KR101048485B1

KR101048485B1 - 재조합 대장균을 배양하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101048485B1
Application number: KR1020090075754A
Authority: KR
Inventors: 서진호; 박용철; 곽수량; 박성훈; 모한 라지 스브라마니안; 라스나싱 첸라두라이
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-08-17
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2011-07-12
Also published as: KR20110018122A

Abstract

본 발명은 재조합 대장균을 이용하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법에 관한 것으로,

글리세롤을 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 1,3-프로판디올(1,3-propanediol)의 전구체가 되는 3-히드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)로 전환시키기 위하여, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래의 글리세롤 데히드라타제를 구성하는 서브 유닛 DHAB1, DHAB2 및 DHAB3 중 DHAB1 및 DHAB2를 각각 암호화하는 오픈리딩프레임의 개시코돈 TTG 및 GTG가 ATG로 각각 변이된 락토바실러스 브레비스 유래의 글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase; DHAB) 및, 락토바실러스 브레비스 유래의 글리세롤 데히드라타제 리액티바제(glycerol dehydratase reactivase)가 발현되게 형질전환되고; 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소가 발현되도록 형질전환된; 재조합 대장균을 글리세롤 및 포도당을 배지에 지속적으로 공급하는 유가식 배양을 통해 배양하는 것을 특징으로 하는 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법을 제공한다.

NAD, 3-히드록시프로피온산, 1,3-프로판디올, 글리세롤, 글리세롤 데히드라타제, 글리세롤 데히드라타제 리액티바제, 대장균, 락토바실러스 브레비스, 유가식 배양, 포도당

Description

재조합 대장균을 배양하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법{Method for simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1,3-propanediol from glycerol by cultivating recombinant E. coli}

본 발명은 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 재조합 대장균을 이용하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법에 관한 것이다.

글리세롤은 화장품, 물비누, 음식, 의약품 및 윤활유와 같이 산업적 목적으로 사용될 뿐만 아니라 발효산업에 있어서 원료물질로도 사용되고 있는데, 3-히드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA)를 경유하여 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 1,3-프로판디올(1,3-propanediol; 1,3-PD)을 생산하는데 사용된다(참고도 1 참조).

[참고도 1]

이 중 1,3-프로판디올은 폴리에스터(polyester), 폴리에테르(polyether), 혹은 폴리우레탄(polyurethanes) 등의 합성원료로 사용될 수 있는 물질이며, 특히 1,3-PD와 테레프탈릭산(therphtalic acid)의 중합반응에 의해 생성되는 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT)는 물성이 우수하고 유점이 228℃로 폴리에틸렌 데레프탈레이트(PET)보다 낮아 실질적인 효용성이 많으므로 향후 PET를 대체할 수 있는 차세대 섬유재료로서 주목받고 있다.

또한, 1,3-프로판디올을 단량체로 하여 만든 플라스틱과 중합체는 1,2-프로판디올, 부탄디올, 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)로 만든 제품보다 더 우수한 광학 안정성을 가지는 특성을 나타낸다[Elm et al. , 1980; Witt et al. , 1994].

그런데, 1,3-프로판디올은 잠재력이 큰 화학 원료물질 중의 하나임에도 불구 하고, 화학합성에 의한 생산 단가가 너무 높아 최근까지 상용화되지 못하고 있으며, 특히 국내에서는 미생물 발효에 의한 1,3-프로판디올 생산에 관한 연구가 거의 전무한데, 향후 섬유산업 분야나 생분해성 플라스틱 산업분야에서 발생되는 수요를 충족시키기 위하여 전적으로 외국기술의 도입이나 제품의 수입에 의존해야할 형편이다. 이에 국내독자 생산을 위한 기술의 개발이 시급하다.

한편, 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)은 현재 US DOE 리스트에 올라 있는 재생 바이오 매스 생산물 관련 12가지 플랫폼 화합물 중 세 번째 위치를 차지할 정도로 중요하다.

3-HP는 고분자 코팅제의 가교 결합제, 금속 윤활제 및 직물에 대한 정전기 방지제로 주로 사용되고 있는데, 이 외에도 많은 분야에서 활용이 되고 있는 화합물이다.

