶剂在冷凝器110中冷凝成液态，并且该液态的与水不混溶的溶剂(例如，在大约室温下)经由虹吸管112流向萃取容器116的底部。所述冷凝的与水不混溶的溶剂在萃取容器116中与水相混合，使得所述与水不混溶的溶剂从水相中萃取3-HP，从而在该与水不混溶的溶剂中形成3-HP的溶液(有机相)。结果是萃取容器116包含水相和有机相。由于所述与水不混溶的溶剂的密度小于水，因此有机相在水相上方。选择最初放置在系统中的3-HP水溶液，与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的总量，以使萃取容器116中的有机相到达侧臂108。因此，有机相从萃取容器116通过侧臂108流入溶剂容器100。这样，3-HP从萃取容器116转移到溶剂容器100。随着萃取容器116中3-HP的量减少，萃取容器116中的水相的pH倾向于增加，例如如由pH计122检测到的。响应于pH的这种增加，蠕动泵126可以将酸从酸存储容器130经由入口管114泵送到萃取容器116，从而调节萃取容器116中水相的pH。萃取容器116中的水相可用搅拌器120搅拌(例如，连续搅拌)以增强水相的pH均质性。萃取容器116中的水相和萃取容器116中的有机相的温度可以大致相同，并且通常为约15℃至约40℃(例如，约室温)。通常，将萃取容器116中水相的pH调节至上述范围内。例如，在一些实施方案中，水相的pH为约4至约7(例如，约4至约5，约4.2至约4.7，约4.3至约4.4，约4.3或约4.4)。
在某些实施方案中，所述与水混溶的溶剂最初被放置在萃取容器116中，并且所述与水不混溶的溶剂最初被放置在溶剂容器100中。通常，在将所述与水混溶的溶剂置于萃取容器116中以及将所述与水不混溶的溶剂置于溶剂容器100中之后，将所述3-HP的水溶液(例如，含有3-HP的去细胞化发酵液)置于萃取容器116中，尽管可选地可以在将所述与水混溶的溶剂置于萃取容器116中和/或将所述与水不混溶的溶剂置于溶剂容器100中之前或与之同时进行将3-HP的水溶液置于萃取容器116中。萃取容器116中的3-HP水溶液和所述与水混溶的溶剂合并形成萃取容器116中的水相。选择3-HP水溶液和所述与水混溶的溶剂的总量，以使水相不会向上延伸到侧臂108，从而水相不会转移到溶剂容器100中。使用加热元件104加热溶剂容器100，直到溶剂容器100中包含的所述与水不混溶的溶剂的温度达到其沸点，例如由温度计124所测定的。溶剂容器100中的所述与水不混溶的溶剂蒸发，并且所述与水不混溶的溶剂的蒸气从溶剂容器100通过侧管108流到冷凝器110。冷凝器110在低于所述与水不混溶的溶剂的沸点(例如，约5℃至约25℃，约5℃，约10℃或约15℃)的温度使用冷却剂。因此，所述汽化的与水不混溶的溶剂在冷凝器110中冷凝成液态，并且该液态的与水不混溶的溶剂(例如，在大约室温下)经由虹吸管112流到萃取容器116的底部。所述冷凝的与水不混溶的溶剂在萃取容器116中与水相混合，使得该与水不混溶的溶剂从水相中萃取3-HP，从而在与水不混溶的溶剂中形成3-HP的溶液(有机相)。结果是萃取容器116包含水相和有机相。由于所述与水不混溶的溶剂的密度小于水，因此有机相在水相上方。选择最初放置在系统中的3-HP水溶液，所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总量，以使萃取容器116中的有机相到达侧臂108。因此，有机相从萃取容器116通过侧臂108流入溶剂容器100。这样，3-HP从萃取容器116转移到溶剂容器100。随着萃取容器116中3-HP的量减少，萃取容器116中的水相的pH倾向于增加，例如由pH计122检测的。响应于pH的这种增加，蠕动泵126可以将酸从酸存储容器130经由入口管114泵送到萃取容器116，从而调节萃取容器116中水相的pH。萃取容器116中的水相可用搅拌器120搅拌(例如，连续搅拌)以增强水相的pH均质性。萃取容器116中的水相和萃取容器116中的有机相的温度可以大致相同，并且通常为约15℃至约40℃(例如，约室温)。通常，将萃取容器116中水相的pH调节至上述范围内。例如，在一些实施方案中，水相的pH为约4至约7(例如，约4至约5，约4.2至约4.7，约4.3至约4.4，约4.3或约4.4)。
图59示出了使用比水密度更高的与水不混溶的溶剂从水溶液中取出3-HP的示例性系统。该系统包括溶剂容器300，冷凝器310和萃取容器316。溶剂容器300通过侧管308流体连接至冷凝器310。溶剂容器300也通过侧管312流体连接至萃取容器316。冷凝器310通过连接管334与萃取容器316流体连接。溶剂容器300包括搅拌器302，加热元件304和温度计332。萃取容器316包括pH计320和入口管324。入口管324连接到蠕动泵326，蠕动泵326被配置成经由入口管324将来自储酸容器330的酸添加至萃取容器316。
在一些实施方案中，将所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂两者都放置在萃取容器300中。通常，在将所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂放置在溶剂容器300中之前，将3-HP的水溶液(例如，含有3-HP的去细胞化发酵液)放置在萃取容器316中。然而，可选地，可以在将所述与水混溶的溶剂放置在溶剂容器300中和/或将所述与水不混溶的溶剂放置在溶剂容器300中之后或同时将3-HP的水溶液放置在萃取容器316中。选择放置在萃取容器316中的3-HP水溶液的体积，以使溶液不会延展得足够高而通过侧管312流入溶液容器300中。溶剂容器300使用加热元件304加热，直到包含在溶剂容器300中的液体的温度达到溶剂容器300中包含的具有较低沸点的溶剂(所述与水不混溶的溶剂或所述与水不混溶的溶剂)的沸点为止，例如由温度计332确定的。通常，所述与水混溶的溶剂的沸点低于所述与水不混溶的溶剂。溶剂容器300中的与水混溶的溶剂蒸发(溶剂容器300中的所述与水不混溶的溶剂没有蒸发)，并且所述与水混溶的溶剂的蒸气从溶剂容器300通过侧管308流到冷凝器310。冷凝器310在低于所述与水混溶的溶剂的沸点的温度(例如，约5℃至约25℃，约5℃，约10℃或约15℃)下使用冷却剂。因此，所述气化的与水混溶的溶剂在冷凝器310中冷凝成液态，并且所述液态的与水混溶的溶剂(例如，在大约室温下)经由连接管334流向萃取容器316。所述冷凝的与水混溶的溶剂与3-HP的水溶液合并，在萃取容器316中形成水相。选择最初放置在溶剂容器300中并随后转移到萃取容器316中的与水混溶的溶剂的量，以使容器316中的水相不会延展得足够高而通过侧管312流入溶液容器300。随后使用加热元件304将溶剂容器300加热至更高的温度，直到包含在溶剂容器300中的液体的温度达到所述与水不混溶的溶剂的沸点为止，使溶剂容器300中的所述与水不混溶的溶剂蒸发。所述与水不混溶的溶剂的蒸气从溶剂容器300通过侧管308流到冷凝器310。冷凝器310在低于所述与水不混溶的溶剂的沸点的温度(例如，约5℃至约25℃，约5℃，约10℃或约15℃)使用冷却剂。因此，所述气化的与水不混溶的溶剂在冷凝器310中冷凝成液态，并且所述液态的与水不混溶的溶剂(例如，在大约室温下)经由连接管334流到萃取容器316。所述冷凝的与水不混溶的溶剂与水相在萃取容器316中混合，使得所述与水不混溶的溶剂从水相中萃取3-HP，从而在该与水不混溶的溶剂中形成3-HP的溶液(有机相)。结果是萃取容器316包含水相和有机相。因为所述与水不混溶的溶剂比水密度大，所以有机相在水相之下。选择最初放置在系统中的3-HP水溶液、所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总量，以使萃取容器316中的有机相足够大，从而有机相可以通过侧管312从萃取容器316转移到溶剂容器300。以这种方式，将3-HP从萃取容器316转移到溶剂容器300。随着萃取容器316中3-HP的量减少，萃取容器316中水相的pH倾向于增加，例如由pH计320检测到的。响应于pH的这种增加，蠕动泵326可以将酸从酸存储容器330经由入口管324泵送到萃取容器316，从而调节萃取容器316中的水相的pH。萃取容器316中的水相的温度和萃取容器316中的有机相的温度可以大致相同，并且通常为约15℃至约40℃(例如，大约室温)。通常，将萃取容器316中水相的pH调节至上述范围内。例如，在一些实施方案中，水相的pH为约4至约7(例如，约4至约5，约4.2至约4.7，约4.3至约4.4，约4.3或约4.4)。
在某些实施方案中，将与水混溶的溶剂放置在萃取容器316中，并且将与水不混溶的溶剂放置在萃取容器300中。通常，在此之前，将3-HP的水溶液(例如，含有3-HP的去细胞化发酵液)放置在萃取容器316中。然而，可选地，在将所述与水混溶的溶剂放置在萃取容器316中和/或将所述与水不混溶的溶剂放置在溶剂容器300中之后或与之同时，可以将3-HP的水溶液放置在萃取容器316中。3-HP的水溶液和在萃取容器316中的所述与水混溶的溶剂在萃取容器316中合并形成水相。选择萃取容器316中3-HP的水溶液和所述与水混溶的溶剂的合并量，使得萃取容器316中的水相不会延展到足够高而经由侧管312流入溶液容器300中。使用加热元件304加热溶剂容器300，直到容纳在溶剂容器300中的液体的温度达到所述与水不混溶的溶剂的沸点，从而使溶剂容器300中的所述与水不混溶的溶剂蒸发。所述与水不混溶的溶剂的蒸气从溶剂容器300通过侧管308流到冷凝器310。冷凝器310使用温度低于所述与水不混溶的溶剂的沸点(例如约5℃至约25℃，约5℃，约10℃或约15℃)的冷却剂。因此，所述气化的与水不混溶的溶剂在冷凝器310中冷凝成液态，并且所述液态的与水不混溶的溶剂(例如，在大约室温下)经由连接管334流到萃取容器316。所述冷凝的与水不混溶的溶剂与在萃取容器316中的水相混合，从而所述与水不混溶的溶剂从水相中萃取3-HP，由此形成3-HP在所述与水不混溶的溶剂中的溶液(有机相)。结果是萃取容器316包含水相和有机相。因为所述与水不混溶的溶剂密度比水高，所以有机相在水相之下。选择最初放置在系统中的3-HP水溶液，所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总量，以使萃取容器316中的有机相足够大，从而有机相可以从萃取容器中转移316通过侧管312到达溶剂容器300。以这种方式，将3-HP从萃取容器316转移到溶剂容器300。随着萃取容器316中3-HP的量减少，萃取容器316中水相的pH倾向于增加，例如由pH计320检测的。响应于pH的这种增加，蠕动泵326可以将酸从酸存储容器330经由入口管324泵送到萃取容器316，从而调节萃取容器316中的水相的pH。萃取容器316中的水相的温度和萃取容器316中的有机相的温度可以大致相同，并且通常为约15℃至约40℃(例如，大约室温)。通常，将萃取容器316中水相的pH调节至上述范围内。例如，在一些实施方案中，水相的pH为约4至约7(例如，约4至约5，约4.2至约4.7，约4.3至约4.4，约4.3或约4.4)。
3-HP的纯化
在一些实施方案中，可以在从水溶液中取出后纯化3-HP。例如，可以将粗制的3-HP(从水溶液中取出后但在纯化之前的3-HP)转化为盐，例如碱金属盐，然后用有机溶剂洗涤该盐以提供3-HP的纯碱金属盐。3-HP的纯碱金属盐可以转化为纯的3-HP游离酸。在这样的实施方案中，可以通过用碱金属氢氧化物例如氢氧化钠或氢氧化钾处理粗制的3-HP来形成3-HP的碱金属盐。为了进行这样的反应，可以形成粗3-HP在有机溶剂中的溶液，并且可以用碱金属氢氧化物处理所得溶液。在一些实施方案中，有机溶剂是丙酮、甲醇或异丙醇中的至少一种。在一些实施方案中，粗3-HP在有机溶剂中的溶液的pH为约4至约5(例如，约4.3或约4.4)。在一些实施方案中，将碱金属氢氧化物添加到反应混合物中，直到反应混合物的pH为约7。可以通过过滤收集从反应混合物中沉淀出的3-HP的碱金属盐，并进一步用如上所述的有机溶剂洗涤。
为了获得纯的3-HP游离酸，可以将3-HP的盐，例如钠盐溶解在水中，并且可以用本文所述的任何一种酸处理所得的水溶液。例如，可以用盐酸或草酸处理3-HP盐的水溶液，直到pH为约4至约5，并且可以通过本文所述的任何一种方法从所得水溶液中取出纯的3-HP游离酸。
制作丙烯酸
在一些实施方案中，由3-HP制备丙烯酸的方法包括使3-HP反应以形成丙烯酸。该方法可以提供至少约50％(例如，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％或至少约99％)的丙烯酸收率。在某些实施方案中，该方法提供了丙烯酸的定量收率(即100％收率)。
在一些实施方案中，该方法包括使液态的3-HP反应。在这样的实施方案中，3-HP可以是纯净的或可以是在水中或在一种或多种有机溶剂中的溶液中。示例性的有机溶剂包括DMSO、DMF和水。
通常，制备丙烯酸的方法可以在任何合适的温度下进行。在一些实施方案中，制备丙烯酸的方法包括在至少约50℃(例如，约60℃，约70℃或约80℃)的温度下加热3-HP。在一些实施方案中，3-HP反应在至多约200℃(例如，约190℃或约180℃)的温度下发生。在一些实施方案中，使3-HP反应以产生丙烯酸是在约50℃至约200℃(例如，约60℃至约190℃，或约80℃至约180℃)的温度下进行的。
通常，可以在任何合适的压力下使3-HP反应形成丙烯酸。在一些实施方案中，当邻近含有3-HP的反应混合物的压力低于大气压时，丙烯酸在反应温度下从反应混合物中蒸发。即，丙烯酸可以气态形式从反应混合物中取出。在一些实施方案中，使3-HP反应以形成丙烯酸是在减压下发生，例如与包含3-HP的反应混合物相邻的压力小于一个大气压下进行。在某些实施方案中，邻近包含3-HP的反应混合物的压力小于约700mbar(例如，小于约500mbar，小于约400mbar，小于约300mbar，小于约200mbar，小于约150mbar，小于约120mbar或小于约100mbar)。在一些实施方案中，邻近含有3-HP的反应混合物的压力为约50mbar至约200mbar(例如，约60mbar至约150mbar，约70mbar至约130mbar或约70mbar至约100mbar)。在一些实施方案中，邻近包含3-HP的反应混合物的压力为约70mbar，约74mbar，约75mbar，约80mbar，约90mbar，约100mbar或约120mbar。
在一些实施方案中，反应混合物包含催化剂以催化3-HP向丙烯酸的转化。通常，可以使用酸催化剂来催化3-HP转化为丙烯酸。
方案2
Figure BDA0002464690110000821
参考方案2，当3-HP与酸接触时，位置3的羟基被质子化，随后发生消除反应，产生丙烯酸和水。反应催化剂的合适实例包括本文所述的有机酸和无机酸中的任何一种。例如，可以使用盐酸、硫酸、多磷酸、草酸或乙酸来催化3-HP形成丙烯酸的反应。在一些实施方案中，沸石、二氧化硅或海沙可以用作反应的催化剂。沸石的合适实例包括分子筛，例如3A分子筛、4A分子筛或5A分子筛。
通常，可以适当选择催化剂的用量。在一些实施方案中，基于反应混合物中3-HP的量，反应混合物可包含约1重量％至约25重量％(例如，约1重量％至约20重量％，约2重量％至约20重量％，约1重量％至约10重量％，约1重量％至约5重量％，或约2重量％至约4重量％)的催化剂。在一些实施方案中，基于反应混合物中3-HP的量，反应混合物中催化剂的量为约1重量％，约2重量％，约3重量％，约4重量％，约5重量％，约10重量％，约20重量％或约25重量％。
由反应混合物中3-HP形成的丙烯酸易于聚合，从而形成聚丙烯酸。本文所述的制备丙烯酸的方法有利地避免了聚丙烯酸的形成，并且以高收率提供了所需的产物，例如约至少50％的收率(例如，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，或至少约99％)。
为了减少不希望的聚合，在一些实施方案中，在聚合抑制剂存在下使3-HP反应形成丙烯酸。聚合抑制剂的说明性实例包括吩噻嗪、氢醌、4-叔丁基邻苯二酚、叔丁基氢醌、1,4-苯醌、6-叔丁基-2,4-二甲苯酚、2,6-二叔丁基-对甲酚、2,6-二叔丁基苯酚或4-甲氧基苯酚。
通常，可以适当选择聚合抑制剂的用量。在一些实施方案中，基于反应混合物中3-HP的量，聚合抑制剂以约1重量％至约20重量％(例如，约1重量％至约10重量％，约1重量％至约5重量％，约5重量％至约15重量％)的量存在于反应混合物中。在一些实施方案中，基于反应混合物中3-HP的量，聚合抑制剂的量为约1重量％，约2重量％，约3重量％，约5重量％，约10重量％或约15重量％。
在一些实施方案中，将由3-HP形成的丙烯酸从反应混合物中取出。丙烯酸的取出可以在整个反应过程中连续进行，可选地直到所有的3-HP已经反应形成丙烯酸为止，或者丙烯酸的取出可以在反应过程中不连续地进行，可选地直到所有的3-HP已经反应生成丙烯酸为止。
如上所述，丙烯酸可以作为气态丙烯酸从反应混合物中取出。在这样的实施方案中，已经从反应混合物中取出的气态丙烯酸可以被冷凝成液态、收集并用于预期目的。在一些实施例中，使用冷却剂来冷凝气态丙烯酸。例如，用于在低于大气压的压力下冷凝丙烯酸的冷却剂的温度为约-5℃至约10℃(例如，约0℃至约5℃)。
制备丙烯酸的示例性系统和方法
图60中显示了使3-HP反应形成丙烯酸并从反应混合物中蒸馏丙烯酸的示例性系统。该系统包括反应容器200，通过溶剂管线212连接到反应容器200的蒸馏头214，溶剂收集器224，在蒸馏头214上方的冷凝器226以及通过阀236连接到蒸馏头214的收集容器238，用于收集蒸馏的丙烯酸。反应容器200包括搅拌器206，加热元件202，控制反应容器200内部温度的温度计208和入口管210，包含3-HP(以及任选地溶剂和催化剂)的反应混合物可以通过入口管210加入反应容器200中。蒸馏头214包括冷却套218，该冷却套218具有冷却剂入口管220和冷却剂出口管222。收集容器238包括入口管242，通过该入口管242可以将其他成分(例如聚合抑制剂)加入收集容器238。收集容器238还包括用于从系统中取出丙烯酸的出口管244。入口管242也可以用于将收集容器238连接到另外的真空管线。冷凝器226包括具有冷却剂入口管230和冷却剂出口管232的冷却套228。冷凝器226还包括接头234，系统可以通过该接头234连接至主真空管线。
在取出过程之前，向反应容器200中装入3-HP和任选地催化剂，例如4A分子筛。然后向系统施加真空以在系统内部产生约70-100mbar的压力。然后使用加热罩202将反应混合物加热至由温度计208确定的约80℃的温度。在该温度下，3-HP开始反应以形成反应产物丙烯酸和水。在约70-100mbar的压力下，在反应过程中形成的丙烯酸和水蒸发，并且蒸气流经溶剂管线212到达蒸馏头214。某些含有丙烯酸和水的蒸汽在蒸馏头214中冷凝，从而形成包含在蒸馏头214中的液体产品。剩余的蒸气通过阀224到达冷凝器226，在此剩余的气态丙烯酸和水冷凝并流过阀224向下到达蒸馏头214。如果在蒸馏头214收集到足量的液体，则液体通过打开的阀236流到收集容器238。可以关闭阀236以防止蒸馏头214中包含的液体不期望地流到收集容器238。
在一些实施方案中，本公开提供了一种使3-HP反应以形成丙烯酸的方法，包括：(1)提供包含3-HP的反应容器、收集容器和冷凝器；(2)在反应容器中使3-HP反应生成丙烯酸；(3)从反应容器中蒸发丙烯酸；(3)在冷凝器中将所述气化的丙烯酸冷凝成液态；和(4)将丙烯酸流从冷凝器引导至收集容器。在一些实施方案中，反应容器还包含催化剂。在一些实施方案中，反应容器还包含聚合抑制剂。在本申请的“制造丙烯酸”部分中描述了催化剂、聚合抑制剂、催化剂和聚合抑制剂的量以及反应条件的示例性实施方案。
丙烯酸的纯化
在一些实施方式中，通过本公开的“制造丙烯酸”部分中描述的任何方法制备的丙烯酸可以被进一步纯化以获得不含任何聚合产物和未反应的3-HP的丙烯酸。纯化丙烯酸的常规方法包括在聚合抑制剂例如4-甲氧基苯酚(MEHQ)的存在下，在大气压下蒸馏丙烯酸(在约760mmHg下丙烯酸的沸点为约141℃)。当在其沸点或接近其沸点加热时，丙烯酸即使在聚合抑制剂的存在下也迅速聚合。因此，常规方法的产率仅是令人满意的(例如40-60％)。本公开内容的方法有利地避免聚合，并且基于纯化前的粗丙烯酸的量以至少约50％(例如，约75％至约95％)的收率纯化丙烯酸。在一些实施方案中，以含水混合物的形式获得纯的丙烯酸。此类混合物中丙烯酸的浓度为约70重量％至约90重量％(例如，约70重量％，约75重量％，约80重量％，约85重量％或约90重量％)。
在一些实施方案中，本公开提供了通过在减压下蒸馏丙烯酸来纯化丙烯酸的方法。在这样的实施方案中，在蒸馏期间由丙烯酸周围的气氛施加的压力通常为约70mbar至约100mbar(例如，约75mbar至约105mbar，或约80mbar至约100mbar)，并且温度通常为约80℃至约120℃(例如，约90℃至约110℃，或约80℃至约100℃)。例如，在一些实施方案中，在蒸馏期间由丙烯酸周围的气氛施加的压力为约70mbar，约75mbar，约80mbar，约85mbar，约90mbar，约95mbar或约100mbar，和/或温度为约80℃，约85℃，约90℃，约95℃或约100℃。在一些实施方案中，蒸馏在聚合抑制剂的存在下进行，其中聚合抑制剂的量可以适当选择(例如，约1重量％至约20重量％)。聚合抑制剂可以是本文所述的聚合抑制剂中的任何一种或其组合。
在一些实施方案中，本公开提供了通过用气体吹扫含有粗丙烯酸的容器来纯化丙烯酸的方法。在一些实施方案中，所述气体是空气、氮气或氩气。在一些实施方案中，所述气体的温度低于丙烯酸的沸点。在这样的实施方案中，温度为约40℃至约80℃(例如，约50℃，约60℃或约70℃)。在一些实施方案中，吹扫在大约大气压下进行。在该过程中，丙烯酸在温热气体的温度下缓慢蒸发(不沸腾)，并且温热气体的流动将纯丙烯酸蒸汽从容器中带出。在一些实施方案中，用于用气体吹扫丙烯酸的系统包含冷凝器，冷凝器中的冷却剂的温度为约5℃至约25℃。当含有丙烯酸蒸气的温热气体通过冷凝器时，丙烯酸冷凝成液态，而载气不会保留在冷凝器中，而是离开系统。可以从冷凝器中收集纯丙烯酸并用于预期目的。
实施例
在以下实施例中进一步描述本公开，其不限制权利要求中描述的本公开的范围。
实施例1.小分子诱导剂对MmsR转录激活蛋白的特异性
3-HP或类似的小酸诱导型基因表达系统是在脱氮假单胞菌中鉴定的新型表达系统。该表达系统调节3-HP降解酶的表达。脱氮假单胞菌基因组中3-HP降解基因附近的基因排列的分析表明存在一个推定的LysR家族转录调节子MmsR。据推测，所述转录调节子蛋白与3-HP复合后会激活mmsA、hpdH等的转录。推定的转录激活蛋白MmsR由用于DNA结合的N末端螺旋-转-螺旋结构域，用于响应3-HP的诱导剂结合的C末端结构域和连接这两个结构域的接头组成。进行了一项研究，以确定可以诱导MmsR的分子的范围。测试了各种酸和醇类诱导MmsR的能力，包括L-乳酸(LAC)、乙酸(AcOH)、丙酸(PA)、3-羟基丁酸盐(3-HB)、1,3-丙二醇(1,3-PDO)和2,3-丁二醇(2,3-BDO)，以及L-缬氨酸(L-val)及其降解中间体3-羟基异丁酸盐(3-HIB)。选择大多数测试的酸和醇主要是因为它们的大小和/或结构与3-HP相似。但是，选择L-val和3-HIB是基于它们与甲基丙二酰半醛脱氢酶和3-羟基异丁基脱氢酶的相似性，因为其转录受MmsR调节的mmsA和hbdH-4分别编码参与L-val降解的甲基丙二酰半醛脱氢酶和3-羟基异丁基脱氢酶。
在有和没有每种待测化合物的情况下，在基本培养基上培养脱氮假单胞菌，并通过定量RT-PCR测定mmsA和hbdH-4的转录(图2A)。编码σ因子70的管家基因rpoD用作参考。当脱氮假单胞菌暴露于3-HIB(mmsA，154倍；hbdH-4，146倍)，3-HB(mmsA，38倍；hbdH-4，32倍)和L-val(mmsA，72倍；hbdH-4，68倍)和3-HP(mmsA，134倍；hbdH-4，128倍)后，两个基因(mmsA和hbdH-4)的转录显著增强。相反，在暴露于LAC、AcOH、PA、1,3-PDO和2,3-BDO时，观察到的诱导作用有限或没有。3-HP、3-HB和3-HIB在结构上相似，因为它们都是β-羟基酸。羧基和β-羟基均似乎是3-HP、3-HB和3-HIB结合MmsR的能力所不可或缺的。L-val在结构上与这三种化合物有很大不同，并被转化为3-HIB。L-val的诱导可归因于L-val衍生的3-HIB，而不是L-val本身。
还检查了源自3-HP的丙二酸半醛(MSA)以及源自L-val和3-HIB的甲基丙二酸二醛(methylmalonatesemialdhyde，MMSA)而不是3-HP和/或3-HIB作为生理诱导剂的可能性(见图2A和2B)。一般而言，醛是有毒的，并且当醛在细胞中积累时，醛降解基因通常被上调。3-HP被hpdH，hbdH-4和hbdH-1编码的酶降解，并且缺失突变体脱氮假单胞菌ΔhpdHΔhbdH-4ΔhbdH-1不会以明显的速率降解3-HP。在这个不会从3-HP产生MSA的三重突变体中，mmsA的转录仍被3-HP上调(图3)。这表明3-HP无需转化为MSA即可激活MmsR蛋白。同样，三联突变体中3-HIB上调了mmsA的转录，表明3-HIB也是MmsR的真正诱导物。有趣的是，在不存在3-HP或存在3-HP的情况下，三联缺失突变体脱氮假单胞菌中mmsA的转录均高于野生型菌株。
为了确认MmsR是转录激活因子，进行了缺失和随后的互补实验(图2B)。在缺失突变体(ΔmmsR)中，mmsA和hbdH-4的转录均较低，并且该水平不受3-HP的影响。但是，当通过质粒将mmsR重新引入ΔmmsR突变体时，完全恢复了3-HP对mmsA和hbdH-4的上调。这些结果证实了MmsR是用于表达mmsA和hbdH-4的转录激活蛋白。有趣的是，ΔmmsR突变体中mmsA和hbdH-4的基础水平转录比野生型或mmsR互补重组体(mmR-C)高约2倍。这表明无诱导剂的MmsR蛋白可能在一定程度上抑制mmsA和hbdH-4的转录。
尽管hbdH-4的表达受3-HP调控，但启动子序列与mmsA的序列有很大不同，因为启动子缺少结合转录激活蛋白的操纵子位点。为了确认hbdH-4启动子是可诱导的，将mmsA–hbdH-4基因间区域克隆到带有绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因的质粒上。此外，用纯化的MmsR蛋白和hbdH-4启动子区域的DNA片段进行了电动迁移分析(electromobility shiftassays，EMSA)。两项实验均表明，hbdH-4启动子是组成型的，不能被3-HP诱导。在PhbdH-4控制下的GFP是组成性表达的，并且不存在MmsR蛋白与hbdH-4启动子区域之间的结合(数据未显示)。此外，在针对在3-HP存在下生长的细胞的qRT-PCR实验中，检测到了mmsA和hbdH-4的大量多顺反子mRNA转录本。这些结果表明，hbdH-4的转录受两个独立的启动子控制，即3-HP诱导型PmmsA和组成型PhbdH-4，并且在添加3-HP后hbdH-4的明显上调(见图1B和2B)归因于从PmmsA的转录通读。我们还注意到在mmsA和hbdH-4基因间区域中没有终止子序列。由于PhbdH-4不是诱导型的，因此对PmmsA进行了详细研究。
实施例2.mmsR-mmsA基因间操纵子-启动子区域的计算机分析
