KR102569806B1

KR102569806B1 - 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR102569806B1
Application number: KR1020180134671A
Authority: KR
Inventors: 이경묵; 허인영; 김재형; 성민경
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2018-11-05
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2023-08-22
Also published as: KR20200051375A

Abstract

아데노실트랜스퍼라제(adenosyltransferase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산 미생물 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산 방법에 관한 것이다. 상기 미생물은 배지 내 시아노코발라민의 사용량을 저감시키면서도 3-HP 생산량을 증대시킬 수 있다.

Description

아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 및 이의 이용{Microorganism transformed by a gene encoding adenosyltransferase and uses thereof}

3-히드록시프로피온산(3-HP)은 젖산(2-히드록시프로피온산)의 이성질체로서 고분자 코팅제의 가교제, 금속 윤활제, 섬유의 정전기 방지제 등으로 사용되고, 아크릴산, 1,3-프로판디올, 메틸아크릴레이트, 에틸 3-히드록시프로피온산, 말로닉산, 프로피온락톤, 아크로니트릴, 또는 아크릴아마이드 등 상업적으로 중요한 여러 화학물질로 전환될 수 있는 플랫폼 화합물이다.

3-HP는 에틸렌 사이아노하이드린, 베타-아이도프로피온산, 베타-브로모프로피온산, 베타-클로로프로피온산, 베타-프로피오락톤, 아크릴산 등을 중간체로 하여 화학적 공정을 통해 생산될 수 있고, 글리세롤로부터 생물학적 공정을 통해 생산될 수도 있다. 그러나 이러한 화학물질 대부분이 유독하며 발암성을 띠고, 높은 온도와 압력의 조건으로 대량의 에너지를 소모하며 다량으로 공해 물질을 배출하는 문제가 있다.

3-HP는 또한 미생물 발효를 통해 생산될 수 있다. 현재까지 대장균이나 크렙시엘라 뉴모니아 등을 이용한 3-HP 생산 공정이 연구되었으나, 생산성, 수율, 배지의 경제성 등의 측면에서 아직 상업적 수준에 이르지 못하고 있다. 따라서, 미생물로부터 3-HP 의 생산을 증가시키기 위한 기술의 개발이 요구된다.

한편, 코발라민계 조효소(코엔자임 B12 및 이의 유도체)는 라디칼 기반의 재배열(rearrangement) 반응에서 조효소로 사용되는 물질로, 생물 내에서 DNA 합성, 아미노산 및 지방산 대사에 필수적이다. 또한 디올 디하이드라타제(diol dehydratase) 또는 글리세롤 디하이드라타제(glycerol dehydratase) 와 같이 생물 공정에서 핵심적인 역할을 하는 효소의 조효소로 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다.

그러나 대부분의 생물은 코발라민계 조효소를 합성할 수 없기 때문에 외부 섭취를 통해 공급받아야만 한다. 현재까지 알려진 비타민 중 가장 복잡한 구조를 가지고 있는 코발라민계 조효소는 화학 합성법이 알려져 있으나 수십개의 반응을 거치므로 경제성이 떨어진다. 따라서 현재 코발라민계 조효소는 전량이 박테리아로부터 생산되고 있으나, 이 또한 생산량이 제한적이고 높은 시장가격을 가진 것으로 알려져 있다. 이에, 코발라민계 조효소를 합성하는 미생물 또는 이를 사용하지 않는 효소를 개발하는 등 관련 연구가 진행되고 있으나, 의미 있는 성과는 나타나지 않고 있다.

국내특허공개 제10-2014-0003258호 (2014.01.09)

이러한 배경 하에, 본 발명에서는 미생물에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 도입함으로써, 배지 내 시아노코발라민의 사용량을 저감시키면서도 3-HP 생산량을 증대시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

이에, 일 예로, 아데노실트랜스퍼라제(adenosyltransferase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산 미생물을 제공한다.

다른 예로, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환된, 아데노실코발라민을 생산하는 미생물을 제공한다.

다른 예로, 상기 미생물들을 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따라 아데노실트랜스퍼라제(adenosyltransferase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된, 3-히드록시프로피온산(3-HP)를 생산하는 미생물이 제공 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따라 아데노실트랜스퍼라제(adenosyltransferase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된, 아데노실코발라민을 생산하는 미생물이 제공 제공된다.

일 구체예로, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 btuR일 수 있다.

다른 구체예로, 상기 미생물은, 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase) 또는 디올 디하이드라타제(diol dehydratase) 를 코딩하는 유전자, 알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 또는 둘 다가 추가로 형질전환된 미생물일 수 있다.

