BRPI1012693B1 - método para produzir grande quantidade de ácido glicólico por fermentação - Google Patents

Abstract

método para produzir grande quantidade de ácido glicólico por fermentação a presente invenção refere-se a um método melhorado para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável ao ácido glicólico por um microrganismo recombinante tendo novas modificações genéticas, como deltaldha, deltamgsa, deltaarca, and deltalldp, deltaglca, deltayjcge, ou uma combinação deles, permitindo uma produção com maior rendimento, título e produtividade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: MÉTODO PARA PRODUZIR GRANDE QUANTIDADE DE ÁCIDO GLICÓLICO POR FERMENTAÇÃO.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método melhorado para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável ao ácido glicólico por um microrganismo recombinante tendo novas modificações genéticas, como AldhA, AmgsA, AarcA, e AlldP, AglcA, AyjcG e uma combinação delas, permitindo uma produção com maior rendimento, titulo e produtividade. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Ácido glicólico (HOCH₂COOH) é o membro mais simples da família de alfa-hidroxiácidos dos ácidos carboxílicos. O ácido glicólico tem dupla funcionalidade, tanto com grupos funcionais álcool quanto com grupos funcionais ácidos moderadamente fortes em uma molécula muito pequena. Isso resulta em atributos químicos únicos, bem como em uma química de ácido e de álcool emblemática.

O ácido glicólico usa tanto os grupos hidroxila quanto os de ácido carboxílico para formar complexos de anéis de cinco membros (quelatos) com metais polivalentes. Esta capacidade de complexação a ions metálicos é útil na dissolução de crostas de água dura e prevenção de deposição, especialmente em aplicações de limpeza ácida, onde uma boa capacidade de rinsagem é um fator chave. Suas propriedades o tornam ideal para um amplo espectro de aplicações de consumo e industriais, incluindo o uso na regeneração de água de poço, na indústria do couro, na indústria de petróleo e gás, na indústria de lavanderia e têxtil, e como um componente em produtos de cuidados pessoais. O ácido glicólico passa por reações com álcoois orgânicos e ácidos para formar ésteres. Ésteres alquilglicólicos de baixo peso molecular possuem propriedades incomuns como solventes e podem ser usados como um substituto para n- e isopropanol, etilenodiamina, fenol, m-cresol, acetato de 2-etoxietila e lactato de etila e de metila. Ésteres alquilicos de maior peso molecular podem ser utilizados em formulações de produtos de cuidados pessoais.

O ácido glicólico também pode ser usado para produzir uma variedade de materiais poliméricos, incluindo resinas termoplásticas compreendendo ácido poliglicólico. As resinas compreendendo ácido poliglicólico têm excelentes propriedades como barreira de gás, e tais resinas termoplásticas compreendendo ácido poliglicólico podem ser usadas para produzir materiais de embalagem com as mesmas propriedades (por exemplo, recipientes de bebidas, etc.). Os polímeros de poliéster se hidrolisam gradualmente em meios aquosos sob taxas controladas. Esta propriedade os torna úteis em aplicações biomédicas, tais como suturás absorviveis e em aplicações onde uma liberação controlada de ácido é necessária para reduzir o pH. Atualmente, mais de 15000 toneladas de ácido glicólico são consumidas anualmente nos Estados Unidos.

A produção biológica de ácido glicólico a partir de um substrato de carbono de baixo custo, como a glicose ou outros açúcares, apresentada na figura 1, é divulgada no WO 2007/140816 e no WO 2007/141316, respectivamente, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. O microrganismo descrito nestes pedidos é geneticamente modificado em diferentes níveis:

- para melhorar o fluxo na via do glioxilato,

- para aumentar a conversão de glioxilato em glicolato; e para reduzir o metabolismo de glicolato e seu intermediário, o glioxilato.

As modificações têm um impacto direto sobre as reações terminais da via de síntese do glicolato ou nos intermediários mais próximos do glicolato. Todos eles têm o mesmo objetivo, direcionar o fluxo de carbono na produção de ácido glicólico e evitar o catabolismo do mesmo.