进行了mmsR和mmsA的两个不同转录的基因之间的基因间区域的计算机分析。这项研究表征了顺式作用元件，包括：(i)mmsA转录起始位点(TSS)上游的推定启动子，(ii)两个推定的串联操纵子位点O1和O2，以及(iii)三个T-N11-A基序，其中两个包括O1的两个半位点，最后一个包括O2的半位点(图3A)。每个操作子都包含了dyad对称的DNA序列，中心分别位于mmsA基因推定的TSS上游–81和–33位。反向重复在调节蛋白识别的许多原核生物操作子中很常见。两个回文区的中心之间的距离约为50bp，对应于螺旋DNA的五转。O1位点的二元组中的核苷酸序列由两个9bp的片段(相距15bp)组成，高度对称，只有一个错配。O2位点的反向重复序列相距11bp，对称性较差，在9个碱基中有6个碱基错配。O1和O2操纵子的四个回文片段的比对显示共有序列AACGTGTAA的存在(图3B)。在所有片段中，分别位于第2、4和5位的三个碱基A、G和T(图3B，粗体)完全保守，而在第3、7、8位的三个碱基C、T、A(带下划线的)分别在三个片段中高度保守。应当指出的是，假定的O2区域的身份有些疑问。它的一半位点之一显示非常差的保守性(3/9)，间隔子的大小比O1短4bp。应当从体内和体外实验中获得确认O2位点身份的其他证据(请参见以下示例)。
LysR型转录调控因子(LysR-type transcriptional regulators,LTTR)是原核生物中最大的转录因子家族。LTTR结合DNA序列具有两个对称的操作子区域，称为RBS(调节性结合位点)和ABS(激活子结合位点)，其中RBS相对于ABS显示出更大程度的对称性。此外，已知RBS和ABS的对称性半位点经常被T-(N11)-A基序包含。这些序列特征以及MmsR的结构特征表明MmsR属于转录调控银子的LTTR家族。我们对基因间区域的序列的分析(见图3A)也表明，mmsR的转录受到其自身产物MmsR的抑制。O1位点位于mmsR上游的推定-10区，O2位点与mmsR上游的-35启动子区完全重叠。MmsR蛋白在O1和O2位点的结合会干扰RNA聚合酶在mmsR启动子处的结合和/或转录过程中其沿DNA链的移动。我们还注意到，mmsA的转录可能会受到MmsR蛋白结合的干扰，因为mmsA的-35区位于O2位点的两个半位点的11bp长间隔区中。这也许可以解释为什么ΔmmsR突变体中mmsA和hbdH-4的基础水平转录比野生型对应物高2倍(见图2A和图2B)。对基因间区域进行了体内和体外的广泛研究，以验证计算机预测(参见下面的实施例)。
实施例3.mmsR-mmsA基因间操作子-启动子区域的体内表征
通过5'末端作图和体内随机诱变研究了控制mmsA基因表达的启动子区域的特征。为了鉴定-10和-35区，在PmmsA启动子区进行了各种突变，包括上游区的系列缺失或推定的-10和-35区的随机化，然后将突变启动子与gfp报告基因融合(图4)。缺乏mmsR基因的脱氨假单胞菌被用作测试突变启动子的宿主，因为MmsR可以与启动子结合并影响gfp报告基因的表达。当缺失-117至-60(PmmsA_Δ1)或-117至-37(PmmsA_Δ2)之间的启动子区域时，与包含全长启动子的对照(PmmsA_wt)相比，gfp表达下降了约16％(表1)。相比之下，当缺失-27(PmmsA_Δ3)或-14(PmmsA_Δ4)之前的更长上游序列时，启动子强度显著降低了39％或58％。这些结果表明，在PmmsA_Δ3和PmmsA_Δ4中缺失的序列包含重要的转录元件，如计算机分析所预测的，最可能是-10和-35区域。此外，与PmmsA_wt相比，推定的-10(PmmsA_-10)和-35(PmmsA_-35)区域的随机化降低了启动子强度52％。5'末端作图和随机诱变支持PmmsA的-10和-35区域的计算机预测。
表1：在启动子和操纵子区域的受控系列诱变之后，基于GFP表达的体内mmsR-mmsA基因间区域分析(AU/OD；AU，任意单位)。
Figure BDA0002464690110000901
Figure BDA0002464690110000911
a.表示MmsR在质粒上的互补表达
b.诱导后4h测荧光3次(n＝3)，取平均值
c.将25mM 3-HP加入生长培养基中进行诱导
还进行了5'末端作图和随机诱变，以体内研究操作子区域(O1和O2)的位置和身份。因为mmsR可能是自动调节的(请参见下面的实施例)，所以在弱Pc1启动子(hbdH-1启动子)的控制下从质粒组成性表达mmsR。如表1所示，包含两个操作子(O1和O2)的BS_wt和BS_Δ1表现出较高的3-HP诱导(高达
Figure BDA0002464690110000912
倍)。相比之下，当单独或与O1或O2的另一半位点(BS_Δ3或BS_Δ4)一起缺失假定的O1位点的前半位点(BS_Δ2)时，诱导性完全丧失。
还研究了在O1和/或O2区域发生突变的启动子。在这里，对操作子序列随机化，以破坏二元对称性，但是-35区域没有改变。不出所料，O1或者O1和O2的随机化完全消除了3-HP的诱导性。这些结果证实了O1操作子区域的位置和身份，该区域被认为位于-98的下游。但是，这些结果并未明确定义或确定O2区域的作用。当仅将假定的O2区随机化(BS_ΔO2)时，与野生型BS_wt相比，在没有3-HP的情况下启动子强度大大提高
Figure BDA0002464690110000921
当存在3-HP时，强度降低了37％(与野生型BS_wt相比)，但仍保持在较高水平。另外，当同时突变O1和O2(BS_ΔO1O2)时，启动子强度显著降低，并且启动子不是诱导型的。这表明O2位点与O1位点紧密协作，并且在调节PmmsA功能和强度中起重要作用。
总的来说，对操作子区域的体内研究可总结如下：(i)单独O1可以激活转录(由3-HP-MmsR复合物)，尽管效率比同时存在O1和O2时要低；(ii)不含3-HP的MmsR与O2操纵子的结合可以抑制PmmsA启动子的转录，以及(iii)ΔO2突变体启动子的高强度仍然涉及O1位点的存在。非常有可能PmmsA启动子既受到正调控(在3-HP存在下)也受到负调控(不存在3-HP的情况下)。
还使用GFP报告基因研究了操作子区域中MmsR的结合对mmsR表达的影响。PmmsR启动子受到其自身的蛋白质产物MmsR蛋白质的负调控(图4B)；删除mmsR(PmmsR_wtΔmmsR)时GFP表达增加了约2倍。O2中的突变(PmmsR_ΔO2)不会影响GFP的表达，而O1突变(PmmsR_ΔO1)略微增加了表达
Figure BDA0002464690110000922
这些结果表明，MmsR单独占据O1区域可以抑制从PmmsR启动子的转录。此外，3-HP的存在不影响MmsR蛋白的阻遏作用，表明该阻抑不是3-HP依赖性的。还尝试通过推定的启动子区域的5'端作图来鉴定PmmsR的-10和-35区(图5A)，但失败了。PmmsR启动子的强度太弱，无法实现突变体启动子之间的差异(p>0.05)。
已经在几种微生物中研究了LTTR蛋白及其顺式作用元件。在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌LT2中，已经研究了控制ilvC基因(编码乙酰羟酸异构酶；EC 1.1.1.86)表达的IlvY蛋白(LysR型转录调节蛋白)。在这些研究中，ilvC基因的转录由乙酰羟酸异构酶的底物--乙酰羟基丁酸或乙酰乳酸的诱导，并且该诱导由IlvY蛋白介导。
与PmmsA启动子相似，ilvY和ilvC基因的启动子区域具有两个操作子O1和O2，每个操作子由9bp长的反向重复组成。这些重复序列具有相同的同源序列，分别是大肠杆菌中的AACGTTAC(T)A和鼠伤寒沙门氏菌LT2中的NG(A)CGTTG(A)TA。此外，类似于脱氮假单胞菌中的PmmsA启动子，这些菌株中两个二元组之间的对称性在O1(单个错配)中比在O2(六个错配)中更为严格。据报道，存在于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)中的另一种LysR型激活剂AtzR显示出在ABS操作子区域中的非相似性。AtzR激活不同地转录的氰尿酸降解操纵子atzDEF的表达。但是，ABS包含三个基序，分别称为ABS-1，ABS-2和ABS-3，其中各子位点在激活过程中具有不同的作用。体内突变分析表明，ABS-1和ABS-2子位点参与了PaztDEF启动子的完全激活。相反，当AtzR位于ABS-2和ABS-3亚位点时，ABS-3充当“亚基陷阱”，导致PaztDEF失活。对于PmmsA启动子，与许多其他LTTR介导的系统一样，O2区被假定与-35区完全重叠。转录激活因子，分别来自大肠杆菌、恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌的IlvY、ClcR和AtuR，也具有相同的排列，其中-35启动子元件位于O2亚位点内。该重叠区域通过结合LTTRs的二聚体来控制下游基因的上调。然而，在没有诱导分子的情况下抑制下游基因的功能尚未见报道。
实施例4.体外生产MmsR蛋白及其结合操作子位点
为了进行体外生物化学表征，从重组大肠杆菌生产并纯化了在蛋白质C末端标记有六个组氨酸残基的重组MmsR蛋白。无论His是存在于MmsR的C端还是N端，在如实施例1(参见图6C)中所述进行的互补实验中，His标记的MmsR蛋白似乎与天然MmsR蛋白一样起作用。因此仅在体外进一步研究了重组C末端His标签MmsR。在优化培养条件(例如温度，培养基，IPTG浓度，收获时间和3-HP浓度以及与各种分子伴侣(如GroEL-ES，DnaKJ-GrpE和触发因子)的共表达)后，重组MmsR在大肠杆菌中以可溶形式高水平表达，并通过亲和层析纯化(图5A-E)。His标签融合的MmsR蛋白的大小估计为34.4kDa，这与基于6倍的his-mmsR基因序列的大小估计非常吻合。根据天然PAGE和/或凝胶过滤分析，MmsR蛋白在65nM的低浓度下为单体，而在550nM的高浓度下为二聚体(图6B)。
通过EMSA在体外研究了MmsR与mmsR-mmsA基因间区的结合(图7A)。将40nM的完整130bp DNA片段用作探针(称为F12片段；见图3B)，将0–72.7nM纯化的MmsR蛋白与DNA探针一起在存在和不存在3-HP作为诱导剂的条件下孵育。将在O1和O2中均随机化的DNA片段(F1M2M)用作对照(见图3B和表2)。在电泳中，当添加MmsR时，完整的130bp DNA片段出现了条带移动，并且随着孵育过程中蛋白质浓度的增加，移位的DNA与未移位的DNA的比例增加。相比之下，在高达72.7nM MmsR的对照DNA片段中未观察到这种迁移性降低(数据未显示)。这表明MmsR对天然PmmsA具有很强的结合亲和力，在体外形成结合复合物。在高浓度的MmsR蛋白下，出现了多个行进距离较短的条带。这归因于在DNA片段和蛋白质分子之间形成了各种寡聚复合物。DNA探针具有两个用于MmsR的结合位点(O1和O2)，并且MmsR以二聚体的形式与DNA结合，因此，当DNA和蛋白质的浓度很高时，很可能会形成多种寡聚复合物。图7A还显示了3-HP对MmsR和PmmsA启动子之间的结合亲和力的影响。当添加3-HP时，在较低的MmsR浓度下出现条带偏移。同样，当存在3-HP时，在较低的MmsR浓度下，行进距离较短的寡聚复合物更早出现。这表明3-HP促进了MmsR和PmmsA启动子之间的结合亲和力。
表2：本研究中使用的EMSA片段
Figure BDA0002464690110000941
Figure BDA0002464690110000951
粗体字母表示O1操作子的半位点；斜体字母表示O2操作子的半位点；带下划线的字母表示定点诱变区域。
为了在体外分析MmsR结合区，通过毛细管电泳进行了DNA酶I足迹分析(图7B)。包含完整的130bp基因间区域的更长的169bp DNA片段(用于上述EMSA实验)用作探针(表2)。DNA的浓度固定在特定的浓度，而MmsR的浓度在0–1.2μM之间变化。足迹结果清楚地表明存在MmsR保护的两个区域，分别对应于操作子符O1(中心在-81处)和O2(中心在-33处)。随着MmsR浓度的增加，保护作用更加明显。但是，很难在DNA序列的碱基对水平上精确确定保护的具体区域。
在低DNA浓度(0.4nM)下重复EMSA实验，以评估MmsR与PmmsA启动子之间的解离常数KD(图8)。采用了三个DNA片段，一个包含O1和O2操纵子位点二者(F12)，另两个与F12长度相同，但在O1(F1M2)或O2(F12M)操作子位点的回文区中突变(随机化)。在这三个DNA片段中，F12对MmsR的亲和力最高，其次是F12M，然后是F1M2。
从MmsR蛋白质-DNA等温线曲线确定MmsR结合(KD)这三个DNA片段的解离常数，其中绘制了MmsR结合的DNA的分数针对反应缓冲液中游离MmsR浓度的关系图(图9)。在没有3-HP的情况下，对单体MmsR蛋白进行估算时，F12的KD为10.7nM，F12M的KD为18.6nM，F1M2的KD为79.8nM(图9)。3-HP以不同方式改变这些DNA片段的结合亲和力。在存在3-HP的情况下，F12的KD值(单体MmsR浓度)估计为5.4nM，F12M的KD值为19.8nM，F1M2的KD值为316nM(图9)。F12的亲和力高于F12M或F1M2表明操纵子结合具有一定的协同性，因此MmsR与一个操作子(可能是O1)的结合会刺激与另一操作子(可能为O2)的结合。在不存在3-HP的情况下F12仅存在一个DNA-MmsR复合带也支持以下概念：两个操作子之间的结合具有协同作用：如果MmsR与O1的结合不刺激与O2的结合，则应出现两个DNA-MmsR复合物条带(一个为O1结合，另一个为O1和O2结合)。
Rhee等还研究了大肠杆菌IlvY蛋白与包含串联操作子(O1O2)或者仅包含O1或O2操作子的DNA片段的结合亲和力。对于包含串联O1O2操作子的片段，结合亲和力最高，而对于仅具有O2操作子的片段，结合亲和力最低，对单体IlvY的Kapp测定为：对串联操作子为4.4nM，对O1为35.2nM，对O2为
Figure BDA0002464690110000961
然而，Rhee等还报道了诱导物不影响IlvY蛋白与这些操作子的结合。在此，在3-HP存在下，在最高蛋白质浓度下可分辨出两条延迟带。在诱导剂存在下DNA结合蛋白的性质变化可能会影响复合物的形成。如以上实施例中所解释的，当DNA和MmsR的浓度增加到一定水平以上时，它们可能形成具有不同迁移率的多个复杂的寡聚结构。
实施例5.小分子诱导剂对HpdR转录激活蛋白的特异性
HpdR是一种转录激活蛋白，类似于MmsR，可以识别3-HP或类似的小酸，并刺激脱氮假单胞菌中特定基因的表达。图10A显示了在脱氮假单胞菌中HpdR调节的操纵子中的基因排列和基因间区域。hpdR和hpdH基因在假单胞菌基因组数据库中可用的所有测序的假单胞菌基因组中均是保守的，并且该基因组区域的组织相同。hpdH基因编码3-羟基丙酸脱氢酶(EC号1.1.1.59)，一种参与3-HP分解代谢的酶。hpdR基因编码LTTR蛋白，该蛋白由304个氨基酸残基组成，与其结构基因hpdH相比，其转录方式不同。序列分析显示，hpdR和hpdH之间的基因间隔区域长124个核苷酸bp，并包含两个用于表达hpdR和hpdH的启动子，HpdR二聚体结合位点(分别为调节子结合位点和激活结合位点，RBS和ABS)和核糖体结合位点。HpdR的DNA结合位点可能具有三个推定的串联操作子位点ABS-1、-2和-3以及RBS-1和-2，只有两个T-N11-A基序位于该基因间区域内，一个位于RBS-1，另一个与RBS-2和ABS-1重叠。T-N11-A基序的存在是LTTR介导的表达系统的典型特征之一(请参见图10A)。这三个操作子包含相对于hpdH转录起始位点(TSS；使用NNPP工具预测的)上游分别位于–52、–36和–21位置的二联体对称区域。对于hpdR基因的表达，假回文重复序列(如RBS-2和ABS-2)掩盖了转录起始位点与–35区域之间的区域，表明在这些操作子区域中的HpdR结合可以完全消除RNA聚合酶的结合。从而自动抑制其自身基因hpdR的转录。另一方面，RBS和ABS位点的两个9bp片段分别相距5、7和6个核苷酸。三个反向的二联体的核苷酸序列不是完全对称的，因为每个亚位点都有三个错配。
实施例6.HpdR对hpdH的转录激活
已经提出，HpdR是脱氮假单胞菌中hpdH基因的转录激活蛋白。为了在体内进行测试，我们创建了几种脱氮假单胞菌菌株，包括缺失突变株，即PdΔhpdR和PdΔmmsR，以及携带有pUCPK'/Pc1-hpdR的重组菌株PdΔhpdR(用于互补研究)，并且与WT菌株(ATCC13867)一起分析了hpdH转录。测试具有假定的C4转录激活蛋白缺失的PdΔmmsR菌株，以查看在C3和C4转录激活蛋白HpdR和MmsR之间是否存在串扰(cross-talk)。测定和比较在存在和不存在3-HP作为诱导剂的情况下的mRNA表达水平。3-HP导致来自脱氮假单胞菌染色体(WT)的hpdH表达增加43.0±10.9倍，而其转录激活因子HpdR却没有显示由3-HP引起的变化(图11A)。在C4操纵子中，mmsA和hpdH-IV的表达也被3-HP分别激活了151.3±18.2和149.3±9.6倍，而mmsR却根本没有激活(图11B)。在脱氮假单胞菌WT中，调节蛋白的基因(即hpdR和mmsR)以低水平表达，而受这些蛋白调节的基因(hpdH，mmsA和hpdH-IV)在3-HP的存在下高表达。特别地，C4操纵子的mmsA和hpdH-IV显示出高表达，表明存在高强度启动子。一旦缺失hpdR(ΔhpdR)，则hpdH的转录不被激活(1.20±0.58)；当hpdR被从中表达HpdR的重组质粒(hpdR-C)互补时，其转录激活被恢复至野生型水平(60.5±6.1)。因此，可以得出结论，当3-HP作为诱导物存在时，hpdH(3-HP的C3操纵子中的分解代谢基因之一)受到其转录调节因子HpdR的正调控。为了研究C3和C4操纵子之间的串扰，观察了PdΔhpdR和hdpR互补的重组脱氮假单胞菌菌株中C4操纵子基因(mmsA和hbdH-IV)的表达。mmsA和hbdH-IV的表达不受hpdR的存在和/或缺失的影响，表明C3转录激活因子对C3操纵子具有特异性，并且确实调节C4操纵子(图11B)。同样，C4转录激活因子(MmsR)不会影响C3操纵子基因的表达(数据未显示)。综上所述，这些结果表明，尽管HpdR和MmsR被相同的诱导物分子(3-HP)激活，并且属于相同的LTTR家族，但它们在结合操作子位点和随后的转录激活被调控的基因上是高度特异的。
实施例7.HpdR的自调节
已知LTTR调节蛋白通过以不依赖诱导物的方式抑制转录起始来自调节其自身的启动子。hpdH上游的HpdR的调控结合位点(操作子)被认为是可能的自调节位点。为了了解C3操纵子中HpdR的自调节，我们构建了一些质粒，包括(i)在PhpdR控制下表达的GFP，其中HpdR使用PC1或Pzwf启动子进行组成性表达，以及(ii)使用Peda和Pfbp启动子组成性表达的GFP。使用PhpdR启动子表达GFP荧光，其中HpdR与Pzwf或PC1(比Pzwf弱)启动子以两种不同的水平表达。在24小时的培养期内监测GFP的自动调节。当使用Pzwf或PC1表达HpdR时，GFP在10小时达到饱和水平，尽管是HpdR组成型表达，但并没有更多的表达。但是，当受Peda和Pfbp等组成型启动子调控时GFP荧光仍在逐渐表达。GFP荧光的表达水平受其启动子强度，即PhpdR、Peda和Pfbp的影响。该结果与LTTR蛋白自动调节其自身启动子的事实一致(图12)。
实施例8.C3操纵子中HpdR的诱导物的特异性
使用了几种酸和醛来检查对HpdR的诱导物特异性，这些酸和醛是根据它们在碳原子数(C3或4)、分子质量和化学结构上与3-HP的相似性来选择的，包括3-HP、L-val、BA、IBA、LAC、AA、IVA和PA。根据hpdH和gfp基因的转录以及GFP的荧光检查相对诱导性。根据HpdH和gfp的转录水平以及GFP荧光，确定了3-HP是HpdR的最佳诱导剂。与没有诱导物的对照(Ctrl)相比，3-HP使hpdH的转录增加了75±8.3倍。与其他化学品的结果相比，这是统计学上显著的差异(图12A)。暴露于L-缬氨酸后，hpdH的转录也增加了52.8±27.4倍，使L-缬氨酸成为这些实验中第二强的诱导剂。但是，发现其他酸和丙醛效果较差，或无法诱导HpdR介导的调节性C3基因表达系统。使用C3(hpdH和hpdR)调控子获得的3-HP和L-缬氨酸诱导性的结果与上述实施例中针对C4调控子(mmsA和MmsR)所述的结果相似。
在结构上，3-HP同时具有羧基和β-羟基，它们在配体与HpdR的结合能力中起重要作用。还测试了L-缬氨酸，因为编码3-HP脱氢酶的hpdH也参与了L-缬氨酸的降解，其代谢产物可显示出诱导能力。L-缬氨酸即使在结构上不同于3-HP，也很容易转化为3-羟基异丁酸(3-HIB)，后者可以诱导Cm操纵子(手稿完成中)，并且L-val的诱导是因其转化为3-HIB。总的来说，检查了作为报告基因的gfp的转录。在质粒pUCPK’/Pzwf-hpdR-PC3-gfp中，hpdH基因被gfp取代，gfp被异质表达。如上所述，将携带gfp的报告菌株PdΔhpdRΔhpdH用几种化学药品在25mM(pH
Figure BDA0002464690110001001
)下处理，包括3-HP、L-val、BA、IBA、LAC、AA、IVA和PA。3-HP可以最大程度地诱导gfp mRNA的表达，导致表达比对照高3.4倍。这与对照相比在统计学上是显著的。被测试的其他化学物质不诱导mRNA表达(图12B)。同样，GFP荧光分别在诱导后6和11小时被3-HP诱导最多(3-和3.3倍)(图12C)，这与gfp基因表达结果相符，后者显示3倍的诱导比率。因此，当在C3操纵子中与HpdR复合时，3-HP是激活靶基因转录的最佳诱导物。
还通过将3-HP的浓度范围从0.1mM变化到25mM研究了3-HP对hpdH诱导型启动子系统的剂量效应。诱导后6和11小时，GFP荧光的诱导比率的增加倍数在
Figure BDA0002464690110001002
呈线性变化。但是，高于0.5mM到25mM的浓度显示出相似的诱导性增加(图12D)。通过在转录水平和翻译水平上检查诱导物特异性来表征C3操纵子，其中hdpH的转录在体内和体外通过3-HP介导的诱导过程由HpdR调节。研究了hpdH启动子系统的诱导物特异性和强度。所得发现表明，当与HpdR复合以诱导该基因表达系统时，3-HP显示出最高的特异性，并且在体内观察到对于GFP表达，hpdH启动子有总体3倍的诱导比率。
实施例9.HpdR结合位点的体内分析
对PhpdH的5'区域进行的计算机序列分析表明，存在五个假定的操作子(RBS-1，RBS-2，ABS-1，ABS-2和ABS-3)。为了阐明这些操作子在hpdH转录激活中的重要性，进行了研究，其中每个推定的操作子的重复序列都被突变。构建了几种基于pUCPK'/Pzwf-hpdR-PC3-gfp质粒的重组质粒，其中用9bp随机DNA序列(ACAGGCGTA，由Random DNA SequenceGenerator工具生成，其既不显示保守的T-N11-A基序也不显示与实际亚位点的序列保守性)取代五个操作子重复序列之一，然后通过测量GFP水平(报告基因)评估基因表达的诱导能力(数据未显示)。RBS-1或ABS-2位点的突变显著降低了3-HP的诱导能力(数据未显示)。相比之下，突变对ABS-1或ABS-3位点的影响较小，而RBS-2位点的突变确实仅稍微影响了PC3启动子。这些结果表明，RBS-1和ABS-2位点是HpdR激活hpdH(或gfp)转录的关键结合位点，而其他操作子位点对于HpdR结合的重要性不高。
根据LTTR研究，LysR蛋白二聚体以协作方式结合到两个操作子位点。通常，一旦RBS首次被占用，它将帮助ABS招募第二个LTTR二聚体。在这种情况下，由于RBS在有效募集LTTR二聚体用于靶基因转录激活中的功能性作用，RBS位点比ABS更重要。在一个操作子中的两个重复序列(即RBS-1和RBS-2)中，尚不清楚哪个重复序列在结合LTTR蛋白时更重要。这两个重复序列均接受LysR蛋白的螺旋-转角-螺旋基序，因此两者同等重要。但是，考虑到PC3的启动子强度低，HpdR对操作子的亲和力可能很弱，这可以归因于RBS-2在HpdR蛋白募集中的贡献较小。这项研究表明，即使检查了RBS-2的突变，诱导性也没有变化，这表明该重复序列的贡献还不够高。通过改变RBS-2具有更多的共有序列以实现与LysR的更高亲和力，可以对RBS-2在LTTR结合方面的作用进行更详细的研究。ABS位点突变(ABS的两个重复序列)后表达降低的幅度较小可能归因于这一事实，即该ABS与hpdH的推定启动子位点紧密匹配，并且这些突变导致hpdH启动子发生改变，导致诱导性波动。ABS-2上的突变似乎使PC3成为组成型，导致在3-HP存在下HpdR介导的转录激活没有诱导性。总之，在HpdR与3-HP复合的情况下，除了RBS-2以外，每个操作子的突变都会导致诱导性的丧失，并且这种改变导致启动子的功能性修饰，从诱导型的变为具有组成型特征。由操作子突变引起的基因表达变化可归因于以下几种假设原因：(i)HpdR对激活hpdH(或gfp)转录的DNA结合位点的亲和力减弱；(ii)HpdR蛋白-操作子DNA复合物中的构象变化不适当，因为DNA弯曲导致靶基因的低转录；(iii)hpdH启动子强度发生重大变化，导致表达降低。因此，操作子突变可导致内在启动子特征的改变。
实施例10.结合位点随机化和激活蛋白表达水平的修饰
可以在转录和/或翻译水平上修饰基因表达。最初，我们修饰了操作子位点(O1和O2)，以尝试改善PmmsA启动子的转录。激活蛋白MmsR结合的mmsR-mmsA基因间区域中存在的操作子位点在确定启动子区域对RNA聚合酶的亲和力中起重要作用。将kgsA基因克隆到多拷贝pUCPK质粒中mmsR-mmsA基因间区域的下游，并将O2操作子序列的两个不同部分(各自组成该操作子的半个位点)独立地随机化(PmmsA2a和PmmsA2b)或组合使用(PmmsA2ab)(图15A)。在天然启动子(PmmsR)下从细菌染色体表达转录激活因子MmsR。没有突变的完整基因间序列被用作对照。O2a或O2b中的突变显著提高了转录水平，在没有3-HP的情况下是7.3–10.6倍，在有3-HP的情况下是1.3–1.7倍。与后半部分(O2b)内的突变相比，O2区域前半部分(O2a)内的突变显著提高了转录效率。当将O2操作子的两个半位点均随机化时，转录的基础水平(无3-HP)与O2a或O2b突变产生的基础转录水平相当(图15B)。然而，在3-HP存在下的最大转录水平降低并且该水平甚至低于野生型启动子的水平。O2区域与其中RNA聚合酶的σ-因子相结合的-35区域完全重叠。在响应3-HP时，就上调而言，-35区周围序列的变化可能直接影响MmsR对PmmsA启动子的亲和力/功能。在这种情况下，通过随机化O2区域的一半来减少结合相互作用大大提高了以诱导方式进行转录的水平。
通过使用GFP作为报告基因，清楚地比较了野生型和突变型启动子的强度(图15C)。结果表明，在采用25mM 3-HP的诱导期中，在O2区前半部分(PmmsA2a)具有突变的启动子在表达GFP方面表现高出约2倍。该结果与图15B所示的转录水平结果一致。该研究表明，可以通过改变操作子结合位点区域来修饰转录水平。我们既可以增加启动子的基础水平表达(极大)，又可以提高启动子表达的诱导水平(约2倍)。
在细菌中，LysR型转录调节因子(LTTR)蛋白通过与RNA聚合酶相互作用而有效地上调下游基因。结果，LTTR蛋白的量会影响靶基因的转录水平。为了研究MmsR表达对PmmsA启动子强度的影响，我们开发了组成型Pzwf启动子文库(图16A)，并在Pzwf文库中选择的启动子下表达MmsR(图16B)。在构建该合成启动子文库中，Pzwf启动子的-35和-10共有序列保持恒定，并且围绕这些序列的空间被随机化，并且长度是变化的。
