KR101764933B1 - 발효에 의해 많은 양의 글리콜산을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새로운 유전자 변형, 예컨대 ΔldhA, ΔmgsA, ΔarcA, 및 ΔlldP, ΔglcA, ΔyjcG 및 이들의 조합을 보유하는 재조합 미생물에 의해 발효성 탄소 공급원을 글리콜산으로 생물전환시키기 위한 개선된 방법에 관한 것이며, 이는 더 높은 수율, 역가 및 생산성으로 생산할 수 있게 한다.
Description
본 발명은 새로운 유전자 변형, 예컨대 ΔldhA, ΔmgsA, ΔarcA, 및 ΔlldP, ΔglcA, ΔyjcG 및 이들의 조합을 보유하는 재조합 미생물에 의해 발효성 탄소 공급원을 글리콜산으로 생물전환시키기 위한 개선된 방법에 관한 것이며, 이는 더 높은 수율, 역가 및 생산성으로 생산할 수 있게 한다.
글리콜산 (HOCH2COOH)은 카르복실산의 알파-히드록시산 군의 가장 간단한 구성원이다. 글리콜산은 매우 작은 분자 상에 알콜 및 다소 강한 산 관능기 양자 모두를 갖는 이중 관능성을 갖는다. 이는 독특한 화학적 속성 및 또한 전형적인 산 및 알콜 화학을 초래한다.
글리콜산은 히드록실 및 카르복실산 기 양자 모두를 사용하여 다가 금속과 5원 고리 착물 (킬레이트)을 형성한다. 이 금속 이온 착화 능력은 경수 물때의 용해 및 침착 방지, 특히 양호한 헹굼성이 핵심 인자인 산 세정 적용에 유용하다. 그의 특성은 글리콜산을 광범위한 소비자 및 산업적 용도, 예를 들어 우물 복원, 피혁 산업, 오일 가스 산업, 세탁업 및 섬유 산업에서의 용도를 위해, 및 개인 위생 제품 중 성분으로서 이상적으로 만든다. 글리콜산은 유기 알콜 및 산과의 반응을 거쳐 에스테르를 형성한다. 저분자량 알킬 글리콜산 에스테르는 독특한 용해력 특성을 갖고, n-프로판올 및 이소-프로판올, 에틸렌디아민, 페놀, m-크레졸, 2-에톡시에틸 아세테이트, 및 에틸 및 메틸 락테이트에 대한 대체물로서 사용될 수 있다. 고분자량 알킬 에스테르는 개인 위생 제품 제형에서 사용될 수 있다.
글리콜산은 또한 다양한 중합체성 물질, 예를 들어 폴리글리콜산을 포함하는 열가소성 수지를 제조하는데 사용될 수 있다. 폴리글리콜산을 포함하는 수지는 우수한 기체 장벽 특성을 갖고, 폴리글리콜산을 포함하는 이러한 열가소성 수지는 동일한 특성을 갖는 포장 재료 (예를 들어, 음료 용기 등)를 제조하는데 사용될 수 있다. 폴리에스테르 중합체는 수성 환경에서 제어가능한 속도로 서서히 가수분해된다. 이 특성은 폴리에스테르 중합체를 생물의학적 적용, 예컨대 용해성 봉합사 및 pH를 감소시키기 위해 산의 제어된 방출이 필요한 적용에 유용하게 만든다. 현재 미국에서 15,000 톤 초과의 글리콜산이 매년 소비된다.
도 1에 표시된 저렴한 탄소 기질, 예컨대 글루코스 또는 기타 당으로부터 글리콜산의 생물학적 생산은 각각 제WO 2007/140816호 및 제WO 2007/141316호에 개시되어 있으며, 이들은 그 내용이 본원에 참고로 도입된다. 이들 출원에 기재된 미생물은 상이한 수준에서 유전자 조작된다:
- 글리옥실레이트 경로에서 흐름의 향상,
- 글리옥실레이트의 글리콜레이트로의 전환의 증가, 및
- 글리콜레이트 및 그의 중간체, 글리옥실레이트의 대사의 감소.
변형은 글리콜레이트 합성 경로의 최종적 반응 또는 글리콜레이트의 가장 가까운 중간체에 대해 직접적 영향을 미친다. 이들 모두는 글리콜산 생산에서 탄소 흐름을 지정하고 그의 이화작용을 방지하는 동일한 목적을 갖는다.
글리콜산의 생물학적 생산은 유전자 ycdW에 의해 코딩되는 NADPH 의존성 산화환원효소에 의해 글리콜레이트로 환원되는 중간체로서 글리옥실레이트의 형성을 필요로 한다 (문헌 [Nunez et al., (2001) Biochemistry, 354, 707-715]). 글리옥실레이트는 TCA 회로의 션트(shunt)인 글리옥실레이트 회로의 중간체이다 (트리카르복실산 회로 및 글리옥실레이트 측로, 문헌 [Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology]에서 검토됨). TCA 회로로 진입하기 전에, 탄소 흐름은 여러 반응이 일어나는 해당작용을 통해 통과하고, 목적 화합물의 생산을 개선시키도록 최적화될 수 있다.
해당작용은 글루코스를 피루베이트로 전환시키는, 10종의 중간체 화합물을 수반하는 10개의 일련의 반응이다. 중간체는 해당작용으로의 진입점을 제공하고, 또한 직접적으로 또는 간접적으로 유용할 수 있다. 예를 들어, 중간체 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)는 단백질 MgsA를 통한 락테이트의 공급원이다. 락테이트 데히드로게나제, LdhA에 의해 락테이트로 전환되는 피루베이트 분자에 대해서 동일하다. 두 효소 모두는 탄소 흐름의 일부를 의미하는 해당 경로의 분자를 소비하여, 상기 경우에 바람직하지 않은 부산물인 락테이트를 생산한다. 유전자 ldhA는 숙시네이트의 생산 방법에서, 예컨대 혹위 박테리아 균주에서 (제WO2008/0134051A1호) 또는 높은 수율로 숙시네이트 생산을 위해 이. 콜라이(E. coli)에서 감쇠된다. 대조적으로, ldhA는 락테이트 합성을 목표로 하는 방법에서 과다발현된다 (제US2007/116852A1호). 동등한 것이 mgsA에서 발견되며, 이는 1,3-프로판디올의 생산을 위한 기타 유전자 변형 중에서 결실되나 (제WO2004/033646A2호), 1,2-프로판디올의 합성을 위해 과다발현된다 (제WO2008/116852A1호). 두 활성 모두의 감쇠에 의해 글리콜산 생산은 틀림없이 개선될 것이며, 동시에 락테이트 합성은 틀림없이 감소될 것이다.
동일한 방식으로, 해당작용 및 TCA 흐름, 글루코스 내수송(import) 또는 해당작용 및 TCA 효소의 효소적 활성을 야기하는 모든 유전자 변형은 글리콜레이트 생산을 개선시킬 것이다. ArcA 활성의 감쇠는 이러한 돌연변이 중 하나이다. 사실은, 상기 단백질은 상기 언급된 효소를 코딩하는 유전자의 억압에 관여되는 것으로 나타났다.
Arc 시스템에 의한 통괄 조절의 이해는 arcA 유전자의 확인 및 이. 콜라이에서 호기성 대사에 대한 그의 돌연변이의 효과를 기술한 이우치(Iuchi) 및 린(Lin)의 논문 (1988) (문헌 [Iuchi and Lin, 1988, PNAS; 85: 1888-1892])으로 시작되었다. 2-성분 신호 도입 시스템 ArcAB (호기성 호흡 제어)는 에너지 대사, 수송, 생존, 이화작용 및 세포의 산화환원 상태에 관여되는 100 내지 150개의 오페론의 발현을 전사 수준에서 조정한다 (문헌 [Liu and DeWulf 2004, J Biol Chem, 279:12588-12597]; [Lynch and Lin, 1996 Responses to molecular oxygen; in Neidhardt FC, Curtiss III RJ, Ingraham L, Lin ECC, Low KB, Magasanik BW, Zeznikoff S, Riley M, Schaechter M, Umbarger HE (eds) Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, ed 2. Washington, American Society for Microbiology, 1996, vol 1, pp 1526-1538]). ArcAB 신호 도입 쌍의 주요 기능은 이. 콜라이에서 호기성 경로로부터 혐기성 경로로의 전이를 조절하는 것이다. 호기생활 수준과 통괄 조절에 의해 발휘된 제어 간의 상관관계에 대한 추가 이해는 샤렐-레바논(Shalel-Levanon) 및 동료들의 연구로부터 얻었다 (문헌 [Biotechnol. Bioeng. 2005a; 89:556-564] 및 [Biotechnol. Bioeng. 2005b; 92:147-159]). 이들 연구는 ArcA에 의한 TCA 유전자의 억압을 나타내었다. 이들 결과는 산소 이용가능성의 상이한 조건에서 이. 콜라이에서 글루코스 이화작용에 대한 ArcA의 효과에 대한 충분한 생리학적 연구에 의해 확인되었다. ΔarcA 돌연변이체에서 및 미세 호기생활 하에 여러 변화; 예컨대 호흡 증가, 시토크롬 o- 및 d-말단 옥시다제에 걸친 전자 흐름 분포의 변경, 및 세포내 산화환원 상태의 변형이 관찰되었다 (문헌 [Aleexeva et al., 2003, J. Bacteriol. 185:204-209]). 2005년 페레누(Perrenoud) 및 사우어(Sauer)의 연구는 ArcAB 조절에 대한 새로운 통찰을 제공하였으며, 이는 호기성 및 완전 혐기성 TCA 회로 흐름의 제어가 그의 인지 센서 키나제인 ArcB와는 관계없이 ArcA에 의해 발휘되었다는 것을 나타낸다 (문헌 [J. Bacteriol. 2005, 187:3171-3179]).
상기 모두는 이. 콜라이에서 ArcA를 통괄 조절인자로 만든다. 그의 결실은 목적 분자의 호기생활 또는 혐기생활 생산을 청구하는 여러 특허에 기재되어 있다. 예를 들어, ΔarcA는 혐기생활에서와 같이 호기생활에서 숙시네이트 및 1,2-프로판디올의 생산을 개선시킨다 (제US 2006/0073577A1호; 제WO2006/020663호 및 제WO2008/116848호). 다른 유전자 변형 중에서 ArcA 활성의 감소는 또한 아지노모토(Ajinomoto)에 의한 L-아미노산, 예컨대 L-리신 및 L-글루탐산의 생산에 대한 특허 (제EP 1 382686A1호) 및 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니(DuPont de Nemours and Co.)에 의한 1,3-프로판디올의 생산에 대한 특허 (제WO2004/033646호)에 개시되어 있다.
3종의 단백질, 즉 GlcA, LldP 및 YjcG는 글리콜레이트 및 락테이트의 내수송인자(importer)로서 문헌에 특징화되어 있다 (문헌 [Nunez, F. et al., 2001 Microbiology, 147, 1069-1077]; [Nunez, F. et al., 2002 Biochem. And Biophysical research communications 290, 824-829]; [Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455]). 상기 언급된 공개에 따라, GlcA는 글리콜레이트에 대해 더 특이적인 것으로 보이고, Lldp는 락테이트 분자에 대해 더 친화성을 갖는다. 3종의 글리콜레이트 퍼미아제가 결실된 균주는 외인성 글리콜레이트를 전혀 내수송할 수 없다 (문헌 [Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455]). 글리콜레이트를 생산하는 균주의 글리콜레이트 내수송의 감쇠는 세포가 고농도의 글리콜레이트에 대해 저항할 수 있는 능력을 개선시키며 그러므로 생산 역가를 개선시킬 것이다.