A produção biológica de ácido glicólico requer a formação de glioxilato como um intermediário, que é reduzido a glicolato por uma oxidorredutase dependente de NADPH codificada pelo gene ycdW (Nunez e col. , (2001) Biochemistry, 354, 707-715). O glioxilato é um intermediário do ciclo do glioxilato, um desvio do ciclo TCA (Ciclo do ácido tricarboxílico e< desvio de glioxilato, revisado em Neidhardt, F. C. (editor-chefe), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin,. K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter e Η. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology). Antes de entrar no ciclo TCA, o fluxo de carbono passa pela glicólise, onde diversas reações ocorrem e podem ser otimizadas para melhorar a produção do composto desejado.

A glicólise é uma sequência de dez reações envolvendo dez compostos intermediários, que converte glicose em piruvato. Os intermediários oferecem pontos de entrada para a glicólise e também podem ser direta ou indiretamente úteis. Por exemplo, o intermediário diidroxiacetona fosfato (DHAP) é uma fonte de lactato através da proteína MgsA. O mesmo ocorre para a molécula de piruvato, convertida em lactato pela lactato desidrogenase, LdhA. Ambas as enzimas consomem moléculas da via glicolítica, destinando uma parte do fluxo de carbono para a produção de lactato, um subproduto indesejado nesse caso. O gene IdhA é atenuado em processos para a produção de succinato, como em uma cepa de bactérias do rúmen (W02008/0134051A1) ou em E. coll, para a produção de succinato com um alto rendimento. Ao contrário, IdhA é superexpresso em processos destinados à sintese de lactato (US2007/116852A1). O mesmo é encontrado para mgsA, que é suprimido, entre outras modificações genéticas, para a produção de 1,3-propanodiol (W02004/033646A2), porém superexpresso para a sintese do 1,2-propanodiol (WO2008/116852A1). Pela atenuação de ambas as atividades, a produção de ácido glicólico deve ser melhorada e, ao mesmo tempo, a sintese de lactato deve ser reduzida.

Da mesma forma, toda	modificação genética	que aumenta
os fluxos	glicolítico	e	de TCA,	captação de	glicose	ou
atividade	catalítica	de	enzimas	glicolíticas	e de	TCA

podería melhorar a produção de glicolato. A atenuação da atividade ArcA é uma de tais mutações. Na verdade, a proteína foi mostrada como estando envolvida na repressão de genes que codificam as enzimas mencionadas acima.

entendimento da regulação global pelo sistema Arc começou com o artigo de luchi e Lin em 1988 (luchi e Lin, 1988, PNAS, 85: 1888-1892) que descreve a identificação do gene arcA e o efeito de sua mutação no metabolismo aeróbico em E.coli. O sistema de transdução de sinal de dois componentes ArcAB (controle de respiração aeróbica) modula, no nivel transcricional, a expressão de entre 100 e 150 operons envolvidos no metabolismo energético, transporte, sobrevivência, catabolismo e no estado redox da célula (Liu e DeWulf 2004, J Biol Chem, 279:12588-12597; Lynch e Lin,

1996 Responses to molecular oxygen; em Neidhardt FC,

Curtiss III RJ, Ingraham L, Lin ECC, Low KB, Magasanik BW,

Zeznikoff S, Riley M, Schaechter M, Umbarger HE (eds)

Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular

Biology, ed 2. Washington, American Society for

Microbiology, 1996, vol 1, pp 1526-1538). A principal função do par de transdução de sinal ArcAB é regular a transição da via aeróbica para a anaeróbica em E.coli. Uma compreensão adicional da correlação entre o nivel de 15 aerobiose e o controle exercido pela regulação global foi obtido a partir do trabalho de Shalel-Levanon e colaboradores (Biotechnol. Bioeng. 2005a; 89: 556-564 e