评价了文库中的几种合成启动子，这些启动子显示了如图16A所示的启动子强度分布。使用组成型启动子Pzwf(Pzwf-7)作为阳性对照。在将背景信号归一化之后，文库启动子产生的GFP荧光水平在11,500(Pzwf-1)至51,000(Pzwf-12)相对荧光单位(AU/OD600)之间。因此，相对于野生型Pzwf-7(32,200)，启动子表达水平的范围大约为5个数量级。从该文库中选择了三个启动子：Pzwf-1和Pzwf-11，分别对应于与野生型Pzwf有0.4、1和1.7倍的差异。置于这些衍生的Pzwf启动子中每一种的控制下的转录激活因子MmsR以不同的水平产生，并且PmmsA启动子下游的基因(kgsA)的转录受到影响。使用在天然启动子PmmsR下染色体表达MmsR的菌株(PmmsA)作为对照。在低MmsR水平(MmsR-1株)下，当MmsR受Pzwf-1启动子控制时，无论是否存在3-HP，kgsA的mRNA表达均与对照相当。当通过将MmsR置于两个较强的Pzwf-1和Pzwf-11启动子的控制下(分别为MmsR-1和MmsR-11)来增加MmsR的量时，在有3-HP存在下kgsA的转录得到改善。但是，不存在3-HP时，kgsA的基础表达水平显著降低。如前所述，由于apo-MmsR的阻遏调控，该结果是可以理解的。对于可诱导性，较高的MmsR表达水平可通过最小化基础水平来大大增加非诱导和诱导情况之间的差异。这表明增强激活剂是阻碍强的诱导型启动子情况下通常会发生的诱导前靶基因渗漏的好策略。
实施例11.在PmmsA启动子下天然mmsA与异源kgsA基因的表达比较
脱氮假单胞菌可以积极降解甘油产生的3-HP。由hbdH-4和mmsA分别编码的3-羟基异丁酸脱氢酶IV(HbdH-4)和甲基丙二酸半醛脱氢酶(MmsA)部分负责3-HP的降解(mmsA启动子(PmmsA)被3-HP借助于激活蛋白MmsR而高度诱导((>140倍))。该启动子用于开发3-HP感受器，当外部添加时，该感受器可在25mM左右灵敏地检测3-HP。
尽管PmmsA可以被3-HP高水平诱导，但是置于PmmsA的控制之下的异源基因(例如gfp或kgsA)的表达水平要比在脱氮假单胞菌中固有地受PmmsA控制的mmsA的表达水平低得多。在工程化PmmsA之前，通过RT-PCR定量比较了克隆在PmmsA下的同源(mmsA)和异源(kgsA)基因的表达。异源基因kgsA的转录显著低于天然基因(mmsA)，在以染色体方式表达时约为100倍，当使用多拷贝(
Figure BDA0002464690110001041
拷贝)pUCPK'质粒以附加体形式表达时约为40倍。粗细胞KgsA活性清楚地表明了3-HP诱导和基因剂量的影响。当从染色体(Int-1)表达时，活性分别为0.08U/mg蛋白(没有3-HP)和0.15U/mg蛋白(有3-HP)。当从多拷贝质粒表达时，活性分别为1.02U/mg蛋白(没有3-HP)和3.15U/mg蛋白(有3-HP)。我们注意到，在有或没有3-HP的情况下测定的KgsA活性均忠实地反映了基因剂量效应，并且几乎与基因拷贝数成正比。当由多拷贝质粒与甘油脱水酶(DhaB)一起表达KgsA时，其粗细胞活性为2.5U/mg蛋白，得到良好的3-HP产生。这表明，当将kgsA整合到染色体中时，应该对PmmsA启动子进行工程改造以使其基因表达高约20倍。幸运的是，在PmmsA启动子的控制下，与kgsA相比，同源mmsA基因的转录高约100倍。即使是kgsA基因的拷贝数非常低(例如1或2个拷贝)，通过改变mmsA调控结构的特性来提高其转录和/或翻译效率也可以改善kgsA的表达。
实施例12.串联启动子系统的开发
在细菌宿主中优化基因表达水平的尝试已经使用合理和组合的方法来改变转录和翻译水平。当使用强启动子和/或核糖体结合位点(RBS)时，基因表达增加。已经开发了提供一系列表达水平的合成启动子文库。在诸如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的细菌中，还发现了营养期和固定期启动子，它们对RNA聚合酶的一种σ因子的响应要强于另一种。尽管前述调节模块可以帮助在广泛水平上更好地控制基因的表达，但是它们不能在动态生长条件下的水平表达基因。为了解决这个问题，我们通过创建串联启动子开发了新的基因表达调控模块，所述串联启动子并入了上文实施例中所述的3-HP诱导型启动子表达模块。在自然界中，微生物使用串联启动子来维持某些分子的浓度，并在不同生理条件下的动态细胞生长期间调节蛋白质。我们将3-HP或小的酸诱导型启动子与一系列组成型或诱导型启动子结合在一起。启动子是天然的或合成的。在这里，我们开发了一个3-HP诱导型启动子与另一个启动子融合的文库，该启动子是天然的/合成的，和/或可以在指数/静止生长期激活基因。在某些情况下，串联启动子系统具有至少一个诱导型启动子和至少一个组成型启动子。
一旦它们被激活蛋白(类似于LysR)结合，则小酸诱导型启动子就会被3-HP激活。在表征调节3-HP(或类似的小酸)诱导型启动子系统的激活蛋白后，已确定这些启动子本身不适用于重组蛋白表达，因为它们以低强度表达靶蛋白。因此，通过产生随机的启动子突变，开发了显示出一系列表达强度的小酸诱导型启动子文库。通过在报告基因(绿色荧光蛋白(GFP))的上游克隆突变启动子来分析每个突变启动子的强度。通过对携带3-HP诱导型衍生突变质粒的菌株进行荧光测量来进行体内分析。简而言之，从预测的TSS的-51位置(第一个重复序列的开始)开始到-9区，对四个长度为10bp的序列块随机化。尽管前30bp(即从-51到-21)的突变并没有导致荧光的任何差异，但-21到-12之间的突变显著提高了荧光水平(最高约6倍)。因此，在-10区附近的突变随机化显著增强了启动子强度(图13)。该结果与计算机模拟预测一起强烈支持了我们对3-HP诱导型启动子的启动子元件的预测位置。
如本文所述，自诱导型启动子系统对于生化和生物燃料产生菌株中的酶表达和调控是有价值的，因为代谢途径可以通过途径的中间产物或终产物来增强，而无需添加任何额外的诱导剂。然而，自诱导型启动子的类型在细胞中非常有限，并且这些启动子通常产生弱的表达水平。可以进行诱导型系统的修饰(例如，通过修饰启动子元件或操作子区域)以实现更好的性能，但是必须小心进行以维持启动子的诱导型性质。我们试图通过使用包括串联启动子的表达盒来增加诱导型启动子的转录强度，同时保持启动子的诱导型特性。
我们设计了一个组合了诱导型启动子和组成型启动子的串联启动子表达盒。将包含控制kgsA基因的PmmsA和PhbdH-4启动子的串联启动子表达盒克隆到pUCPK’质粒中，而MmsR激活子则由其在染色体中的天然启动子产生。图17A示意性地描述了串联启动子表达盒，以及由启动子产生的两个mRNA转录物。通过串联方式组合两个启动子，如图17A所示，转录了两种mRNA转录物，一种来自PmmsA启动子，另一种来自PhbdH-4启动子，从而增加了kgsA mRNA转录物的数量。图17B显示，与单独的天然PmmsA启动子相比，串联启动子系统使kgsA的mRNA表达水平提高了1.75倍。图17C显示，与单独使用天然PmmsA启动子产生的酶活性相比，使用串联启动子系统导致KgsA酶活性增加了3倍。
当考虑串联构建体中每个启动子的翻译效率时，我们发现来自PhbdH-4启动子的一个转录本单元产生了两个单位的蛋白质/活性(比率为1：2)；而一个单位的转录物形式的PmmsA启动子则产生了一个单位的蛋白质/活性(比例为1：1)(见图17)。该结果表明，与PmmsA启动子的5'UTR区相比，PhbdH-4启动子的5'非翻译区(5'UTR)可能导致更高的翻译水平。串联启动子表达盒产生的每个转录物都继承了PhbdH-4的UTR区，与单独的每个启动子(PmmsA或PhbdH-4)相比，它可以显著提高翻译水平，从而导致KgsA的活性更高。因此，相对于单独的单个启动子，由于PmmsA启动子的贡献，PhbdH-4启动子的诱导性得以维持(如果略有降低)，由于组成型启动子，无诱导子的基础表达水平提高了，这对于在早期时间点表达通路酶是有用的。
图55A示出了用串联启动子构建的四种不同表达构建体，所述串联启动子包括至少一种3-HP诱导型启动子。这些将phpdH与Pc1或Pzwf启动子组合在一起。图55B显示基于DhaB活性，串联启动子具有不同的强度。
实施例13.UTR工程化
基于核糖体对这些元件的可及性，5'非翻译区(5'-UTR)和5'-近端编码序列在控制翻译起始速率和mRNA稳定性中起着重要作用。我们创建了PmAdH-4串联启动子表达盒的5'UTR和5'近端编码序列中的突变文库，目的是增加置于该系统控制下的基因产生的转录本的翻译。有几个因素使这些区域的诱变具有挑战性，包括这些区域的总长度以及翻译效率可能会降低的难易程度。RBS工程化是一种易于操作的方法，用于随机化RBS以调节核糖体对其结合位点的亲和力。但是，该方法仅修饰RBS中的6-9个核苷酸，应考虑翻译的其他重要组成部分(5'-UTR或5'-编码序列)。
已开发了一种计算机工具UTR Designer，用于精确预测翻译起始水平。该工具考虑了mRNA(35bp)的5'非翻译区(5'UTR)的折叠结构，结构基因的5'-近端编码序列(25bp)以及核糖体与Shine-Dargarno区之间的亲和力，以了解目标基因的翻译控制，从而可以设计修饰来改变翻译水平。我们使用该工具评估了特征组合用于改善PhbdH-4串联启动子表达盒的转录和翻译，包括我们生成的具有Opt-3和Hyb-20以及MmsR染色体表达的构建体(我们将其称为UTR-0)。如图19C所示，UTR Designer工具预测将增加12倍，这比我们在正常条件下(200rpm，37℃，25mM 3-HP)完全表达该系统时观察到的1.5到2倍的改善要高。(数据未显示)。为了阐明UTR修饰对翻译起始的影响，测量了相关基因(在这种情况下为KgsA)的表达水平。在SDS-PAGE凝胶上测量蛋白质的表达水平，我们有意避免添加诱导剂以将表达保持在较低水平，从而可以轻松区分各种UTR之间的差异。该实验仅考虑翻译起始作用。因此，无诱导剂的基础表达应为我们提供更好、更充分的评价依据。同样，通过使用低速摇床(150rpm)来限制生长条件，由此使蛋白质表达限制最小化。
如图19A-C所示，UTR工程化成功提高了靶蛋白的水平。图19A显示在对PhbdH-4串联启动子表达盒的5'UTR和5'近端编码序列进行的突变的文库中实现了广泛的翻译水平，并且当细菌在正常诱导条件(200rpm，37℃，25mM 3-HP)下生长时即观察到这些现象。我们发现，与天然PmmsA启动子相比，该功效可以显著提高(约30倍)。
如SDS-PAGE分析所测定的(使用BioRad Image Lab 2.2软件分析)，UTR-6构建体表现出最高的倍数变化，与UTR-0和PmmsA相比，水平分别提高了12.5倍和30.8倍。选择UTR-6整合到重组脱氮假单胞菌菌株的mmsA染色体位置(mmsR激活基因系统保持完整)。最后，如图18B和图18C所示，分别在转录水平(mRNA)和翻译水平(酶活性)上，以预期的2倍和1.7倍水平成功地观察到了从染色体进行的靶蛋白的表达。这一结果表明，UTR设计器是一种有希望的工具，它可以促进大范围的表达，甚至可以采用少量的变体实现靶基因的理想水平。
实施例14.密码子优化和蛋白质杂合
如果翻译系统运作不正常，那么即使采用有效的转录系统，蛋白质也可能无法有效产生。因此，优化转录和翻译控制通常用于产生足够的蛋白质水平。
密码子偏好与tRNA组成有关，并控制翻译的传播速度。密码子偏好通常会影响蛋白质的折叠。通常建议在克隆异源基因时使用偏好的密码子，但这通常会导致错误折叠、失活的蛋白质甚至包涵体的产生。在这些情况下，应考虑使用融合系统(杂合蛋白)来增加蛋白表达，防止蛋白水解性降解，提高溶解度并支持纯化。
如以上实施例中所述，使用PmmsA表达系统驱动基因表达导致同源mmsA基因和异源kgsA基因之间的表达水平不同。PmmsA表达系统在控制kgsA方面的较差表现可能来自于kgsA和mmsA基因的性质方面的差异(二级结构，翻译起始能力，密码子偏好性，溶解度)。我们修饰了kgsA基因以减少这些差异。
整个基因的密码子优化是增加翻译的一条常用途径。但是，这是一个昂贵且耗时的过程。因此本研究集中于仅优化异源基因的前十个密码子以增强翻译起始。我们使用GenScript生物信息学工具生成了高度表达的天然mmsA基因的密码子使用表，该表显示了MmsA中每个氨基酸的密码子频率水平。我们使用此信息，根据以下三个选项来修饰KgsA(异源蛋白质)的前十个密码子：(i)使用在mmsA中显示较高频率水平的密码子，(ii)使用显示中等频率水平的密码子，以及(iii)使用显示出与MmsA的前十个密码子相同的频率水平的密码子，并去除KgsA的稀有密码子(频率为0％)(表3)。
我们发现，根据选项3(Opt-3)进行的密码子优化在不存在或存在3-HP的情况下可以使KgsA活性提高30％。我们发现，通过保持所有前10个密码子的频率与mmsA基因(Opt-3)的频率相同，kgsA的翻译得到了改善。相反，增加某些密码子的频率，例如Opt-1和Opt-2中的第1、第4、第7和第9个密码子(表3)，表达没有增加，甚至略有减少。
表3：野生型kgsA的前10个密码子的频率和基于脱氮假单胞菌中mmsA的密码子使用优化的kgsA的前10个密码子的频率。
Figure BDA0002464690110001091
Figure BDA0002464690110001101
a使用显示高频率水平的密码子。
b使用显示中频率水平的密码子。
c使用显示的频率水平与mmsA的前10个密码子相同的密码子并除去稀有密码子。
通过在SDS-PAGE上产生蛋白质来证实结果(图21B)。
融合蛋白通常用于异源基因表达中，以增强蛋白质产量，减少蛋白水解降解并改善折叠和溶解性。我们将脱氮假单胞菌中高度表达的mmsA基因产生的MmsA的N末端与KgsA酶融合在一起。我们认为，通过在PmmsA启动子下游添加mmsA的5'编码区的部分，可以使异源基因(kgsA)转录本的翻译起始更加有效。由于我们担心将部分MmsA蛋白融合到KgsA上会对KgsA活性产生什么影响，因此将MmsA的长度变化5、10、15和20个氨基酸，分别对应于Hyb-5、Hyb-10、Hyb-15和Hyb-20菌株。结果表明，当与MgA融合的MmsA的长度增加时，KgsA活性增加，尽管一旦使用MmsA的15个氨基酸(Hyb-15)时这种效果趋于稳定(图17A)。与对照KgsA(无MmsA融合)相比，在3-HP存在下，Hyb-15融合蛋白的产量增加了约3倍。将MmsA的长度进一步延长到20个氨基酸(Hyb-20)并没有改善在系统被完全诱导时的表达；但是，Hyb-20菌株中蛋白质生产的基础水平提高了，这一结果被SDS-PAGE上KgsA的条带强度所证实(图17B)。
除了参与翻译起始外，靶基因的5'端还通过调控mRNA浓度而在控制转录物水平方面起着重要作用。测量没有和有MmsA的前20aa的N端融合(mmsA(20)kgsA)的kgsA转录物的稳定性(图17C)。用对照检查该表达。kgsA和mmsA(20)kgsA的半衰期分别为2.7分钟和5.4分钟，表明与野生型kgsA mRNA相比，mmsA杂合融合的kgsA mRNA更加稳定。发现mmsA转录物的半衰期约为6分钟，因此mmsA(20)kgsA稳定性的提高可能是由于与kgsA基因融合的mmsA5'末端编码部分(20个氨基酸)的保护作用所致。有趣的是，在我们测试的基因中，最稳定的转录物似乎属于mmsR，半衰期为9.5分钟(图17D)。
实施例15.辅酶B12的产生
辅酶B12是许多酶(包括甘油脱水酶，蛋氨酸合酶或甲基丙二酰CoA变位酶)的必需辅因子。甘油脱水酶(或二醇脱水酶)参与将甘油转化为3-羟基丙醛(3-HPA)，并且是从甘油生产3-HP(或其盐)或1,3-PDO所必需的酶。3-HPA可以进一步转化为其他工业上重要的化学品，例如1,3-PDO或3-HP(或其盐)。为了以商业规模连续地从甘油生产这些生物化学物质，必须不间断地供应辅酶B12。由于辅酶B12非常昂贵，因此我们检查了使用天然辅酶B12生产者从甘油生产3-HP的方法。据报道，有几种微生物可天然产生辅酶B12(包括肠杆菌，包括克雷伯菌属；链球菌属的物种，包括肺炎链球菌；假单胞菌属的物种，包括脱氮假单胞菌；根瘤菌属(Rhizhobium)的物种；中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的物种，包括苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)和红细菌属(Rhodobacter)的物种，包括荚膜红细菌(R.capusulatus)和类球红细菌(R.sphaeroides)等)。当我们测试这些微生物中的一些作为宿主从甘油产生3-HP时，所产生的辅酶B12的量不足以以高效价合成3-HP(每种产生<30g/L)。
注意到脱氮假单胞菌可以在不外部添加该辅因子的情况下以
Figure BDA0002464690110001121
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产生3-HP(或其盐)。但是，当该菌株补充有饱和量的辅酶B12时，可以产生约100g/L的3-HP。这些结果表明该微生物天然产生的辅酶B12不足以支持高效价的3-HP产生。经过仔细的分析并消除了辅酶B12合成中涉及的调控(mRNA中的二级结构)，发现其产量略有提高。辅酶B12的改善已通过前面各节中提到的各种测定方法得到证实。该重组菌株在用作宿主从甘油生产3-HP时，显示出在从甘油生产3-HP中有超过两倍的改善，为38.6g/L。
在下一个实验中，我们通过在培养基中补充少量辅酶B12来检查该菌株，结果如图50所示。我们注意到，当培养物中添加少量辅酶B12(10mg/L)时，3-HP产量从38.6g/L大幅提高到100g/L。该结果表明，由修饰菌株(IR1-RS1)产生的辅酶B12的量得到改善，但是不足以支持高效价的3-HP产生。
此外，为了改善辅酶B12的产生，我们需要增强参与辅酶B12合成途径的酶的活性。这可以通过改善辅酶B12的酶活性增强其合成途径来完成。可以通过增强其物理和动力学特性或通过改善其表达并增加其量来改善酶的活性。由于该途径与许多酶有关，因此最初我们增加了酶的量，并尝试增强辅酶B12的合成。为了增加细胞中该酶的量，天然启动子被上述合成改造的启动子代替。
在这项研究中，我们试图通过改善微生物的辅酶B12生产以支持以适合商业化的规模从甘油生产生物化学物质。为实现此目的，我们检查了天然的辅酶B12微生物生产者例如脱氮假单胞菌中的钴胺素基因簇，以了解各种辅酶B12-核糖开关(B12-核糖开关)对转录和翻译的调控。最初，我们使用软件确定了五个二级结构，这些结构可以由辅酶B12调节(见图23)。我们确定了这些结构中的四个是核糖开关。体外表征显示，其中仅仅三个核糖开关受到转录调控，它们位于cobG和cbtB基因上游(图23)。这些核糖开关受辅酶B12调节，因此添加钴胺素B12(浓度低至
Figure BDA0002464690110001131
)导致转录/翻译显著降低(见图28)。
另外，我们检查了位于cob基因簇I和II中的六个未表征基因(gst，xre，dahp，gntR，bgpM，cobA)是否参与了辅酶B12的合成(见图23)。我们发现，bgpM基因产物对于辅酶B12的生物合成至关重要。编码尿卟啉原甲基转移酶的cobA基因参与了辅酶B12生物合成途径中的一个重要分支点，因此，我们预期缺失cobA会阻碍辅酶B12的产生。但是，我们发现cobA缺失突变体可以合成大量的辅酶B12。当我们分析脱氮假单胞菌的基因组时，我们注意到存在几种可能替代CobA活性的CobA同工酶。
在本研究的第一部分中，我们描述了用于鉴定B12-核糖开关的方法，以及它们在参与辅酶B12合成的转录/翻译中的调控作用。我们还研究了通过调节核糖开关的调节来增强辅酶B12产生的方法。我们还通过用上述实施例中所述的合成表达模块(串联启动子，UTR，调节蛋白，高表达基因的N端区域)代替天然启动子来进一步改善辅酶B12的产生。这些修饰的菌株具有增强的辅酶B12产生，这有助于增加从甘油生产3-HP(或其盐)，而无需外部添加辅酶B12。
具有修饰的启动子的菌株显示出良好的辅酶B12产生，分析表明该菌株可以产生比野生型菌株高4倍、比核糖开关修饰的菌株高2倍的辅酶B12。当用含有3-HP合成途径酶的质粒转移该菌株时，它显示出在不添加辅酶B12情况下的3-HP产量显著提高。该菌株以高于90g/L的水平从甘油产生3-HP，但是与野生型菌株相比，其生长缓慢，这可能是由于辅酶B12合成途径中的修饰所致。在这项研究中，我们成功开发了一种突变菌株，该菌株可以产生更高量的辅酶B12，并可以支持更高效价的3-HP生产。
实施例16.各种假单胞菌属物种中B12基因的计算机分析和比较
为了了解基因的排列及其调控，我们比较了各种假单胞菌菌株中存在的辅酶B12基因簇。迄今为止，在有氧辅酶B12生物合成途径中所涉及的辅酶B12生物合成基因簇中已经鉴定出多达31个基因。其中，在酶水平上研究了脱氮假单胞菌的辅酶B12生物合成途径。基于对各种假单胞菌属物种的辅酶B12基因的组织的比较分析(图24)，发现脱氮假单胞菌ATCC 13867和铜绿假单胞菌PAO1菌株中的基因高度相似，平均序列同一性为73％。有趣的是，这些菌株在辅酶B12基因簇中还包含另外四个未表征的基因：gst，xre，dahp和bgpM。与其他假单胞菌菌株不同，在这两个菌株中编码镁螯合酶(chlID)的基因与xre基因一起分开定位。另外，嗜虫假单胞菌(P.entomophila)、恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌中的基因和基因的组织与脱氮假单胞菌相似。此外，这些菌株缺乏ton依赖性B12转运蛋白(btuB)，已知该蛋白可编码辅酶B12转运系统。同样，这些微生物中的操纵子cobGHIJ不受B12依赖性核糖开关结构的控制(图24)。
固氮菌(如箭菌属(Ensifer)/根瘤菌属物种)也被报道具有很高的B12生产能力。有趣的是，对脱氮假单胞菌SC510(和工业性B12生产者)、脱氮假单胞菌ATCC 13867和草木犀箭菌(Ensifer meliloti)之间的基因组织进行比较后发现，脱氮假单胞菌SC510和草木犀箭菌之间更为密切相关，并且与脱氮假单胞菌ATCC13867菌株非常不同。由于没有脱氮假单胞菌SC510的完整基因组序列，因此无法进一步研究这些差异。
除了了解脱氮假单胞菌中的基因组织外，我们使用Rfam数据库/工具鉴定了四个潜在的B12-核糖开关的存在。这些核糖开关结构的一个代表在图25A中显示，据信其可控制钴胺素生物合成的表达。这些B12-核糖开关各具有一个钴胺素结合共有结构域(调节结构域和受体结构域)，类似于大肠杆菌中存在的那个结构域，并且与肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)btuB B12-核糖开关相似。一个核糖开关(RS1)位于两个分开地定位的cobGHIJ和cobLFK操纵子之间，这些操纵子编码负责从前咕啉-2中间体形成hydrogenobyrinate的酶(除cobM基因之外)(图25A；见图23)。如图23所示，基于该位点处基因的重要性，我们假设在辅酶B12和西罗血红素生物合成节点之间的流转向中，RS1对基因间区域1(IR1)进行了严格控制。位于操纵子即cobWN和cbtBA-cobEM之间的两个B12特异性核糖开关结构(RS2和RS3)似乎独立地调节这两个操纵子的表达。最后，RS4位于cob操纵子(btuB-cobOBRDCQUP-bgpM-cobV)的上游，它包含11个基因，这些基因编码负责由hydrogenobyrinate形成Ado-Cbl的酶。
我们研究了这些核糖开关结构控制cob操纵子基因表达的机制。简而言之，核糖开关的保守区域J6/3和J11/10的相互作用使每个核糖开关都具有特异性，并能够以腺苷部分结合辅酶B12，而核糖开关的环L5和L13之间的相互作用改变了核糖开关的调节状态(请参阅图25A-25D)。
实施例17.辅酶B12感受核糖开关结构及其启动子系统的表征
核糖开关结构在转录延伸或翻译起始水平上调节基因表达。核糖开关在基因间区域内的位置决定了这些核糖开关结构的调控方式。我们注意到脱氮假单胞菌中的大多数B12核糖开关结构与启动子元件重叠，而不是与非翻译区(UTR)重叠，这表明这些核糖开关可能在转录水平上受到控制。因此，我们使用实时PCR对在指数后期收获的、在存在或不存在辅酶B12的条件下生长的脱氮假单胞菌培养物分析cob操纵子中选定基因(每个操纵子中的第一个基因)的mRNA水平。如所预期的，在存在辅酶B12的情况下，cob操纵子中的四个基因(cobG，cobW，cbtB和btuB)的mRNA水平被显著抑制(图26)。在RS3控制下的操纵子cbtBA-cobEM的转录被高度抑制了43.3倍。我们注意到该操纵子中的大多数基因不编码B12生物合成途径的结构基因(cobE，cbtBA分别充当推定的伴侣蛋白和钴转运蛋白)。值得注意的是，在不存在B12(未抑制形式)的情况下，编码操纵子的结构基因(cobGHIJ，cobWN和btuB-cobOBRDCQUP-bgpM-cobV)的转录水平比操纵子cbtBA-cobEM至少低3.3倍。从基因间区域的计算机分析中，尚不清楚RS1是否控制cobGHIJ/cobLFK操纵子或两者的表达。但是，基于mRNA水平，似乎RS1控制cobGHIJ操纵子的表达，但不控制cobLFK操纵子的表达。我们观察到cob基因簇中各种B12-RS的转录抑制的递减顺序为：cbtB-RS3>cobG-RS1>cobW-RS2>btuB-RS4。在cobLFK、chlID-xre和dahp操纵子中未发现抑制，这些结果与它们在这些操纵子上游缺乏核糖开关结构的事实相符。
我们怀疑这些核糖开关除了在转录水平上的调控外，还可能在翻译起始方面受到控制。此外，我们试图通过将cob操纵子的启动子和酶编码区(上游)之间的基因间区域克隆到质粒中来预测这些核糖开关的调控强度。对于这些质粒，我们在选自cob操纵子的二级结构位置的下游添加了绿色荧光蛋白作为报告蛋白(荧光标记)。构建了这些质粒系统的两个版本。一个版本中相应天然蛋白编码序列的前35bp与质粒中编码GFP的基因融合，另一个版本不具有这种融合。与未融合的gfp构建体相比，cobG的融合形式(cobG的前35bp与gfp融合)显示出4.2倍的荧光强度(图27，表6)。但是，当cobG的前35bp融合到gfp上时，我们观察到其他启动子系统(来自其他B12操纵子的基因间片段)产生的荧光水平没有显著差异，这表明它们不在翻译起始水平上受到控制。这些结果进一步表明，PcobG-RS1在转录和翻译起始水平上都严格控制基因的表达。转录和翻译的严格调控表明cobGHIJ操纵子中基因受控表达的重要性。
当过表达涉及几种基因的任何途径(例如维生素B12途径或涉及几种膜蛋白的途径)时，估计天然启动子的强度至关重要。具有许多基因的途径的过表达可能对细胞生长有害，并且途径基因/操纵子的不平衡表达可能导致毒性途径中间体的积累。天然启动子强度的分析和定量可以帮助我们重新设计带有合成启动子的操纵子，而不会在工程化过程中过度表达途径酶。表5显示了我们在操纵子中观察到的各种天然cob启动子的估计启动子强度(相对于荧光单位)。在该组中，控制钴转运蛋白基因表达的启动子PcbtB具有最高的强度，而PcobL启动子具有最低的强度。编码甲基转移酶的基因通常是由弱启动子系统组成的。
表6：脱氮假单胞菌中cob调节子基因间区域的表征。
Figure BDA0002464690110001171
工程化处理辅酶B12的生产途径
B12启动子的合理工程化需要量化启动子强度及其UTR结构(融合和未融合的版本)。因此，对编码辅酶B12合成途径酶的Cob操纵子的天然启动子强度进行了精确定量(图27，表6&10)。此外，为了增加这些(cob)基因的表达水平(相对于它们的天然表达增加3倍和5倍)。通过用合适的组成型启动子替换来修饰cob操纵子的表达(图57)。通过筛选并鉴定几种天然假单胞菌启动子的强度来选择组成型启动子(表10)。例如，为了开发具有三倍提高的启动子强度的Pedd-IR13-PsucA重组菌株，分别用组成型启动子Pedd和PsucA代替PcobG和PcobL(更多信息参见表8)。
表10.B12启动子替换策略
Figure BDA0002464690110001172
Figure BDA0002464690110001181
实施例18.基于核糖开关的B12传感系统的开发