3-HP는 광학적으로 활성이 있는 물질의 합성을 위해 중요한 역할을 하는 2개의 작용기를 가지고 있는데, 이는 화학산업에서 3-HP가 중요한 전구체로 각광받게 하는 요소이다. 3-HP를 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물로는 1,3-프로판디올, 아크릴릭 에시드(acrlici acid), 메틸 아크릴레이트(methyl acrylate), 아크릴아미드(acrylamide), 에틸 3-HP, 말로닉 에시드(malonic acid), 프로피로락톤(propiolactone) 및 아크릴로니트릴(acrylonitrile) 등이 있다.

3-HP는 상기에서 살펴본 바와 같이 다양한 물질의 합성을 위한 전구체로 활용되고, 다양한 응용분야를 가지고 있는데, 세계 시장의 규모가 연간 3.63 백만 톤 으로 어림잡아 진다.

그런데, 상기와 같은 중요하고 유용한 역할을 하는 3-HP에 대한 생합성 경로에 대해서는 많이 연구되어 있지 않고, 특히, 글리세롤로부터 3-HP를 생합성하는 기술에 대한 연구는 많이 이루어지지 않고 있다.

이에 본 발명은 재조합 대장균을 이용하여 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법을 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 글리세롤을 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 1,3-프로판디올(1,3-propanediol)의 전구체가 되는 3-히드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)로 전환시키기 위하여, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래의 글리세롤 데히드라타제를 구성하는 서브 유닛 DHAB1, DHAB2 및 DHAB3 중 DHAB1 및 DHAB2를 각각 암호화하는 오픈리딩프레임의 개시코돈 TTG 및 GTG가 ATG로 각각 변이된 락토바실러스 브레비스 유래의 글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase; DHAB) 및, 락토바실러스 브레비스 유래의 글리세롤 데히드라타제 리액티바제(glycerol dehydratase reactivase)가 발현되게 형질전환되고; 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소가 발현되도록 형질전환된; 재조합 대장균을 글리세롤 및 포도당을 배지에 지속적으로 공급하는 유가식 배양을 통해 배양하는 것을 특징으로 하는 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 하기에서 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 발명에서는 글리세롤을 3-히드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA)로 전환하는 글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase; DHAB), 불활성화된 글리세롤 데히드라타제를 재활성화하는 글리세롤 데히드라타제 리액티바제(glycerol dehydratase reactivase) 및 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소를 발현하도록 대장균을 형질전환하는데, 형질전환의 방법은 유전공학계에 알려진 공지의 방법을 통해 수행할 수 있다.

글리세롤 데히드라타제는 글리세롤을 3-히드록시프로피온알데히드로 전환하는 효소로서, 본 발명에서는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래의 것을 사용한다. 글리세롤 데히드라타제는 B₁₂-의존성으로서, 반응을 위해 반드시 B₁₂가 필요하다.

조효소 B₁₂-의존성 데히드라타제는 대형 또는 "α" 서브유닛, 중간 또는 "β" 서브유닛 및 소형 또는 "γ" 서브유닛의 3개 서브유닛으로 구성된다. 이들 서브유닛은 α₂β₂γ₂ 구조로 조립되어 주효소(apoenzyme)를 형성한다.

한편, 조효소 B₁₂는 촉매반응을 일으키는 라디칼 메카니즘에 관여하기 때문에 촉매 활성에 반드시 필요한데, 조효소 B₁₂는 상기 주효소에 결합하여 촉매활성완전 효소(holoenzyme)를 형성한다. 생화학적으로, 조효소 B₁₂-의존성 글리세롤 데히드라타제는 글리세롤에 의해 불활성화를 겪는다는 것이 공지되어 있다([Daniel et al., 상기 문헌]; 문헌 [Seifert, et al., Eur. J. Biochem. 268:2369-2378 (2001)]).

글리세롤 데히드라타제의 불활성화는 조효소 B₁₂ 보조인자의 코발트-탄소 (Co-C) 결합이 절단되어 5'-데옥시아데노신 및 불활성 코발라민 종이 형성되는 단계를 포함하는데, 불활성 코발라민 종은 상기 데히드라타제에 밀착 결합된 채로 유지되어, 데히드라타제 재활성화 인자의 개입 없이는 분리되지 않는다. 불활성화는 3-HPA 형성과 관련된 반응 속도를 유의하게 감소시켜서, 3-HP 및 1,3-프로판디올의 제조를 간접적으로 감소시킬 수 있는 문제를 수반하기 때문에 재활성화는 상당히 중요한 고려사항이다.

한편, 데히드라타제 활성의 재활성화는 2가지 측면에서 해결될 수 있다.