Biotechnol. Bioeng. 2005b; 92: 147-159). Esses estudos mostraram a repressão dos genes TCA pelo ArcA. Estes 20 resultados foram confirmados por estudos fisiológicos completos no efeito de ArcA no catabolismo da glicose em E. coli sob diferentes condições de disponibilidade de oxigênio. Várias alterações foram observadas em um mutante harcA e sob microaerobiose, tais como respiração aumentada, uma distribuição do fluxo de elétrons alterada ao longo das oxidases o·^ e d-terminal do citocromo e uma modificação no estado redox intracelular (Aleexeva e col., 2003., J. Bacteriol. 185:204-209). O trabalho de Perrenoud e Sauer, em 2005, forneceu novas compreensões sobre a regulação de ArcAB, demonstrando que o controle dos fluxos de ciclo TCA aeróbicos e totalmente anaeróbicos foi exercido por ArcA independentemente da sua quinase sensor cognato, ArcB (J. Bacteriol 2005, 187:3171-3179).

Todos estes fazem de ArcA um regulador global em .E.coli. Sua deleção é descrita em diversas patentes reivindicando a produção em aerobiose ou anaerobiose de uma molécula desejada. Por exemplo, AarcA melhora a produção de succinato e 1,2—propanodiol tanto em aerobiose como em anaerobiose (US 2006/0073577A1; W02006/020663 e WO2008/116848). Uma diminuição da atividade ArcA, entre outras modificações genéticas, também foi divulgada em patentes para a produção de L-aminoácidos, como L-lisina e ácido L-glutâmico pela Ajinomoto (EP 1 382686A1) e para a produção de 1,3-propanodiol (W02004/033646) pela DuPont de Nemours e Co.

Três proteínas denominadas GlcA, LldP e YjcG foram caracterizadas na literatura como importadoras de glicolato e lactato (Nunez, F. e col., 2001 Microbiology, 147, 1069

1077;. Nunez, F. e col., 2002 Biochem. And Biophysical research communications 290, 824-829; Gimenez, R. e col., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455). De acordo com as publicações mencionadas acima, GlcA parece ser mais especifico com glicolato e LldP tem mais afinidade com a molécula de lactato. Uma cepa em que as três glicolato permeases são deletadas é totalmente incapaz de importar o glicolato exógeno (Gimenez, R. e col., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455). A atenuação da importação de glicolato da cepa produtora de glicolato poderia melhorar a capacidade da célula de resistir a altas concentrações de glicolato e, assim, melhorar o titulo de produção.

problema a ser resolvido pela presente invenção é a melhoria da produção biológica, de ácido glicólico a partir de um substrato de carbono de baixo custo, como a glicose ou outros açúcares. Modificações genéticas adicionais e, em particular, uma combinação delas são aqui descritas para obter melhor rendimento e titulo de produção de ácido glicólico por fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um método melhorado para a bioconversão com um alto rendimento e titulo de uma fonte de carbono fermentável diretamente em ácido glicólico.

Em um aspecto da presente invenção, um microrganismo recombinante previamente modificado para produzir ácido glicólico compreende ainda várias modificações, tais como: atenuação dos genes que codificam a lactato desidrogenase (IdhA) e/ou metilglioxal sintase (mgsA), atenuação do regulador de controle respiratório aeróbico (arcA),

- atenuação de pelo menos um dos genes glcA, lldP e yjcG, que codificam as proteinas importadoras de glicolato.

De acordo com a invenção, o microrganismo utilizado no método foi geneticamente modificado previamente para produzir ácido glicólico. Diversas modificações foram previamente introduzidas no dito microrganismo, e em particular modificações permitindo as seguintes alterações metabólicas:

i) o microrganismo não poder metabolizar glioxilato a outros compostos além de glicolato, através da inativação de genes que codificam as malato sintases (aceB e glcB) , a glioxilato carboligase (gel) e a 2-ceto-3-desoxigliconato 6-fosfato aldolase (eda) , ii) o microrganismo não poder metabolizar glicolato, através da atenuação dos genes glcDEFG e aldA, iii) o fluxo da via do glioxilato ser aumentado pela atenuação de icd, acek, pta, ackA, poxB, iclR ou fadR e/ou por superexpressão de aceÃ, iv) a conversão de glioxilato em glicolato ser aumentada pelo uso de genes de codificação endógena como ycdW,

v) a disponibilidade de NADPH ser aumentada pela atenuação dos genes pgi, udhA e edd.