본 발명이 해결하려는 과제는 저렴한 탄소 기질, 예컨대 글루코스 또는 기타 당으로부터 글리콜산의 생물학적 생산의 개선이다. 발효에 의한 글리콜산의 훨씬 더 좋은 수율 및 생산 역가를 획득하기 위한 추가 유전자 변형 및 특히 이들의 조합이 본원에 기재되어 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 높은 수율 및 역가로 발효성 탄소 공급원을 직접적으로 글리콜산으로 생물전환시키기 위한 개선된 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 글리콜산 생산을 위해 이전에 변형된 재조합 미생물은 여러 변형, 예컨대;
- 락테이트 데히드로게나제 (ldhA) 및/또는 메틸글리옥살 신타제 (mgsA)를 코딩하는 유전자의 감쇠,
- 호기성 호흡 제어 조절인자 (arcA)의 감쇠,
- 글리콜레이트 내수송인자 단백질을 코딩하는 유전자 glcA, lldP 및 yjcG 중 적어도 하나의 감쇠
를 추가로 포함한다.
본 발명에 따라, 방법에서 사용된 미생물은 글리콜산 생산을 위해 이전에 유전자 조작되었다. 여러 변형, 및 특히 하기 대사적 변화를 허용하는 변형이 상기 미생물에 이전에 도입되었다:
i) 미생물은 말레이트 신타제 (aceB 및 glcB), 글리옥실레이트 카르보리가제 (gcl) 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라제 (eda)를 코딩하는 유전자를 비활성화시킴으로써 글리옥실레이트를 글리콜레이트가 아닌 화합물로 대사시킬 수 없고,
ii) 미생물은 유전자 glcDEFG 및 aldA를 감쇠시킴으로써 글리콜레이트를 대사시킬 수 없고,
iii) 글리옥실레이트 경로 흐름은 icd, aceK, pta, ackA, poxB, iclR 또는 fadR의 감쇠 및/또는 aceA의 과다발현에 의해 증가되고,
iv) 글리옥실레이트의 글리콜레이트로의 전환은 ycdW와 같은 내인성 코딩 유전자를 사용함으로써 증가되고,
v) NADPH의 이용가능성은 유전자 pgi, udhA 및 edd의 감쇠에 의해 증가된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한
(a) 단당류, 올리고사카라이드, 다당류 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소 공급원과 본 발명의 재조합 미생물을 접촉시켜, 이에 의해 글리콜레이트를 생산하고; 임의로
(b) 적어도 글리콜산 이량체로 중합하는 단계를 통해 생산된 글리콜산을 회수하고,
(c) 글리콜산 이량체, 올리고머 및/또는 중합체로부터 해중합에 의해 글리콜산을 회수하는 것
을 포함하는, 재조합 미생물로부터 글리콜산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 도입되고 그의 부분을 구성하는 첨부된 도면은 본 발명을 예시하고, 기재와 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 탄수화물로부터 글리콜산 생산 시스템의 개발에서 해당작용, TCA 회로 및 글리옥실레이트 경로의 유전자 조작을 나타낸다.
도 2는 벡터 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01, 즉 pAG25의 구축을 나타내는 다이어그램이다.
도 3은 락테이트 및 아세테이트 경로의 확대도이다. 이들 경로에 관여되는 유전자들 중 일부가 본 발명에서 변형된다.
<발명의 상세한 설명>
본원에 별도의 정의가 없는 경우, 본원에서 사용된 모든 전문 용어 및 과학 용어는 본 발명과 관계가 있는 분야의 통상의 지식을 가진자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서, 용어 "미생물" 및 "박테리아"는 상호교환적으로 사용되고, 그람 음성 박테리아를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과에 속한다. 엔테로박테리아세아에 과는 특히 에스케리치아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 살모넬라(Salmonella) 및 판토에아(Pantoea) 속을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "돌연변이체 균주"는 비-야생형 균주를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "재조합" 또는 "유전자 변형된" 또는 "변형된 미생물"은 게놈의 변형, 예를 들어, 유기체에서 천연적으로 발생하지 않는 핵산의 첨가에 의한 변형 및 숙주 세포에서 천연적으로 발생하는 핵산의 변형에 의한 변형을 갖는 숙주 세포를 지칭한다. 용어 "형질전환" 또는 "형질감염"은 외인성 핵산의 혼입 후 세포 내 새로운 유전자의 획득을 지칭한다. 용어 "형질전환체"는 형질전환의 생성물을 지칭한다.
용어 "변형" 또는 숙주 세포에 의해 생산된 단백질 또는 효소 활성의 수준을 "변형시키다"는 수준이 필요에 따라 증가되거나 감소되도록 배양 동안 생산된 단백질 또는 효소적 활성의 수준을 제어하는 것을 지칭한다. 용어 "변형된"은 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 언급시, 핵산이 야생형 핵산과 비교하여 일부 방법으로, 예컨대 핵산의 일부 또는 전체의 돌연변이; 치환, 삽입, 결실에 의해; 또는 전사 제어 영역에 작동가능하게 연결됨으로써 변경되었음을 의미한다. 돌연변이의 예로는 점 돌연변이, 틀 이동 돌연변이, 및 언급된 유전자의 일부 또는 전체의 결실이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
유전자는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 발현에 작동가능하게 연결된 조절성 RNA의 프로모터 영역, 운반 RNA의 프로모터 영역, 리보솜 RNA의 프로모터 영역에 대한 코딩에 관여되는 DNA의 세그먼트, 예를 들어 코딩 영역, 코딩 영역 이전의 비-코딩 영역 ("리더(leader)") 및 코딩 영역 이후의 비-코딩 영역 ("테일러(tailer)"), 뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 ("엑손") 사이의 개입 비-코딩 서열 ("인트론")을 의미한다. 코딩은 아미노산의 표시, 3개의 염기 "트리플렛" 코드에서 개시 및 종결 신호를 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 요소들이 기능적으로 연관되도록 배열된 근접위치를 지칭한다. 프로모터는 서열의 전사를 제어하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 리보솜 결합 부위는 mRNA의 번역을 허용하도록 위치된 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
용어 "비활성화" 또는 "감쇠"는 유전자 발현의 감소 또는 유전자의 생성물인 단백질의 활성의 감소를 지칭한다. 당업자는 이러한 결과를 얻기 위한 수많은 수단, 및 예를 들어 하기 기재를 알고 있다:
- 돌연변이의 유전자로의 도입, 이는 상기 유전자의 발현 수준 또는 코딩된 단백질의 활성 수준을 감소시킴.
- 낮은 강도 프로모터에 의한 유전자의 천연 프로모터의 대체, 이는 더 낮은 발현을 초래함.
- 상응하는 전령 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소의 사용
- 발현이 필요하지 않는 경우 유전자의 결실.
용어 "발현"은 유전자로부터 유전자의 생성물인 단백질로의 전사 및 번역을 지칭한다.
용어 "과다발현" 또는 "과다발현된"은 본원에서 적절한 대조 종과 비교하여 150% 이상의 단백질 활성인 것으로 정의된다. 과다발현은 더 활성인 형태 또는 억제에 대해 저항성인 형태의 생성을 위한 단백질의 돌연변위화에 의해, 억제인자의 제거에 의해, 또는 활성인자의 첨가 등에 의해 달성될 수 있다. 과다발현은 또한 억제자의 제거, 유전자의 여러 카피의 세포로의 첨가, 또는 내인성 유전자의 상향 조절 등에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 보유하고 통상적으로 고리형 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 염색체외 요소를 지칭한다.
용어 "탄소 기질", "탄소 공급원" 또는 "발효성 탄소 공급원"은 미생물에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미하며, 여기서 기질은 1개 이상의 탄소 원자를 함유한다.
용어 "ATCC"는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; 미국 20852 메릴랜드주 로크빌 파크론 드라이브 12301)을 의미할 것이다.
용어 "글리옥실레이트" 및 "글리옥실산"은 상호교환적으로 사용된다.
용어 "글리콜레이트" 및 "글리콜산"은 상호교환적으로 사용된다. 용어 "글리콜산, 그의 유도체 또는 전구체"는 글리콜산의 형성 및 분해의 대사 경로에서 모든 중간체 화합물을 표시한다. 글리콜산의 전구체는 특히 시트레이트, 이소시트레이트, 글리옥실레이트, 및 일반적으로 글리옥실레이트 회로의 모든 화합물이다 (도 1 참조). 글리콜산의 유도체는 특히 글리콜레이트 에스테르, 예컨대 에틸 글리콜레이트 에스테르, 메틸 글리콜레이트 에스테르 및 글리콜레이트를 함유하는 중합체, 예컨대 폴리글리콜산이다.
본 발명의 기재에서, 효소는 그의 특이적 활성에 의해 확인된다. 그러므로 이러한 정의는 또한 다른 유기체, 보다 구체적으로 다른 미생물에 존재하는 정의된 특이적 활성을 갖는 모든 폴리펩티드를 포함한다. 종종 유사한 활성을 갖는 효소는 PFAM 또는 COG라고 정의된 특정 과로의 그룹화에 의해 정의될 수 있다.
PFAM (정렬 및 은둔 마르코브(Markov) 모델의 단백질 과 데이터베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬의 큰 수집을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 관찰하고, 유기체 중 분포를 평가하고, 다른 데이터베이스에 접근하고, 공지된 단백질 구조를 가시화하는 것을 가능하게 한다.
COG (오르토로거스(orthologous) 단백질 군의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 30개의 주요 계통발생 계를 나타내는 43개의 충분히 서열분석된 게놈으로부터 단백질 서열을 비교함으로써 얻어진다. 각각의 COG는 3개 이상의 계로부터 정의되며, 이는 전자 보존 도메인의 확인을 허용한다.
상동성 서열의 확인 수단 및 그의 상동성 백분율은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 특히 BLAST 프로그램을 포함하며, 이는 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 상기 웹사이트 상에 지정된 디폴트 파라미터로 사용될 수 있다. 그 후, 얻은 서열은 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)을 사용하여 상기 웹사이트 상에 지정된 디폴트 파라미터로 활용 (예를 들어, 정렬)될 수 있다.
공지된 유전자에 대한 진뱅크(GenBank) 상에 주어진 기준을 사용하여, 당업자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 등가의 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 통상적인 작업은 유리하게는 다른 미생물로부터 유도된 유전자에 의한 서열 정렬을 수행하고, 또 다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝하기 위한 축퇴성 프로브를 설계함으로써 결정될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 수행된다. 이들 통상적인 분자 생물학 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)]에 기재되어 있다.
이. 콜라이와 관련하여 본 출원에서 확인된 유전자는 모든 그람 음성 박테리아에서 발견될 수 있다.
본 발명은 글리콜산 생산을 위해 이전에 변형되고 하기 변형:
- 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠
- 유전자 arcA의 감쇠
- 글리콜레이트의 막 내수송을 감쇠시키기 위한 유전자 glcA, lldP 및 yjcG 중 적어도 하나의 감쇠
및 이들의 조합
중 적어도 하나를 포함하도록 추가로 유전자 조작된 단일 재조합 그람 음성 박테리아를 사용하여 발효성 탄소 공급원을 직접적으로 글리콜산으로 생물전환시키기 위한 개선된 방법을 제공한다.