첫 번째 방안으로, 데히드라타제 활성의 재활성화는 이를 담당하는 단백질에 의해 극복될 수 있다. 재활성화는 다단계로 일어나는데, 불활성화된 조효소 B₁₂-의존성 데히드라타제와 데히드라타제 재활성화 인자가 ATP-의존성 과정으로 상호작용하여, 밀착 결합된 불활성 코발라민 종을 방출시켜 주효소를 생성할 수 있는 것이다. 그 후, 데히드라타제 주효소는 조효소 B₁₂와 결합하여 촉매 활성 완전효소를 재형성할 수 있고, 불활성 코발라민 종은 효소 작용에 의한 별도의 ATP-의존성 과정으로 조효소 B₁₂로 재생될 수 있다.

데히드라타제 재활성화 인자는 WO 98/21341호(US 6,013,494), 문헌 [Daniel et al., 상기 문헌], 문헌 [Toraya and Mori, J. Biol. Chem. 274:3372 (1999)] 및 문헌 [Tobimatsu et al., J. Bacteriol. 181:4110 (1999)]에 기재되어 있다.

그런데, 데히드라타제 재활성화 과정 및 조효소 B₁₂ 재생 과정 둘 다 ATP를 필요로 하기 때문에, 글리세롤의 3-HPA로의 전환과정에 상당한 에너지 부담이 된다.

따라서, 데히드라타제 활성의 재활성화에 대한 두 번째 방안으로 배지에 첨가되는 조효소 B₁₂의 양을 증가시키거나, 또는 배양 배지에 비타민 B₁₂ (생체 내에서 조효소 B₁₂로 전환됨)를 보충하여 미생물에게 추가의 조효소 B₁₂를 공급하는 방법이 고려되어 질 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 대장균은 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소가 발현되도록 형질전환되어 있는데, 글리세롤 데히드라타제에 의해 생산된 3-HPA가 이 효소에 의해 3-HP로 전환된다.

본 발명의 사전 실험에 의하면, 글리세롤 데히드라타제 및 글리세롤 데히드라타제 리액티바제만을 발현시켰을 경우, 3-HPA의 생산은 원활히 이루어지나, 생산된 3-HPA가 3-HP로 원활히 전환되지 않음을 확인할 수 있었다.

하지만, 본 실험예에 의할 경우 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소(일 예로, 알데히드 데히드로지나제)를 동시발현시키 고, 포도당을 배지 중에 첨가할 경우, 3-HPA가 3-HP로 현저히 전환됨을 확인할 수 있었다. 다만, 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소(일 예로, 알데히드 데히드로지나제)를 동시발현시킨다 하더라도, 과량의 포도당 공급이 없다면, 3-HP가 생산되지 않음이 본 발명의 실시예 2로부터 확인되었다.

[참고도 2]

상기 참고도 2에 의할 경우, 글리세롤로부터 생산된 3-HPA가 3-HP로 전환되기 위해서는 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소가 필요하고, 보조인자로 NAD⁺가 요구됨을 알 수 있다. 이때, 보조인자가 적절히 공급되지 않으면, 3-HPA만 쌓이게 되고, 3-HP로 전환되지 않게 된다.

그런데, 본 발명에서와 같이 포도당이 배지 중 고갈되지 않도록 충분히 공급되면, 해당경로를 통해 NAD ⁺가 생산되고, 이를 통해 생산된 NAD ⁺가 3-HP의 생산에 사용되어, 3-HPA가 3-HP로 급격히 전환되는 것으로 확인되었다.

따라서, 통상적으로 대장균을 배양할 때는 배지 중에 특별히 포도당을 별도 로 첨가하지 않으나, 본 발명에서와 같이, 3-HP와 1,3-PD를 동시생산하는 공정에서는 배지 중에 반드시 포도당을 첨가해야 하고, 특히 발효 전반에 걸쳐 포도당이 고갈되지 않게 첨가해 주어야 하는 것이다.

한편, 본 발명의 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법은 재조합 대장균을 글리세롤 및 포도당을 배지에 지속적으로 공급하는 유가식 배양을 통해 배양하고자 하는데, 이를 통해 3-HP의 생산성이 증대되고, 또한, 회분식 배양에서는 관찰되지 않던 1,3-프로판디올(1,3-PD)의 생산이 확인되었다.

[참고도 3]

포도당이 배지 중에 과량공급될 경우, 해당경로를 통해 NAD ⁺가 생산되고, 이를 통해 생산된 NAD ⁺가 3-HP의 생산에 사용되어, 3-HPA가 3-HP로 급격히 전환되는 것은 상기에서 살펴본 바와 같았다.