Em outra modalidade, a invenção também fornece um processo para a produção de ácido glicólico a partir de um microrganismo recombinante compreendendo:

(a) contato do microrganismo recombinante da presente invenção com pelo menos uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo de monossacarideos, oligossacarideos, polissacarideos e substratos de carbono simples por meio do que o glicolato é produzido; opcionalmente (b) recuperação do ácido glicólico produzido através de uma etapa de polimerização a pelo menos dimeros de ácido glicólico e (c) recuperação do ácido glicólico por depolimerização a partir dos dimeros, oligômeros e/ou polímeros de ácido glicólico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos em anexo, que são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, exemplificam a invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios desta invenção.

A Figura 1 descreve a engenharia genética da glicólise, do ciclo TCA e da via do glioxilato no desenvolvimento do sistema de produção de ácido glicólico a partir de carboidratos.

A Figura 2 é um diagrama mostrando a construção do vetor pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01, chamado de pAG25.

A Figura 3 é uma ampliação nas vias do lactato e acetato. Alguns dos genes envolvidos nessas vias são modificados na invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Salvo indicação em contrário neste documento, todos os termos técnicos e termos científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que comumente compreendidos por uma pessoa versada na técnica para a qual esta invenção pertence.

Na presente invenção, os termos microrganismo e bactéria são usados indistintamente e se referem a bactérias gram-negativas. Em uma modalidade preferida da invenção, os microrganismos pertencem à família das Enterobacteriaceae. A família Enteriobacteriaceae compreende, em particular, mas não exclusivamente, os gêneros Escherichia, Klebsiella, Salmonella e Pantoea.

O termo cepa mutante se refere a uma cepa do tipo não-selvagem.

Como usado no presente documento, o termo recombinante ou geneticamente modificado ou microrganismo modificado se referem a uma célula hospedeira que tem uma modificação de seu genoma, por exemplo, como através da adição de ácido nucléico que não ocorre naturalmente no organismo ou por uma modificação de ácido nucléico que ocorre naturalmente na célula hospedeira. O termo transformação ou transfecção se refere à aquisição de novos genes em uma célula após a incorporação do ácido nucléico exógeno. O termo transformante se refere ao produto de uma transformação.

O termo modificação ou modificando o nível de uma proteína ou atividade enzimática produzida por uma célula hospedeira se refere ao controle dos níveis de proteína ou atividade enzimática produzidos durante a cultura, de modo que os níveis sejam aumentados ou diminuídos conforme tgesgjaclQ, o termo modificado, quando se refere ao ácido nucléico ou um polinucleotídeo, significa que o ácido nucléico foi alterado de alguma maneira em relação a um ácido nucléico tipo selvagem, como por mutação em.

substituição, inserção, deleção de uma parte ou de todo o ácido nucléico; ou por ser operativamente ligado a uma região de controle transcricional. Exemplos de mutações incluem, mas não estão limitados, às mutações pontuais, mutações por mudança de quadro e deleções de parte ou todos os genes mencionados.

Por um gene se entende um segmento de DNA envolvido na codificação de regiões regulatórias de RNA, de transferência de RNA, promotoras de RNA ribossomal operativamente ligadas à expressão de um peptideo, polipeptideo ou proteína, incluindo a região codificante, a região não codificante precedente (líder) e seguinte (tailer) à região codificante, bem como sequências não codificantes de intervenção (introns) entre segmentos de codificação individuais (éxons). A codificação se refere à representação de aminoácidos, sinalização de início e parada em um código de três bases triplete.

O termo operativamente ligado se refere a uma justaposição em que os elementos estão em uma disposição que permite que sejam funcionalmente relacionados. Um promotor é operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele controla a transcrição da sequência e um sítio de ligação ao ribossomo é operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele for posicionado de forma a permitir a tradução do mRNA.

O termo inativação ou atenuação se refere a uma expressão diminuída de um gene ou uma atividade diminuída da proteína, produto do gene. A pessoa versada na técnica conhece várias formas de obter este resultado, como por exemplo:

Introdução de uma mutação no gene, diminuindo o nível de expressão deste gene, ou o nível de atividade da proteína codificada.