이들 변형의 모든 조합이 가능하고, 특히:
- 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠 및 유전자 arcA의 감쇠;
- 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠 및 글리콜레이트의 막 내수송의 감쇠;
- 유전자 arcA의 감쇠 및 글리콜레이트의 막 내수송의 감쇠;
- 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠 및 유전자 arcA의 감쇠 및 글리콜레이트의 막 내수송의 감쇠
가 가능하다.
유전자는 다음과 같이 단축된다: 락테이트 데히드로게나제 (ldhA), 메틸글리옥살 리덕타제 (mgsA), 호기성 호흡 제어 조절인자 A (arcA), L-락테이트 퍼미아제 (lldP), 글리콜레이트 퍼미아제 (glcA) 및 아세테이트 내수송인자 (yjcG).
이들 추가 변형의 주요 장점은 조작된 미생물에 의한 글리콜산 생산의 개선이다. 사실은, 모든 이들 변형은 2% 내지 36%의 생산 수율의 개선 (0.38 g/g과 비교하여 0.39 g/g 내지 0.52 g/g) 또한 및/또는 9% 내지 28%의 글리콜레이트의 역가의 개선 (4.0 g/L와 비교하여 4.36 g/L 내지 5.14 g/L)에 이르게 한다.
발효에 의한 글리콜산 생산을 위해 이미 변형된 미생물은 특허 출원 제WO 2007/140816호 및 제WO 2007/141316호에 기재되어 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 글리콜산 생산을 위해 이전에 변형된 미생물은 하기 유전자 변형 중 적어도 하나를 포함한다:
- 글리콜레이트의 핵심 전구체인 글리옥실레이트를 소비하는 효소를 코딩하는 유전자: 말레이트 신타제를 코딩하는 aceB 및 gclB 유전자, 글리옥실레이트 카르보리가제를 코딩하는 gcl 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라제를 코딩하는 eda의 감쇠로 인한 글리콜레이트 생산을 제외한 글리옥실레이트 전환의 낮은 능력.
- 미생물이 글리콜레이트를 실질적으로 대사할 수 없는 방식으로의 변형. 이러한 결과는 글리콜레이트를 소비하는 효소를 코딩하는 유전자 (글리콜레이트 옥시다제를 코딩하는 glcDEFG 및 글리코알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 aldA) 중 적어도 하나의 감쇠에 의해 달성될 수 있다. 유전자의 감쇠는 저강도 프로모터에 의해 또는 상응하는 전령 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소에 의해 천연 프로모터를 대체함으로써 수행될 수 있다. 필요하다면, 유전자의 완전 감쇠는 또한 상응하는 DNA 서열의 결실에 의해 달성될 수 있다.
- 상이한 수단 및 특히 하기에 의한 글리옥실레이트 경로 흐름의 증가:
i) 효소 이소시트레이트 데히드로게나제 (ICDH)의 활성의 감소,
ii) 유전자의 감쇠에 의한 하기 효소 중 적어도 하나의 활성의 감소:
● pta 유전자에 의해 코딩되는 포스포-트랜스아세틸라제
● ackA 유전자에 의해 코딩되는 아세테이트 키나제
● poxB 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트 옥시다제
iii) aceA 유전자에 의해 코딩되는 효소 이소시트레이트 리아제의 활성의 증가
iv) 효소 이소시트레이트 데히드로게나제 키나제/포스파타제 AceK의 활성의 감소.
이소시트레이트 데히드로게나제의 수준의 감소는 이소시트레이트 데히드로게나제를 코딩하는 icd 유전자의 발현을 유도하는 인공 프로모터를 도입함으로써, 또는 단백질의 효소적 활성을 감소시키는 icd 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 성취될 수 있다.
단백질 ICDH의 활성은 인산화에 의해 감소되기 때문에, 이는 또한 야생형 AceK 효소와 비교하여 증가된 키나제 활성 또는 감소된 포스파타제 활성을 갖는 돌연변이체 aceK 유전자를 도입함으로써 제어될 수 있다.
이소시트레이트 리아제의 활성의 증가는 aceA 유전자의 발현을 자극함으로써, 예를 들어 유전자의 발현을 유도하는 인공 프로모터를 도입함으로써, 또는 코딩된 단백질의 활성을 증가시키는 aceA 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 글리옥실레이트 경로 억제자를 코딩하는 iclR 또는 fadR 유전자의 수준을 감쇠시킴으로써 성취될 수 있다.
- 반응을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현시킴으로써 글리옥실레이트의 글리콜레이트로의 전환을 촉매하는 활성의 증가. 특히, NADPH 의존성 글리옥실레이트 리덕타제 효소를 코딩하는 유전자는 호기성 조건 하에 독성 글리옥실레이트 중간체를 저독성 최종 생성물 글리콜레이트로 전환시키기 위해 존재한다. 유전자는 외인성 또는 내인성일 수 있고, 염색체적으로 또는 염색체외적으로 발현될 수 있다. NADPH-의존성 글리옥실레이트 리덕타제 코딩 유전자는 이. 콜라이 MG1655의 게놈으로부터 ycdW 또는 yiaE 유전자 중에서 취해질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 유전자 중 적어도 하나의 발현이 증가된다. 필요하다면, 당분야의 전문가에게 공지된 재조합 방법에 의해 도입될 수 있는 게놈 상의 하나 또는 여러 카피를 사용함으로써 염색체적으로 배치된 유전자로부터 높은 수준의 NADPH-의존성 글리옥실레이트 리덕타제 활성이 얻어질 수 있다. 염색체외 유전자의 경우, 복제 원점 및 그러므로 세포내 카피수 측면에서 상이한, 상이한 유형의 플라스미드가 사용될 수 있다. 이들은 치밀 복제를 갖는 낮은 카피수 플라스미드 (pSC101, RK2), 낮은 카피수 플라스미드 (pACYC, pRSF1010) 또는 높은 카피수 플라스미드 (pSK bluescript II)에 상응하는 1-5개의 카피, 약 20개 또는 최대 500개의 카피로서 존재할 수 있다. ycdW 또는 yiaE 유전자는 유도자 분자에 의해 유도될 필요가 있거나 또는 유도될 필요가 없는 상이한 강도를 갖는 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 예는 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac, 람다 프로모터 cI, 또는 당분야의 전문가에게 공지된 기타 프로모터이다. 유전자의 발현은 또한 상응하는 전령 RNA (문헌 [Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64]) 또는 단백질 (예를 들어 GST 태그, 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences))을 안정화시키는 요소에 의해 부스팅될 수 있다.
- NADPH-의존성 글리옥실레이트 리덕타제에 대한 NADPH 이용가능성의 증가. 미생물 특징의 이러한 변형은 하기 중에서 선택된 유전자 중 적어도 하나의 감쇠를 통해 얻어질 수 있다: 글루코스-6-포스페이트 이소머라제를 코딩하는 pgi, 가용성 트랜스히드로게나제를 코딩하는 udhA 및 6-포스포글루코네이트 데히드라타제 활성을 코딩하는 edd. 이러한 유전자 변형으로, 모든 글루코스-6-포스페이트는 펜토스 포스페이트 경로를 통해 해당작용으로 들어가야 할 것이고, 대사된 글루코스-6-포스페이트 당 2개의 NADPH가 생성될 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 글리콜산 생산을 위해 이전에 변형된 미생물은 특히 유전자 aceK의 감쇠를 포함한다. 글리옥실레이트 측로 효소 ICL은 그의 공통 기질에 대한 크렙스 회로 효소 이소시트레이트 데히드로게나제 (ICDH)와 직접 경쟁에 있고, ICDH가 이소시트레이트에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖긴 하지만, ICL을 통한 탄소의 흐름은 이소시트레이트의 높은 세포내 수준 및 ICDH의 큰 분획의 가역적 인산화/비활성화 때문인 것으로 확신된다. 가역적 비활성화는 동일한 폴리펩티드에 대해 효소적 활성 양자 모두를 보유하는 ICDH 키나제/포스파타제, 즉 AceK에 의해 촉매되는 가역적 인산화 때문이다 (문헌 [Laporte DC 1989, Biochimie Sep-Oct; 71(9-10):1051-7]; [Ikeda TP, 1992, J Bacteriol. Feb;174(4):1414-6.]; [Cozzone AJ, El-Mansi M. 2005, J Mol Microbiol Biotechnol. 9(3-4):132-46]).
aceK를 포함하는 모든 공지된 조절을 세포로부터 제거함으로써 ICDH의 활성을 완전히 제어하는 것이 본 발명의 방법에 이로울 것이다. aceK 결실은 ICDH의 증가된 활성에 이르게 할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 그의 프로모터의 유전자 변형에 의한 icd 유전자의 더 낮은 인공 발현이 한정된 낮은 수준의 ICDH를 갖는 생산자 균주의 구축을 허용할 것이며, 이는 ΔaceK 배경에서 글리옥실레이트 및 그러므로 글리콜레이트의 생산을 허용한다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 글리콜산 생산을 위해 초기에 변형된 미생물은 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠를 추가로 포함한다. 유전자 ldhA는 해당작용의 최종 생성물인 피루베이트를 락트산으로 전환시키는 락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.27)를 코딩한다. 유전자 mgsA는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 메틸글리옥살로 전환시키는 메틸글리옥살 신타제 (EC 4.2.3.3)를 코딩한다.
두 효소 모두는 해당작용 대사 경로에서 주요 생화학적 역할을 하고 락테이트 생성에 이르게 하는 분자를 소비한다. 글리콜레이트 생산을 위한 일부 탄소를 절약하고, 부산물로서 락테이트의 축적을 회피하기 위해, ldhA 및 mgsA의 결실이 본 발명의 방법에서 사용된 균주에서 수행되었다. 이러한 결실의 목적은 글리콜레이트 생산 수율을 개선시키고 생산물의 정제를 촉진시키는 것이다.
본 발명의 추가 실시양태는 글리콜산 생산을 위해 초기에 변형된 미생물이 유전자 arcA의 감쇠를 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 "ArcA" 및 "arcA"는 각각 폴리펩티드 및 코딩 영역을 지칭한다.
ArcA는 2-성분 조절성 ArcAB 시스템의 한 폴리펩티드이다. 2-성분 신호 도입 시스템은 박테리아가 광범위한 환경, 스트레스 및 성장 조건을 지각하고 반응하고 이에 적응할 수 있게 한다. 원형의 2-성분 시스템에서, 센서 히스티딘 키나제는 그의 자가인산화를 촉매한 후, 후속적으로 포스포릴기를 반응 조절인자로 이동시키며, 이는 그 후 종종 유전자 발현의 조절에 의해 세포 생리의 변화를 수행할 수 있다. 예를 들어, ArcB는 막결합 히스티딘 키나제 및 ArcA 반응 조절인자이다 (문헌 [Georgellis et al., 1999]). 조절 시스템은 이. 콜라이가 광범위한 산소 농도 (완전 호기성 조건으로부터 미세 호기성 조건 내지 완전 혐기성 조건까지)에 반응하게 한다.