维生素B12定量方法通常包括微生物学测定法和采用紫外检测的高效液相色谱(HPLC)。HPLC方法可以检测高浓度(高于μM水平)的B12，但是微生物分析可以检测非常低浓度的B12(低至nM水平)。微生物学测定法基于B12作为鼠伤寒沙门氏菌metE–cbiB–的某些突变菌株中的生长因子。简而言之，这些微生物的生长与B12的浓度成正比。但是，基于细胞生长的B12定量受多种生理因素的影响，例如培养基和孵育时间。因此，基于细胞生长的辅酶B12定量很繁琐且难以复制。
在本研究中，我们发现在五个推定的B12核糖开关结构中，在启动子PcobG'和PcbtB之后发现的两个核糖开关结构可以在存在和不存在辅酶B12的情况下显示下游基因的差异表达。此外，通过使用各种浓度的辅酶B12(最高100nM)评估了这些核糖开关的动力学范围，以验证其作为新型B12感受器的潜力。注意到B12浓度与GFP荧光呈线性相关，其关断点约为5nM钴胺素B12(图28)。在存在和不存在B12的情况下，B12核糖开关PcobG’和PcbtB的差异表达约为2.1和1.7倍。与基于生长的B12检测相比，基于荧光的B12检测方法可重现，方便且省力。
实施例19.辅酶B12定量生物测定：
将脱氮假单胞菌以初始OD600为0.1在M9基本培养基中生长，该培养基含有NaCl1g/L，NH4Cl 1g/L，MgSO4 2mM，葡萄糖酸钠10g/L，并补充了5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)0.1mM，甜菜碱1g/L和微量元素H3BO3 0.232g/L、ZnSO4·7H2O 0.174g/L、Fe(NH4)2SO4·6H2O0.116g/L、CoCl2·6H2O 0.025g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.022g/L和CuSO4·5H2O0.008g/L、MnSO4·4H2O 0.008g/L。在指数期收获细胞，并通过FastPrep-24TM 5GHomogenizer系统(韩国MP Biomedicals)破碎。将细胞裂解液在30分钟内以13,000rpm离心，收集上清液并通过0.2μm膜滤器灭菌。所获得的裂解物溶液用于生物测定。通过使用鼠伤寒沙门氏菌metE-cbiB-突变株来定量辅酶B12。简而言之，在鼠伤寒沙门氏菌中，metE编码不依赖于B12的蛋氨酸合酶，而cbiB编码腺苷钴胺磷酸合酶，这是B12合成途径中必不可少的酶。这些基因的突变使鼠伤寒沙门氏菌成为B12或蛋氨酸的营养缺陷型。将指示菌株鼠伤寒沙门氏菌metE-cbiB-在含有0.5g/L NaCl；Na2HPO4，6克/升；KH2PO4，3克/升；NH4Cl 1克/升；葡萄糖4g/L；MgSO4 2mM；CaCl2 0.1mM，并补充有50mg/L甲硫氨酸的基本培养基中预培养。将过夜的培养液离心并用水洗涤。在基本培养基中，接种洗涤的细胞至初始OD 600为0.01。将测量B12所需的细胞裂解液添加到培养液中。指示菌株的生长反映了样品中辅酶B12的浓度。改变辅酶B12的浓度以形成标准曲线。B12浓度的动态范围是0到100pM B12。B12的浓度表示为每1OD600的nM数。
实施例20.鉴定bgpM为B12合成的必需基因
为了全面了解cob生物合成操纵子中基因的必需性，研究了cob基因簇中几个未表征的基因(如gnt，gst，xre，dahp和bgpM)对于B12生物合成的必要性。为了阐明这些基因对于B12生物合成是否必需，创建了每个基因的单敲除突变体。使用上述实施例中描述的B12特异性核糖开关感受器系统和常规鼠伤寒沙门氏菌基于metE–cbiB–的B12分析系统(参见材料)，研究了这些突变菌株的B12生物合成能力。由于辅酶B12的生物合成涉及其金属中心的钴，因此其生物合成取决于CoCl2的浓度。当这些突变株用浓度升高的CoCl2(最高50μgL-1)培养时，除bgpM突变株外，GFP的荧光成比例地降低(图29A)。这些结果表明，除了bgpM之外，这些突变菌株中的每一个都可以合成与野生型菌株相似的辅酶B12。bgpM的基因产物在脱氮假单胞菌中辅酶B12的生物合成中起着至关重要的作用。但是，其在B12生物合成中的确切作用尚待阐明。还使用鼠伤寒沙门氏菌作为指示菌株进行了必需性分析。定量由这些突变菌株合成的辅酶B12的细胞内浓度(图29B)。与脱氮假单胞菌中的结果相似，只有bgpM突变体无法合成(或只能合成痕量的)辅酶B12(比野生型菌株低约7倍)。基于这些结果，位于IR2的基因(见图23)对于B12生物合成不是必需的。因此，这些基因的过表达可能无法有效地增强辅酶B12的产生。出人意料的是，cobA缺失突变体(编码尿卟啉原甲基转移酶)，是B12生物合成途径中的重要分支点，仍可以合成辅酶B12(图29B)。经过进一步分析，我们确定了脱氮假单胞菌基因组中几种CobA同工酶的存在，它们可能替代了CobA在脱氮假单胞菌中的作用。
实施例21.通过缺失核糖开关结构来改善辅酶B12的产生
为了提高B12的生产，单个缺失所有核糖开关结构中的已确定的负调控结构域(P5-L5区域)。在存在和不存在辅酶B12的情况下，对由这些核糖开关缺失的突变体产生的mRNA水平进行定量(表7)。在大于5nM的辅酶B12存在下，由于脱氮假单胞菌菌株中的核糖开关，cob操纵子转录可受到抑制，而在核糖开关突变菌株中，辅酶B12的存在可导致产生更多的辅酶B12。因此，通过测量由这些突变菌株合成的B12的量，将更容易评估由于核糖开关的突变而导致的辅酶B12生物合成基因的增强。有趣的是，与野生型菌株相比，RS1(核糖开关1缺失)和RS2/RS3(核糖开关2和3缺失)突变体中辅酶B12的产生没有显著差异。但是，与野生型相比，RS4(核糖开关4缺失)突变体中的辅酶B12存在显著差异。在RS4菌株中基本上抑制了辅酶B12的产生。以上结果表明，RS1和RS2/RS3中的缺失不影响辅酶B12的产生，而RS4缺失实质上降低了辅酶B12的产生。一种可能性是，随机选择用于突变的核糖开关1、2和3中的区域不足以消除功能，因此我们在RS1和RS2/RS3突变菌株中未发现辅酶B12产生的任何变化。另一方面，由于核糖开关与编码区重叠，RS4中的突变可能影响蛋白质表达。为了克服此限制，我们没有开发缺失突变体，而是修饰了核糖开关区域，在该区域中，mRNA中的二级结构被突变性中和，并同时通过密码子优化来维持蛋白质序列。
表7：在存在和不存在25mg/L CoCl2的情况下B12合成基因的转录水平。
Figure BDA0002464690110001211
我们使用软件设计了序列，化学合成了核酸并将其替换在基因组中，以避免在cobmRNA(编码辅酶B12合成途径的酶)中形成二级结构。通过改变每个核糖开关或核糖开关的组合，我们开发了七种重组菌株。有趣的是，我们注意到当缺失了核糖开关1(ΔRS1株)后，可注意到细胞生长和辅酶B12产生的略微下降。这可能是由于某些有毒中间体的积累。但是，缺失核糖开关2和3(ΔRS2/ΔRS3)或核糖开关4(ΔRS4)并不能提高辅酶B12的产生。这可能是由于上游途径碳通量的限制。但是，当通过核糖开关2和3(ΔRS1ΔRS2/RS3)或通过核糖开关4(ΔRS1ΔRS4)缺失了核糖开关1时，辅酶B12的产量略有提高。而且，缺乏所有核糖开关的突变菌株显示出相对较高的辅酶B12产生(表8)。
这项研究表明，通过去除cob mRNA的二级结构，可以提高脱氮假单胞菌生产辅酶B12的能力。当将具有改善的辅酶B12生产的突变菌株用作宿主以从甘油生产3-HP(或其盐)时，它产生的3HP<38.6g/L(表8)。该突变菌株产生的3-HP效价略高于野生型菌株，后者产生<30g/L。与野生型菌株相比，突变菌株从甘油产生3-HP的提高可归因于辅酶B12途径的改善。当该突变菌株在培养基中外部补充10mg/L的辅酶B12时，该菌株可以以
Figure BDA0002464690110001221
的水平从甘油产生3-HP(图50)。这些实验清楚地表明该突变菌株具有增加的辅酶B12产生，但是，可以对该菌株进行进一步修饰以更显著地提高更高效价的3-HP的产生。
为了进一步改善辅酶B12的产生，将核糖开关突变体菌株中cob操纵子的天然启动子替换为上述实施例中所述的合成表达模块(串联启动子，UTR，调节蛋白，高表达基因的N末端区域)。cob基因簇的分析显示，存在五个控制B12生物合成途径中基因表达的启动子，通过单独或组合替代天然启动子开发了几种重组菌株，如表8所示。选择用于启动子替代的启动子如表10所示。每个启动子的替换显示了辅酶B12产生的少量改善，但是，当所有的启动子都被合成基因表达模块替换时，发现辅酶B12有了实质性的改善。当将此菌株(PhpdH-Pedd-IR15-PsucA-PhpdH:PhpdH-Ptkt-IR45-Psp2-PhpdH)用作宿主以在生物反应器中由甘油生产3-HP时，该菌株能够产生约100g/L的3-HP，类似于在生物反应器中向野生型脱氮假单胞菌外部补充辅酶B12(最高50mg/L)以产生工业量的3-HP时产生的3-HP的量(参见图50)。因此，我们成功开发了重组脱氮假单胞菌菌株，该菌株可以合成更多量的辅酶B12，继而支持从粗制甘油商业规模生产3-HP，而无需外部补充辅酶B12。由甘油产生3-HP的生产成本大大降低了，因为3-HP的生产成本中有近38％归因于向培养基中外部供应辅酶B12的成本。
表8.关于各种辅酶B12过生产脱氮假单胞菌菌株的开发和评估的总结。
Figure BDA0002464690110001231
I.核糖开关破坏
Figure BDA0002464690110001232
II.采用组成型或诱导型启动子进行代替
Figure BDA0002464690110001233
Figure BDA0002464690110001241
III.串联启动子
Figure BDA0002464690110001242
实施例22.醛脱氢酶表达盒的开发
醛脱氢酶(ALDH)催化3-HPA转化为3-HP(3-HP合成途径中的第二个反应)。为了使3-HPA(其是有毒的)在细胞中的积累最小化，ALDH的表达(例如，通过kgsA基因)应维持在比甘油脱水酶(DhaB)更高的水平。另外，为了将ALDH整合到染色体中，其表达被增加到甚至更高的水平(以追踪从质粒观察到的基因表达)。为此，将包含上述实施例中所述的诱导型串联启动子系统的表达模块/盒用作基础启动子，以驱动表达ALDH的基因(例如，kgsA)，并进一步开发。如上文实施例所述，通过各种遗传改变来改变/改善ALDH表达盒的强度。总而言之，表达模块/盒具有以下特征：(i)串联启动子，其中一个启动子是诱导型的，另一个启动子是组成型或诱导型的，其中这些启动子可以是宿主微生物天然的或合成的；(ii)启动子区域中活化蛋白的结合(操作子)位点的突变(随机化)；(iii)活化蛋白表达水平的改变；(iv)可变长度的融合体，其中高表达的天然蛋白质(例如MmsA)的N端的一部分与ALDH融合，并且对ALDH的前10个密码子进行密码子优化(根据宿主微生物，例如脱氮假单胞菌的密码子用法)；和(v)5’-非翻译区(UTR)工程化(对于表达系统的遗传修饰的示意图参见图30A；对于将ALDH表达基因整合到染色体中的表达系统参见图30B)。
实施例23.DhaB-GdrAB表达盒的开发
将dhaB和gdrAB基因整合到脱氮假单胞菌的染色体中，并且通过提高转录和翻译效率来提高它们的表达水平。为避免3-HPA积累，dhaB和gdrAB的表达水平应低于ALDH。为了实现这一点，相对于用于产生ALDH的启动子，具有中等强度的3-HP诱导型启动子被用于驱动dhaB和gdrAB基因的表达。表达盒的设计如下：(i)UTR工程化；(ii)使用串联启动子，其中一个启动子是组成型而另一个是诱导型的；(iii)修饰组成型启动子；(iv)修饰诱导型启动子(-10和-35盒)和激活蛋白HpdR的结合(操作子)位点；(v)激活蛋白表达水平的变化(关于表达系统的遗传修饰的示意图，参见图31A；有关用于将DhaB整合到染色体中的表达系统参见图31B)。
因此，实施例22中所述的醛脱氢酶表达盒和此处所述的DhaB-gdrAB表达盒被用于通过重组菌株从甘油生产3-HP。
实施例24.使用脱氮假单胞菌从质粒表达ALDH和DhaB
用不同的质粒组合转化脱氮假单胞菌Δ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhIpUCPK’，以表达DhaB和KgsA。质粒带有不同强度的不同表达模块。因此，测试了驱动DhaB和KgsA表达的一系列不同强度的启动子，以便找到这样的DhaB和KgsA表达模块，这些模块将共同产生大量的3-HP。为了尽量避免3-HPA积累，同时仍允许显著的3-HP生产和细胞生长，将较低强度的表达模块用于DhaB，GdrAB表达，而将较高强度的表达模块用于KgsA表达。
在产生的所有菌株中，一种称为P1-1的菌株在生物反应器实验中显示出大量的3-HP产生(参见表9)。但是，在该菌株中，我们确定了ALDH活性相对较低，并且在发酵的早期出现了有毒的中间体3-HPA。使用P1-1作为参考菌株(具有DhaB，GdrAB和KgsA的参考表达水平)，我们接下来试图通过增加ALDH的质粒表达水平来减少3-HPA的积累。我们通过使用上述实施例中描述的各种基因表达盒开发了一系列表达较高ALDH水平的质粒。将这些质粒引入脱氮假单胞菌中，以产生菌株P1-1x(x＝a，b，c，d，……)。与P1-1菌株中2.5U/mg蛋白的ALDH活性相比，新开发的重组菌株的粗细胞提取物中的ALDH活性增加到10至19U/mg蛋白。评价了重组菌株在生物反应器规模上的3-HP生产。
表9.从质粒表达KgsA和DhaB的脱氮假单胞菌菌株的评估
Figure BDA0002464690110001261
a用25mM 3-HP诱导后4h从烧瓶实验中测量。
b来自生物反应器实验。
实施例25.具有ALDH表达模块的染色体整合和游离型DhaB表达模块的脱氮假单胞菌的开发
ALDH整合菌株的开发：
已知整合的染色体位置会影响整合基因的表达水平，应谨慎选择。通常，由于基因剂量效应，当位于更靠近复制起点时，基因表达更高。首先整合kgsA基因以取代距离复制起点约3,000Kb的内源mmsA基因。染色体上的mmsA基因表达单位(即基因间区域和mmsA)被kgsA表达盒取代(参见图30；表达盒具有串联启动子(mmsA的20个氨基酸融合到kgsA的N端)(杂合蛋白)；kgsA的前10个密码子的密码子优化；以及修饰的UTR(UTR-6))，以创建第一KgsA整合菌株(命名为P2-0)；对于P2-0，使用野生型kgsA。
通过改变整合位置，可以开发出更多的整合菌株(例如P2-0，P2-10，P2-20和P2-30)(见图32)。对于这些菌株，使用融合kgsA基因(例如，mmsA的20个氨基酸与kgsA基因的N末端融合)。研究了kgsA在染色体不同位置的许多菌株，例如远离复制起点
Figure BDA0002464690110001271
Figure BDA0002464690110001272
这些菌株没有表达DhaB的质粒。用25mM的3-HP诱导菌株4小时，并测定KgsA活性。图32显示了其中突变kgsA位于最靠近复制起点的P2-10产生最大的KgsA1活性(24U/mg)。突变体kgsA插入与P2-0菌株(野生型kgsA)相同的染色体位置的P2-30菌株产生的蛋白质比P2-0菌株更多(分别为15U/mg和10.8U/mg。)。结果表明：(i)在相同的染色体位置整合后进行测试时，突变体KgsA1的活性高于KgsA的活性，并且(ii)ALDH活性随其染色体整合的位置而显著变化(图32)。
改变从质粒的DhaB表达和染色体整合的KgsA的表达：
DhaB和ALDH的比例可以通过调节质粒中附加体DhaB的表达和/或染色体整合的ALDH的表达来改变。仅重组P2-0和P2-10菌株被含有DhaB表达盒(pUCPK主链中的dhaBgdrAB)的质粒修饰(表11)。表11中描述的P2菌株在用于表达DhaB表达盒的启动子系统上不同。用于P2-1至P2-5的启动子如下：Pc3，具有UTR设计的Pc3(即，如本文所述的改良型UTR)，具有UTR设计的Pc3-Pc1，具有UTR设计的Pc1-Pc3和具有UTR设计的Pc3-Pzwf。这些启动子系统的启动子强度按升序变化。
表11.用染色体ALDH和附加体DhaB评价脱氮假单胞菌菌株
Figure BDA0002464690110001281
a用25mM 3-HP诱导后4h从烧瓶实验中测量。
b来自生物反应器实验。
实施例26.具有ALDH和DhaB的染色体整合的重组脱氮假单胞菌的开发
优化DhaB/ALDH比率：
开发了具有整合到染色体中的DhaB-GdrAB和KgsA表达盒的重组脱氮假单胞菌菌株。如以上实施例所述，ALDH活性随kgsA基因插入的染色体位置而变化(图32)，并且我们开发了几种ALDH整合物，显示出不同的活性(P2-10，P2-20，P2-30)。我们将DhaB-GdrAB表达盒整合到实施例25中所述的P2-10和P2-20重组菌株中。DhaB-GdrAB表达盒的染色体整合位点的位置相对于重组菌株中KgsA表达盒而言有不同。例如，通过将DhaB-GdrAB表达盒(参见图31B)整合到宿主P2-20的染色体(参见图32和37)中来开发P4-1整合菌株。在P4-1菌株中，DhaB-GdrAB盒被整合到距复制起点约4,150kb的位置。P4-1菌株从染色体上高表达DhaB和KgsA(表12)。通过改变KgsA，DhaB或KgsA和DhaB二者的表达，开发了其他菌株以优化DhaB和KgsA活性之间的比率。我们还采用P2-10菌株，并整合了DhaB-GdrAB盒(用于P4-1的相同盒)，从而产生了P4-2菌株(图33)。
此外，为了相对于KgsA表达而减少DhaB表达，修饰了P4-1和P4-2中DhaB盒的启动子区域。我们选择了较弱的启动子来表达DhaB盒(参见实施例10)。这样分别得到了两个新的整合株，P4-3和P4-4(图33)。表12总结了每种菌株中的DhaB和KgsA活性。在菌株P4-3和P4-4中使用的串联启动子Pc3-Pzwf的启动子强度低于P4-1和P4-1菌株中使用的Pc1-Pc3串联启动子。在P4-5和P4-6菌株中，用于KgsA表达的启动子强度减弱。
表12.对具有KgsA和DhaB染色体整合的重组脱氮假单胞菌
菌株的评估
Figure BDA0002464690110001291
a用3-HP诱导后4h从烧瓶培养物中测量。
b根据生物反应器实验测量。
实施例27：DhaB和KgsA的通道化
在细菌中观察到编码一种途径的酶的基因的成簇排列，以避免特定途径的中间体在细胞中积累。重要的是要注意，在诸如细菌的原核生物中，转录和翻译是同时发生的。在大多数情况下，第一种酶的产物将成为第二种酶的底物。如果这些基因彼此靠近，则第二种基因/酶的底物将位于其附近。这种机制可以通过立即被第二种酶消耗来提高途径的效率，并避免中间体的毒性(如果有)。这种相互靠近的基因成簇被称为通道效应(channelingeffect)。为了提高3-HP的产生和细胞活力，我们通过DhaB和ALDH酶引导3-HPA，以减少其他酶和细胞组分对有毒3-HPA的暴露。我们试图建立一个系统，其中3-HPA被快速催化为3-HP。为此，我们研究了改变DhaB和kgsA(ALDH)在染色体中相对于彼此的位置以促进3-HPA的通道化。在一种菌株中，dhaB、gdrAB基因和kgsA所处位置彼此相邻。在另一株中，kgsA的位置与DhaB和GdrAB编码基因相距2000bp以上。如上所述，基因在染色体上各个位置的定位会显著影响表达和活性。当将kgsA放置在不同位置时(靠近DhaB，GdrAB(菌株P4-20)，与DhaB、GdrAB相距2000bp(菌株P4-10))，我们注意到酶活性存在巨大差异。两种菌株(具有(P4-20)和没有(P4-10)通道效应)均显示出相似的KgsA和DhaB活性。这两个菌株之间的唯一区别是基因的位置，用于研究通道化效应(图51)。
3-HPA对细胞代谢和3-HP产生的通道化效应。
我们检查了两种菌株(具有(P4-20)和没有(P4-10)通道化效应)，它们在3-HP生产中显示出明显差异。与基因位于染色体上间隔2000np的P4-10菌株相比，基因彼此靠近的P4-20菌株显示出更高的3-HP产生速率和改善的3-HP效价。在这些菌株中，还发现有趣的1,3-PDO的边际差异。与P4-20相比，P4-10的1,3-PDO产量略高。这可能是由于较高的3-HPA积累诱导了氧化还原酶。在基因彼此相邻的P4-20菌株中，低1,3-PDO和高3-HP表示DhaB酶产生的3-HPA立即被紧邻的KgsA酶消耗，不会允许3-HPA积累。
实施例28.重组生物中3-HP的生物生产条件
3-羟基丙酸已被认为是潜在的工业化学品，可用作平台化学品来衍生工业上重要的商品化学品。作为商品(散装)化学品的前体，其生产必须便宜且经济。对于3-HP或其盐的生物生产，尽管开发了几种好的重组菌株，但是，当在分析级培养基中培养时，这些菌株中的大多数表现出良好的性能。分析级介质价格昂贵，不适用于散装化学品的商业化。因此，应配制使用廉价培养基成分的工业培养基，以辅助重组菌株以商业规模从甘油生产3-HP。而且，重组菌株的性能高度依赖于生理/生物过程条件。因此，随着工业培养基的发展，应仔细优化生理/生物过程条件，以实现靶产品的高效价。
用于培养微生物的培养基是许多无机和有机化学品的组合。要配制良好的培养基，重要的是了解重组菌株的代谢和目标产物的特性。为了开发廉价的培养基，使用了几种含有显著量的不需要的有毒物质的低级别原料。这些有毒物质或者通过降低其生长和生存力来影响菌株的性能，或者会干扰目标产物的纯化。因此，选择适合该工艺的培养基成分的正确组合是艰苦的，但非常重要。在这项研究中，我们仔细选择和筛选了几种成分，并仔细分析了每种成分以配制工业培养基。
除工业培养基配方外，应在生物反应器条件下研究和优化生物工艺条件，例如温度，pH，通气等。已通过在受控条件下改变生理参数进行了分析性研究了对3-HP的生产至关重要的细胞代谢和NAD+再生。考察了pH的影响，其中pH在提高重组菌株的耐酸性和3-HP生产途径的酶效率中起着至关重要的作用。仔细研究了曝气、温度和诱导时间的优化，因为每个生理参数都会显著影响3-HP的产生。通过生物工艺优化，实现了重组菌株从甘油生产3-HP的性能的良好改善。
pH
除了开发有效的重组菌株外，以商业上有意义的效价生物学生产有机酸的另一个严重挑战是处理这些酸对产生这些酸的微生物的细胞生长和细胞代谢的毒性作用。众所周知，大多数弱酸都具有抗菌性能。已经提出了有机酸的抗菌活性的几种机制。一种这样的机制包括细胞内pH扰动或质子引起的细胞内pH降低，引起酸毒性。
在连续生产有机酸的过程中，有机酸会在培养液中积累，因此未分解形式的浓度会根据Henderson-Hasselbalch方程而增加。这种未解离的酸形式很容易穿过质膜，并在进入细胞质时解离成质子和相应的阴离子。释放的质子降低了细胞质的pH，而据报道，阴离子会影响特定的代谢并导致生长受损。关于酸毒性的数项研究已显示可降低产生有机酸产物的微生物的细胞质pH。
对于商业化而言，影响高效价的3-HP微生物合成的重要因素是其毒性(有机酸毒性)。3-乳酸是乳酸的异构体，据报道，由于其酸度较弱或pKa值高0.64，因此毒性比乳酸高约4.4倍。当生长抑制与通过Henderson-Hasselbalch方程计算的未离解或质子化的游离酸浓度相关时，这两种酸没有明显的差异。Chun等提示小弱酸对生长的抑制主要是由质子效应即细胞内质子浓度的增加(而不是阴离子效应)引起的。在这项研究中，建议适当增加培养基的pH值，以通过降低培养基中的游离酸浓度来减轻酸的毒性。
本研究中使用的重组菌株是嗜中性粒细胞，在pH6.8至7时具有最佳生长，但是该菌株进化适应于在pH7.5下生长。我们感兴趣的目标产物是酸(3-HP)或其盐，这些重组微生物在细胞质中产生目标产物并将其分泌到培养基中。微生物不间断地产生和分泌酸会导致培养基的pH值大大降低，这已在前面的部分中进行了详细说明。为了连续生产3-HP或其盐并维持细胞活力，应将培养基保持在中性pH。因此，为了维持pH，在细菌生物反应器研究中已经使用中和碱。在细菌生物反应器研究中通常使用强碱(例如NaOH，KOH或甚至NH4OH)来维持pH值。当分别使用NaOH或KOH时，使用这种强碱会导致盐的积累，例如Na+或K+。据报道，这种高浓度盐的累积对细胞生长及其代谢具有毒性。另一方面，使用氢氧化铵或碳酸氢铵中和酸的产生，含氨的中和碱的优点是NH3+可以作为氮源被微生物消耗。据报道，碳酸氢盐对中枢代谢有影响，会增加通向TCA循环的通量，从而改善细胞生长和活力。因此，使用基于碳酸氢盐的中和剂来开发用于3-HP生产的商业上可行的生物工艺。
使用不同的碱NaOH、KOH和NH4OH进行了通过重组菌株从甘油生产3-HP或其盐的生物反应器实验，以研究其对细胞生长和3-HP产生的影响(图35)。用NaOH和KOH作为中和碱的培养物显示几乎相同的结果。用NH4OH进行的生物反应器研究显示出与这些研究中使用的其他中和碱相似的最终效价。但是，仔细分析从NH4OH获得的结果表明，在最初的22小时生物反应器研究中，生长和生产力均得到改善。有趣的是，使用NH4OH22 h后，生产力下降了，这可能是由于NH3+积累的毒性所致。NH4OH显示出更高的细胞生长的原因可能是由于NH4OH的利用导致NH3+的同化。另一方面，22小时后3-HP生产率较高，并且与以NaOH/KOH作为中和碱一致。结果促使人们开始用NH4OH进行培养，以便在早期获得良好的生长和更高的生产率，并在22h后将碱改成NaOH，以实现持续稳定的生产率。使用该策略进行了实验，结果如图52所示。结合两个中和碱导致较高的生长以及较高的3-HP效价。该实验导致在48小时内产生>90g/L。
如上所述，避免酸毒性的重要因素是避免未解离形式的酸的积累。这可以通过两种方法来完成：1)通过将pH值提高到远离有机酸的pKa值，如前所述进行了检查，2)通过降低酸积累的浓度。为避免酸在培养液中积累，最合适的选择是在生产时从培养液中提取酸。由于经济上的不舒适性，该方法实际上是不可行的。另一种方法是稀释培养液，以便降低浓度，这将导致减少未分解形式的有机酸。根据Henderson-Hasselbalch方程，可以通过高pH或通过降低培养基中酸的浓度来显著减少酸的未离解形式。在先前的实验中，我们优化了pH条件，因为非常高的pH不适合细胞生长。在这里，在这项研究中，我们研究了第二种方法。为了研究这些实验，我们着重于稀释中和碱。在我们的实验中检查的各种中和碱中，我们注意到氢氧化铵给了最好的结果。因此，对于降低3-HP浓度并增加3-HP量的实验，使用氢氧化铵作为中和碱。该策略是通过使用稀释的中和碱来稀释培养基中的3-HP浓度。在先前的实验中，15％的氢氧化铵导致浓度>100g/L，总产量为280g(量)3-HP。在下一组实验中，使用浓度分别为10％、7％和3.5％的氢氧化铵稀释液，分别产生72、61和54g/L的3-HP效价。但是，总产量分别为295g、304g和326g。这些结果表明，降低培养液中的酸浓度可以通过增加重组细胞产生的酸总量来提高酸产生。另一方面，当使用氢氧化铵中和酸的产生时，含氨的中和碱的优点是微生物可以将NH3+用作氮源。
在一项研究中，我们通过适应性突变开发重组菌株以在更高的酸性浓度下生长。通过补充一定浓度的有机酸(在这种情况下为3-HP)，在有机酸生产培养基中培养产生3-HP的重组菌株。注意到当重组菌株在补充有30g/L3-HP的培养基中生长时，与不补充任何有机酸的培养物相比，该培养物显示出延迟生长。但是，重组菌株在补充少于30g/L的培养基中，细胞生长或比生长速率没有显著差异。因此，将30g/L 3-HP视为重组菌株的毒性浓度。为了适应性进化，将重组菌株在补充有30g/L的培养基中重复培养，直到比生长速率增加并与不补充3-HP的培养基中的培养物匹配。一旦各培养物之间的比生长速率可比，则将适应的菌株转移到补充有更高浓度的3-HP(>30g/L)的新鲜培养基中。将该适应性进化过程重复几次，直到达到适当的比生长速率为止。有趣的是，随着培养基中3-HP浓度的增加(>50g/L)，这些重组菌株需要更长的时间(重复培养的次数)才能适应并达到更高的比生长速率。这些重组细胞适应了高达80g/L的3-HP(图36)。