Substituição do promotor natural do gene por um promotor de baixa resistência, resultando em uma menor expressão.

- Uso de elementos que desestabilizam o RNA mensageiro ou a proteína correspondentes.

Deleção do gene, se nenhuma expressão for necessária.

O termo expressão se refere à transcrição e tradução de um gene à proteína, produto do gene.

O termo superexpressão ou superexpresso é aqui definido para ser pelo menos 150% da atividade da proteína em comparação com uma espécie de controle adequada. A superexpressão pode ser alcançada através da mutação da proteína para produzir uma forma mais ativa ou uma forma que seja resistente à inibição, através da remoção de inibidores ou adição de ativadores, e similares. A superexpressão também pode ser alcançada através da remoção de repressores, adição de múltiplas cópias do gene à célula ou suprarregulação do gene endógeno, e assim por diante.

termo plasmideo ou vetor, como aqui utilizado, se refere a um elemento extracromossomal que muitas vezes carrega genes que não fazem parte do metabolismo central da célula, e que geralmente estão na forma de moléculas de DNA de dupla fita circulares.

Os termos substrato de carbono, fonte de carbono ou fonte de carbono fermentável significam qualquer fonte de carbono capaz de ser metabolizada por um microrganismo, 10 em que o substrato contém pelo menos um átomo de carbono.

O termo ATCC significa a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, EUA.

Os termos glioxilato e ácido glioxilico são usados intercambiavelmente.

Os termos glicolato e ácido glicólico são usados intercambiavelmente. O termo ácido glicólico, seus derivados ou precursores designa todos os compostos intermediários na via metabólica de formação e degradação 20 do ácido glicólico. Precursores de ácido glicólico são, em particular: citrato, isocitrato, glioxilato e, em geral, todos os compostos do ciclo do glioxilato (ver figura 1) .

Derivados de ácido glicólico são, em particular, ésteres de glicolato, como éster de etilglicolato, éster de metilglicolato e polímeros contendo glicolato, tal como ο ácido poliglicólico.

Na descrição da presente invenção, as enzimas são identificadas por suas atividades específicas. Esta definição inclui, assim, todos os polipeptídeos que têm a atividade específica definida também presente em outros organismos, mais particularmente em outros microrganismos. Muitas vezes as enzimas com atividades semelhantes podem ser identificadas por seus agrupamentos a certas famílias definidas como PFAM ou COG.

PFAM (banco de dados das famílias de proteínas dos alinhamentos e modelos ocultos de Markov; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequências de proteína. Cada PFAM torna possível visualizar alinhamentos múltiplos, ver domínios de proteína, avaliar a distribuição entre os organismos, ter acesso a outros bancos de dados e visualizar estruturas de proteínas conhecidas.

COGs {clusters de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos pela comparação das sequências de proteína de 43 genomas completamente seguenciados, representando 30 linhas filogenéticas principais. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhas, que permitem a identificação do domínios antigos conservados.

Os meios de identificar sequências homólogas e suas homologias percentuais são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, e incluem em especial os programas BLAST, que podem ser usados a partir do sitio da internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros predefinidos indicados neste sitio da internet. As sequências obtidas podem ser exploradas (por exemplo, alinhadas), utilizando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) ou MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgibin/multalin.pl), com os parâmetros predefinidos indicados nesses sitios da internet.

Usando	as	referências dadas	no	GenBank	para genes
conhecidos,	as	pessoas versadas na	técnica são	capazes de
determinar	os	genes equivalentes	em	outros	organismos,

cepas de bactérias, leveduras, fungos, mamíferos, plantas, etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito pela utilização de sequências de consenso que podem ser determinadas através da realização de alinhamentos de sequência com genes derivados de outros microrganismos, e projetando sondas degeneradas para clonar o gene correspondente em outro organismo. Estes métodos de rotina da biologia molecular são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e são descritos, por exemplo, em Sambrook e col. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2^a ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nova Iorque .) .

Genes identificados no presente pedido com referência à E. coli podem ser encontrados em todas as bactérias gram negativas.