ArcA는 이. 콜라이 및 다른 그람 음성 박테리아에서 많은 오페론의 발현을 제어한다. 당 기질로부터 세포 에너지를 생성하는 경로에 관여되는 인자: 플라빈단백 부류의 여러 데히드로게나제, 말단 옥시다제, 트리카르복실산 회로 효소, 글리옥실레이트 션트의 효소, 발효적 대사에 관여되는 효소가 주로 ArcA 레귤론에 포함된다 (문헌 [Iuchi, S., and Lin, E. C. C. (1993) Mol. Microbiol. 9, 9-15]; [Bauer, C. E., Elsen, S., and Bird, T. H. (1999) Annu. Rev. Microbiol. 53, 495-523]). ArcA는 높은 성장률 (예를 들어, 지수함수적 성장)에서 혐기성 성장 동안 및 호기성 조건 동안 이들 오페론 중 많은 것들의 감소된 발현을 초래한다 (문헌 [S. Iuchi et al., Cell, 66, 5-7 (1991)]). ArcA 단백질은 트리카르복실산 회로 (TCA) 효소에 대한 유전자의 발현을 음성으로 제어하는 것으로 공지되어 있다. arcA-파괴 균주에서, TCA 회로에 대한 유전자의 발현이 증가된다 (http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext?Exp_DB+-n+Bget-bin/get_htext?Exp_DB+-n+B).
글리콜레이트 합성의 생산성 및 수율을 개선시키기 위해, 본 발명의 방법에서 사용된 균주에서 유전자 arcA가 결실된다. 사실은, 균주에서 이전에 수행된 유전자 변형과 조합된 ΔarcA는 글리콜레이트 생산을 향한 TCA 회로 및 글리옥실레이트 션트에서의 흐름을 상승시켜야 한다.
더욱이, ArcA는 세포의 산화환원 상태에 반응하여 PTS 발현의 조절에 관여되는 것으로 나타났다 (문헌 [Jeong, J-Y. et al., 2004, Journal of Bio. Chem.]). ArcA의 인산화된 형태는 P1 프로모터로부터 ptsG 전사를 억제한다. 심지어 ArcA가 주로 혐기성 조건에서 인산화되는 경우에도 (ArcB는 산소의 부재하에 자가-인산화됨); ArcA가 호기성 조건에서 또 다른 2-성분 시스템 (교차-반응)의 키나제에 의해 인산화될 것임을 배제할 수 없다 (문헌 [Laub, M. T. and Goulian, M. Annu. Rev. Genet. (2007); 41:121-45]). 그러므로, 호기성 조건에서 ArcA-P에 의한 ptsG 발현의 억압을 배제할 수 없다. 이는 본 발명에 기재된 방법에서 사용된 글리콜레이트 생산 균주에서 arcA 유전자의 결실의 또 다른 이유이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 글리콜산 생산을 위해 초기에 변형된 미생물은 글리콜레이트 막 내수송의 감쇠를 추가로 포함한다. 특히 글리콜레이트 내수송인자를 코딩하는 유전자 glcA, lldP 및 yjcG 중 적어도 하나가 감쇠된다.
막 내수송 단백질 (또는 간단히 내수송인자)은 이온, 소분자 또는 거대분자, 예컨대 생물학적 막을 가로지르는 또 다른 단백질의 이동에 관여되는 단백질이다. 내수송 단백질은 내재막 단백질이며; 즉 막 내에 존재하고 막에 걸쳐 있으며, 상기 막을 가로질러 물질을 내수송한다. 단백질은 촉진 확산 또는 능동 내수송에 의해 물질의 이동을 보조할 수 있다. 상기 언급된 3종의 단백질은 모두 글리콜레이트 및 락테이트의 내수송인자로서 특징화되었다 (문헌 [Nunez, F. et al., 2001 Microbiology, 147, 1069-1077]; [Nunez, F. et al., 2002 Biochem. And Biophysical research communications 290, 824-829]; [Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455]). 각각의 글리콜레이트 퍼미아제에 대해 돌연변이된 균주는 탄소 공급원으로서 글리콜레이트 상에서 성장할 수 없으며, 이는 균주가 글리콜레이트를 내수송할 수 없다는 것을 나타낸다 (문헌 [Gimenez, R. et al., 2003]). 목적은 글리콜산 생산에 사용되는 세포로의 글리콜레이트 내수송을 감쇠시킴으로써 글리콜산에 저항하고 글리콜산을 축적하는 균주의 능력을 개선시키고 따라서 생산 역가를 개선시키는 것이다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 3종의 유전자 glcA, lldP 및 yjcG가 감쇠된다.
이러한 글리콜산 생산 미생물로부터 글리콜산의 외수송(exportation)을 증가시키는 것이 또한 이로울 것이다. 당업자는 특정 대사물질의 외수송의 이러한 증가를 얻기 위한 수많은 수단, 특히 미생물로부터 배지로 글리콜산을 외수송할 수 있는 외수송 단백질의 활성 및/또는 발현을 향상시키기 위한 수단을 알고 있다.
구체적 실시양태에서 본 발명은
(a) 글루코스, 수크로스, 단당류 (예컨대 프룩토스, 만노스, 크실로스, 아라비노스), 올리고사카라이드 (예컨대 갈락토스, 셀로비오스 …), 다당류 (예컨대 셀룰로스), 전분 또는 그의 유도체, 글리세롤 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소 공급원과 본 발명의 재조합 유기체를 접촉시켜, 이에 의해 글리옥실산을 생산하는 단계
를 포함하는, 재조합 유기체로부터 글리콜산을 발효적으로 생산하는 방법을 제공하고,
(b) 임의로, 상기 방법은 박테리아 또는 배지 중 글리콜레이트를 농축시키고, 최종 생성물 중에 부분적으로 또는 총량으로 (0-100%) 임의로 남아있는 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터 글리콜산을 단리하는 단계를 포함하고,
임의로 상기 방법은 적어도 글리콜산 이량체로의 중합 단계를 통해 단계 (a)에서 생산된 글리콜산을 회수하는 단계, 및
(c) 글리콜산 이량체, 올리고머 및/또는 중합체로부터 해중합에 의해, 최종 생성물 중에 부분적으로 또는 총량으로 임의로 남아있는 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터 글리콜산을 단리하고 회수하는 단계
를 포함한다.
당업자는 본 발명에 따른 미생물을 위한 배양 조건을 정의할 수 있다. 특히, 그람 음성 박테리아는 20℃ 내지 55℃, 우선적으로 25℃ 내지 40℃, 및 보다 구체적으로 이. 콜라이를 위해 약 37℃의 온도에서 발효된다.
발효는 일반적으로 발효기에서 하나 이상의 간단한 탄소 공급원, 및 필요하다면 대사물질의 생산에 필수적인 공동-기질을 함유하는, 사용되는 박테리아에 대해 적합화된 공지된 정의된 조성의 무기 배양 배지로 수행된다.
본 발명은 또한 이전에 기재된 미생물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 미생물은 엔테로박테리아세아에 과에 속한다. 보다 우선적으로, 미생물은 에스케리치아 속의 미생물이며, 훨씬 더 우선적으로 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)이다.
도 1은 탄수화물로부터 글리콜산 생산 시스템의 개발에서 해당작용, TCA 회로 및 글리옥실레이트 경로의 유전자 조작을 나타낸다.
도 2는 벡터 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01, 즉 pAG25의 구축을 나타내는 다이어그램이다.
도 3은 락테이트 및 아세테이트 경로의 확대도이다. 이들 경로에 관여되는 유전자들 중 일부가 본 발명에서 변형된다.
<발명의 상세한 설명>
본원에 별도의 정의가 없는 경우, 본원에서 사용된 모든 전문 용어 및 과학 용어는 본 발명과 관계가 있는 분야의 통상의 지식을 가진자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서, 용어 "미생물" 및 "박테리아"는 상호교환적으로 사용되고, 그람 음성 박테리아를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과에 속한다. 엔테로박테리아세아에 과는 특히 에스케리치아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 살모넬라(Salmonella) 및 판토에아(Pantoea) 속을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "돌연변이체 균주"는 비-야생형 균주를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "재조합" 또는 "유전자 변형된" 또는 "변형된 미생물"은 게놈의 변형, 예를 들어, 유기체에서 천연적으로 발생하지 않는 핵산의 첨가에 의한 변형 및 숙주 세포에서 천연적으로 발생하는 핵산의 변형에 의한 변형을 갖는 숙주 세포를 지칭한다. 용어 "형질전환" 또는 "형질감염"은 외인성 핵산의 혼입 후 세포 내 새로운 유전자의 획득을 지칭한다. 용어 "형질전환체"는 형질전환의 생성물을 지칭한다.
용어 "변형" 또는 숙주 세포에 의해 생산된 단백질 또는 효소 활성의 수준을 "변형시키다"는 수준이 필요에 따라 증가되거나 감소되도록 배양 동안 생산된 단백질 또는 효소적 활성의 수준을 제어하는 것을 지칭한다. 용어 "변형된"은 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 언급시, 핵산이 야생형 핵산과 비교하여 일부 방법으로, 예컨대 핵산의 일부 또는 전체의 돌연변이; 치환, 삽입, 결실에 의해; 또는 전사 제어 영역에 작동가능하게 연결됨으로써 변경되었음을 의미한다. 돌연변이의 예로는 점 돌연변이, 틀 이동 돌연변이, 및 언급된 유전자의 일부 또는 전체의 결실이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
유전자는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 발현에 작동가능하게 연결된 조절성 RNA의 프로모터 영역, 운반 RNA의 프로모터 영역, 리보솜 RNA의 프로모터 영역에 대한 코딩에 관여되는 DNA의 세그먼트, 예를 들어 코딩 영역, 코딩 영역 이전의 비-코딩 영역 ("리더(leader)") 및 코딩 영역 이후의 비-코딩 영역 ("테일러(tailer)"), 뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 ("엑손") 사이의 개입 비-코딩 서열 ("인트론")을 의미한다. 코딩은 아미노산의 표시, 3개의 염기 "트리플렛" 코드에서 개시 및 종결 신호를 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 요소들이 기능적으로 연관되도록 배열된 근접위치를 지칭한다. 프로모터는 서열의 전사를 제어하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 리보솜 결합 부위는 mRNA의 번역을 허용하도록 위치된 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
용어 "비활성화" 또는 "감쇠"는 유전자 발현의 감소 또는 유전자의 생성물인 단백질의 활성의 감소를 지칭한다. 당업자는 이러한 결과를 얻기 위한 수많은 수단, 및 예를 들어 하기 기재를 알고 있다:
- 돌연변이의 유전자로의 도입, 이는 상기 유전자의 발현 수준 또는 코딩된 단백질의 활성 수준을 감소시킴.
- 낮은 강도 프로모터에 의한 유전자의 천연 프로모터의 대체, 이는 더 낮은 발현을 초래함.
- 상응하는 전령 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소의 사용
- 발현이 필요하지 않는 경우 유전자의 결실.
용어 "발현"은 유전자로부터 유전자의 생성물인 단백질로의 전사 및 번역을 지칭한다.
용어 "과다발현" 또는 "과다발현된"은 본원에서 적절한 대조 종과 비교하여 150% 이상의 단백질 활성인 것으로 정의된다. 과다발현은 더 활성인 형태 또는 억제에 대해 저항성인 형태의 생성을 위한 단백질의 돌연변위화에 의해, 억제인자의 제거에 의해, 또는 활성인자의 첨가 등에 의해 달성될 수 있다. 과다발현은 또한 억제자의 제거, 유전자의 여러 카피의 세포로의 첨가, 또는 내인성 유전자의 상향 조절 등에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 보유하고 통상적으로 고리형 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 염색체외 요소를 지칭한다.
용어 "탄소 기질", "탄소 공급원" 또는 "발효성 탄소 공급원"은 미생물에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미하며, 여기서 기질은 1개 이상의 탄소 원자를 함유한다.