使为3-HP或其盐生产而开发的重组菌株适于在补充有80g/L 3-HP的工业培养基中生长。然而，对我们来说重要的是要了解在这些采用的菌株中激活的耐受机制。该机制是否对3-HP耐受非常特异，还是对几种有机酸耐受。为了证实这一点，通过补充50g/L浓度的其他有机酸，例如乳酸、乙酸、丙酸、丙酮酸、2-羟基丁酸和3-羟基丁酸，使适应的菌株在工业培养基中生长。结果示于(图37)。有趣的是，注意到适应的菌株对本研究中检测的其他有机酸表现出一定程度的耐受性。这些结果证实，酸毒性是由于与阳离子相比产生的质子。通过研究组学对适应的微生物中这些有机酸耐受性的具体机制的鉴定正在进行中。
如前所述，在一些研究中已经报道了酸毒性是由于未解离形式的酸的浓度增加所致。根据Henderson-Hasselbalch方程(HH方程)，随着较高浓度的酸的积累，未解离形式的浓度增加。然而，根据Henderson-Hasselbalch方程，当pH增加而远离pKa值时，未解离形式的酸显著减少。考察了较高的pH值对耐酸性的影响及其在重组菌株中的产生。如图38所示，将从适应性进化实验中分离的重组菌株在pH范围从6.8到8.0的不同pH值(间隔0.2pH)的培养基中生长。
结果显示，随着pH的增加，3-HP效价和比生产速率依次提高。然而注意到细胞生长受到pH增加的实质影响。高于7.4pH时，重组菌株显示细胞生长下降。因此，使从酸适应性实验分离的重组菌株(适应于80g/L的3-HP)进一步在维持较高pH值的培养物中适应。这些重组菌株的最佳pH为7，因此，这些菌株在具有较高pH的培养基中反复生长，直到其比生长与在7pH下生长的培养物相当为止。通过该程序，酸耐受性菌株适应于在pH7.6下的生长与在pH7下生长的培养物相同的比生长速率。有趣的是，即使我们尝试了几次适应性进化研究(图38和图39)，当我们尝试使细胞在7.6pH以上适应时，重组细胞的比生长速率也没有提高。
在下一个研究中，对适应pH7.6的重组菌株进行了生物反应器研究，目的是产生更高的3-HP效价和量。在pH 7至8下检查所述适应的菌株的生长和3-HP产量。注意到与非适应性菌株相比，适应性菌株表现出更好的性能。有趣的是，在7.4–7.5，适应的重组体显示出与未适应的细胞相当的生长，并显示出显著改善的生长、3-HP效价、利用甘油的收率和由粗甘油的生产率。结果如图40所示。确定更高的目标产品产量的最佳pH值对于生物工艺优化很重要。最佳pH对获得酶的最高活性很重要。在这种情况下，通过导入来自各种不同微生物的酶来构建具有3-HP合成途径的重组菌株，其酶特性表明每种酶具有不同的最佳生理特性。因此，重要的是确定菌株的最佳pH，以从粗甘油中产生最高的3-HP效价。设计了几个实验，以鉴定具有异源3-HP合成途径以高效价产生3-HP的重组微生物的最佳pH。
图38显示了通过在6.8至7.8的各种pH范围内培养用于3-HP生产的重组菌株所获得的结果。具有6.8的生物反应器显示出良好的生长，但是3-HP生产较低。然而，当pH增加时，注意到3-HP生产的改善。当pH保持在7.4至7.5时，这些重组细胞显示出最高的产量。pH的进一步升高显示了3-HP产量的大幅下降。另一方面，pH的升高会降低细胞生长。在7.8pH下细胞生长受到严重影响，导致3-HP产量较低。选择最佳pH(pH 7.4)进行进一步研究，而不会对细胞生长和3-HP产生有较大损害。在7.4pH下观察到最高的3-HP产量
碳酸氢盐对由甘油生产3-HP的影响
在我们用氢氧化铵作为中和碱的实验之一中，我们注意到大量丙酮酸的积累，这表明从丙酮酸流向乙酰辅酶A和TCA的碳流在生产3-HP的重组菌株中已经被阻断。丙酮酸的积累导致大量乙酸的产生。众所周知，细胞质中NADH的浓度增加会变构性抑制参与催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A的酶。我们检查了开发为从甘油产生3-HP的重组菌株的细胞质中NAD/NADH的情况。我们注意到产生3-HP的菌株在其生产过程中显示出NADH的大量积累。我们假设3-HP生产过程中重组菌株细胞质中的高NADH浓度会变构地抑制参与将丙酮酸转化为乙酰辅酶A的酶(PDHc)，并导致丙酮酸和乙酸的产生(通过Pox B酶)。低的NAD/NADH比值会导致参与3-HPA向3-HP的转化的醛脱氢酶活性降低，这会导致3-HPA积累，据报道会损害宿主DNA和蛋白质的一种有毒的醛。有趣的是，我们的实验结果没有显示3-HPA的积累。但是，在低NAD+/NADH比值期间，3-HP的生产被完全阻碍。这些结果表明，与3-HP生产途径的第二反应一起，由于低NAD/NADH比，第一酶活性也显著降低。
我们分析了生物反应器研究不同阶段的第一种酶，甘油脱水酶的表达水平和体外活性(图53)。我们在SDS PAGE上检查了甘油脱水酶的表达水平，并确认整个生物反应器中的酶表达及其体外活性没有明显变化。这些分析表明酶表达不受影响，但是，我们假设细胞质中的生理条件/环境可能不利于甘油脱水酶的活性。仔细的分析表明，少数几种糖酵解途径中间体对甘油脱水酶具有变构抑制作用。在反应混合物中存在各种浓度的几种糖酵解途径中间体的情况下，测定了体外甘油脱水酶的活性(图54)。在这些结果中，注意到即使在非常低的浓度下，酶活性反应混合物中少数几种糖酵解途径中间体的存在也大大降低了酶活性。如图54所示，诸如磷酸二羟基丙酮和3-磷酸甘油醛的中间体对甘油脱水酶活性具有明显的变构抑制作用。这些结果表明从甘油糖酵解途径连续生产3-HP应当避免中间体的积聚，因为它可以变构地抑制甘油脱水酶。做到这一点的最好方法是提高流向TCA循环的碳通量(carbon flux)。
以前已经成功地表明，即使在低NAD/NADH比值的情况下仍能保持较高活性的突变型PDHc酶的开发可以改善向TCA循环的碳通量。然而，在这项研究中我们采用了不同的方法，因为这些突变酶的开发是艰苦的。在这种情况下，我们在培养基中使用碳酸盐，并通过激活图47所示的回补途径酶(anaplerotic pathway enzyme)来提高通向草酰乙酸的碳通量。在这里，我们计划使用铵形式或钠形式的碳酸盐。使用了四种不同的碳酸盐，例如碳酸铵，碳酸钠，碳酸氢铵和碳酸氢钠。这些研究的目的是以高效价生产有机酸(在本案中是3-HP)，因此我们将这些碱用于两个重要目的，即作为酸生产过程中的中和碱以及用于增强中央代谢的回补途径。
在本实验中获得的结果示于图48和图49。最初，仅基于这些碳酸盐的溶解度研究所有碳酸氢盐的一种浓度。有趣的是，正如我们所假设的，我们没有看到3-HP生产重组菌株中丙酮酸积累或乙酸产生。我们还注意到由重组菌株产生的3-HP量的显著改善。将碳酸盐的结果与先前使用氢氧化铵的优化条件进行比较时，可以明显看出3-HP量的显著改善。使用碳酸盐会使5L生物反应器中的3-HP量增加100g以上。但是，3-HP量的增加会导致消耗更多的碱，过量的铵盐和碳酸盐的添加会导致发酵液中这些元素的浓度更高。较高浓度的铵盐和/或碳酸氢盐/碳酸盐会导致在生物反应器研究的后期细胞裂解和细胞死亡。为了克服此限制，我们检查了这些中和碱的几种稀释液。中和碱的稀释通过增加培养液的总体积而导致浓度降低。该稀释因子具有两个显著优点，一个是可以通过降低铵盐和碳酸盐/碳酸氢盐的浓度来避免细胞裂解，另一方面，体积增加还可以降低培养液中有机酸积累的浓度，从而减少了其未解离形式并避免了如前节所述的酸毒性。
为了进一步优化生物过程，将两种不同的碱如碳酸氢铵和氢氧化铵或碳酸氢铵和碳酸氢钠以适当比例混合，并在生物反应器条件下检查其对3-HP生产和细胞活力的影响。这样做是为了避免氨离子和碳酸氢根在高浓度下的积累，并确定引起细胞裂解的离子。如果铵离子有毒并导致细胞裂解，则可以通过与碳酸氢钠形式组合来避免铵积累。如果碳酸氢盐有毒，则可以与氢氧化物形式合用。通过将碳酸氢钠和氢氧化钠以适当的比例混合也进行了类似的研究。类似地采用适当浓度的碳酸氢钠和碳酸氢铵。最初分析了不同浓度的几种组合，并确定了能提高目标有机酸产物的效价、并避免生物过程中的细胞裂解的适当浓度的中和碱混合物。在检查了中和碱及其稀释液的几种不同组合后，将3-HP的量从300g提高到450g，在5L生物反应器中几乎>150g。这些组合增加了3-HP的量，避免了与中和碱的碳酸氢/碳酸铵/钠盐形式相关的细胞裂解问题(图52)。将在5L实验室规模下获得的结果按比例放大至50L规模，并且结果可重复。该工艺优化导致大大降低了从甘油生产3-HP的成本。
通气
通气是细胞生长及其代谢的重要生理参数之一。氧气是最佳的电子受体，微生物已经进化为使用氧气来维持细胞的氧化还原状态，还可以用于通过电子传输链来生产ATP。通过使用氧敏感性甘油脱水酶(DhaB)，广泛地研究了由甘油生产3-HP(或其盐)。在厌氧/微需氧条件下，该酶在甘油代谢和1,3-丙二醇(1,3-PDO)生产过程中将甘油催化生成3-羟基丙醛(3-HPA)，并且其在几种肠杆菌中天然存在。在我们的研究中，我们使用了来自肺炎克雷伯菌的一种类似的氧敏感酶。已经有充分的文献证明，在存在大量氧气的情况下，DhaB的活性会大大降低。另一方面，如上所述，已经进化了几种微生物以使用氧作为最终的电子受体并协助细胞的氧化还原平衡，因为这对于细胞生长至为重要。还已知开发用于3-HP生产的重组菌株可有效利用氧气再生NAD+并维持氧化还原平衡。重组细胞中由甘油生产3-HP的途径涉及醛脱氢酶，其通过将电子转移至NAD+并产生NADH而将3-HPA氧化为3-HP。这些NADH应再生为NAD+，用于从甘油不间断地生成3-HP。正如注意到的，两种酶参与从甘油合成3-HP的合成途径，一种酶对氧敏感，而第二种酶需要氧气才能保持其连续活性(图41)。因此，优化通气对于从甘油生产3-HP非常重要，应进行认真研究。培养基中必须溶解有足够的氧气，才能通过电子传输链再生NAD+，但是量并不那么大，不会影响甘油/二醇脱水酶的活性。生物反应器中的通气可以通过搅拌和气流来控制，这决定了质量转移。因此在本研究中，我们通过仔细控制气流和搅拌转速来研究通气。
在各种搅拌速度和气流下培养重组菌株(结果未显示)。最初，空气流量固定为0.5或1vvm，搅拌速度从400变为800，每次增加50rpm。结果表明，较低的曝气条件显示3-HP生成量低，这可能是由于NAD+再生不当，导致了ALDH催化活性降低并积累了3-HPA(一种对细胞生长有害的醛)。但是，由于峰不正确，无法用HPLC准确测量3-HPA(3-HP途径中间体)的积累。因此，改变策略，以维持溶解氧(dissolved oxygen，DO)而不是搅拌和气流变化。最初溶解氧保持在40％，但是在此百分比下3-HP的产量并不令人鼓舞。因此，检查了各种溶解氧水平，从1％到40％。结果显示在图42中。当DO保持在1％时，重组菌株在48小时内产生了近40g/L 3-HP。细胞生长不令人满意。注意到大量的3-HPA积累。通过将搅拌速度提高至450rpm而显著提高通气(溶解氧％)，显示出从甘油生成3-HP的量提高。转速的进一步增加显示了3-HP产量更高。当溶解氧保持在5％到6％时，可以看到最高的产量，但是3-HP的产生保持到高达10％DO，而效价没有任何显著变化。另一方面，DO进一步增加到10％以上时显示3-HP产量下降，表明在这些生物反应器条件下，
Figure BDA0002464690110001391
–10％DO对于更高的3-HP产量是最佳选择。高于10％的DO显示出与10％的DO相比略低的3-HP生成量，这可能是由于DhaB活性降低(DhaB活性在较高浓度下对氧敏感)。在600rpm时发现最高产量，而在600rpm以上进一步提高rpm显示3-HP产量下降，这表明在这些生物反应器条件下700rpm是较高3-HP产量的最佳rpm。与700rpm和1vvm相比，800rpm的较高转速显示3-HP产量略低，这可能是由于DhaB活性降低的缘故(DhaB活性在较高浓度下对氧敏感)。
温度
温度是优化细胞生长和细胞代谢的另一个重要的生理参数，它实质性地影响重组微生物对目标产物的生产。确定用于更高靶产物生产的最佳温度在生物工艺优化中极为重要。另一方面，温度是决定酶的最佳催化活性的重要生理参数。在这种情况下，通过导入来自各种不同微生物的酶来构建具有3-HP合成途径的重组菌株，其酶特性表明每种酶具有不同的最佳生理特性。因此，重要的是确定菌株的最佳温度以产生最高的3-HP效价。在这方面，设计了几个实验来确定具有异源3-HP合成途径的重组微生物以高效价产生3-HP的最佳温度。
图43中显示了通过在28至40℃的各种温度下生长用于3-HP生产的重组菌株而获得的结果。28℃的生物反应器显示出缓慢的生长，缓慢的细胞代谢和低的3-HP产量；然而，当温度升高时，注意到细胞生长和3-HP产生的改善。当温度保持在33摄氏度时，这些重组细胞显示出最高的产量。温度的进一步升高显示细胞生长缓慢，3-HP产量显著下降。在40℃的培养物中观察到细胞生长和3-HP产量显著下降。参与3-HP合成途径的酶的表征表明，其活性的最适温度约为37到45℃，而亲本菌株的最适细胞生长温度为30℃。但是，发现33℃不仅更适合细胞生长，同时也有最高的3-HP生产。因此，考虑将33摄氏度的温度用于进一步的实验。
诱导时间
另一方面，文献研究表明重组菌株产生目标产物和蛋白质的能力取决于特定酶的诱导阶段/时间。例如，当途径的酶在对数早期被诱导时，几乎没有产品会达到高效价，而在生长的后期(对数晚期或静止期)诱导时，几乎没有产品显示更高的产量。在这方面，我们通过在细胞生长的不同阶段诱导3-HP产生的合成途径，分析了重组菌株产生高效价的3-HP的能力。通过在不同的细胞OD点(例如3、5、6、7、9、11和15OD)补充甘油(3-HP来源)，检查了不同诱导时间对3-HP产生的影响。这些结果表明，在对数中期的诱导导致重组菌株的3-H P产生最高。
在细胞生长的不同阶段诱导靶产物可能显示出其产生的实质性差异。因此，在这项研究中，3-HP产生的诱导时间从3OD变化到15OD。从这些实验获得的结果示于图44。这些结果表明，从生物反应器研究的早期阶段开始，在3至9OD范围内诱导的培养物显示出良好的产量。然而，在9OD后诱导的培养物显示3-HP产量低。在所有这些条件中，在
Figure BDA0002464690110001411
诱导的培养物在48小时显示出最高的3-HP产量，为102g/L。有趣的是，在OD值介于3到9之间诱导的所有培养物在36小时的产量约为100g/L，生产力为2.5g/L/h，此后产量大幅下降。代谢物分析还显示36小时后碳源积累，表明细胞减少了葡萄糖酸的消耗，这也导致了NAD+的再生不当，因此36小时后3-HP较低。
开发用于重组菌株生产3-HP的工业培养基。
利用工作容积为5升的NBS生物反应器检查碳源对重组菌株的细胞生长和3-HP产生的影响。根据摇瓶实验，对表现出良好细胞生长和3-HP产生的葡萄糖酸盐、谷氨酸盐(谷氨酸一钠盐，MSG)和柠檬酸进行生物反应器研究。最初，在生物反应器中检查了三种不同工业级的MSG，其结果如图2所示。无论哪种工业级MSG，细胞生长、甘油消耗和3-HP产量均无显著差异。在开始时，使细胞生长至一定的光密度(OD)，然后通过向培养基中添加粗甘油来诱导它们产生3-HP。添加甘油或生成3-HP并不能阻止细胞生长，但是在OD在15h达到约5gcdw/L之后，无论以何种MSG作为碳源，细胞生长都显著下降。在数种MSG中，具有较小目数的这种MSG显示出了更高的3-HP产量，而具有较大目数的那种MSG从粗甘油产生相对较低量的3-HP。
实施例29.确定用于高效价3-羟基丙酸生产的合适的碳源
这项研究旨在确定合适的碳源，该碳源可以帮助重组菌株生长并产生高效价的目标酸产物。碳源是主要的培养基成分之一，在细胞代谢、细胞生长以及3-HP产生中起着至关重要的作用。在这项研究中，我们研究了碳源，这些碳源可以支持重组菌株生长到更高的细胞密度，而且以高效价产生3-HP。在这方面，我们分析了以下四种不同的碳源：葡萄糖、谷氨酸盐、葡萄糖酸盐和柠檬酸。所有这些碳源都是根据重组菌株的代谢途径以及可获得性和成本精心选择的。
如前所述，在含有补充有各种碳源的工业培养基的摇瓶中培养重组菌株。一式两份进行实验以检查再现性。所获得的结果如图1所示。与本研究中使用的其他碳源相比，所使用的几种碳源中，葡萄糖酸盐和葡萄糖显示生长速率最高和最低。另一方面，可以进入TCA循环的其他两种碳源--谷氨酸盐和柠檬酸直接显示出可比的生长方式。但是，与葡萄糖酸盐相比，生长速率略低。同样，由甘油生产3-HP在具有不同碳源的情况下显示出不同的生产速率。采用葡萄糖酸盐的产量最高，而采用葡萄糖则较低。在所检查的所有四种碳源中，葡萄糖酸盐显示出更好的生长和3-HP生成，但是在烧瓶实验中12h后，生长和3-HP生成显著下降，这可能是由于pH值的大幅下降或碳源的耗尽，此研究未对此进行衡量。因此，在受控条件下在生物反应器中检查了该条件，以研究葡萄糖酸盐对重组菌株从粗制甘油生产3-HP的潜力。另一方面，谷氨酸盐和柠檬酸也显示出与葡萄糖酸盐相当的量产生3-HP的潜力，因此，在另一项研究中，谷氨酸盐和柠檬酸也作为在生物反应器条件下生产3-HP的碳源进行了研究。
实施例29.鉴定葡萄糖酸盐是高效价生产3-羟基丙酸的合适碳源
在下一组实验中，检查了葡萄糖酸盐作为碳源。一个生物反应器用于研究葡萄糖酸盐对细胞生长和3-HP产生的影响，而在另一种生物反应器中，通过在生物反应器研究的12h改变碳源，采用葡萄糖酸盐用于细胞生长，MSG用于3-HP产生。MSG用于生产条件，因为它是细菌中一种耐酸机制的众所周知的底物。另一方面，谷氨酸盐代谢导致较少的NADH生成，这间接地帮助由甘油生成3-HP(图3)。类似的，以柠檬酸为碳源进行了更多的生物反应器实验，一个生物反应器中柠檬酸用于细胞生长和3-HP生产，另一个生物反应器中组合使用柠檬酸用于细胞生长，MSG用于3-HP生产。当柠檬酸用作初始细胞生长过程中的碳源时，注意到pH值存在很大变化，并且在生物反应器研究期间难以控制pH。但是，在生物反应器研究的6小时添加甘油会导致有毒的3-羟基丙醛(3-HPA)大量积累，导致细胞死亡，未发现3-HP产生。
葡萄糖酸盐的使用导致良好的细胞生长，生物量达到6cdw l-1。当通过添加甘油诱导细胞产生3-HP时，突然细胞生长显著下降(图2a)，并在生物反应器的后期下降至
Figure BDA0002464690110001431
细胞生长的下降导致了3-HP产量较低。在36小时内，以葡萄糖酸盐为碳源的细胞生长和3-HP生产显示出合理的良好3-HP生产，这有望用于商业化。36小时后产量下降，并且在接下来的12小时也这样。在48小时时终止了生物反应器，这项研究显示效价、产量和生产率分别为83g l-1、>0.95molmol-1和1.72g l-1h-1。另一方面，在12小时生物反应器后将其中的碳源从葡萄糖酸盐变为谷氨酸盐的生物反应器研究显示3-HP产量大幅下降，表明碳源的变化在这些条件下不适合。这项研究在48小时内仅从粗甘油中得到65g/L的3-HP(图2b)。
这些研究表明，葡萄糖酸盐是细胞生长以及3-HP生产的良好碳源之一。因此，在优化的条件下检查了来自不同来源的多种工业级葡糖酸盐，并将其中显示出良好的3-HP产生而又不严重影响细胞生长的那种葡萄糖酸盐用于进一步研究。
实施例30.鉴定合适的氮源
氮源是与碳源一起用于培养微生物的培养基中的另一重要成分。含氮的培养基成分以及碳源应谨慎选择，因为它们在细胞代谢和3-HP产生中起着至关重要的作用。在这项研究中，我们确定并检查了合适的氮源，这些氮源可以支持重组菌株生长至更高的细胞密度，并且也以高效价产生3-HP。在这方面，我们分析了几种不同类型的玉米浆和酵母提取物作为氮源。该分析表明，在几种氮源中，来自中国(SJB)的酵母提取物显示重组菌株在由粗甘油产生更高3-HP效价和生产率中具有更好的性能。
采用初始工作体积为3L的NBS生物反应器用于检查氮源对重组菌株的细胞生长和3-HP产生的影响。来自不同来源的各种酵母提取物(工业级)用于不同的生物反应器研究中。以前，已确认葡萄糖酸盐是实现良好的3-HP效价和细胞生长的合理碳源，因此葡萄糖酸盐被用作碳源来研究各种类型的氮源对由甘油生产3-HP的影响。
生物反应器研究表明，具有多种氮源的重组菌株在细胞生长和3-HP产生方面存在显著差异。玉米浆液(Corn steep liquor，CSL)，包括粉末状和糊状，均显示出极低的3-HP产量。当将CSL用作氮源时，细胞生长测量很困难，因为CSL中的未溶解颗粒会干扰OD测量。结果显示在图4a中。另一方面，以酵母提取物为氮源的3-HP生产的时程曲线没有显著差异。但是，生物反应器发酵酵母提取物在生物反应器研究的初期显示出稍好的3-HP产生，并且还有助于稍微改善细胞的生长。
在确定了合适的氮源后，改变其浓度以鉴定酵母提取物浓度对细胞生长和由甘油产生3-HP的影响。注意到当在培养基中以＞1g/L使用酵母提取物时，重组细胞从粗甘油中产生大量的3-HP。类似地，当使用浓度>1g/L的玉米浆和葡萄糖酸盐或谷氨酸盐作为碳源时，也会导致3-HP产生类似于酵母提取物条件。
实施例31.使用与水不混溶的溶剂从去细胞化的发酵液中萃取3-HP
通用方案A
在室温下向含有指定效价的3-HP钠盐(如先前实施例所述制备)的指定量的发酵液中加入指定酸，直至达到指定pH的值。在指定的温度下，用指定量的指定的与水不混溶的溶剂连续萃取所得的反应混合物指定的时间。在某些实施例中，在相同条件下用至少另一部分的相同溶剂重复萃取。在这样的实例中，以以下方式在表13的“温度，提取时间”栏中指示提取时间：初始提取时间/用另外一部分溶剂提取的时间。通过1H NMR确定所获得的3-HP的纯度。
3-HP的1H NMR：对于接近OH的CH2基团，观察到约3.75ppm处的三重峰，对于接近COOH的CH2基团，观察到约2.39ppm处的三重峰。在1H NMR中未观察到长程偶联。
1H NMR(400MHz,D2O)δ3.75(t,J＝6.6Hz,2H),2.39(t,J＝6.6Hz,2H)
表13描述了酸、水相的pH值、与水不混溶的溶剂及其用量、温度、萃取时间以及按照常规萃取方案A获得的3-HP的产率和纯度。
表13
Figure BDA0002464690110001451
Figure BDA0002464690110001461
通用方案B
在室温下向按照前述实施例制备的含有3-HP 65g/L钠盐的4.8L发酵液中加入指定的酸，直到达到指定的pH。将所得反应混合物在指定温度下用6.2L异丁醇连续萃取指定的时间。通过1H NMR确定所获得的3-HP的纯度。
表14描述了酸、水相的pH、与水不混溶的溶剂、温度、萃取时间和通过遵循常规萃取方案B获得的3-HP的产率。
表14
条目编号 酸 萃取时间 温度 pH 产率 纯度
1B-1 HCl 3天 100～115℃ 0.8 分解 n/a
1B-2 HCl 3天 100～115℃ 1.0 分解 n/a
1B-3 HCl 3天 100～115℃ 4.0 54％ n/a
1B-4 H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 3天 100～115℃ 1.0 分解 n/a
1B-5 H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 3天 100～115℃ 2.0 43％ 32％
1B-6 H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 3天 100～115℃ 3.3 53％ n/a
1B-7 H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 3天 100～115℃ 3.0 70％ 40％
1B-8 草酸 3天 100～115℃ 2.4 n/a n/a
1B-9 草酸 120h 100～115℃ 3.5 89％ 84％
1B-10 草酸 120h 100～115℃ 4.3 83％ 77％
1B-11 草酸 120h 100～115℃ 4.4 100％ 72％
1B-12 草酸 96h 100～115℃ 4.4 91％ 85％
1B-13 草酸 74h 100～115℃ 4.4 78％ 80％
实施例32.与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂用于从去细胞化发酵液中萃取3-HP的用途
通用方案C
使用与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂的混合物从发酵液中提取3-HP的典型系统如图58和图59所示。向指定量的如前面实施例中所述制备的含有3-HP钠盐的发酵液中加入草酸，直至在室温下达到发酵液的pH 4.4。用pH计监测发酵液中pH的降低。将指定量的乙酸乙酯(与水不混溶的溶剂)添加到溶剂瓶中，然后向溶剂瓶中添加指定量(相对于系统中发酵液量的v/v％)的特定与水混溶的溶剂。使用加热罩将溶剂瓶加热至与水混溶的溶剂的沸点，直到所有与水混溶的溶剂蒸发并转移至含有发酵液的烧瓶中。随后将溶剂瓶加热至乙酸乙酯的沸点约48小时，其间用乙酸乙酯从发酵液中连续提取3-HP。将所得的3-HP在乙酸乙酯中的溶液真空浓缩，得到期望的粗制3-HP，为黄色油。通过1H NMR确定所获得的3-HP的纯度。
从发酵液中萃取3-HP的各种条件，如发酵液的量和效价、与水混溶(wm)的溶剂及其量、通过常规提取方案C获得的3-HP的纯度均示于表15中。
表15
Figure BDA0002464690110001471
Figure BDA0002464690110001481
图61显示了使用乙酸乙酯和甲醇作为与水混溶的溶剂在78℃萃取去细胞化发酵液48小时过程中，溶剂瓶内乙酸乙酯中3-HP的浓度增加(甲醇的量为用于萃取的发酵液的量的25v/v％)。表16汇总了图61所示的数据。
表16
条目编号 发酵液量 发酵液中3-HP的效价 3-HP的产率
2B-1 3.8L 87.6g/L 97.2％
2B-2 4L 88.6L 94.5％
2B-3 3.5L 73g/L 97.2％
2B-4 3.5L 73.07g/L 97.7％
实施例33.粗3-HP的纯化
Figure BDA0002464690110001482
步骤1–形成3-HP钠盐
向室温下的粗3-HP(如前述实施例中所述制备)在IPA中的溶液中加入NaOH(MeOH中的2N溶液)直至pH＝7.0。将反应混合物在室温搅拌2小时后，将反应混合物过滤并用IPA洗涤。将粗3-HP钠盐溶于EtOH(比率：3-HP钠盐：EtOH＝1：4或1：6或1：8)并过滤，得到纯净的所需产物3-HP钠盐，为白色固体，通过1H NMR测定，其收率为63％，纯度为99％。
步骤2–由3-HP钠盐形成纯净的3-HP
Figure BDA0002464690110001491
在室温下，向3-HP钠盐的溶液中加入MeOH中的酸(乙酸，浓HCl，H2SO4或草酸)。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物过滤并用MeOH洗涤。真空浓缩滤液，以定量收率得到期望的纯的3-HP，为黄色油。
实施例34.在催化剂存在下，对3-HP粗品进行反应性蒸馏
Figure BDA0002464690110001492
通用方案D
用于丙烯酸反应性蒸馏的典型系统如图60所示。将在前面实施例中制备的指定量的粗3-HP放入反应烧瓶中，然后加入指定量的催化剂(重量％，基于反应混合物中粗3-HP的量)。系统组装完成后，打开真空并将其设置为74mbar(在整个反应性蒸馏过程中，压力均保持在70-100mbar)。当设定好压力时，使用加热罩将反应混合物加热至80℃。当反应混合物的温度达到50℃时开始脱水反应。丙烯酸和水(反应产物)的混合物蒸发并收集在蒸馏头和收集瓶中。反应混合物的温度以20℃的增量逐渐升高，直到达到指定的温度，然后继续进行该工艺指定的时间，直到不再观察到液体收集为止。通过1H NMR确定所得丙烯酸的纯度。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.51(d,J＝17.2Hz,1H),6.14(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),5.96(d,J＝10.4Hz,1H)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ6.24(dd,J＝17.3,1.9Hz,1H),6.07(dd,J＝17.3,10.2Hz,1H),5.86(dd,J＝10.2,1.9Hz,1H)。