A presente invenção fornece um método melhorado para a bioconversão de uma fonte de carbono fermentável diretamente ao ácido glicólico usando uma única bactéria gram negativa recombinante, previamente modificada para a produção de ácido glicolico e ainda geneticamente

modificada para	incluir	pelo	menos	uma das seguintes
modificações:
- atenuação	dos genes	IdhA	e mgsA
- atenuação	do gene arcA
- atenuação	de pelo	menos	um dos	genes glcÃ, lldP e

yjcG para atenuar a importação de membrana do glicolato, e suas combinações.

Todas as combinações destas modificações são possíveis e, em particular:

- a atenuação dos genes IdhA e mgsA E a atenuação do gene arcA;

- a atenuação dos genes IdhA e mgsA E a atenuação da importação de membrana de glicolato;

- a atenuação do gene arcA E a atenuação da importação de membrana de glicolato;

- a atenuação dos genes IdhA e mgsA E a atenuação do gene arcA E a atenuação da importação de membrana de glicolato.

Os genes são abreviados da seguinte forma: lactato desidrogenase {IdhA) , metilglioxal redutase {mgsA), regulador de controle da respiração aeróbica A (arcA), Llactato permease (lldP) , glicolato permease (glcA) e importador de acetato (yjcG).

A principal vantagem dessas modificações adicionais é a melhoria da produção de ácido glicólico pelo microrganismo modificado. Na verdade, todas estas modificações levam a uma melhoria do rendimento da produção entre 2% e 36% (de 0,39 g/g a 0,52 g/g em comparação com 0,38g/g), assim como/ou uma melhoria do titulo de glicolato entre 9% e 28% (de 4,36 g/1 a 5,14 g/1 em comparação com 4,0 g/1).

Um microrganismo já modificado para produzir ácido glicólico por fermentação é descrito nos pedidos de patente WO 2007/140816 e WO 2007/141316.

Em uma modalidade da invenção, o microrganismo previamente modificado para a produção de ácido glicólico compreende pelo menos uma das seguintes modificações genéticas:

- Uma baixa capacidade de conversão de glioxilato, exceto para produzir glicolato, devido à atenuação dos genes que codificam as enzimas que consomem glioxilato, um precursor chave do glicolato: genes aceB e gclB, que codificam as malato sintases, gel, que codifica a glioxilato carboligase e eda, que codifica a 2-ceto-3desoxigliconato 6-fosfato aldolase.

- Modificações de tal forma que o microrganismo seja incapaz de metabolizar substancialmente o glicolato. Este resultado pode ser alcançado através da atenuação de pelo menos um dos genes que codificam as enzimas consumidoras de glicolato (glcDEFG, que codifica a glicolato oxidase e aldA, que codifica a glicoaldeido desidrogenase). A atenuação dos genes pode ser feita através da substituição do promotor natural por um promotor de baixa resistência ou pelo elemento desestabilizador do RNA mensageiro ou da proteína correspondentes. Se necessário, a atenuação completa do gene também pode ser alcançada por uma eliminação da sequência de DNA correspondente.

Um aumento do fluxo da via do glioxilato por diversos meios, e particularmente:

i) diminuindo a

atividade da enzima isocitrato desidrogenase (ICDH), li) diminuindo a atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas:

® fosfotransacetilase, codificada pelo gene pta • acetato quinase, codificada pelo gene ackA • piruvato oxidase, codificada pelo gene poxB pela atenuação dos genes, iii) aumentando a atividade da enzima isocitrato liase, codificada pelo gene aceA, iv) diminuindo a atividade da enzima isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase AceK.

A diminuição do nivel de isocitrato desidrogenase pode ser realizada através da introdução de promotores artificiais que direcionam a expressão do gene ícd, que codifica a isocitrato desidrogenase, ou através da introdução de mutações no gene icd que reduzem a atividade enzimática da proteína.