용어 "ATCC"는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; 미국 20852 메릴랜드주 로크빌 파크론 드라이브 12301)을 의미할 것이다.
용어 "글리옥실레이트" 및 "글리옥실산"은 상호교환적으로 사용된다.
용어 "글리콜레이트" 및 "글리콜산"은 상호교환적으로 사용된다. 용어 "글리콜산, 그의 유도체 또는 전구체"는 글리콜산의 형성 및 분해의 대사 경로에서 모든 중간체 화합물을 표시한다. 글리콜산의 전구체는 특히 시트레이트, 이소시트레이트, 글리옥실레이트, 및 일반적으로 글리옥실레이트 회로의 모든 화합물이다 (도 1 참조). 글리콜산의 유도체는 특히 글리콜레이트 에스테르, 예컨대 에틸 글리콜레이트 에스테르, 메틸 글리콜레이트 에스테르 및 글리콜레이트를 함유하는 중합체, 예컨대 폴리글리콜산이다.
본 발명의 기재에서, 효소는 그의 특이적 활성에 의해 확인된다. 그러므로 이러한 정의는 또한 다른 유기체, 보다 구체적으로 다른 미생물에 존재하는 정의된 특이적 활성을 갖는 모든 폴리펩티드를 포함한다. 종종 유사한 활성을 갖는 효소는 PFAM 또는 COG라고 정의된 특정 과로의 그룹화에 의해 정의될 수 있다.
PFAM (정렬 및 은둔 마르코브(Markov) 모델의 단백질 과 데이터베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬의 큰 수집을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 관찰하고, 유기체 중 분포를 평가하고, 다른 데이터베이스에 접근하고, 공지된 단백질 구조를 가시화하는 것을 가능하게 한다.
COG (오르토로거스(orthologous) 단백질 군의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 30개의 주요 계통발생 계를 나타내는 43개의 충분히 서열분석된 게놈으로부터 단백질 서열을 비교함으로써 얻어진다. 각각의 COG는 3개 이상의 계로부터 정의되며, 이는 전자 보존 도메인의 확인을 허용한다.
상동성 서열의 확인 수단 및 그의 상동성 백분율은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 특히 BLAST 프로그램을 포함하며, 이는 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 상기 웹사이트 상에 지정된 디폴트 파라미터로 사용될 수 있다. 그 후, 얻은 서열은 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)을 사용하여 상기 웹사이트 상에 지정된 디폴트 파라미터로 활용 (예를 들어, 정렬)될 수 있다.
공지된 유전자에 대한 진뱅크(GenBank) 상에 주어진 기준을 사용하여, 당업자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 등가의 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 통상적인 작업은 유리하게는 다른 미생물로부터 유도된 유전자에 의한 서열 정렬을 수행하고, 또 다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝하기 위한 축퇴성 프로브를 설계함으로써 결정될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 수행된다. 이들 통상적인 분자 생물학 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)]에 기재되어 있다.
이. 콜라이와 관련하여 본 출원에서 확인된 유전자는 모든 그람 음성 박테리아에서 발견될 수 있다.
본 발명은 글리콜산 생산을 위해 이전에 변형되고 하기 변형:
- 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠
- 유전자 arcA의 감쇠
- 글리콜레이트의 막 내수송을 감쇠시키기 위한 유전자 glcA, lldP 및 yjcG 중 적어도 하나의 감쇠
및 이들의 조합
중 적어도 하나를 포함하도록 추가로 유전자 조작된 단일 재조합 그람 음성 박테리아를 사용하여 발효성 탄소 공급원을 직접적으로 글리콜산으로 생물전환시키기 위한 개선된 방법을 제공한다.
이들 변형의 모든 조합이 가능하고, 특히:
- 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠 및 유전자 arcA의 감쇠;
- 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠 및 글리콜레이트의 막 내수송의 감쇠;
- 유전자 arcA의 감쇠 및 글리콜레이트의 막 내수송의 감쇠;
- 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠 및 유전자 arcA의 감쇠 및 글리콜레이트의 막 내수송의 감쇠
가 가능하다.
유전자는 다음과 같이 단축된다: 락테이트 데히드로게나제 (ldhA), 메틸글리옥살 리덕타제 (mgsA), 호기성 호흡 제어 조절인자 A (arcA), L-락테이트 퍼미아제 (lldP), 글리콜레이트 퍼미아제 (glcA) 및 아세테이트 내수송인자 (yjcG).
이들 추가 변형의 주요 장점은 조작된 미생물에 의한 글리콜산 생산의 개선이다. 사실은, 모든 이들 변형은 2% 내지 36%의 생산 수율의 개선 (0.38 g/g과 비교하여 0.39 g/g 내지 0.52 g/g) 또한 및/또는 9% 내지 28%의 글리콜레이트의 역가의 개선 (4.0 g/L와 비교하여 4.36 g/L 내지 5.14 g/L)에 이르게 한다.
발효에 의한 글리콜산 생산을 위해 이미 변형된 미생물은 특허 출원 제WO 2007/140816호 및 제WO 2007/141316호에 기재되어 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 글리콜산 생산을 위해 이전에 변형된 미생물은 하기 유전자 변형 중 적어도 하나를 포함한다:
- 글리콜레이트의 핵심 전구체인 글리옥실레이트를 소비하는 효소를 코딩하는 유전자: 말레이트 신타제를 코딩하는 aceB 및 gclB 유전자, 글리옥실레이트 카르보리가제를 코딩하는 gcl 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라제를 코딩하는 eda의 감쇠로 인한 글리콜레이트 생산을 제외한 글리옥실레이트 전환의 낮은 능력.
- 미생물이 글리콜레이트를 실질적으로 대사할 수 없는 방식으로의 변형. 이러한 결과는 글리콜레이트를 소비하는 효소를 코딩하는 유전자 (글리콜레이트 옥시다제를 코딩하는 glcDEFG 및 글리코알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 aldA) 중 적어도 하나의 감쇠에 의해 달성될 수 있다. 유전자의 감쇠는 저강도 프로모터에 의해 또는 상응하는 전령 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소에 의해 천연 프로모터를 대체함으로써 수행될 수 있다. 필요하다면, 유전자의 완전 감쇠는 또한 상응하는 DNA 서열의 결실에 의해 달성될 수 있다.
- 상이한 수단 및 특히 하기에 의한 글리옥실레이트 경로 흐름의 증가:
i) 효소 이소시트레이트 데히드로게나제 (ICDH)의 활성의 감소,
ii) 유전자의 감쇠에 의한 하기 효소 중 적어도 하나의 활성의 감소:
● pta 유전자에 의해 코딩되는 포스포-트랜스아세틸라제
● ackA 유전자에 의해 코딩되는 아세테이트 키나제
● poxB 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트 옥시다제
iii) aceA 유전자에 의해 코딩되는 효소 이소시트레이트 리아제의 활성의 증가
iv) 효소 이소시트레이트 데히드로게나제 키나제/포스파타제 AceK의 활성의 감소.
이소시트레이트 데히드로게나제의 수준의 감소는 이소시트레이트 데히드로게나제를 코딩하는 icd 유전자의 발현을 유도하는 인공 프로모터를 도입함으로써, 또는 단백질의 효소적 활성을 감소시키는 icd 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 성취될 수 있다.
단백질 ICDH의 활성은 인산화에 의해 감소되기 때문에, 이는 또한 야생형 AceK 효소와 비교하여 증가된 키나제 활성 또는 감소된 포스파타제 활성을 갖는 돌연변이체 aceK 유전자를 도입함으로써 제어될 수 있다.
이소시트레이트 리아제의 활성의 증가는 aceA 유전자의 발현을 자극함으로써, 예를 들어 유전자의 발현을 유도하는 인공 프로모터를 도입함으로써, 또는 코딩된 단백질의 활성을 증가시키는 aceA 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 글리옥실레이트 경로 억제자를 코딩하는 iclR 또는 fadR 유전자의 수준을 감쇠시킴으로써 성취될 수 있다.
- 반응을 촉매하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 발현시킴으로써 글리옥실레이트의 글리콜레이트로의 전환을 촉매하는 활성의 증가. 특히, NADPH 의존성 글리옥실레이트 리덕타제 효소를 코딩하는 유전자는 호기성 조건 하에 독성 글리옥실레이트 중간체를 저독성 최종 생성물 글리콜레이트로 전환시키기 위해 존재한다. 유전자는 외인성 또는 내인성일 수 있고, 염색체적으로 또는 염색체외적으로 발현될 수 있다. NADPH-의존성 글리옥실레이트 리덕타제 코딩 유전자는 이. 콜라이 MG1655의 게놈으로부터 ycdW 또는 yiaE 유전자 중에서 취해질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 유전자 중 적어도 하나의 발현이 증가된다. 필요하다면, 당분야의 전문가에게 공지된 재조합 방법에 의해 도입될 수 있는 게놈 상의 하나 또는 여러 카피를 사용함으로써 염색체적으로 배치된 유전자로부터 높은 수준의 NADPH-의존성 글리옥실레이트 리덕타제 활성이 얻어질 수 있다. 염색체외 유전자의 경우, 복제 원점 및 그러므로 세포내 카피수 측면에서 상이한, 상이한 유형의 플라스미드가 사용될 수 있다. 이들은 치밀 복제를 갖는 낮은 카피수 플라스미드 (pSC101, RK2), 낮은 카피수 플라스미드 (pACYC, pRSF1010) 또는 높은 카피수 플라스미드 (pSK bluescript II)에 상응하는 1-5개의 카피, 약 20개 또는 최대 500개의 카피로서 존재할 수 있다. ycdW 또는 yiaE 유전자는 유도자 분자에 의해 유도될 필요가 있거나 또는 유도될 필요가 없는 상이한 강도를 갖는 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 예는 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac, 람다 프로모터 cI, 또는 당분야의 전문가에게 공지된 기타 프로모터이다. 유전자의 발현은 또한 상응하는 전령 RNA (문헌 [Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64]) 또는 단백질 (예를 들어 GST 태그, 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences))을 안정화시키는 요소에 의해 부스팅될 수 있다.
- NADPH-의존성 글리옥실레이트 리덕타제에 대한 NADPH 이용가능성의 증가. 미생물 특징의 이러한 변형은 하기 중에서 선택된 유전자 중 적어도 하나의 감쇠를 통해 얻어질 수 있다: 글루코스-6-포스페이트 이소머라제를 코딩하는 pgi, 가용성 트랜스히드로게나제를 코딩하는 udhA 및 6-포스포글루코네이트 데히드라타제 활성을 코딩하는 edd. 이러한 유전자 변형으로, 모든 글루코스-6-포스페이트는 펜토스 포스페이트 경로를 통해 해당작용으로 들어가야 할 것이고, 대사된 글루코스-6-포스페이트 당 2개의 NADPH가 생성될 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 글리콜산 생산을 위해 이전에 변형된 미생물은 특히 유전자 aceK의 감쇠를 포함한다. 글리옥실레이트 측로 효소 ICL은 그의 공통 기질에 대한 크렙스 회로 효소 이소시트레이트 데히드로게나제 (ICDH)와 직접 경쟁에 있고, ICDH가 이소시트레이트에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖긴 하지만, ICL을 통한 탄소의 흐름은 이소시트레이트의 높은 세포내 수준 및 ICDH의 큰 분획의 가역적 인산화/비활성화 때문인 것으로 확신된다. 가역적 비활성화는 동일한 폴리펩티드에 대해 효소적 활성 양자 모두를 보유하는 ICDH 키나제/포스파타제, 즉 AceK에 의해 촉매되는 가역적 인산화 때문이다 (문헌 [Laporte DC 1989, Biochimie Sep-Oct; 71(9-10):1051-7]; [Ikeda TP, 1992, J Bacteriol. Feb;174(4):1414-6.]; [Cozzone AJ, El-Mansi M. 2005, J Mol Microbiol Biotechnol. 9(3-4):132-46]).
aceK를 포함하는 모든 공지된 조절을 세포로부터 제거함으로써 ICDH의 활성을 완전히 제어하는 것이 본 발명의 방법에 이로울 것이다. aceK 결실은 ICDH의 증가된 활성에 이르게 할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 그의 프로모터의 유전자 변형에 의한 icd 유전자의 더 낮은 인공 발현이 한정된 낮은 수준의 ICDH를 갖는 생산자 균주의 구축을 허용할 것이며, 이는 ΔaceK 배경에서 글리옥실레이트 및 그러므로 글리콜레이트의 생산을 허용한다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 글리콜산 생산을 위해 초기에 변형된 미생물은 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠를 추가로 포함한다. 유전자 ldhA는 해당작용의 최종 생성물인 피루베이트를 락트산으로 전환시키는 락테이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.27)를 코딩한다. 유전자 mgsA는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 메틸글리옥살로 전환시키는 메틸글리옥살 신타제 (EC 4.2.3.3)를 코딩한다.