由粗3-HP制备丙烯酸的各种条件，例如粗3-HP的量、催化剂及其用量、反应温度、反应时间、按照一般反应方案D获得的3-HP的收率和纯度均如表17所示。
表17
Figure BDA0002464690110001501
Figure BDA0002464690110001511
实施例35.多聚磷酸(polyphosphoric acid，PPA)催化的3-HP的反应性蒸馏
Figure BDA0002464690110001512
在室温下向纯化的化合物3-HP(10.00g，0.11mmol)中添加PPA(1.00g，10wt％)。将反应混合物在180℃加热5小时，在此期间形成丙烯酸并从反应混合物中蒸馏，得到所需产物(4.90g，62％)，为无色油，产率为62％，纯度为76％，如通过1H NMR测定的。
实施例36.吩噻嗪存在下3-HP的反应性蒸馏
Figure BDA0002464690110001513
通用方案E
在室温下，向3-HP中加入特定量的吩噻嗪(3-HP量的重量％)和特定量的草酸(3-HP量的重量％)。将反应混合物在180℃加热5小时，在此期间形成丙烯酸并从反应混合物中蒸馏，得到所需产物，为无色油。
由粗制3-HP制得丙烯酸的各种条件，例如吩噻嗪和草酸的量以及通过遵循一般反应方案E获得的3-HP的收率示于表18。
表18
条目编号 吩噻嗪的量 草酸的量 产率
6A-1 0.5wt.％ 5wt.％ 66％
6A-2 2wt.％ 10wt.％ 73％
6A-3 2wt.％ 5wt.％ 62％
6A-4 0.5wt.％ 20wt.％ 56％
6A-5 4wt.％ 20wt.％ 67％
6A-6 5wt.％ 10wt.％ 67％
6A-7 2wt.％ 10wt.％ 60％
实施例37.在氢醌存在下反应性蒸馏3-HP
Figure BDA0002464690110001521
在室温下向纯化的化合物3-HP(50g)中加入氢醌(2重量％)、柠檬酸(10重量％)和草酸(20重量％)。将反应混合物在180℃下加热5小时，在此期间形成丙烯酸并从反应混合物中蒸馏，得到期望的产物，为无色油状物，产率为75％，通过1H NMR测定其纯度为67％。
实施例38.纯化的3-HP的反应性蒸馏
Figure BDA0002464690110001531
将纯化的化合物3-HP(1.36kg)在180℃下加热8小时，在此期间形成丙烯酸并进行蒸馏，得到所需的产物，为无色油，产率为56％，通过1H NMR测得纯度为75％。
实施例39.用活性炭和草酸处理的3-HP的反应性蒸馏
Figure BDA0002464690110001532
通用方案F
将指定量的粗化合物3-HP溶解在MeOH中，然后向所得溶液中加入活性炭(3-HP的量的1重量％)。将溶液通过硅藻土垫过滤，并将滤液真空浓缩。在室温下向所得残余物中加入指定量的草酸，并将反应混合物在从135℃逐渐升高至180℃的温度下加热，在此期间形成丙烯酸并蒸馏，得到所需产物，为无色油。通过1H NMR测定纯度。
表19显示了由粗制3-HP制备丙烯酸的各种条件，例如活性炭和草酸的量，以及通过一般反应方案F获得的3-HP的产率。
表19
Figure BDA0002464690110001533
Figure BDA0002464690110001541
实施例40.通过蒸馏纯化粗制丙烯酸
在70-80mbar的减压和80-110℃的温度下蒸馏粗制丙烯酸(650.8g)，得到所需产物，为无色油状物(360.7g，55.4％)。
实施例41.用气体吹扫纯化粗丙烯酸
将粗丙烯酸(2457g)放入反应烧瓶中，其装有入口管的以使大气压下的热空气鼓泡通过反应混合物。将空气加热至约60℃，并剧烈鼓泡通过丙烯酸粗品。大约12个小时，热空气将丙烯酸带入蒸馏头。在冷凝器中将任何汽化的丙烯酸冷凝成液态。还使用加热套将反应烧瓶加热至60℃。纯化过程后，收集的丙烯酸产物(1969g，80.1％)通过NMR纯化，表明收集的产物中丙烯酸与水的比例约为80:20(纯丙烯酸产物包含20wt％的水)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ6.25(dd,J＝17.3,1.8Hz,1H),6.07(dd,J＝17.3,10.3Hz,1H),5.87(dd,J＝10.3,1.8Hz,1H)。
其他实施方式
应当理解，尽管已经结合本公开的详细描述描述了本公开，但是前述描述旨在举例说明而不是限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改均在所附权利要求书的范围内。
Figure IDA0002604797010000011
Figure IDA0002604797010000021
Figure IDA0002604797010000031
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Figure IDA0002604797010000121
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Figure IDA0002604797010000171
Figure IDA0002604797010000181
Figure IDA0002604797010000191

Claims (494)

1.一种表达系统，其包含可被小分子诱导的第一启动子、第二启动子、编码参与3-HP、3-HP盐或B12合成的蛋白质的第一基因、经修饰的UTR以及编码来自天然脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)蛋白质的N-末端至多20个氨基酸的天然序列，其中该天然序列可操作地连接到所述经修饰的UTR的3'-末端，并且可操作地连接到所述第一基因的5'端，并且所述第一和第二启动子以串联形式可操作地连接到所述经修饰的UTR的上游。
2.根据权利要求1所述的表达系统，其中进一步包含第三启动子和编码被配置为调节所述第一基因的表达的转录调节子的第二基因，其中所述第三启动子可操作地连接到所述第二基因。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的表达系统，其中所述第二启动子可被所述小分子诱导。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的表达系统，其中所述天然序列可操作地连接至所述第一基因的5'-末端以定义融合基因，所述第二启动子是所述天然脱氮假单胞菌蛋白质的天然启动子，并且所述第二启动子可操作地连接至所述融合基因的5'-末端。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的表达系统，其中所述第一启动子可操作地连接到所述第二启动子的5'-末端，所述第二启动子可操作地连接到所述经修饰的UTR的5'-末端，并且所述经修饰的UTR可操作地连接到所述融合基因的5'末端。
6.一种核酸，其包含第一和第二启动子，其中所述第一启动子是诱导型启动子，并且可被小分子诱导；所述第一和第二启动子与第一基因可操作地连接；并且所述第一基因编码参与3-羟基丙酸(3-HP)、3-HP盐或辅酶B12合成的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的核酸，其中所述第一基因编码参与3-羟基丙酸(3-HP)合成的蛋白质，并且选自甘油脱水酶、甘油脱水酶再活化酶和醛脱氢酶。
8.根据权利要求6或7所述的核酸，其中所述第一基因包含选自dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、gdrB和kgsA的至少一个基因。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的核酸，其中所述第一基因包括dhaB1基因、dhaB2基因、dhaB3基因、gdrA基因和gdrB基因。
10.根据权利要求6-8中任一项所述的核酸，其中所述第一基因是dhaB1，并且所述序列包含与SEQ ID NO：1至少95％相同的序列。
11.根据权利要求6-8中任一项所述的核酸，其中所述第一基因是dhaB2，并且所述序列包含与SEQ ID NO：2至少95％相同的序列。
12.根据权利要求6-8中任一项所述的核酸，其中所述第一基因是dhaB3，并且所述序列包含与SEQ ID NO：3至少95％相同的序列。
13.根据权利要求6-8中任一项所述的核酸，其中所述第一基因是gdrA，并且所述序列包含与SEQ ID NO：4至少95％相同的序列。
14.根据权利要求6-8中任一项所述的核酸，其中所述第一基因是grdB，并且所述序列包含与SEQ ID NO：5至少95％相同的序列。
15.根据权利要求7所述的核酸，其中所述第一基因包含醛脱氢酶基因。
16.根据权利要求15所述的核酸，其中所述醛脱氢酶是kgsA。
17.根据权利要求16所述的核酸，其中kgsA包含与SEQ ID NO：6至少95％相同的序列。
18.根据权利要求6-17中任一项所述的核酸，其中所述小分子是酸或醇。
19.根据权利要求18所述的核酸，其中所述小分子酸或醇选自L-乳酸(LAC)、乙酸(AcOH)、丙酸(PA)、3-羟基丙酸(3-HP)、3-羟基丁酸(3-HB)、1,3-丙二醇(1,3-PDO)、2,3-丁二醇(2,3-BDO)、L-缬氨酸(L-val)和3-羟基异丁酸(3-HIB)。
20.根据权利要求19所述的核酸，其中所述小分子酸或醇选自由3-羟基丙酸(3-HP)、3-羟基丁酸(3-HB)、L-缬氨酸(L-val)和3-羟基异丁酸(3-HIB)。
21.根据权利要求20所述的核酸，其中所述小分子是3-羟基丙酸(3-HP)。
22.根据权利要求6-21中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子可操作地连接到所述第一启动子的3′-末端，并且所述第一基因可操作地位于所述第二启动子的下游。
23.根据权利要求6-22中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含与SEQ ID NO：65至少85％相同的序列。
24.根据权利要求6-22中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO：65。
25.根据权利要求6-21中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子可操作地连接到所述第二启动子的3′-末端，并且所述第一基因可操作地位于所述第二启动子的下游。
26.根据权利要求6-25中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子是组成型启动子。
27.根据权利要求6-25中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子是第二诱导型启动子。
28.根据权利要求6-27中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子与所述第二启动子之间的基因间空间不包括终止子序列。
29.根据权利要求6-28中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子和所述第二启动子调节所述第一基因的表达。
30.根据权利要求6-28中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子衍生自PmmsA启动子、PhpdH-1启动子、PhpdH-4启动子或PhpdH启动子。
31.根据权利要求6-28中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含与SEQ ID NO：14(PmmsA启动子)至少95％相同的序列。
32.根据权利要求6-28中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含与SEQ ID NO：13(PhbdH-1启动子)至少95％相同的序列。
33.根据权利要求6-28中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含与SEQ ID NO：11(PhbdH-4启动子)至少95％相同的序列。
34.根据权利要求6-28中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含与SEQ ID NO：12(PhpdH启动子)至少95％相同的序列。
35.根据权利要求30所述的核酸，其中所述第一启动子包含选自SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列。
36.根据权利要求6-35中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含PmmsA启动子，并且所述核酸进一步包含与所述PmmsA启动子的5′-末端可操作地连接的操纵子位点。
37.根据权利要求36所述的核酸，其包含与SEQ ID NO：15(PmmsA序列Δ2，图4)95％相同的序列。
38.根据权利要求36所述的核酸，其包含与SEQ ID NO：16(MmsA操纵子的O1)有95％相同的序列和与SEQ ID NO：17(MmsA操纵子的O2)95％相同的序列。
39.根据权利要求36所述的核酸，其包含与SEQ ID NO：18(PmmsA和操纵子，图3)具有95％同一性的序列。
40.根据权利要求36所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO：15、18、19(PmmsA2a)、20(PmmsA2b)和21(PmmsA2ab)的序列。
41.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子衍生自PmmsA启动子、PhpdH-1启动子、PhpdH-4启动子、PhpdH启动子或Pzwf启动子。
42.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：11(PhbdH-4启动子)至少95％相同的序列。
43.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：12(PhpdH启动子)至少95％相同的序列。
44.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：14(PmmsA启动子)至少95％相同的序列。
45.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：13(PhbdH-1启动子)至少95％相同的序列。
46.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：7(Pzwf)至少95％相同的序列。
47.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：8(Pzwf-1)至少95％相同的序列。
48.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：9(Pzwf-7)至少95％相同的序列。
49.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：62(较短的Pzwf-7)至少95％相同的序列。
50.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含与SEQ ID NO：10(Pzwf-12)至少95％相同的序列。
51.根据权利要求6-40中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含选自SEQ IDNO：7、8、9、10、11、12、13、14、52-60、61、62和63(Pzwf启动子和其他启动子)的序列。
52.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含PmmsA启动子，并且所述第二启动子包含PhpdH-4启动子。
53.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含与SEQ ID NO：14(PmmsA启动子序列)至少95％相同的序列，并且所述第二启动子包含与SEQ ID NO：11(PhbdH-4启动子)至少95％相同的序列。
54.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含PhpdH-1启动子，并且所述第二启动子包含PhpdH启动子。
55.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子包含与SEQ ID NO：13(PhbdH-1启动子序列)至少95％相同的序列，并且所述第二启动子包含与SEQ ID NO：12(PhpdH启动子)至少95％相同的序列。
56.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含PhpdH启动子，并且所述核酸进一步包含与所述PbdH启动子的N-末端可操作连接的操纵子位点。
57.根据权利要求56所述的核酸，其中所述操纵子位点包含与SEQ ID NO：RBS-1、RBS-2、ABS-1、ABS-2和ABS-3至少95％相同的一个或多个序列。
58.根据权利要求57所述的核酸，其中所述操纵子位点包含与SEQ ID NO：RBS-1位点和ABS-2至少95％相同的序列。
59.根据权利要求58所述的核酸，其中所述操纵子位点包含SEQ ID NO：RBS-1位点和ABS-2。
60.根据权利要求6-59中任一项所述的核酸，其中所述核酸进一步包含编码调节所述第一基因的表达的转录调节子的基因。
61.根据权利要求60所述的核酸，其中所述转录调节子与所述第一或第二启动子结合。
62.根据权利要求60或61所述的核酸，其中所述转录调节子是LysR型转录调节子(LTTR)。
63.根据权利要求62所述的核酸，其中所述转录调节子是MmsR或HpdR。
64.根据权利要求63所述的核酸，其中所述转录调节子是MmsR。
65.根据权利要求61所述的核酸，其中所述转录调节子与所述第一启动子结合。
66.根据权利要求65所述的核酸，其中所述转录调节子衍生自mmsR蛋白，并且所述第一启动子衍生自PmmsA启动子。
67.根据权利要求65所述的核酸，其中所述转录调节子包含mmsR蛋白，并且所述第一启动子包含PmmsA启动子。
68.根据权利要求66所述的核酸，其进一步包含操纵子位点，其中所述MmsR蛋白结合所述操纵子位点。
69.根据权利要求68所述的核酸，其包含与SEQ ID NO：19(PmmsA2a)至少95％相同的序列。
70.根据权利要求68所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO：19-21(PmmsA2a、A2b、A2ab)的序列。
71.根据权利要求60所述的核酸，其中所述转录调节子与所述第二启动子结合。
72.根据权利要求71所述的核酸，其中所述第二启动子是组成型启动子。
73.根据权利要求71所述的核酸，其中所述转录调节子是HpdR蛋白，并且所述第二启动子衍生自hpdH启动子。
74.根据权利要求73所述的核酸，其中所述第二启动子包含与PhpdH SEQ ID NO：12的序列至少95％相同的序列。
75.根据权利要求60所述的核酸，其中所述转录调节子与所述第一启动子结合并且在所述小分子存在下与所述第一启动子的结合增强。
76.根据权利要求60所述的核酸，其中所述转录调节子与所述第二启动子结合并且在所述小分子存在下与所述第二启动子的结合增强。
77.根据权利要求60所述的核酸，其中所述转录调节子是自我调节的。
78.根据权利要求60所述的核酸，其进一步包含与编码所述第一转录调节子的基因可操作地连接的第三启动子。
79.根据权利要求78所述的核酸，其中所述第三启动子包含与选自SEQ ID NO：7-10和52-63的序列95％相同的序列。
80.根据权利要求78所述的核酸，其中：
所述第二组成型启动子选自SEQ ID NO：9、10、57-60、62和63；
所述转录调节子包含MmsR蛋白；和
所述第一启动子包含PmmsA。
81.根据权利要求78所述的核酸，其中
所述第二组成型启动子选自SEQ ID NO：9、10、57-60、62和63；
所述转录调节子包含HpdR蛋白；和
所述第一启动子包括PhbdH。
82.根据权利要求80或81所述的核酸，其中所述第三启动子包含SEQ ID NO：10。
83.根据权利要求80或81所述的核酸，其中所述第三启动子包含SEQ ID NO：62。
84.根据权利要求6-83中任一项所述的核酸，其中所述第一基因包含所述基因的经修饰的5'UTR。
85.根据权利要求84所述的核酸，其中所述第一基因包含选自SEQ ID NO：22-28和64(UTR 0-6)的序列。
86.根据权利要求85所述的核酸，其中所述5′UTR包含SEQ ID NO：28(UTR-6)。
87.根据权利要求84所述的核酸，其中所述第一基因包含编码kgsA的基因，并且所述5′UTR包含SEQ ID NO：28(UTR-6)。
88.根据权利要求6-87中任一项所述的核酸，其中所述第一基因的5'末端处的至少10个密码子被优化以用于在脱氮假单胞菌中翻译。
89.根据权利要求6-88中任一项所述的核酸，其中所述第一基因的5'末端处的至多10个密码子被优化以用于在脱氮假单胞菌中翻译。
90.根据权利要求88或89所述的核酸，其中所述密码子优化包括：
测量编码天然脱氮假单胞菌蛋白质的基因中每种氨基酸的密码子频率；
使用所述天然蛋白质的密码子频率用优化的10个密码子替换第一基因的5'-末端处的所述10个密码子，其中被优化的10个密码子的每个氨基酸的密码子均以与天然蛋白质的密码子频率相同的频率存在。
91.根据权利要求90所述的核酸，其中所述经过优化的后10个密码子中每个氨基酸的密码子频率大于0。
92.根据权利要求90所述的核酸，其中所述密码子频率是在编码天然脱氮假单胞菌蛋白质的基因的5'-末端处的10个密码子中的每个氨基酸测量的。
93.根据权利要求88所述的核酸，其中所述核酸包含与选自SEQ ID NO：29、30和31(Opt1-3)的序列具有95％同一性的序列。
94.根据权利要求6-93中任一项所述的核酸，其中所述第一基因包含编码kgsA的基因，并且包含选自SEQ ID NO：29-31的序列。
95.根据权利要求6-93中任一项所述的核酸，其中所述第一基因在其5'末端与编码衍生自编码天然脱氮假单胞菌蛋白质的第二基因的5'-末端的至多20个氨基酸的序列融合，从而产生融合基因。
96.根据权利要求95所述的核酸，其中所述融合基因的mRNA具有比单独的所述第一基因的mRNA更高的稳定性。
97.根据权利要求95所述的核酸，其中，与单独的所述第一基因相比，所述融合基因增加基因翻译。
98.根据权利要求95所述的核酸，其中所述融合基因的mRNA比单独的所述第一基因的mRNA对核糖核酸酶降解的抵抗力更大。
99.根据权利要求95所述的核酸，其中与单独的所述第一基因相比，所述融合基因增加基因翻译。
100.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第一基因在其5'-末端与编码衍生自编码天然脱氮假单胞菌蛋白质的第二基因的5'-末端的至多20个(5、10、15或20个)氨基酸的序列融合，从而产生融合基因，并且所述第二启动子衍生自所述第二基因的天然启动子。
101.根据权利要求100所述的核酸，其中所述第二启动子衍生自所述PmmsA启动子，并且所述融合基因包含编码天然MmsA蛋白的N-末端的至少5、10、15或20个氨基酸的序列。
102.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第二启动子包含PmmsA启动子，并且所述融合基因包含编码来自天然MmsA基因的N-末端的五个或更多个氨基酸的序列，以及所述融合基因与PmmsA启动子的3'末端可操作地连接。
103.根据权利要求102所述的核酸，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：32-35的序列。
104.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第一基因在其5'-末端与编码衍生自编码天然脱氮假单胞菌MmsA蛋白N-末端的序列的至多20个(5、10、15或20个)氨基酸的序列融合。
105.根据权利要求104所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO：32-35(Pcm-mmsA(5)(10)(15)(20))的序列。
106.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述第一基因编码参与维生素B12合成的蛋白质。
107.根据权利要求106所述的核酸，其中所述第一基因包含选自下述的基因：cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM和cobV。
108.根据权利要求107所述的核酸，其中所述第一基因包含bgpM。
109.根据权利要求106所述的核酸，其中所述第一基因衍生自选自下述的假单胞菌属的种：脱氮假单胞菌(P.denitrifcans)；铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；食虫假单胞菌(P.entomophila)；恶臭假单胞菌(P.putida)；丁香假单胞菌(P.syringae)；荧光假单胞菌(P.fluorescens)；门多萨假单胞菌(P mendocina)；和施氏假单胞菌(P.stutzeri)。
110.一种核酸，其包含与编码参与辅酶B12合成的蛋白质的第一基因可操作地连接的第一启动子。
111.根据权利要求110所述的核酸，其中所述第一启动子是组成型启动子。
112.根据权利要求110或111所述的核酸，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：7-10和52-63的序列。
113.根据权利要求110或111所述的核酸，其中所述第一基因包含一个或多个选自下述的基因：cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM和cobV。
114.根据权利要求110或111所述的核酸，其中所述第一基因来自选自下述的假单胞菌属物种：脱氮假单胞菌；铜绿假单胞菌；食虫假单胞菌；恶臭假单胞菌；丁香假单胞菌；荧光假单胞菌；门多萨假单胞菌；和施氏假单胞菌。
115.根据权利要求110-114中任一项所述的核酸，其进一步包含与所述第一启动子可操作地连接的第二启动子。
116.根据权利要求115所述的核酸，其中所述第一和第二启动子调节所述第一基因的表达。
117.根据权利要求110-116中任一项所述的核酸，其中所述第一启动子不是所述第一基因的天然启动子。
118.一种核酸，其包含cobG基因、Pedd启动子、PsucA启动子和cobL基因；其中所述Pedd启动子与cobG基因和PsucA启动子可操作地连接，并且所述PsucA启动子与cobL基因可操作地连接。
119.根据权利要求118所述的核酸，其中所述Pedd启动子包含序列SEQ ID NO：36；并且所述PsucA启动子包含序列SEQ ID NO：37。
120.根据权利要求118所述的核酸，其包含序列SEQ ID NO：38。