한편, 상기 참고도 3에서 살펴보는 바와 같이 3-HP의 생산을 위해 사용된 NAD ⁺는 NADH로 전환되는데, 전환된 NADH는 1,3-PD의 생산에 보조인자로 사용될 수 있다. 이와 같은 NAD ⁺ 및 NADH의 커플링 반응에 의해 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올으로 전환시키는 효소를 특별히 발현 또는 과발현시키지 않았음에도 불구하고, 1,3-PD가 생산된 것이다.

본 발명에서는 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올으로 전환시키는 효소를 특별히 발현 또는 과발현시키지 않았음에도 불구하고 1,3-PD의 생산을 확인할 수 있었는데, 이는 대장균이 관련되는 효소를 보유하고 있기 때문이다. 다만, 반응속도를 빨리 하기 위해 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올으로 전환시키는 효소를 발현시키거나 과발현시키는 것이 바람직하고, 이와 같은 '발현' 또는 '과발현'에 의해 1,3-PD의 생산성이 증가할 수 있음은 효소의 일반 특성에 대한 공지의 사실로부터 당연히 유추될 수 있다.

한편, 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올으로 전환시키는 효소의 예로는 글리콜알데히드 리덕타제(glycolaldehyde reductase), L-1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(L-1,2-propanediol oxidoreductase), 에탄올 데히드로지나제(ethanol dehydrogenase) 등이 있다.

이상, 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 유래의 글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase; DHAB), 락토바실러스 브레비스 유래의 글리세롤 데히드라타제 리액티바제(glycerol dehydratase reactivase) 및 3-히 드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소를 발현하도록 형질전환된 재조합 대장균을 이용하고, NAD⁺의 재생산을 위해 포도당을 배지에 지속적으로 공급하는 유가식 배양을 사용함으로써, 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 효율적으로 동시 생산할 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 하나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 대장균의 제조

락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) ATCC 367로부터 글리세롤 데히드라타제를 클로닝한 후, 이를 구성하는 서브 유닛 DHAB1, DHAB2 및 DHAB3 중 DHAB1 및 DHAB2를 각각 암호화하는 오픈리딩프레임의 개시코돈 TTG 및 GTG를 사이트-드렉티드 뮤타제네시스(site-directed mutagenesis)를 통해 ATG로 각각 치환하여, pET29b(+) 벡터(Novagen 판매)에 도입하여 pET29-dhaB(pELD) 벡터를 구축하였다 (하기 참고도 4 및 5 참조 요망).

[참고도 4]

[참고도 5]

상기 과정에서 글리세롤 데히드라타제의 클로닝 및 사이트-드렉티드 뮤타제네시스(site-directed mutagenesis)는 오버랩 익스텐션 PCR(overlap extension PCR)을 통해 수행하였다. PCR은 하기의 표 1에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 수행하였다.

용도	이름	올리고뉴클레오타이드
dhaB 변이 및 증폭	LBF1bX (XbaⅠ)	5'-GCTCTAGATAAAGGGGGATTTTTAAATG
	LbR (BamHⅠ)	5'-CGGGATCCCTAGTTATCACCCTTCAG
	LbOF	5'-GTTAACACTATGGCTCAAGAA
	LbOR	5'-TTCTTGAGCCATAGTGTTAAC

먼저, LbF1bX-LbOR 및 LbOF-LbR의 두개의 프라이머 조합을 이용하여 첫 번째 PCR을 수행함으로써 2개의 DNA 절편을 증폭하였다. 그리고 나서 이 2개의 DNA 절편을 이용하여 두 번째 PCR을 수행하였다. 이때에는 별도의 프라이머를 첨가하지 않고 수행하였는데, 그렇다 하더라도 상기 2개의 DNA 절편이 상호 중첩되는 서열을 가지고 있기 때문에, PCR되는데는 문제가 없고, PCR 결과 두 번째 PCR 산물이 수득되었다.

그 후, 상기 두번째 PCR 산물을 템플레이트로 하여 LbF1bX 및 LbR의 프라이머를 첨가하여 세 번째 PCR을 수행함으로써 참고도 5의 하단에 모식화된 DNA 절편을 최종 수득하고, pET29b(+) 벡터에 도입함으로써 pET29-dhaB(pELD) 벡터를 구축하였다.