Uma vez que a atividade da proteína ICDH é reduzida por fosforilação, ela também pode ser controlada através da introdução de genes aceK mutantes, que possuem atividade quinase aumentada ou atividade fosfatase reduzida, em comparação com a enzima AceK tipo selvagem.

aumento da atividade da isocitrato liase pode ser realizado tanto pela atenuação do nível dos genes iclR ou fadR, que codificam repressores da via do glioxilato, quanto pela estimulação da expressão do gene aceA, por exemplo, através da introdução de promotores artificiais

que direcionam a expressão do	gene,	ou	através	da
introdução de mutações no gene	aceA,	que	aumentam	a
atividade da proteína codificada.
- Uma atividade aumentada na	catálise	da	conversão	de

glioxilato em glicolato através da expressão de pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo que catalisa a reação. Em particular, um gene que codifica uma enzima glioxilato redutase dependente de NADPH está presente para converter, em condições aeróbias, o intermediário glioxilato tóxico no produto final de baixa toxicidade glicolato. O gene pode ser exógeno ou endógeno e pode ser expresso cromossomicamente ou extracromossomicamente. Um gene que codifica a glioxilato redutase dependente de NADPH pode ser tomado entre os genes ycdW ou yiaE do genoma de E. coli MG1655. Em uma modalidade preferida, a expressão de pelo menos um dos ditos genes é aumentada. Se for necessário, um alto nível de atividade de glioxilato redutase dependente de NADPH pode ser obtido a partir dos genes cromossomicamente localizados, usando uma ou várias cópias no genoma, que podem ser introduzidas por meio de métodos de recombinação conhecidos pelo especialista na área. Para genes extracromossômicos, diferentes tipos de plasmideos que diferem em relação a sua origem de replicação e, portanto, os seus números de cópia na célula, podem ser usados. Eles podem estar presentes como de 1 a 5 cópias, cerca de 20 ou até 500 cópias, correspondendo aos plasmideos de baixo número de cópias com replicação firme (pSClOl, RK2), plasmideos de baixo número de cópias (pACYC, pRSFlOlO) ou plasmideos de elevado número de cópias (PSK bluescript II ) . Os genes ycdW ou yiaE podem ser expressos utilizando promotores com diferentes forças, que precisam ou não ser induzidos por moléculas indutoras. Exemplos são os promotores Ptrc, Ptac, Plac, o promotor lambda cl ou outros promotores conhecidos pela pessoa versada na técnica. A expressão dos genes também pode ser impulsionada por elementos estabilizadores do RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou da proteína (por exemplo, etiquetas GST, Amersham Biosciences).

Aumento na disponibilidade de NADPH para a glioxilato redutase dependente de NADPH. Esta modificação das características do microrganismo pode ser obtida através da atenuação de pelo menos um dos genes selecionados dentre os seguintes: pgi_f que codifica a glicose-6-fosfato isomerase, udhA, que codifica a transidrogenase solúvel e edd, que codifica a atividade da 6-fosfogliconato desidratase. Com tais modificações genéticas, todas as glicose-6-fosfatos terão que entrar na glicólise pela via das pentoses fosfato e 2 NADPH serão produzidos por glicose-6-fosfato metabolizada.

Em outra modalidade da invenção, o microrganismo previamente modificado para a produção de ácido glicólico compreende, em particular, uma atenuação do gene aceK. A enzima do circuito secundário de glioxilato ICL está em competição direta com a enzima isocitrato desidrogenase (ICDH) do ciclo de Krebs por seus substratos em comum e, embora ICDH tenha uma afinidade muito maior para o isocitrato, o fluxo de carbono através de ICL é garantido em virtude do alto nivel intracelular de isocitrato e a fosforilação/inativação reversível de uma grande fração de ICDH. A inativação reversível se deve à fosforilação reversível catalisada pela ICDH quinase/fosfatase, chamada AceK, que abriga ambas as atividades catalíticas no mesmo polipeptídeo (Laporte DC1989, Biochimie Set-Out; 71(910):1051-7,- Ikeda TP, 1992, J Bacteriol. Fev; 174(4): 14146. ; Cozzone AJ, El-Mansi M. 2005, J Mol Microbiol Biotechnol. 9(3-4):132-46).