121.一种核酸，其包含cobG基因、Psp9启动子、Pzwf启动子和cobL基因，其中所述Psp9启动子与cobG基因和Pzwf启动子可操作地连接，并且所述Pzwf启动子与cobL基因可操作地连接。
122.根据权利要求121所述的核酸，其中所述Psp9启动子包含SEQ ID NO：39；并且所述Pzwf启动子包含SEQ ID NO：40。
123.根据权利要求121所述的核酸，其包含SEQ ID NO：41。
124.一种核酸，其包含cobW基因、Pzwf启动子、Psp9启动子和cbtB基因，其中所述Pzwf启动子与cobW基因和Psp9启动子可操作地连接，并且所述Psp9启动子与cbtB基因可操作地连接。
125.根据权利要求124所述的核酸，其中所述Pzwf启动子包含SEQ ID NO：42；并且所述Psp9启动子包含SEQ ID NO：43。
126.根据权利要求124所述的核酸，其包含SEQ ID NO：44。
127.一种核酸，其包含cobW基因、Ptkt启动子、Psp2启动子和cbtB基因，其中所述Ptkt启动子与cobW基因和Psp2启动子可操作地连接，并且所述Psp2启动子与cbtB基因可操作地连接。
128.根据权利要求127所述的核酸，其中所述Ptkt启动子包含SEQ ID NO：45；并且所述Psp2启动子包含SEQ ID NO：46。
129.根据权利要求127所述的核酸，其包含SEQ ID NO：47。
130.一种核酸，其包含与tonB基因(例如butB基因)可操作地连接的Pzwf启动子。
131.根据权利要求130所述的核酸，其中所述Pzwf启动子包含SEQ ID NO：48。
132.根据权利要求130所述的核酸，其包含SEQ ID NO：49。
133.一种核酸，其包含与tonB基因(例如butB基因)可操作地连接的Psp9启动子。
134.根据权利要求133所述的核酸，其中所述Psp9启动子包含SEQ ID NO：50。
135.根据权利要求133所述的核酸，其包含SEQ ID NO：51。
136.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含一个或多个衍生自脱氮假单胞菌的序列。
137.根据权利要求136所述的核酸，其中所述第一或第二启动子衍生自脱氮假单胞菌。
138.根据权利要求1-137中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含一个或多个衍生自肠杆菌属(Enterobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或固氮螺菌属(Azospirillum)细菌的序列。
139.根据权利要求138所述的核酸，其中所述第一基因衍生自肠杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属或固氮螺菌属细菌。
140.包含DhaB表达模块的核酸，其中所述DhaB表达模块包含与SEQ ID NO：66(DhaB表达模块)至少85％相同的序列。
141.根据权利要求140所述的核酸，其中所述序列与SEQ ID NO：66至少90％相同。
142.根据权利要求140所述的核酸，其中所述序列包含SEQ ID NO：66。
143.包含DhaB表达模块的核酸，其中所述DhaB表达模块包含与SEQ ID NO：67(kgsA表达模块)至少85％相同的序列。
144.根据权利要求143所述的核酸，其中所述序列与SEQ ID NO：67至少90％相同。
145.根据权利要求143所述的核酸，其中所述序列包含SEQ ID NO：67。
146.包含DhaB表达模块的核酸，其中所述DhaB表达模块包含含有SEQ ID NO：68的gdrA基因的UTR和含有SEQ ID NO：69的gdrB基因的UTR。
147.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含与选自SEQ ID NO：70-72的序列至少85％相同的序列。
148.根据权利要求6-29中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：70-72的序列。
149.包含辅酶B12传感器的核酸，其中所述辅酶B12传感器包含与选自SEQ ID NO：73和74的序列至少85％相同的序列。
150.根据权利要求149所述的核酸，其中包含选自SEQ ID NO：73和74的序列。
151.包含辅酶B12表达模块的核酸，其中所述辅酶B12表达模块包含参与辅酶B12合成的第一基因、由小分子诱导的第一启动子、以及第二启动子，其中所述第一和第二启动子以串联形式可操作地连接到所述第一基因的上游，从而它们调节所述第一基因的表达。
152.根据权利要求151所述的核酸，其中进一步包含参与辅酶B12合成的第二基因、由小分子诱导的第三启动子、以及第四启动子，其中所述第三和第四启动子以串联形式在所述第二基因的上游可操作地连接，从而它们调节所述第二基因的表达。
153.根据权利要求152所述的核酸，其进一步包含参与辅酶B12合成的第三基因、由小分子诱导的第五启动子、以及第六启动子，其中所述第五和第六启动子以串联形式在第三基因的上游可操作地连接，从而它们调节所述第三基因的表达。
154.根据权利要求153所述的核酸，其进一步包含参与辅酶B12合成的第四基因、由小分子诱导的第七启动子、以及第八启动子，其中所述第七和第八启动子以串联形式在第四基因的上游可操作性地连接，从而调节第四基因的表达。
155.根据权利要求151-154中任一项所述的核酸，其中所述第一、第二、第三和第四基因各自包含选自下述的一个或多个基因：cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM和cobV。
156.根据权利要求155所述的核酸，其中所述第一基因包含bgpM。
157.根据权利要求151所述的核酸，其中所述核酸不包含调节参与辅酶B12产生的基因的任何天然核糖开关。
158.根据权利要求151所述的核酸，其中所述核酸不包含SEQ ID NO：75或76。
159.一种重组细菌，其包含权利要求1-158中任一项所述的核酸。
160.根据权利要求159所述的重组细菌，其特征在于所述细菌是假单胞菌属的种。
161.根据权利要求160所述的重组细菌，其中所述细菌是脱氮假单胞菌。
162.根据权利要求159所述的重组细菌，其中所述核酸在表达质粒上。
163.根据权利要求159所述的重组细菌，其中所述核酸被整合到所述细菌的染色体中。
164.根据权利要求159所述的重组细菌，其中所述核酸在附加体上。
165.一种重组细菌，其包含含有DhaB表达模块的第一核酸和包含ALDH表达模块的第二核酸。
166.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述DhaB表达模块包含权利要求1-14和18-142中任一项所述的核酸。
167.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述ALDH表达模块包含权利要求1-8和15-142中任一项所述的核酸。
168.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述第一和第二核酸位于表达质粒上。
169.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述第一和第二核酸位于附加体上。
170.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述第一和第二核酸被整合到所述细菌的染色体中。
171.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述第一核酸被整合到所述细菌的染色体中，并且所述第二核酸位于表达质粒上。
172.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述第一核酸位于表达质粒上，并且所述第二核酸被整合到所述细菌的染色体中。
173.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述第一核酸被整合到所述细菌的染色体中，并且所述第二核酸位于附加体上。
174.根据权利要求165所述的重组细菌，其中所述第一核酸位于附加体上，并且所述第二核酸被整合到所述细菌的染色体中。
175.根据权利要求170所述的重组细菌，其中所述第一核酸在第一位置被整合到所述细菌的染色体中，所述第二核酸在第二位置被整合到所述细菌的染色体中，并且所述第一和第二位置彼此相距2500kb以内。
176.根据权利要求175所述的重组细菌，其中所述第一位置和第二位置彼此相距100kb以内。
177.根据权利要求175所述的重组细菌，其中所述第一位置和第二位置彼此相距50kb以内。
178.根据权利要求175所述的重组细菌，其中所述第一位置和第二位置彼此相距1000bp以内。
179.根据权利要求170所述的重组细菌，其中所述第一核酸在复制起点的4000bp以内的第一位置处被整合到所述细菌的染色体中。
180.根据权利要求179所述的重组细菌，其中所述第一位置在所述复制起点的1000bp以内。
181.一种重组细菌，其包含含有参与辅酶B12合成的第一基因的辅酶B12表达模块、被小分子诱导的第一启动子、以及第二启动子，其中所述第一和第二启动子以串联形式可操作地连接于所述第一基因的上游。
182.根据权利要求181所述的重组细菌，其中所述细菌是脱氮假单胞菌细菌。
183.根据权利要求182所述的重组细菌，其中所述细菌在调节所述第一基因的表达的第一核糖开关的第一位置处包含缺失，并且所述第一和第二启动子在所述第一位置处整合到所述细菌的染色体中，从而它们调节所述第一基因的表达。
184.根据权利要求183所述的重组细菌，其中所述细菌进一步在调节参与辅酶B12合成的第二基因的表达的第二核糖开关的第二位置处包含第二缺失，在调节参与辅酶B12合成的第三基因的表达的第三核糖开关的第三位置处包含第三缺失，以及在调节参与辅酶B12合成的第四基因的表达的第四核糖开关的第四位置处包含第四缺失。
185.根据权利要求184所述的重组细菌，其进一步包含第三启动子和第四启动子，所述第三启动子和第四启动子串联地可操作地连接并在所述第二位置整合到染色体中，从而它们调节所述第二基因的表达；第五启动子和第六启动子，所述第五启动子和第六启动子串联地可操作地连接并在所述第三位置处整合到染色体中，从而它们调节所述第三基因的表达；以及第七和第八启动子，所述第七启动子和第八启动子串联地可操作地连接并在所述第四位置处整合到染色体中，从而调节所述第四基因的表达。
186.根据权利要求181所述的重组细菌，其中所述细菌比天然的脱氮假单胞菌产生更多的辅酶B12。
187.根据权利要求165所述的重组细菌，其进一步包含辅酶B12表达模块。
188.一种产生3-HP或其盐的方法，包括在足以产生3-HP或其盐的条件下培养权利要求159-187中任一项所述的重组细菌。
189.根据权利要求188所述的方法，其中所述条件足以产生至少85g/L的3-HP或其盐。
190.根据权利要求189所述的方法，其中所述条件足以产生至少90g/L的3-HP或其盐。
191.根据权利要求189所述的方法，其中所述条件足以产生至少95g/L的3-HP或其盐。
192.根据权利要求189所述的方法，其中所述条件足以产生至少100g/L的3-HP或其盐。
193.根据权利要求188所述的方法，其中培养所述细菌不包括添加外部辅酶B12。
194.根据权利要求188所述的方法，其中培养细菌包括向培养物中添加外部辅酶B12。
195.根据权利要求188所述的方法，其中培养包括使所述细菌在包含碳源的培养基中生长，所述碳源选自甘油、葡萄糖、葡萄糖酸盐或酯、谷氨酸盐或酯和柠檬酸。
196.根据权利要求188所述的方法，其中培养包括通过添加甘油来诱导所述细菌产生3-HP。
197.根据权利要求196所述的方法，其中甘油在对数中期添加。
198.根据权利要求188所述的方法，其中培养包括使所述细菌在包含氮源的培养基中生长，其中所述氮源选自酵母提取物、玉米浆粉末和玉米浆糊。
199.根据权利要求188所述的方法，其中培养包括使所述细菌在6.8和7.8之间的pH下生长。
200.根据权利要求199所述的方法，其中培养包括添加选自下述的一种或多种碱：NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3和Na2CO3。
201.根据权利要求199所述的方法，其中培养包括添加选自下述的至少一种碱：NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3和Na2CO3的碱。
202.根据权利要求188所述的方法，其中培养包括稀释所述碱浓度和增加所述酸浓度。
203.根据权利要求188所述的方法，其中培养包括在28至40摄氏度之间的温度下生长所述细菌。
204.根据权利要求203所述的方法，其中培养包括使所述细菌在33摄氏度下生长。
205.生产3-HP或其盐的方法，该方法包括：
在适于细菌生长和产生3-HP或其盐的培养基中提供权利要求159-187中任一项所述的重组细菌。
206.根据权利要求205所述的方法，其进一步包括从所述细菌或培养基中分离3-HP。
207.根据权利要求205所述的方法，其中所述培养基包含的溶解氧浓度为约2-20％的溶解氧。
208.根据权利要求207所述的方法，其中所述溶解氧浓度为大约5-10％。
209.根据权利要求207所述的方法，其中所述溶解氧浓度不超过20％。
210.根据权利要求207所述的方法，其中所述溶解氧浓度为至少2％。
211.一种方法，其包括：
在不使用逆流液流(counter-current liquid flow)的情况下从水溶液中取出3-羟基丙酸(3-HP)。
212.根据权利要求211所述的方法，其包括使用溶剂从所述水溶液中取出3-HP。
213.根据权利要求212所述的方法，其包括，在使用所述溶剂从所述水溶液中取出3-HP之前：
蒸发所述溶剂；和
冷凝所述蒸发的溶剂。
214.根据权利要求212或权利要求213所述的方法，其中所述溶剂包括与水不混溶的溶剂。
215.根据权利要求212或权利要求213所述的方法，其中所述溶剂包括与水混溶的溶剂。
216.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述溶剂的密度小于约1g/mL。
217.根据权利要求211-215中任一项所述的方法，其中所述溶剂的密度大于约1g/mL。
218.根据权利要求212或213所述的方法，其中所述溶剂包含选自乙酸C1-6烷基酯、C4-6醇和C1-6烷基醚中的至少一种溶剂。
219.根据权利要求212或权利要求213所述的方法，其中所述溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正戊酯和乙酸正己酯。
220.根据权利要求212或213所述的方法，其中所述溶剂包括乙酸乙酯。
221.根据权利要求212或213所述的方法，其中所述溶剂包括选自正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇和正己醇的至少一种溶剂。
222.根据权利要求212或213所述的方法，其中所述溶剂包括异丁醇。
223.根据权利要求212或213所述的方法，其中所述溶剂包括选自二乙醚、二丙醚、乙基丙基醚、甲基叔丁基醚和甲基己基醚的至少一种溶剂。
224.根据权利要求212或权利要求213所述的方法，其中所述溶剂包括选自氯仿、二氯甲烷和四氯化碳中的至少一种溶剂。
225.根据权利要求212、213或215中任一项所述的方法，包括将所述溶剂添加到所述水溶液中。
226.根据权利要求212、213、215或225中任一项所述的方法，其中所述溶剂包括C1-3醇。
227.根据权利要求212、213、215或225中任一项所述的方法，其中所述溶剂包括选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种溶剂。
228.根据权利要求212、213、215或225中任一项所述的方法，其中所述溶剂包括甲醇。
229.根据权利要求212、213或225-228中任一项所述的方法，其中所述溶剂的量为所述水溶液的量的约5v/v％至约50v/v％。
230.根据权利要求212、213或225-228中任一项所述的方法，其中所述溶剂的量为所述水溶液的量的约25v/v％。
231.根据权利要求212、213或225-228中任一项所述的方法，其包括使用与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂从所述水溶液中取出3-HP，其中1)所述水混溶的溶剂和所述水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比为约1∶1至约2∶1。
232.根据权利要求211-231中任一项所述的方法，其中以至少50％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
233.根据权利要求211-231中任一项所述的方法，其中以至少60％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
234.根据权利要求211-231中任一项所述的方法，其中以至少70％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
235.根据权利要求211-231中任一项所述的方法，其中以至少80％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
236.根据权利要求211-231中任一项所述的方法，其中以至少90％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
237.根据权利要求211-231中任一项所述的方法，其中以至少95％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
238.根据权利要求211-231中任一项所述的方法，其中以至少99％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
239.一种方法，其中包括：
蒸发第一溶剂；
冷凝所述蒸发的第一溶剂；和
引导第一溶剂流以从所述水溶液中取出3-HP。
240.根据权利要求233所述的方法，其中所述第一溶剂的密度小于约1g/mL。
241.根据权利要求233所述的方法，其中所述第一溶剂的密度大于约1g/mL。
242.根据权利要求239所述的方法，其中所述第一溶剂包括与水不混溶的溶剂。
243.根据权利要求239所述的方法，其中所述第一溶剂包括选自乙酸C1-6烷基酯、C4-6醇和C1-6烷基醚中的至少一种溶剂。
244.根据权利要求239所述的方法，其中所述第一溶剂包括选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正戊酯和乙酸正己酯的至少一种溶剂。
245.根据权利要求239所述的方法，其中所述第一溶剂包括乙酸乙酯。
246.根据权利要求239所述的方法，其中所述第一溶剂包括选自正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇和正己醇中的至少一种溶剂。
247.根据权利要求239所述的方法，其中所述第一溶剂包括异丁醇。
248.根据权利要求239所述的方法，其中所述第一溶剂包括选自二乙醚、二丙基醚、乙基丙基醚、甲基叔丁基醚和甲基己基醚中的至少一种溶剂。
249.根据权利要求239所述的方法，其中所述第一溶剂包括选自氯仿、二氯甲烷和四氯化碳中的至少一种溶剂。
250.根据权利要求239-249中任一项所述的方法，其中包括使用第二溶剂从所述水溶液中取出3-HP。
251.根据权利要求250所述的方法，其中所述第二溶剂包括与水混溶的溶剂。
252.根据权利要求250所述的方法，其中所述第一溶剂包括与水不混溶的溶剂，并且所述第二溶剂包括与水混溶的溶剂。
253.根据权利要求250-252中任一项所述的方法，包括将所述第二溶剂添加到所述水溶液中。
254.根据权利要求250-253中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂包括C1-3醇。
255.根据权利要求250-253中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂包括选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种溶剂。
256.根据权利要求250-253中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂包括甲醇。
257.根据权利要求250-256中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂的量为所述水溶液的量的约5v/v％至约50v/v％。
258.根据权利要求250-256中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂的量为所述水溶液的量的约25v/v％。
259.根据权利要求250-258中任一项所述的方法，其中1)所述第一溶剂和所述第二溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比为1：1至约2：1。
260.根据权利要求239-259中任一项所述的方法，其中以至少50％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
261.根据权利要求239-259中任一项所述的方法，其中以至少60％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
262.根据权利要求239-259中任一项所述的方法，其中以至少70％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
263.根据权利要求239-259中任一项所述的方法，其中以至少80％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
264.根据权利要求239-259中任一项所述的方法，其中以至少90％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
265.根据权利要求239-259中任一项所述的方法，其中以至少95％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
266.根据权利要求239-259中任一项所述的方法，其中以至少99％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
267.一种方法，其中包括：
使用与水不混溶的溶剂从水溶液中以至少50％的产率取出3-羟基丙酸(3-HP)。
268.根据权利要求267所述的方法，其中从所述水溶液取出3-HP的产率为至少60％。
269.根据权利要求267所述的方法，其中从所述水溶液取出3-HP的产率为至少70％。
270.根据权利要求267所述的方法，其中从所述水溶液取出3-HP的产率为至少80％。
271.根据权利要求267所述的方法，其中从所述水溶液取出3-HP的产率为至少90％。
272.根据权利要求267所述的方法，其中从所述水溶液取出3-HP的产率为至少95％。
273.根据权利要求265所述的方法，其中从所述水溶液取出3-HP的产率为至少99％。
274.根据权利要求267-273中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括至少一种乙酸C1-6烷基酯。
275.根据权利要求267-273中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯。乙酸仲丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正戊酯和乙酸正己酯。
276.根据权利要求267-273中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括乙酸乙酯。
277.根据权利要求267-276中任一项所述的方法，包括使用逆流液体流。
278.根据权利要求267-276中任一项所述的方法，其包括，在使用所述与水不混溶的溶剂从所述水溶液中取出3-HP之前：
蒸发所述与水不混溶的溶剂；和
冷凝所述蒸发的与水不混溶的溶剂。
279.根据权利要求267-278中任一项所述的方法，包括使用与水混溶的溶剂从所述水溶液中取出3-HP。
280.根据权利要求279所述的方法，其包括将所述水混溶的溶剂加入到所述水溶液中。
281.根据权利要求279或280所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂包括C1-3醇。
282.根据权利要求279或280所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂包括选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇的至少一种溶剂。
283.根据权利要求279或280所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂包括甲醇。
284.根据权利要求279-283中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂的量为所述水溶液的量的约5v/v％至约50v/v％。
285.根据权利要求279-283中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂的量为所述水溶液的量的约25v/v％。
286.根据权利要求279-283中任一项所述的方法，其中1)所述水混溶性溶剂和所述水不混溶性溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比为约1∶1至约2：1。
287.一种方法，其中包括：
使用液体从水溶液中取出3-羟基丙酸(3-HP)，
其中所述液体包括第一和第二溶剂。
288.根据权利要求287所述的方法，其中所述第一溶剂包括有机溶剂。
289.根据权利要求287或权利要求288所述的方法，其中所述第二溶剂包括有机溶剂。
290.根据权利要求287-289中任一项所述的方法，其中所述第一溶剂是与水混溶的。
291.根据权利要求287-289中任一项所述的方法，其中所述第一溶剂是与水混溶的，并且所述第二溶剂是与水不混溶的。
292.根据权利要求287-291中任一项所述的方法，其中在不使用逆流液流的情况下执行所述方法。
293.根据权利要求287-292中任一项所述的方法，其进一步包括在使用所述液体取出3-HP之前：
蒸发所述第二溶剂；和
冷凝所述蒸发的第二溶剂。
294.根据权利要求287-293中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂的密度小于约1g/mL。
295.根据权利要求287-294中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂包括选自乙酸C1-6烷基酯、C4-6醇和C1-6烷基醚中的至少一种溶剂。
296.根据权利要求287-294中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正戊酯和乙酸正己酯。