다른 구체예로, 상기 미생물은, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환되지 않은 미생물에 비하여 시아노코발라민으로부터 아데노실코발라민으로의 전환이 증진된 미생물일 수 있다.

다른 구체예로, 상기 미생물은, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환되지 않은 미생물에 비하여 배지 내 시아노코발라민의 사용이 감소된 미생물일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산 방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

용어, "아데노실트랜스퍼라제(adenosyltransferase)"는 ATP의 아데노실기와 코브(I)알라민(Cob(Ⅰ)alamin)의 결합을 촉진함으로써 코브(I)알라민의 아데노실코발라민(adenosylcobalamin)으로의 전환을 매개하는 효소이다. 코브(I)알라민은 외부에서 유입된 시아노코발라민(cyanocobalamin)으로부터 생성되거나 활성을 잃은 아데노실코발라민으로부터 생성될 수 있다. 시아노코발라민은 아데노실코발라민(코엔자임 B12) 유도체 중 가장 안정적이므로 다른 유도체들에 비해 가격이 저렴하다. 하지만 직접적으로 생물 내에서 조효소로 사용될 수 없기 때문에, 생물활성을 갖기 위해서는 아데노실코발라민(코엔자임 B12)으로 전환되어야만 한다.

아데노실트랜스퍼라제는, 코브(I)알라민의 아데노실코발라민으로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함되고, 각종 원핵세포 또는 진핵세포 유래일 수 있으며, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 데니프리피칸스(Pseudomonas denitrificans), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis), 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum) 또는 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)등의 유래일 수 있고, 이를 코딩하는 유전자로는 btuR 또는 cobO 등을 예시할 수 있다. 본원의 일 실시예에서는 E. coli K12 MG1655 유래의 btuR 유전자를 사용하였고, 그 서열정보는 NCBI Gene ID : 945839 에서 확인할 수 있다. 그러나, 이는 본원의 대표적인 구현예에 해당할 뿐, 본원 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예로, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는, 상기 서열의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성이 있으며, 상기 서열의 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 효소 활성을 가지는 것일 수 있다.

서열의 "% 동일성"은 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열이 최대한 일치되도록을 정렬한 후 서열을 비교하였을 때 염기가 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하고, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누고, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

일 예로, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 도입된, 미생물, 균주 또는 세포가 제공된다. 상기 균주는 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 도입되지 않은 미생물에 비하여 더 높은 수준의 3-HP 을 생산하도록 하는 것일 수 있다.

구체예로, 상기 미생물은 3-HP 생성능을 가지고 있거나 3-HP 생산능을 가지도록 유전적으로 조작된 균주일 수 있다. 상기 3-HP 의 생산은 균주 내에서 생산되는 것, 세포 내에서 생산되어 세포 외부로 분비되는 것, 또는 그 조합을 포함한다. 3-HP의 생산은 합성 5'-UTR 이 도입되지 않은 미생물에 비하여 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 100% 이상, 200% 이상, 또는 300% 이상 증가된 것일 수 있다.

글리세롤과 같은 탄소 기질로부터 3-HP를 생합성하는 경로로는 여러 경로가 알려져 있지만, 대표적인 예시는 다음과 같다: 우선, 글리세롤 디하이드라타제에 의해 글리세롤이 탈수 반응을 통해 중간체인 3-히드록시프로피온알데히드 (3-Hydroxypropionaldehyde: 3-HPA)로 전환되며, 알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase: ALDH)에 의해 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)가 산화되어 3-HP가 된다. 이 중 글리세롤 디하이드라타제는 보조효소로 코엔자임 B12를, 알데히드 디하이드로게나제는 NAD⁺를 필요로 한다. 따라서, 대장균과 같이 코엔자임 B12를 생산하지 않는 균주를 숙주로 사용할 경우 코엔자임 B12를 배지에 첨가하거나, 이의 유도체, 예를 들어 시아노코발라민을 배지에 첨가하여 이를 코엔자임B12 로 전환시켜야 하는 문제가 있다.

본 발명에서는, 놀랍게도, 미생물에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 형질전환하여 이를 과발현함으로써, 상기 미생물이 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환되지 않은 미생물에 비하여 시아노코발라민으로부터 아데노실코발라민(코엔자임 B12)의 전환이 증진됨은 물론, 미생물의 배지 내 시아노코발라민을 최소한으로 사용하면서도 3-HP 생산량을 증대시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 미생물에 3-HP 생산을 더욱 증대시키기 위하여, 3-HP를 생합성하는 경로에 관여하는 효소의 유전자들을 추가로 도입할 수 있다. 예를 들어, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자 및/또는 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 추가로 도입할 수 있다.