한편, 락토바실러스 브레비스로 ATCC 367부터 글리세롤 데히드라타제 리액티바제(glycerol dehydratase reactivase)를 클로닝한 후, 상기 pELD 벡터에 도입하여 pELD-dhaR(pELDRR) 벡터를 구축하였다. 이 후, 상기에서 구축한 pELDRR 벡터를 이 콜라이(E. coli) BL21 star (DE3) 균주(Invitrogen 판매)에 도입하여 형질전환시킴으로써, 재조합 대장균을 제조하였다 (하기 참고도 6 및 7 참조 요망)

[참고도 6]

[참고도 7]

상기 과정에서 사용한 프라이머는 하기 표 2에 기재된 바와 같았다.

용도	이름	올리고뉴클레오타이드	비고
dhaR 증폭	LbReF (BamHⅠ)	5'-CGGGATCCTTAGGAGTCTTCGTATGCAA	정방향
	LbReR1 (SalⅠ)	5'-ACGCGTCGACGCCGGCTTATCCATTGTG	역방향
	LbReR2 (NotⅠ)	5'-ATAAGAATGCGGCCGCCCACCTAATCTAATGTCTTAA	역방향

한편, 이 콜라이(E. coli) K12로부터 클로닝된 알데히드 데히드로지나아제를 포함하는 pCDF1b-aldH (pCEa) 벡터(Raj SM, C Rathnasingh, JE Jo, SH Park. 2008. Production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol by a novel recombinant Escherichia coli BL21 strain. Process Biochemistry 43(12):1440~1446)를 구축한 후, 이것으로 상기 실시예 1에서 형질전환한 재조합 대장균을 추가적으로 형질전환시킴으로써 최종적으로 실시예 1의 재조합 대장균을 제조하였다 (참고도 8)

[참고도 8]

실시예 2: 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균의 회분식 배양

상기 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균을 이용하여 회분식 배양을 수행하였다.

배양은 500 mL 플라스크에서 100 mL 부피로 수행하였다. 배지는 LB 배지를 사용하였고, 도입 효소의 발현 유도(induction)는 균체의 농도가 0.183g/L가 되었을 때, 수행했다. 유도(induction) 후, 20μM의 보효소 B₁₂와 글리세롤을 배지 중에 보충하였다.

배양은 초기에 37℃에서 수행하다가 유도 후, 온도를 20℃(도 1)와 25℃(도 2)로 각각 달리하면서 배양을 수행하였다. 한편, B₁₂의 분해를 막기 위해 배양시에 불빛은 차단하였다.

배양 결과는 도 1 및 도 2와 같았는데, 도 1에서 보는 바와 같이 3-HPA의 생산은 확인이 되었으나, 3-HP의 생산은 확인되지 않았다. 한편, 20℃에서 배양한 경우가 25℃에서 배양하는 것에 비해 3-HPA의 생산량이 높았다.

실시예 3: 과량의 포도당 공급 환경 하에서 상기 실시예 1에서 제조한 재조 합 대장균의 회분식 배양

상기 실시예 2에서는 3-HP의 생산이 확인되지 않았는데, 그 이유로 3-HPA에서 3-HP로의 전환시 요구되는 NAD⁺의 불충분한 공급이 원인으로 예측되었다.

글리세롤로부터 생산된 3-HPA가 3-HP로 전환되기 위해서는 3-HPA를 3-HP로 전환시키는 효소가 필요하고, 보조인자로 NAD⁺가 요구됨을 알 수 있는데, 보조인자가 적절히 공급되지 않으면, 3-HPA만 쌓이게 되고 3-HP로 전환되지 않게 되기 때문이다.

이에 본 실시예에서는 배지 중에 포도당이 고갈되지 않도록 충분히 공급하여, NAD⁺가 포도당의 해당경로를 통해 생산되고, 이를 통해 생산된 NAD ⁺가 3-HP의 생산에 사용될 수 있도록 발효 전략을 수립하였다.

그 결과, 도 3(20℃) 및 도 4(25℃)에서 확인되는 바와 같이, 과량의 포도당이 배지 중에 충분히 공급되는 환경 하에서 3-HPA가 3-HP로 급격히 전환되는 것이 확인되었다. 다만, 25℃ 조건에서 3-HP가 훨씬 더 많이 생산됨을 확인할 수 있었다.