두 효소 모두는 해당작용 대사 경로에서 주요 생화학적 역할을 하고 락테이트 생성에 이르게 하는 분자를 소비한다. 글리콜레이트 생산을 위한 일부 탄소를 절약하고, 부산물로서 락테이트의 축적을 회피하기 위해, ldhA 및 mgsA의 결실이 본 발명의 방법에서 사용된 균주에서 수행되었다. 이러한 결실의 목적은 글리콜레이트 생산 수율을 개선시키고 생산물의 정제를 촉진시키는 것이다.
본 발명의 추가 실시양태는 글리콜산 생산을 위해 초기에 변형된 미생물이 유전자 arcA의 감쇠를 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 "ArcA" 및 "arcA"는 각각 폴리펩티드 및 코딩 영역을 지칭한다.
ArcA는 2-성분 조절성 ArcAB 시스템의 한 폴리펩티드이다. 2-성분 신호 도입 시스템은 박테리아가 광범위한 환경, 스트레스 및 성장 조건을 지각하고 반응하고 이에 적응할 수 있게 한다. 원형의 2-성분 시스템에서, 센서 히스티딘 키나제는 그의 자가인산화를 촉매한 후, 후속적으로 포스포릴기를 반응 조절인자로 이동시키며, 이는 그 후 종종 유전자 발현의 조절에 의해 세포 생리의 변화를 수행할 수 있다. 예를 들어, ArcB는 막결합 히스티딘 키나제 및 ArcA 반응 조절인자이다 (문헌 [Georgellis et al., 1999]). 조절 시스템은 이. 콜라이가 광범위한 산소 농도 (완전 호기성 조건으로부터 미세 호기성 조건 내지 완전 혐기성 조건까지)에 반응하게 한다.
ArcA는 이. 콜라이 및 다른 그람 음성 박테리아에서 많은 오페론의 발현을 제어한다. 당 기질로부터 세포 에너지를 생성하는 경로에 관여되는 인자: 플라빈단백 부류의 여러 데히드로게나제, 말단 옥시다제, 트리카르복실산 회로 효소, 글리옥실레이트 션트의 효소, 발효적 대사에 관여되는 효소가 주로 ArcA 레귤론에 포함된다 (문헌 [Iuchi, S., and Lin, E. C. C. (1993) Mol. Microbiol. 9, 9-15]; [Bauer, C. E., Elsen, S., and Bird, T. H. (1999) Annu. Rev. Microbiol. 53, 495-523]). ArcA는 높은 성장률 (예를 들어, 지수함수적 성장)에서 혐기성 성장 동안 및 호기성 조건 동안 이들 오페론 중 많은 것들의 감소된 발현을 초래한다 (문헌 [S. Iuchi et al., Cell, 66, 5-7 (1991)]). ArcA 단백질은 트리카르복실산 회로 (TCA) 효소에 대한 유전자의 발현을 음성으로 제어하는 것으로 공지되어 있다. arcA-파괴 균주에서, TCA 회로에 대한 유전자의 발현이 증가된다 (http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext?Exp_DB+-n+Bget-bin/get_htext?Exp_DB+-n+B).
글리콜레이트 합성의 생산성 및 수율을 개선시키기 위해, 본 발명의 방법에서 사용된 균주에서 유전자 arcA가 결실된다. 사실은, 균주에서 이전에 수행된 유전자 변형과 조합된 ΔarcA는 글리콜레이트 생산을 향한 TCA 회로 및 글리옥실레이트 션트에서의 흐름을 상승시켜야 한다.
더욱이, ArcA는 세포의 산화환원 상태에 반응하여 PTS 발현의 조절에 관여되는 것으로 나타났다 (문헌 [Jeong, J-Y. et al., 2004, Journal of Bio. Chem.]). ArcA의 인산화된 형태는 P1 프로모터로부터 ptsG 전사를 억제한다. 심지어 ArcA가 주로 혐기성 조건에서 인산화되는 경우에도 (ArcB는 산소의 부재하에 자가-인산화됨); ArcA가 호기성 조건에서 또 다른 2-성분 시스템 (교차-반응)의 키나제에 의해 인산화될 것임을 배제할 수 없다 (문헌 [Laub, M. T. and Goulian, M. Annu. Rev. Genet. (2007); 41:121-45]). 그러므로, 호기성 조건에서 ArcA-P에 의한 ptsG 발현의 억압을 배제할 수 없다. 이는 본 발명에 기재된 방법에서 사용된 글리콜레이트 생산 균주에서 arcA 유전자의 결실의 또 다른 이유이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 글리콜산 생산을 위해 초기에 변형된 미생물은 글리콜레이트 막 내수송의 감쇠를 추가로 포함한다. 특히 글리콜레이트 내수송인자를 코딩하는 유전자 glcA, lldP 및 yjcG 중 적어도 하나가 감쇠된다.
막 내수송 단백질 (또는 간단히 내수송인자)은 이온, 소분자 또는 거대분자, 예컨대 생물학적 막을 가로지르는 또 다른 단백질의 이동에 관여되는 단백질이다. 내수송 단백질은 내재막 단백질이며; 즉 막 내에 존재하고 막에 걸쳐 있으며, 상기 막을 가로질러 물질을 내수송한다. 단백질은 촉진 확산 또는 능동 내수송에 의해 물질의 이동을 보조할 수 있다. 상기 언급된 3종의 단백질은 모두 글리콜레이트 및 락테이트의 내수송인자로서 특징화되었다 (문헌 [Nunez, F. et al., 2001 Microbiology, 147, 1069-1077]; [Nunez, F. et al., 2002 Biochem. And Biophysical research communications 290, 824-829]; [Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455]). 각각의 글리콜레이트 퍼미아제에 대해 돌연변이된 균주는 탄소 공급원으로서 글리콜레이트 상에서 성장할 수 없으며, 이는 균주가 글리콜레이트를 내수송할 수 없다는 것을 나타낸다 (문헌 [Gimenez, R. et al., 2003]). 목적은 글리콜산 생산에 사용되는 세포로의 글리콜레이트 내수송을 감쇠시킴으로써 글리콜산에 저항하고 글리콜산을 축적하는 균주의 능력을 개선시키고 따라서 생산 역가를 개선시키는 것이다.
본 발명의 구체적 실시양태에서, 3종의 유전자 glcA, lldP 및 yjcG가 감쇠된다.
이러한 글리콜산 생산 미생물로부터 글리콜산의 외수송(exportation)을 증가시키는 것이 또한 이로울 것이다. 당업자는 특정 대사물질의 외수송의 이러한 증가를 얻기 위한 수많은 수단, 특히 미생물로부터 배지로 글리콜산을 외수송할 수 있는 외수송 단백질의 활성 및/또는 발현을 향상시키기 위한 수단을 알고 있다.
구체적 실시양태에서 본 발명은
(a) 글루코스, 수크로스, 단당류 (예컨대 프룩토스, 만노스, 크실로스, 아라비노스), 올리고사카라이드 (예컨대 갈락토스, 셀로비오스 …), 다당류 (예컨대 셀룰로스), 전분 또는 그의 유도체, 글리세롤 및 단일 탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소 공급원과 본 발명의 재조합 유기체를 접촉시켜, 이에 의해 글리옥실산을 생산하는 단계
를 포함하는, 재조합 유기체로부터 글리콜산을 발효적으로 생산하는 방법을 제공하고,
(b) 임의로, 상기 방법은 박테리아 또는 배지 중 글리콜레이트를 농축시키고, 최종 생성물 중에 부분적으로 또는 총량으로 (0-100%) 임의로 남아있는 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터 글리콜산을 단리하는 단계를 포함하고,
임의로 상기 방법은 적어도 글리콜산 이량체로의 중합 단계를 통해 단계 (a)에서 생산된 글리콜산을 회수하는 단계, 및
(c) 글리콜산 이량체, 올리고머 및/또는 중합체로부터 해중합에 의해, 최종 생성물 중에 부분적으로 또는 총량으로 임의로 남아있는 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스로부터 글리콜산을 단리하고 회수하는 단계
를 포함한다.
당업자는 본 발명에 따른 미생물을 위한 배양 조건을 정의할 수 있다. 특히, 그람 음성 박테리아는 20℃ 내지 55℃, 우선적으로 25℃ 내지 40℃, 및 보다 구체적으로 이. 콜라이를 위해 약 37℃의 온도에서 발효된다.
발효는 일반적으로 발효기에서 하나 이상의 간단한 탄소 공급원, 및 필요하다면 대사물질의 생산에 필수적인 공동-기질을 함유하는, 사용되는 박테리아에 대해 적합화된 공지된 정의된 조성의 무기 배양 배지로 수행된다.
본 발명은 또한 이전에 기재된 미생물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 미생물은 엔테로박테리아세아에 과에 속한다. 보다 우선적으로, 미생물은 에스케리치아 속의 미생물이며, 훨씬 더 우선적으로 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)이다.
<실시예>
하기 실시예에 기재된 글리콜산을 생산하는 균주를 제작하기 위해 여러 프로토콜을 사용하였다. 프로토콜은 하기 상세히 기재되어 있다.
프로토콜 1: 재조합을 위한 PCR 생성물의 도입 및 재조합체의 선택 (FRT 시스템)
플라스미드 pKD3으로부터의 클로람페니콜 내성 카세트 또는 플라스미드 pKD4로부터의 카나마이신 내성 카세트를 증폭시키기 위해, 유전자 또는 유전자간 영역의 대체를 위해 표 1에 제공되고 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하였다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)]). 그 후, 얻은 PCR 생성물을 전기천공법에 의해 플라스미드 pKD46을 보유하는 수용자 균주로 도입하였으며, 여기서 발현된 시스템 λ Red (γ,β,exo)는 상동성 재조합에 매우 유리하였다. 그 후, 항생제-내성 형질전환체를 선택하고, 표 2에 주어진 적절한 올리고뉴클레오티드로 PCR 분석에 의해 내성 카세트의 삽입을 검사하였다.