용어, "글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase)" 또는 "디올 디하이드라타제(diol dehydratase)"는 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 글리세롤 디하이드라타제 또는 디올 디하이드라타제는 코엔자임 B12 의존성이거나 비의존성일 수 있다. 상기 효소는, 이에 제한되는 것은 아니나, 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 또는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 등 유래일 수 있다. 상기 효소는, 그 유래에 관계없이, 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함되며, 이를 코딩하는 유전자로는 dhaB 를 예시할 수 있다. 본원의 일 실시예에서는 크렙시엘라 뉴모니아 유래의, dhaB1,2 및 3 서브유닛으로 이루어진 dhaB 유전자를 사용하였고, 그 서열정보는 GenBank 등록번호 U30903.1 에서 확인할 수 있다. 그러나, 이는 본원의 대표적인 구현예에 해당할 뿐, 본원 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

용어, "알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase)"는 알데히드를 카르복실산으로 전환시키는 효소로서, 본원에서는 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환을 촉매화하는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 알데히드 디하이드로게나제는 그 유래에 관계없이, 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환을 촉매하는 효소 활성을 가지는 효소라면 본원의 범주에 포함되며, 이를 코딩하는 유전자로는 puuC 등을 예시할 수 있다. 본원의 일 실시예에서는 E. coli K12 MG1655 유래의 puuC 유전자를 사용하였고, 그 서열정보는 GenBank 등록번호 U00096.3 에서 확인할 수 있다. 그러나, 이는 본원의 대표적인 구현예에 해당할 뿐, 본원 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본원에서는 미생물에 3-HP 생산을 더욱 증대시키기 위하여, 글리세롤 디하이드라타제를 재활성화시키기 위한 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수도 있다.

용어, "글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase)"는 글리세롤 디하이드라타제 가 작용하는 동안 비가역적으로 불활성화되는 것을 다시 활성화하여 촉매 활성을 유지시키는 작용을 하는 효소이다. 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제로는 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 클랩시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.) 균주 등에서 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제는 DhaFG, GdrAB, DdrAB 등일 수 있으며, 이를 암호화하는 유전자는 dhaFG, gdrAB, ddrAB 등을 예시할 수 있다.

균주에의 도입은 목적 유전자를 숙주 세포로 도입하여 상기 핵산이 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 숙주 생물체 안으로 도입될 수 있다. 다른 예로, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 통합 벡터가 균주에 도입됨으로써 균주의 게놈 안으로 삽입될 수 있다. 삽입의 조직-특이성은, 예를 들어 벡터 투여 경로에 의하여 조절될 수 있다. 다른 예로, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 비-통합 벡터가 숙주 생물체에 도입됨으로써 숙주 생물체에 도입될 수 있다.

본원에서, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자, 및/또는 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 벡터 내에 클로닝되어 세포에 도입될 수 있다. 여기에서, 벡터는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다.

벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터는, 해당 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열로는, 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.　개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에, 인핸서, 목적하는 유전자의 3' 말단의 비번역영역, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

벡터 내의 각 구성요소는 서로 작동 가능하게 연결되어야 하며, 이들 구성요소 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.

유용한 발현 조절 서열의 예로는, 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합을 포함할 수 있다.

숙주 미생물은 원핵 균주일 수 있고, 예를 들어, 대장균(예를 들어, E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli B 및 E.coli XL1-Blue)을 포함하는 에스케리키아 속일 수 있다. 그러나 이에 제한 되는 것은 아니며, 슈도모나스 속, 바실러스 속, 스트렙토마이세스 속, 어위니아 속, 세라티아 속, 프로비덴시아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속, 살모넬라 속, 브레비박테리아 속, 하이포모나스 속, 크로모박테리움 속, 노카디아 속 등 다양한 균주에 적용할 수 있다. 적당한 균주에 도입되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자, 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자, 및/또는 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 균주로 도입하는 것은, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법(microinjection), 인산칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.

균주의 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 인원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 구체적인 배지의 종류는 LB(Luria Bertani) broth, SD(Sabouraud Dextrose) broth 또는 YM(Yeast medium) broth 와 같은 배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배지 내 탄소원으로는 글리세롤을 포함할 수 있다. 그 외에, 단당류, 올리고당류, 다당류, 단일탄소기질, 또는 그의 혼합물을 예시할 수 있다. 예를 들어 글루코즈와 프럭토즈와 같은 단당류; 수크로즈, 말토즈 또는 락토즈와 같은 올리고당류; 녹말 또는 셀룰로오스와 같은 다당류; 메탄올, 포름알데히드 또는 포르메이트와 같은 단일탄소기질을 예시할 수 있다. 또한, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지 내 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.