한편, 본 실시예에서는 상기 실시예 2에서의 방법과 동일한 방법으로 배양을 수행하되, 다만 배지는 포도당이 18 g/L 첨가된 리젠버그 배지(Riesenberg medium)를 사용하였다.

실시예 4: 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균의 유가식 배양

상기 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균을 이용하여 유가식 배양을 수행하였다.

배양은 2.5 L 자(jar) 발효기에서 1.0 L 부피로 수행하였다. 배지는 pH 6.8의 리젠버그 배지(Riesenberg medium)를 사용하였고, 도입 효소의 발현 유도(induction)는 균체의 농도가 35 g/L가 되었을 때, 수행하였다. 유도(induction) 후, 20 μM의 보효소를 배지 중에 보충하였다.

배양 중 공기는 1 vvm의 속도로 공급하였고, 교반은 12,000~13,000 rpm으로 수행하였으며, 배양온도는 25℃로 하였다.

배양은 pH-stat 방식의 유가식 배양을 수행하였고, pH는 28% 암모니아수를 사용하여 6.8로 조절하였다.

한편, 피딩용액(feeding solution)은 A 타입과 B 타입의 두 개를 제조하여 사용하였는데, A 타입의 피딩용액은 800 g/L의 포도당과 20 g/L의 MgSO₄·7H₂O 이 혼합된 용액이고, B 타입의 피딩용액은 400 g/L의 포도당, 400 g/L의 글리세롤 및 20 g/L의 MgSO₄·7H₂O 이 혼합된 용액이다.

한편, B₁₂의 분해를 막기 위해 배양시에 불빛은 차단하였다.

배양 결과는 도 5와 같았는데, 도 5에서 보는 바와 같이 약 15 g/L의 3-HP 생산이 확인되었고, 그 외에 약 5 g/L의 1,3-PD 생산이 확인되었다.

1,3-PD의 생산은 NAD⁺가 3-HP의 생산을 위해 사용된 후, NADH로 전환되어 1,3-PD의 생산에 보조인자로 사용되어 발생한 현상으로 판단되었다. 즉, NAD ⁺ 및 NADH의 커플링 반응에 의해, 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올으로 전환시키는 효소를 특별히 발현 또는 과발현시키지 않았음에도 불구하고, 1,3-PD가 생산될 수 있었던 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균을 이용하여 LB 배지에서 20℃로 배양한 것이다.

도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균을 이용하여 LB 배지에서 25℃로 배양한 것이다.

도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균을 이용하여 포도당이 18 g/L 첨가된 리젠버그 배지(Riesenberg medium)에서 20℃로 배양한 것이다.

도 4는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균을 이용하여 포도당이 18 g/L 첨가된 리젠버그 배지(Riesenberg medium)에서 25℃로 배양한 것이다.

도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 재조합 대장균을 이용하여 25℃에서 포도당을 지속적으로 공급하면서 유가식 배양을 한 것이다.

Claims

글리세롤을 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid) 및 1,3-프로판디올(1,3-propanediol)의 전구체가 되는 3-히드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)로 전환시키기 위하여, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래의 글리세롤 데히드라타제를 구성하는 서브 유닛 DHAB1, DHAB2 및 DHAB3 중 DHAB1 및 DHAB2를 각각 암호화하는 오픈리딩프레임의 개시코돈 TTG 및 GTG가 ATG로 각각 변이된 락토바실러스 브레비스 유래의 글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase; DHAB) 및, 락토바실러스 브레비스 유래의 글리세롤 데히드라타제 리액티바제(glycerol dehydratase reactivase)가 발현되게 형질전환되고;

3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소가 발현되도록 형질전환된;

재조합 대장균을 글리세롤 및 포도당을 배지에 지속적으로 공급하는 유가식 배양을 통해 배양하는 것을 특징으로 하는 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법
제1항에 있어서,

상기 유가식 배양은,

보효소 B₁₂이 배지에 첨가된 것을 특징으로 하는 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법
제1항에 있어서,

상기 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 효소는,

알데히드 데히드로지나아제(aldehyde dehydrogenase)인 것을 특징으로 하는 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법
제1항에 있어서,

상기 재조합 대장균은,

추가로 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올으로 전환시키는 효소가 발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법
제4항에 있어서,

3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올으로 전환시키는 효소는,

글리콜알데히드 리덕타제(glycolaldehyde reductase), L-1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(L-1,2-propanediol oxidoreductase), 에탄올 데히드로지나제(ethanol dehydrogenase) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산 및 1,3-프로판디올을 동시 생산하는 방법