297.根据权利要求287-294中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂包括乙酸乙酯。
298.根据权利要求287-294中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇和正己醇。
299.根据权利要求287-294中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂是异丁醇。
300.根据权利要求287-294中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：二乙醚、二丙醚、乙基丙基醚、甲基叔丁基醚和甲基己基醚。
301.根据权利要求287-300中任一项所述的方法，其中所述第二溶剂的密度大于约1g/mL。
302.根据权利要求287-300中任一项所述的方法，其中所述第一溶剂包括选自氯仿、二氯甲烷和四氯化碳的至少一种溶剂。
303.根据权利要求287-300中任一项所述的方法，其中所述第一溶剂包括C1-3醇。
304.根据权利要求287-300中任一项所述的方法，其中所述第一溶剂包括选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种溶剂。
305.根据权利要求287-300中任一项所述的方法，其中所述第一溶剂包括甲醇。
306.根据权利要求287-305中任一项所述的方法，其中所述第一溶剂的量为所述水溶液的量的约5v/v％至约50v/v％。
307.根据权利要求287-305中任一项所述的方法，其中所述第一溶剂的量为所述水溶液的量的约25v/v％。
308.根据权利要求287-307中任一项所述的方法，其中1)所述第一和第二溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比为1∶1至约2∶1。
309.根据权利要求287-308中任一项所述的方法，其中以至少50％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
310.根据权利要求287-308中任一项所述的方法，其中以至少60％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
311.根据权利要求287-308中任一项所述的方法，其中以至少70％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
312.根据权利要求287-308中任一项所述的方法，其中以至少80％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
313.根据权利要求287-308中任一项所述的方法，其中以至少90％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
314.根据权利要求287-308中任一项所述的方法，其中以至少95％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
315.根据权利要求287-308中任一项所述的方法，其中以至少99％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
316.一种方法，其中包括：
使用与水混溶的溶剂和与水不混溶的溶剂从水溶液中取出3-羟基丙酸(3-HP)。
317.根据权利要求316所述的方法，其中在不使用逆流液流的情况下执行所述方法。
318.根据权利要求316或权利要求317所述的方法，其包括在使用所述与水不混溶的溶剂从所述水溶液中取出3-HP之前：
蒸发所述与水不混溶的溶剂；和
冷凝所述蒸发的与水不混溶的溶剂。
319.根据权利要求316-318中任一项所述的方法，其中包括在使用所述与水混溶的溶剂从水溶液中取出3-HP之前：
蒸发所述与水混溶的溶剂；和
冷凝所述蒸发的与水混溶的溶剂。
320.根据权利要求316-319中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂的密度小于约1g/mL。
321.根据权利要求316-320中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自乙酸C1-6烷基酯、C4-6醇和C1-6烷基醚中的至少一种溶剂。
322.根据权利要求316-320中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正戊酯和乙酸正己酯。
323.根据权利要求316-320中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括乙酸乙酯。
324.根据权利要求316-320中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇和正己醇的至少一种溶剂。
325.根据权利要求316-320中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括异丁醇。
326.根据权利要求316-320中任一项所述的方法，其中与水不混溶的溶剂包括选自二乙醚、二丙醚、乙基丙基醚、甲基叔丁基醚和甲基己基醚的至少一种溶剂。
327.根据权利要求316-326中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂的密度大于约1g/mL。
328.根据权利要求316-327中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自氯仿、二氯甲烷和四氯化碳中的至少一个成员。
329.根据权利要求316-327中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂包括C1-3醇。
330.根据权利要求316-327中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂包括选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的至少一种溶剂。
331.根据权利要求316-327中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂包括甲醇。
332.根据权利要求316-331中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂的量为所述水溶液的量的约5v/v％至约50v/v％。
333.根据权利要求316-331中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂的量为所述水溶液的量的约25v/v％。
334.根据权利要求316-333中任一项所述的方法，其中1)所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比为约1∶1至约2：1。
335.根据权利要求316-334中任一项所述的方法，其中以至少50％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
336.根据权利要求316-334中任一项所述的方法，其中以至少60％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
337.根据权利要求316-334中任一项所述的方法，其中以至少70％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
338.根据权利要求316-334中任一项所述的方法，其中以至少80％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
339.根据权利要求316-334中任一项所述的方法，其中以至少90％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
340.根据权利要求316-334中任一项所述的方法，其中以至少95％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
341.根据权利要求316-334中任一项所述的方法，其中以至少99％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
342.根据权利要求211-341中任一项所述的方法，其中所述水溶液的pH为至少约3。
343.根据权利要求211-341中任一项所述的方法，其中所述水溶液的pH为至少约4。
344.根据权利要求211-341中任一项所述的方法，其中所述水溶液的pH为约3至约7。
345.根据权利要求211-341中任一项所述的方法，其中所述水溶液的pH为约4至约6。
346.根据权利要求211-341中任一项所述的方法，其中所述水溶液的pH为约4.2至约4.7。
347.一种方法，其中包括：
从水溶液中取出3-羟基丙酸(3-HP)，
其中所述水溶液的pH为至少约3。
348.根据权利要求347所述的方法，其中所述水溶液的pH为至少约4。
349.根据权利要求347或权利要求348所述的方法，其中所述水溶液的pH至多为约7。
350.根据权利要求347所述的方法，其中所述水溶液的pH为约4至约6。
351.根据权利要求347所述的方法，其中所述水溶液的pH为约4至约5。
352.根据权利要求347所述的方法，其中所述水溶液的pH为约4.2至约4.8。
353.根据权利要求347所述的方法，其中所述水溶液的pH为约4.3至约4.6。
354.根据权利要求347所述的方法，其中所述水溶液的pH为约4.4。
355.根据权利要求347-354中任一项所述的方法，其中在不使用逆流液流的情况下执行所述方法。
356.根据权利要求347-355中任一项所述的方法，包括使用与水不混溶的溶剂从所述水溶液中取出3-HP。
357.根据权利要求356所述的方法，包括在使用与水不混溶的溶剂取出3-HP之前：
蒸发所述与水不混溶的溶剂；和
冷凝所述蒸发的与水不混溶的溶剂。
358.根据权利要求356或权利要求357所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂的密度小于约1g/mL。
359.根据权利要求356-358中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自乙酸C1-6烷基酯、C4-6醇和C1-6烷基醚中的至少一种溶剂。
360.根据权利要求356-358中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正戊酯和乙酸正己酯。
361.根据权利要求356-358中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括乙酸乙酯。
362.根据权利要求356-358中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇和正己醇。
363.根据权利要求356-358中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括异丁醇。
364.根据权利要求356-358中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自下述的至少一种溶剂：二乙醚、二丙醚、乙基丙基醚、甲基叔丁基醚和甲基己基醚。
365.根据权利要求355-364中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂的密度大于约1g/mL。
366.根据权利要求356-365中任一项所述的方法，其中所述与水不混溶的溶剂包括选自氯仿、二氯甲烷和四氯化碳的至少一种溶剂。
367.根据权利要求347-365中任一项所述的方法，其包括使用与水混溶的溶剂从所述水溶液中取出3-HP。
368.根据权利要求367所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂的使用包括将所述与水混溶的溶剂添加至所述水溶液。
369.根据权利要求367或权利要求368所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂是C1-3醇。
370.根据权利要求367或权利要求368所述的方法，其中与水混溶的溶剂包括选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇的至少一种溶剂。
371.根据权利要求367或权利要求366所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂包括甲醇。
372.根据权利要求367-371中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂的量为所述水溶液的量的约5v/v％至约50v/v％。
373.根据权利要求367-371中任一项所述的方法，其中所述与水混溶的溶剂的量为所述水溶液的量的约25v/v％。
374.根据权利要求357-373中任一项所述的方法，其中1)所述与水混溶的溶剂和所述与水不混溶的溶剂的总体积与2)所述水溶液的体积之比为约1∶1至约2：1。
375.根据权利要求347-374中任一项所述的方法，其中以至少50％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
376.根据权利要求347-374中任一项所述的方法，其中以至少60％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
377.根据权利要求347-374中任一项所述的方法，其中以至少70％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
378.根据权利要求347-374中任一项所述的方法，其中以至少80％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
379.根据权利要求347-374中任一项所述的方法，其中以至少90％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
380.根据权利要求347-374中任一项所述的方法，其中以至少95％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
381.根据权利要求347-369中任一项所述的方法，其中以至少99％的产率从所述水溶液中取出3-HP。
382.根据权利要求211-381中任一项所述的方法，其中3-HP的水溶液包含去细胞化的发酵液。
383.根据权利要求211-382中任一项所述的方法，其中所述水溶液中3-HP的浓度为约50g/L至约100g/L。
384.根据权利要求211-382中任一项所述的方法，其中所述水溶液中3-HP的浓度为约60g/L至约80g/L。
385.根据权利要求211-384中任一项所述的方法，其中所述水溶液包含酸。
386.根据权利要求211-384中任一项所述的方法，其中所述酸包括选自硫酸、盐酸、乙酸和草酸中的至少一种酸。
387.根据权利要求211-386中任一项所述的方法，其中所述水溶液的温度为约15℃至约50℃。
388.根据权利要求211-386中任一项所述的方法，其中所述水溶液的温度为约15℃至约40℃。
389.根据权利要求211-386中任一项所述的方法，其中所述水溶液的温度为约20℃至约30℃。
390.根据权利要求211-386中任一项所述的方法，其中所述水溶液在大约室温下。
391.根据权利要求211-390中任一项所述的方法，其中进一步包括，在从水溶液中取出3-HP之后，使所述3-HP反应以制备丙烯酸。
392.根据权利要求391所述的方法，其中包括在小于约700mbar的压力下使所述3-HP反应。
393.根据权利要求391或392所述的方法，包括使3-HP在水溶液中进行反应。
394.根据权利要求393所述的方法，其包括使所述水溶液与沸石接触。
395.根据权利要求393或394所述的方法，其中所述水溶液包含酸。
396.根据权利要求391-395中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热到至少约50℃的温度。
397.根据权利要求391-396中任一项所述的方法，其中所述反应在聚合抑制剂的存在下进行。
398.一种方法，其中包括：
在小于约一个大气压的压力下使3-羟基丙酸(3-HP)反应形成丙烯酸以提供丙烯酸。
399.根据权利要求398所述的方法，其中所述压力小于大约700mbar。
400.根据权利要求398所述的方法，其中所述压力小于大约500mbar。
401.根据权利要求398所述的方法，其中所述压力小于大约200mbar。
402.根据权利要求398所述的方法，其中所述压力小于大约100mbar。
403.根据权利要求398所述的方法，其中所述压力在约70至约100mbar的范围内。
404.根据权利要求398-403中任一项所述的方法，其中3-HP在水溶液中进行。
405.根据权利要求404所述的方法，其包括使所述水溶液与沸石接触。
406.根据权利要求405所述的方法，其中所述沸石包括4A分子筛。
407.根据权利要求405或权利要求406所述的方法，其中基于所述水溶液的量，沸石的量为约1重量％至约5重量％。
408.根据权利要求405或权利要求406所述的方法，其中基于所述水溶液的量，沸石的量为约2重量％至约4重量％。
409.根据权利要求398-408中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至少约50℃的温度。
410.根据权利要求398-408中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至少约80℃的温度。
411.根据权利要求398-408中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至多约180℃的温度。
412.根据权利要求404-411中任一项所述的方法，其中所述水溶液包含酸。
413.根据权利要求412所述的方法，其中所述酸包括选自草酸和多聚磷酸中的至少一种酸。
414.根据权利要求412或413所述的方法，其中基于3-HP的量，所述酸的量为约2重量％至约20重量％。
415.根据权利要求398-414中任一项所述的方法，包括使3-HP在聚合抑制剂的存在下反应。
416.根据权利要求415所述的方法，其中所述聚合抑制剂包括选自吩噻嗪和氢醌的至少一种聚合抑制剂。
417.根据权利要求415或416所述的方法，其中基于3-HP的量，所述聚合抑制剂的量为约5重量％至约10重量％。
418.一种方法，其中包括：
使3-羟基丙酸(3-HP)在反应混合物中反应形成丙烯酸；和
从反应混合物中取出气态丙烯酸。
419.根据权利要求418所述的方法，其中所述反应混合物包括液体。
420.根据权利要求419所述的方法，其中所述液体是水性的。
421.根据权利要求418-420中任一项所述的方法，其包括使所述反应混合物与沸石接触。
422.根据权利要求421所述的方法，其中所述沸石包括4A分子筛。
423.根据权利要求421或422所述的方法，其中基于所述水溶液的量，沸石的量为约1重量％至约5重量％。
424.根据权利要求421或权利要求422所述的方法，其中基于所述水溶液的量，沸石的量为约2重量％至约4重量％。
425.根据权利要求418-424中任一项所述的方法，其中取出气态丙烯酸在小于约一个大气压的压力下进行。
426.根据权利要求425所述的方法，其中所述压力小于大约700mbar。
427.根据权利要求425所述的方法，其中所述压力小于约500mbar。
428.根据权利要求425所述的方法，其中所述压力小于大约200mbar。
429.根据权利要求425所述的方法，其中所述压力小于大约100mbar。
430.根据权利要求425所述的方法，其中所述压力在约70至约100mbar的范围内。
431.根据权利要求418-430中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至少约50℃的温度。
432.根据权利要求418-430中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至少约80℃的温度。
433.根据权利要求418-430中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至多约180℃的温度。
434.根据权利要求418-423中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含酸。
435.根据权利要求434所述的方法，其中所述酸包括选自草酸和多聚磷酸中的至少一种酸。
436.根据权利要求434或权利要求435所述的方法，其中基于3-HP的量，所述酸的量为约2重量％至约20重量％。
437.根据权利要求418-436中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含聚合抑制剂。
438.根据权利要求437所述的方法，其中所述聚合抑制剂包括选自吩噻嗪和氢醌的聚合抑制剂。
439.根据权利要求437或权利要求438所述的方法，其中基于3-HP的量，所述聚合抑制剂的量为约5重量％至约10重量％。
440.一种方法，其中包括：
使包含3-羟基丙酸(3-HP)的液体反应形成丙烯酸。
441.根据权利要求440所述的方法，其中所述液体包括水溶液。
442.根据权利要求440或权利要求441所述的方法，包括形成气态丙烯酸。
443.根据权利要求440-442中任一项所述的方法，包括从所述液体中取出丙烯酸。
444.根据权利要求443所述的方法，其中在小于约一个大气压的压力下进行取出。
445.根据权利要求444所述的方法，其中所述压力小于大约700mbar。
446.根据权利要求444所述的方法，其中所述压力小于大约500mbar。
447.根据权利要求444所述的方法，其中所述压力小于大约200mbar。
448.根据权利要求444所述的方法，其中所述压力小于大约100mbar。
449.根据权利要求444所述的方法，其中所述压力在约70至约100mbar的范围内。
450.根据权利要求440-449中任一项所述的方法，包括使所述液体与沸石接触。
451.根据权利要求450所述的方法，其中所述沸石包括4A分子筛。
452.根据权利要求440或权利要求441所述的方法，其中基于所述水溶液的量，沸石的量为约1重量％至约5重量％。
453.根据权利要求440或权利要求441所述的方法，其中基于所述水溶液的量，沸石的量为约2重量％至约4重量％。
454.根据权利要求440-453中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至少约50℃的温度。
455.根据权利要求440-453中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至少约80℃的温度。
456.根据权利要求440-453中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至多约180℃的温度。
457.根据权利要求440-456中任一项所述的方法，其中所述液体包括酸。
458.根据权利要求457所述的方法，其中所述酸包括选自草酸和多聚磷酸中的至少一种酸。
459.根据权利要求247或248所述的方法，其中基于3-HP的量，所述酸的量为约2重量％至约20重量％。
460.根据权利要求440-459中任一项所述的方法，其中反应在聚合抑制剂的存在下进行。
461.根据权利要求460所述的方法，其中所述聚合抑制剂包括至少一种选自吩噻嗪和氢醌的聚合抑制剂。
462.根据权利要求460或权利要求461所述的方法，其中基于3-HP的量，所述聚合抑制剂的量为约5重量％至约10重量％。
463.根据权利要求391-462中任一项所述的方法，其中以至少约70％的产率形成丙烯酸。
464.根据权利要求391-462中任一项所述的方法，其中以至少约80％的产率形成丙烯酸。
465.根据权利要求391-462中任一项所述的方法，其中以至少约90％的产率形成丙烯酸。
466.根据权利要求391-462中任一项所述的方法，其中以至少约95％的产率形成丙烯酸。
467.根据权利要求391-462中任一项所述的方法，其中以至少约99％的产率形成丙烯酸。
468.一种方法，其中包括：
使3-羟基丙酸(3-HP)反应形成丙烯酸，产率至少约70％。
469.根据权利要求468所述的方法，其中以至少约80％的产率形成丙烯酸。
470.根据权利要求468所述的方法，其中以至少约90％的产率形成丙烯酸。
471.根据权利要求468所述的方法，其中以至少约95％的产率形成丙烯酸。
472.根据权利要求468所述的方法，其中以至少约99％的产率形成丙烯酸。
473.根据权利要求468-472中任一项所述的方法，其中所述3-HP在水溶液中进行。
474.根据权利要求468-473中任一项所述的方法，包括形成气态丙烯酸。
475.根据权利要求468-474中任一项所述的方法，包括从液体中取出所述丙烯酸。
476.根据权利要求475所述的方法，其中所述取出是在小于约一个大气压的压力下进行的。
477.根据权利要求476所述的方法，其中所述压力小于大约700mbar。
478.根据权利要求476所述的方法，其中所述压力小于大约500mbar。
479.根据权利要求476所述的方法，其中所述压力小于大约200mbar。
480.根据权利要求476所述的方法，其中所述压力小于大约100mbar。
481.根据权利要求476所述的方法，其中所述压力在约70至约100mbar的范围内。
482.根据权利要求468-481中任一项所述的方法，包括使所述水溶液与沸石接触。
483.根据权利要求482所述的方法，其中所述沸石是4A分子筛。
484.根据权利要求482或权利要求483所述的方法，其中基于所述水溶液的量，沸石的量为约1重量％至约5重量％。
485.根据权利要求482或权利要求483所述的方法，其中基于所述水溶液的量，沸石的量为约2重量％至约4重量％。
486.根据权利要求468-485中任一项所述的方法，其中所述水溶液包含酸。
487.根据权利要求486所述的方法，其中所述酸包括选自草酸和多聚磷酸的酸。
488.根据权利要求486或权利要求487所述的方法，其中基于3-HP的量，所述酸的量为约2重量％至约20重量％。
489.根据权利要求468-488中任一项所述的方法，其中所述反应在聚合抑制剂的存在下进行。
490.根据权利要求489所述的方法，其中所述聚合抑制剂包括选自吩噻嗪和氢醌的聚合抑制剂。
491.根据权利要求489或490所述的方法，其中基于3-HP的量，所述聚合抑制剂的量为约5重量％至约10重量％。
492.根据权利要求468-491中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至少约50℃的温度。
493.根据权利要求468-491中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至少约80℃的温度。
494.根据权利要求468-491中任一项所述的方法，其中使3-HP反应包括将3-HP加热至至多约180℃的温度。
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