배지 내 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함하거나, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양 과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 필요에 따라, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

배양(발효)는 재조합 미생물의 따라 배치, 유가식, 또는 연속식 방식을 선택할 수 있다. 발효 조건은 호기, 마이크로 호기, 혐기 조건에서 배양할 수 있으며 바람직하게는 마이크로 혐기 조건에서 배치 방식으로 수행할 수 있다. 배양 온도 및 배양 시간은 사용하는 숙주세포의 특성을 고려하여 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있으며, 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 일 수 있다. 배양은 원하는 3-HP 의 생산량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다.

발효 배지로부터 3-HP 을 회수하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 3-HP는 원심분리, 크로마토그래피, 추출, 여과, 침전, 또는 이들의 조합을 수행함으로써 세포 배지로부터 얻을 수 있다.

미생물에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 도입함으로써, 배지 내 시아노코발라민의 사용량을 저감시키면서도 3-HP 생산량을 증대시킬 수 있다.

도 1은 본원의 일 실시예에 따른 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 미생물과 대조군 미생물에서 각각 3-HP 생산량을 비교한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. BtuR 유전자가 도입된 미생물을 이용한 3-HP의 생산

글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하는 플라스미드 pCDF 에 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 BtuR 유전자를 클로닝하였다. 사용한 플라스미드는 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 로, pCDFDuetJ23 벡터는 pCDFDuet-1 벡터의 프로모터 부분을 J23101과 J23100 프로모터로 치환한 벡터이다. 여기서 사용한 dhaB (약 2.7 kb; dhaB1, dhaB2, dhaB3)와 gdrAB 유전자 (약 2.2 kb; gdrA, gdrB)는 크렙시엘라 뉴모니아의 염색체에서 아래의 프라이머 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용해 NEB에서 제공하는 조건을 사용하여 증폭하였다:

- dhaB-gdrA-F 프라이머: GAATTCATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTCCT (서열번호 1)

- dhaB-gdrA-R 프라이머: AAGCTTGATCTCCCACTGACCAAAGCTGG (서열번호 2)

- gdrB-F 프라이머: AAGCTTAGAGGGGGCCGTCATGTCGCTTTCACCGCCAG (서열번호 3)

- gdrB-R 프라이머: CTTAAGTCAGTTTCTCTCACTTAACGGC (서열번호 4)

크렙시엘라 뉴모니아의 염색체 상에 dhaB123와 gdrA 유전자가 나란히 위치해 있어 같이 증폭하였고, gdrB는 dhaB123, gdrA와 반대 방향으로 위치해 있기 때문에 gdrB만 따로 증폭하였으며, 이 때 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다. 그 후 dhaB123, gdrA 유전자는 제한 효소 EcoRI과 HindIII을, gdrB 유전자는 제한 효소 HindIII과 AflII을 이용하여 J23101 프로모터 아래에 클로닝하였다. aldH는 J23100 프로모터 아래에 클로닝하였으며, 아래의 프로모터를 이용하여 E. coli K12 MG1655 chromosome으로부터 증폭하였고, 이 때 아래의 프라이머 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다.

- aldH-F 프라이머: ggtaccatgaattttc atcatctggc (서열번호 5)

- aldH-R 프라이머: catatgtcaggcctccaggcttat (서열번호 6)

aldH는 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ을 이용하여 J23108 프로모터 아래에 클로닝하였다. btuR은 aldH 아래에 클로닝하였으며, E. coli K12 MG1655 Chromosome으로부터 아래의 프로모터를 이용하여 증폭하였고, 이 때 아래의 프라이머 및 NEB Q5 DNA 폴리머라제를 이용하였으며, 조건은 NEB에서 제공하는 조건을 사용하였다.

- btuR-F 프라이머: tggaggcctgacataatgagtgatgaacgctaccaacag (서열번호 7)

- btuR-R 프라이머: ttgagatctgccatattaataatcgatccctatctgcgc (서열번호 8)

btuR의 클로닝은 Takara사의 In-Fusion Kit을 이용하여 aldH 아래에 수행하였다. 이상의 클로닝을 통해 pCDF_J23101_dhaB_gdrAB_J23100_aldH_btuR 플라스미드를 제작하였으며 최종 벡터의 개열지도는 도 1에 나타내었다.