프로토콜 2: 내성 카세트의 제거 (FRT 시스템)
하기 기술에 따라 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 FLP 재조합효소를 보유하는 플라스미드 pCP20을 전기천공법에 의해 균주로 도입하였다. 42℃에서 일련의 배양 후, 표 2에 주어진 올리고뉴클레오티드로 PCR 분석에 의해 항생제 내성 카세트의 손실을 검사하였다.
프로토콜 3: 유전자의 결실을 위한 파지 P1에 의한 형질도입
파지 P1에 의한 형질도입 기술에 의해, 수용자 이. 콜라이 균주에서 내성 카세트 (카나마이신 또는 클로람페니콜)에 의한 유전자의 대체에 의해 선택된 유전자의 결실을 수행하였다. 프로토콜은 두 단계, (i) 결실된 단일 유전자를 갖는 공여자 균주 상의 파지 용해물의 제조 및 (ii) 이러한 파지 용해물에 의한 수용자 균주의 형질도입이었다.
파지 용해물의 제조
- 10 ml의 LB + Cm 30 ㎍/ml + 글루코스 0.2% + CaCl2 5 mM의 결실된 단일 유전자를 갖는 균주 MG1655의 밤새 배양물의 100 ㎕에 의한 시딩.
- 진탕하면서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션.
- 공여자 균주 MG1655 상에 제조된 파지 용해물 P1의 100 ㎕의 첨가 (대략 1 x 109개 파지/ml).
- 모든 세포가 용해될 때까지 3시간 동안 37℃에서 진탕.
- 200 ㎕의 클로로포름의 첨가 및 볼텍싱.
- 세포 잔해를 제거하기 위해 4500 g에서 10분 동안 원심분리.
- 멸균 튜브 중 상등액의 이동 및 200 ㎕의 클로로포름의 첨가.
- 4℃에서 용해물의 저장.
형질도입
- LB 배지 중에 이. 콜라이 수용자 균주의 밤새 배양물의 5 ml의 1500 g에서 10분 동안 원심분리.
- 2.5 ml의 MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM 중 세포 펠렛의 현탁.
- 대조 튜브: 세포 100 ㎕
결실된 단일 유전자를 갖는 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕
- 튜브 시험: 세포 100 ㎕ + 결실된 단일 유전자를 갖는 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕
- 진탕 없이 30℃에서 30분 동안 인큐베이션.
- 각각의 튜브 중 시트르산나트륨 1 M 100 ㎕의 첨가, 및 볼텍싱.
- LB 1 ml의 첨가.
- 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션.
- 7000 rpm에서 3분 동안 튜브의 원심분리 후 디쉬 상에 LB + Cm 30 ㎍/ml의 플레이팅.
- 밤새 37℃에서 인큐베이션.
그 후, 항생제-내성 형질전환체를 선택하고, 표 2에 주어진 적절한 올리고뉴클레오티드로 PCR 분석에 의해 결실의 삽입을 검사하였다.
프로토콜 4: 재조합을 위한 PCR 생성물의 도입 및 재조합체의 선택 (Cre-LOX 시스템)
플라스미드 loxP-cm-loxP (진 브릿지스(Gene Bridges))로부터의 클로람페니콜 내성 카세트 또는 플라스미드 loxP-PGK-gb2-neo-loxP (진 브릿지스)로부터의 네오마이신 내성 카세트를 증폭시키기 위해, 유전자 또는 유전자간 영역의 대체를 위해 표 1에 제공되고 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 그 후, 얻은 PCR 생성물을 전기천공법에 의해 플라스미드 pKD46을 보유하는 수용자 균주로 도입하였으며, 여기서 발현된 시스템 λ Red (γ,β,exo)는 상동성 재조합에 매우 유리하였다. 그 후, 항생제-내성 형질전환체를 선택하고, 표 2에 주어진 적절한 올리고뉴클레오티드로 PCR 분석에 의해 내성 카세트의 삽입을 검사하였다.
프로토콜 5: 내성 카세트의 제거 (Cre-LOX 시스템)
하기 기술에 따라 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트의 Cre-LOX 부위에서 작용하는 Cre 재조합효소를 보유하는 플라스미드 pJW168 (문헌 [Palmeros B. et al (2000), Gene 247 : 255-264])을 전기천공법에 의해 균주로 도입하였다. 42℃에서 일련의 배양 후, 표 2에 주어진 올리고뉴클레오티드로 PCR 분석에 의해 항생제 내성 카세트의 손실을 검사하였다.
실시예 1
플라스미드 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01의 구축 (도 2)
특허 출원 제PCT/EP2006/063046호 및 제PCT/EP2007/055625호에 기재된 플라스미드 pME101-ycdW 및 플라스미드 pJB137-aceA로부터 세 단계로 플라스미드 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01을 제작하였다.
- 제1 단계는 ycdW의 말단에 종결자를 첨가함으로써 플라스미드 pME101-ycdW-TT07을 제작하는 것이었다. 표 1에 표시되고 서열에 TT07을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 갖는 게놈 DNA 상에서 수행된 PCR에 의해 유전자 ycdW의 말단을 증폭시켰다. AgeI/SmaI에 의해 소화된 PCR 단편을 동일한 제한 효소에 의해 절단된 플라스미드 pME101-ycdW로 클로닝하여, 플라스미드 pME101-ycdW-TT7에 이르게 하였다.
- SmaI/HindIII에 의해 소화된 플라스미드 pJB137 (EMBL 접속 번호 U75326) 내 PCR 단편을 클로닝함으로써 플라스미드 pJB137-aceA를 제작하였다. 특허 출원 제PCT/EP2006/063046호 및 제PCT/EP2007/055625호에 기재된 MG1655 ΔaceB 균주 및 표 1에 기재된 올리고뉴클레오티드 (Oag0037 및 Oag0038)로부터 정제된 게놈 DNA 상에서 PCR 단편을 구현하였다. 플라스미드로 클로닝되기 전에 유전자 aceA를 그 자체의 프로모터로서 증폭시켰다.
- 마지막 단계는 플라스미드 pJB137-aceA를 절단하여, 단편 PaceA-aceA-TT01, pJB137의 종결자인 TT01을 얻는 것이었다. 플라스미드 pJB137-aceA를 HindIII으로 절단하고, 클레노브 효소로 처리하고, 마지막으로 PstI 제한 효소에 의해 소화시켰다. 그 후, 생성된 DNA 단편을 순차적으로 SmaI 및 PstI에 의해 개방된 플라스미드 pME101-ycdW-TT07로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01, 즉 pAG025였다.
실시예 2
발효에 의해 글리콜산을 생산할 수 있는 균주의 구축: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
특허 출원 제PCT/EP2006/063046호 및 제PCT/EP2007/055625호에 주어진 기재에 따라 균주 이. 콜라이 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta를 제작하였다.
균주 이. 콜라이 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta에서 클로람페니콜 내성 카세트를 보유하는 Ptrc50/RBSB/TTG라고 불리는 인공 프로모터에 의해 천연 icd 프로모터를 치환함으로써 icd 전사의 감쇠를 구현하였다. 프로토콜 1에 기재된 기술에 따라 표 1에 주어진 각각의 올리고뉴클레오티드 (서열 1 및 서열 2)로 구축을 수행하였다. 클로람페니콜 카세트는 제거하지 않았다.
PCR 단편 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm을 먼저 전기천공법에 의해 균주 MG1655 (pKD46)로 도입하여, 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm을 얻었으며, 이를 서열분석에 의해 확인하였다.
제2 단계에서, 감쇠 icd 구축을 형질도입에 의해 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta로 도입하여 (프로토콜 3 참조), 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta를 얻었다.
그 후, 플라스미드 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 (실시예 1)을 균주로 도입하여, MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01), 즉 AG0662를 발생시켰다.
실시예 3
발효에 의한 글리콜산 생산을 개선시키기 위한 균주의 구축: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
표 1에 표시된 올리고 N°3 및 N°4로 수행된 PCR 생성물과의 재조합에 의해 균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pKD46)에서 유전자 ldhA를 비활성화시켰다 (프로토콜 1 참조). 생성된 균주는 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA::Km이었으며, 여기에 플라스미드 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 (실시예 1)을 마지막 단계에서 도입하였다. 최종 균주는 AG0708이라고 지칭하였다.
실시예 4
발효에 의한 글리콜산 생산을 개선시키기 위한 균주의 구축: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
프로토콜 3에 기재된 파지 P1에 의한 형질도입 기술에 의해 균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta에서 유전자 mgsA를 비활성화시켰다. 균주 MG1655 (pKD46)로의 PCR 단편의 도입에 의해 공여자 균주 MG1655 ΔmgsA::Km을 제작하였다. 구축을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드는 표 1에 제공된다. 서열분석에 의해 균주를 확인하였다.
그 후, 플라스미드 pAG025를 균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA::Km에 도입하여, AG0819라고 지칭되는 최종 균주: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA::Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)에 이르게 하였다.
실시예 5
발효에 의한 글리콜산 생산을 개선시키기 위한 균주의 구축: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔarcA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
프로토콜 3에 기재된 파지 P1에 의한 형질도입 기술에 의해 균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta에서 유전자 arcA를 비활성화시켰다. 균주 MG1655 (pKD46)로의 PCR 단편의 도입에 의해 공여자 균주 MG1655 ΔarcA::Km을 제작하였다. 구축을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드는 표 1에 제공된다. 서열분석에 의해 균주를 확인하였다.
그 후, 플라스미드 pAG025를 균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔarcA::Km에 도입하여, AG0956이라고 지칭되는 최종 균주: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔarcA::Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)에 이르게 하였다.
실시예 6
발효에 의한 글리콜산 생산을 개선시키기 위한 균주의 구축: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
제1 단계에서, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta로의 파지 형질도입 (프로토콜 3)에 의해 결실 ΔmgsA::Cm을 수행하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA::Cm을 얻었다. 균주 MG1655 (pKD46)로의 PCR 단편의 도입에 의해 공여자 균주 MG1655 ΔmgsA::Cm을 구축하였다. 구축을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드는 표 1에 제공된다. 서열분석에 의해 균주를 확인하였다.
제2 단계에서, 공여자 균주 MG1655 ΔldhA ::Km (실시예 3에 기재됨)으로부터 형질도입에 의해 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ::Cm로 결실 ΔldhA::Km을 수행하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ::Cm ΔldhA ::Km을 얻었다. 프로토콜 2에 기재된 기술에 따라 클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 표 2에 표시된 올리고에 의해 PCR에 의해 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA를 확인하였다.
제3 단계에서, 실시예 2에 기재된 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm으로부터 형질도입에 의해 구축 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm을 도입하였다. 생성된 균주는 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA였다.
최종적으로, 플라스미드 pAG25 (실시예 1)를 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA로 도입하여, 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01), 즉 AG0873을 얻었다.
실시예 7
발효에 의한 글리콜산 생산을 개선시키기 위한 균주의 구축: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsA ΔarcA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
결실 ΔarcA::Km을 형질도입에 의해 실시예 6에 기재된 균주, MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA로 도입하여, 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔarcA ::Km을 얻었다. 형질도입 실험에서 사용된 공여자 균주 MG1655 ΔarcA ::Km은 실시예 5에 기재되어 있다.
그 후, 플라스미드 pAG25를 균주로 도입하여, 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔarcA ::Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01), 즉 AG1099를 얻었다.
실시예 8
글리콜레이트를 내수송할 수 없는 균주의 구축: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔglcA ΔlldP ΔyjcG (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
제1 단계에서, 구축 ΔyjcG::Nm (Cre/Lox)을 PCR 생성물에 의해 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pKD46)로 도입하여 (프로토콜 4 참조), 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG::Nm을 얻었다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타낸다. 서열분석에 의해 생성된 균주를 확인하였다.