대조군으로는, 상기와 동일한 방법으로 글리세롤 디하이드라타제를 코딩하는 유전자(dhaB), 알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(aldH) 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제를 코딩하는 유전자(gdrAB)를 포함하되, BtuR 유전자가 클로닝되지 않은 플라스미드 pCDF 가 도입된 미생물을 사용하였다. 상기 플라스미드를 E. coli W3110 (KCCM 40219)에 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용한 전기천공법으로 도입하여, 본원의 일 실시예에 따른 3-HP 생산 균주와 대조군 균주를 각각 제작하였다. 상기 균주들을 25mg/L 스트렙토마이신이 포함된 5 mL의 LB 배지(효모 추출물 5 g/L, 트립톤 10g/L, 및 NaCl 10g/L 함유)에 해당 균주의 Single colony를 접종한 뒤 37℃ 및 250 rpm 조건으로 진탕배양기에서 밤새 배양하였다.

250 mL 삼각 플라스크에 20 g/L의 글리세롤(대정화금)과 0.02 μM의 시아노코발아민(대정화금) 및 25mg/L 스트렙토마이신이 포함된 100 mL의 변형된 M9 배지(MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6 g/L, NaCl 1.5 g/L, Na₂HPO₄ㆍ7H₂O 12.8 g/L, K₂HPO₄ 17.4 g/L, NH₄Cl 2 g/L, 효모 추출물 0.5 g/L, KH₂PO₄ 3 g/L 및 CaCl₂ 0.11 g/L 함유)를 제조하였다. 2번의 Seed culture 1 mL을 플라스크에 접종하고, 33℃, 250 rpm 진탕배양기에서 배양하였다

HPLC를 이용하여 다음과 같은 분석 조건에서 Glycerol 및 3-HP 농도를 확인하였다:

HPLC Model	Agilent Technologies 1200 Series
Column	Bio-Rad Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column300 mmⅹ7.8 mm
Detector	Refractive Index (RI) / Ultraviolet (UV) Detector
Mobile Phase	0.5 mM H₂SO₄
Flow rate	0.4 mL/min
Run time	35 min
Column temperature	35℃
Detector temperature	35℃
Injection volume	10 μL

그 결과, 실험균 균주가 생산한 최종 3-HP 농도는 5.5 g/L (±0.12)로 나타났음에 반하여, 대조군 균주가 생산한 최종 3-HP 농도는 3.7 g/L (±0.04)로 나타났다 (도 2). 이는 대조군 대비 3-HP 농도가 52% 더 높은 것이며, 3-HP 생산에 요구되는 코발라민계 조효소의 농도의 저감을 의미한다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> LG CHEM, LTD. <120> Microorganism transformed by a gene encoding adenosyltransferase and uses thereof <130> DPP20182531KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaB-gdrA-F primer <400> 1 gaattcatga aaagatcaaa acgatttgca gtcct 35 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dhaB-gdrA-R primer <400> 2 aagcttgatc tcccactgac caaagctgg 29 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB-F primer <400> 3 aagcttagag ggggccgtca tgtcgctttc accgccag 38 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB-R primer <400> 4 cttaagtcag tttctctcac ttaacggc 28 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aldH-F primer <400> 5 ggtaccatga attttcatca tctggc 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aldH-R primer <400> 6 catatgtcag gcctccaggc ttat 24 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> btuR-F primer <400> 7 tggaggcctg acataatgag tgatgaacgc taccaacag 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> btuR-R primer <400> 8 ttgagatctg ccatattaat aatcgatccc tatctgcgc 39

Claims

아데노실트랜스퍼라제(adenosyltransferase)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 디하이드라타제 (glycerol dehydratase) 또는 디올 디하이드라타제(diol dehydratase)를 코딩하는 유전자, 알데히드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 및 글리세롤 디하이드라타제 리액티바제 (glycerol dehydratase reactivase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된, 3-히드록시프로피온산(3-HP)을 생산하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물이, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환되지 않은 미생물에 비하여 시아노코발라민으로부터 아데노실코발라민으로의 전환이 증진된 것을 특징으로 하는, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물이, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환되지 않은 미생물에 비하여 배지 내 시아노코발라민의 사용이 감소된 것을 특징으로 하는, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물이, 아데노실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환되지 않은 미생물에 비하여 글리세롤에서 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로의 전환 속도가 증가된 것을 특징으로 하는, 미생물.
제1항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는,
3-히드록시프로피온산(3-HP)의 생산 방법.
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