프로토콜 5에 기재된 기술에 따라 네오마이신 내성 카세트를 제거하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG를 얻었다.
제2 단계에서, 구축 ΔglcA::Nm을 PCR 생성물에 의해 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG (pKD46)로 도입하여 (프로토콜 4 참조), 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA ::Nm을 얻었다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타낸다. 서열분석에 의해 생성된 균주를 확인하였다.
프로토콜 5에 기재된 기술에 따라 네오마이신 내성 카세트를 제거하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA를 얻었다.
제3 단계에서, 결실 ΔlldP::Km을 형질도입에 의해 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA로 도입하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA ΔlldP ::Km을 얻었다. MG1655 (pKD46)로 도입된 PCR 단편의 재조합에 의해 형질도입 실험에서 사용된 공여자 균주 MG1655 ΔlldP::Km을 제작하였다. 올리고뉴클레오티드는 표 1에 제공된다. 서열분석에 의해 균주 MG1655 ΔlldP::Km을 확인하였다.
다음 단계는 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA ΔlldP ::Km을 얻기 위해, 감쇠 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm을 형질도입에 의해 실시예 2에 기재된 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm으로부터 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA ΔlldP ::Km으로 형질도입하는 것이었다.
마지막 단계는 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔyjcG ΔglcA ΔlldP ::Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01), 즉 AG1056을 얻기 위한 플라스미드 pAG25 (실시예 1)의 도입이었다.
실시예 9
글리콜레이트를 내수송할 수 없고 발효에 의한 글리콜산 생산을 개선시키기 위한 균주의 구축: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔldhA ΔmgsA ΔglcA ΔlldP ΔyjcG (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
제1 단계에서, 구축 ΔyjcG::Nm을 PCR 생성물 (프로토콜 4)에 의해 실시예 6에 기재된 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA (pKD46)로 도입하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ::Nm을 얻었다.
프로토콜 5에 따라 내성 카세트를 제거하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG를 얻었다.
제2 단계에서, 결실 ΔglcA::Nm (Cre/Lox)을 PCR 생성물에 의해 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG (pKD46)로 도입하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA ::Nm을 얻었다.
프로토콜 5에 따라 내성 카세트를 제거하여, 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA를 얻었다.
제3 단계는 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA ΔlldP ::Km를 얻기 위해, 형질도입에 의해 ΔlldP::Km을 실시예 8에 기재된 균주 MG1655 ΔlldP ::Km으로부터 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA로 도입하는 것이었다.
그 후, 단편 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm을 균주 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA ΔlldP ::Km으로 형질도입하여, 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA ΔlldP ::Km을 얻었다. 실시예 2에 기재된 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm은 형질도입 실험을 위한 공여자 균주였다.
최종적으로, 플라스미드 pAG25를 전기천공법에 의해 균주로 도입하여, AG0960이라고 지칭되는 균주를 얻었다: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔmgsA ΔldhA ΔyjcG ΔglcA ΔlldP ::Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01).
당업자는 미생물을 유전자 조작하는데 사용되는 기술을 알고 있고, 결실을 얻기 위한 상이한 방법이 있다는 것을 알고 있다.
실시예 10
에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 글리콜산 생산 균주의 발효
40 g/l MOPS 및 10 g/l 글루코스로 보충되고 pH 6.8에서 조정된 개질 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128])를 사용하여 250 ml 배플(baffled) 에를렌마이어 플라스크 배양물에서 균주의 성능을 초기에 평가하였다. 스펙티노마이신을 필요하다면 50 mg/l의 농도로 첨가하였다. 72시간 예비배양을 사용하여, 50 ml 배양물을 약 0.3의 OD600 nm로 접종하였다. 배양 배지 중 글루코스가 소모될 때까지 배양물을 30℃ 및 200 rpm에서 진탕기 상에서 유지시켰다. 배양 끝에, 분리용 바이오라드(Biorad) HPX 97H 컬럼 및 검출용 굴절계를 사용하여 HPLC에 의해 글루코스 및 글리콜산을 분석하였다.
상이한 균주의 성능의 비교는 하기 표 3에 제공된다. 실시예 2에 기재된 균주를 기준으로서 간주할 수 있었다. 각각의 값은 n 반복의 평균이다 (n=1 내지 n=6).
실시예 11
유가식 발효기에서의 글리콜산 생산 균주의 발효
유가식 프로토콜을 사용하여 600 ml 발효기에서 생산 조건 하에 상기 실시예에 기재된 균주를 평가하였다.
3일 동안 30℃에서 40 g/l의 MOPS, 10 g/l의 글루코스 (플라스크 배양물을 위해 사용된 것과 동일한 배지) 및 10%의 LB 배지로 보충된 50 ml의 합성 배지로 충전된 500 ml 에를렌마이어 플라스크에서 독특한 예비배양을 수행하였다. 발효기 접종을 위해 이러한 예비배양을 사용하였다.
20 g/l의 글루코스, 50 mg/l의 스펙티노마이신으로 보충된 200 ml의 합성 배지로 충전된 발효기를 약 2의 초기 광학 밀도로 접종하였다. 30% 포화 초과의 용해된 산소를 유지하도록 조정된 환기 및 진탕으로 37℃에서 배양을 수행하였다. 염기를 첨가하여 pH를 6.8에서 조정하였다. 글루코스 소모까지 배치식으로 배양을 수행하였다. 그때, 배지 중 20 g/l의 글루코스의 농도를 회복하기 위해 황산마그네슘, 올리고-요소 및 스펙티노마이신으로 보충된 700 g/l 글루코스 용액을 첨가하였다 (글루코스 펄스). 다섯번째 공급 펄스 후, 배양 끝까지 pH를 7.4에서 조정하였다.
통상적으로, 실시예 5에 기재된 균주가 실시예 2에 기재된 기준 균주보다 발효기에서 더 양호한 생산 성능을 제공하였다.
실시예 5의 균주 (AG0956)를 사용한 글리콜산 생산을 위한 발효의 대표적인 시간-경과는 하기 제공된다.
얻은 최종 역가는 52.2 g/l 글리콜산이었으며, 글루코스 수율은 0.38 g/g이고, 생산성은 1.33 g/l/h였다.
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ggacgcaaac gcatatgcaa cgtggtggca gacgagcaaa ccagtagcgc tcgaaggaga 60
ggtgatcaca ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcc atatgaatat cctccttag 119
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gccgttttgc agggtgatct tcttgccttg tgccggaaca actactttac tttccaaagc 60
tgtttccttc ttaccacaca gtatacgagc cggatgatta atcgccaaca gctctgtagg 120
ctggagctgc ttcg 134
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gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga 60
gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcttcg 100
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ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt 60
agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g 101
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gcaggctttt tcggtcttta tcttgcagcg ataagtgctt acagtaatct gtaggaaagt 60
taactacgga tgattccggg gatccgtcga cctgcagttc 100
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tacttcagac ggtccgcgag tgtaggctgg agctgcttcg 100
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ggcgtttgcc acctgtgcaa tattacttca gacggtccgc gagataacgc tgataatcgg 60
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ccagatcacc gcagaagcga taaccttcac cgtgaatggt ggcgatgatt tccggcgtat 60
ccggcgtaga ttcgaaatgc atatgaatat cctccttag 99
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ggttacctgg acccaaatgt atatgccgat gggaggactg gggctatccg ctctggtcgc 60
cctgatcccg ataatattca attaaccctc actaaaggg 99
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cgagactaac atcccggtaa acacatacgc ctgcagcagg gtgataatgc cgataacgct 60
ggcaaaaatc agactgtgct aatacgactc actataggg 99
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gacctgcaat gaatctctgg caacaaaact acgatcccgc cgggaatatc tggctttcca 60
gtctgatagc atcgcttccc catatgaata tcctccttag 100
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cataagcctg aagcgtggtg atcacgccca ctatacaggt gaagatcagg ctgtgtttga 60
cagtaaagcg gaacaaatct gtaggctgga gctgcttcg 99
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gttctgacgg cgcttgccgc cacactccct ttcgcagcta acgccgcgga tgctattagc 60
ggggccgtag agcgccagcc aattaaccct cactaaaggg 100
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gcgcgcggcc ttgctcaacg ccaaagccgg tctgggagcg gataaactgc gcgcggaaca 60
gttcacgctc acgcgcgcct aatacgactc actataggg 99
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cccaagcttc atattgttat caacaagtta tc 32
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tcccccgggg cttagaactg cgattcttc 29
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ccaggagatt ttacgctcgc c 21
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gcggtattga aaggttggtg c 21
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cgttaatcag gcaaagaggg 20
Claims (20)
- 글루코스, 프룩토스, 만노스, 및 크실로스의 군으로부터 선택된 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 글리콜산 생산을 위해 유전자 변형된 미생물을 배양하고, 상기 배양 배지로부터 글리콜산을 회수하는 것에 의하며,
상기 변형된 미생물은 유전자 ldhA 및 mgsA의 감쇠를 추가로 포함하는 그람 음성 박테리아인,
글리콜산, 그의 유도체 또는 전구체를 발효적으로 생산하는 방법. - 제1항에 있어서, 제1항에 정의된 상기 미생물이 유전자 arcA의 감쇠를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 제1항에 정의된 상기 미생물이 유전자 glcA, lldP 및 yjcG 중 적어도 하나의 감쇠를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 글리콜산 생산을 위해 초기에 변형된 미생물이 하기 변형:
- aceB, glcB, gcl, 및 eda의 감쇠에 의한 글리옥실레이트의 글리콜레이트 이외의 생성물로의 전환의 감쇠
- glcDEFG 및 aldA의 감쇠에 의한 글리콜레이트 대사의 무능력
- icd, aceK, pta, ackA, poxB, iclR 또는 fadR의 감쇠, 또는 aceA의 과다발현, 또는 이들 둘 다
- ycdW의 과다발현에 의한 글리옥실레이트의 글리콜레이트로의 전환의 증가
- pgi, udhA, 및 edd의 감쇠에 의한 NADPH의 이용가능성의 증가
중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법. - 제4항에 있어서, 글리콜산 생산을 위해 초기에 변형된 상기 미생물이 유전자 aceK의 감쇠를 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 3개의 유전자 glcA, lldP 및 yjcG가 감쇠된 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 글리콜레이트 생산을 위해 초기에 변형된 것인 변형된 미생물을 발효시키는 단계,
b) 박테리아 중 또는 배지 중 글리콜레이트를 농축시키는 단계, 및
c) 발효 브로쓰 또는 바이오매스로부터 글리콜산을 단리하는 단계
를 포함하는, 글리콜레이트를 발효적으로 생산하는 방법. - 제7항에 있어서, 글리콜레이트가 적어도 글리콜레이트 이량체로의 중합 단계를 통해 단리되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 글리콜레이트가 글리콜레이트 이량체, 올리고머 및 중합체중 하나 이상으로부터 해중합에 의해 회수되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 변형된 미생물.
- 제10항에 있어서, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물.
- 제11항에 있어서, 에스케리치아(Escherichia) 속에 속하는 미생물.
- 제1항에 정의된 바와 같은 변형된 미생물.
- 제2항에 정의된 바와 같은 변형된 미생물.
- 제3항에 정의된 바와 같은 변형된 미생물.
- 제6항에 정의된 바와 같은 변형된 미생물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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