Seria vantajoso para o processo da invenção controlar totalmente a atividade de ICDH, pela remoção da célula de todas as regulações conhecidas, incluindo aceK. Uma eliminação de aceK pode levar a uma atividade aumentada de ICDH. No entanto, uma menor expressão artificial do gene icd por modificação genética de seu promotor irá permitir a construção de cepas produtoras com um nivel baixo de ICDH definido, permitindo a produção de glioxilato e, assim, de glicolato em um contexto de AaceK.

Em uma modalidade especifica da invenção, o microrganismo inicialmente modificado para a produção de ácido glicólico compreende ainda uma atenuação dos genes IdhA e mgsA. O gene IdhA codifica a lactato desidrogenase (EC 1.1.1.27) que converte piruvato, o produto final da glicólise, em ácido láctico. O gene mgsA codifica a metilglioxal sintase (EC 4.2.3.3) que converte diidroxiacetona fosfato (DHAP) em metilglioxal.

Ambas as enzimas consomem moléculas que têm um papel bioquímico importante na via metabólica da glicólise e levam à produção de lactato. A fim de economizar certa quantidade de carbono para a produção de glicolato e evitar o acúmulo de lactato como um subproduto, a eliminação de IdhA e mgsA foi feita na cepa utilizada no método da invenção. O objetivo de tais remoções é melhorar o rendimento da produção de glicolato facilitar purificação do nosso produto.

Uma modalidade adicional da invenção proporciona o método em que o microrganismo inicialmente modificado para a produção de ácido glicólico adicionalmente compreende uma atenuação do gene arcA. Como aqui utilizado, ArcA e arcA se referem a um polipeptideo e região codificadora, respectivamente.

ArcA é um polipeptideo do sistema regulatório de dois componentes ArcAB. Sistemas de transdução de sinal de dois componentes permitem que as bactérias detectem, respondam e se adaptem a uma ampla gama de condições de ambientes, estresses e crescimento. No sistema protótipo de dois componentes, um sensor de histidina quinase catalisa sua autofosforilação e posteriormente transfere o grupo fosforil a um regulador de resposta, gue pode então efetuar mudanças na fisiologia celular, muitas vezes por regulação da expressão gênica. Por exemplo, ArcB é a histidina quinase ligada à membrana e ArcA é o regulador de resposta (Georgellis e col., 1999). 0 sistema regulatório permite que a E.coli responda a uma ampla gama de concentrações de oxigênio - desde condições totalmente aeróbicas a microaeróbicas a totalmente anaeróbicas.

ArcA controla a expressão de muitos operons em E.coli e em outras bactérias gram-negativas. São incluídos no regulon de ArcA principalmente os fatores envolvidos nas vias de geração de energia celular a partir de substratos de açúcar: várias desidrogenases da classe de flavoproteína, oxidases terminais, enzimas do ciclo do ácido tricarboxilico, enzimas do desvio do glioxilato, enzimas envolvidas no metabolismo fermentative (luchi, S. , e Lin, E. C. C. (1993) Mol. Microbiol. 9, 9-15; Bauer, C. E., Eisen, S., e Bird, T. H. (1999) Annu. Rev. Microbiol. 53, 495-523). ArcA provoca a expressão diminuída de muitos daqueles operons durante o crescimento anaeróbico e durante condições aeróbicas em alta taxa de crescimento (por exemplo, crescimento exponencial) (S. luchi e col., Cell, 66, 5-7 (1991) ) . Sabe-se que a proteína ArcA controla negativamente a expressão dos genes para enzimas do ciclo do ácido tricarboxilico (TCA) . Em uma cepa arcAinterrompido, a expressão dos genes para o ciclo TCA é aumentada (http://www.genome.ad.jp/dbget- bin/get htext?Exp DB+-n+Bget-bin/get htext?Exp DB+-n+B).

A fim de melhorar a produtividade e o rendimento da síntese de glicolato, o gene arcA é eliminado na cepa utilizada no método da invenção. De fato, AarcA combinado com as modificações genéticas previamente realizadas na cepa deve aumentar o fluxo no ciclo TCA e no desvio do glioxilato para a produção de glicolato.

Além disso, foi demonstrado que ArcA está envolvido na regulação da expressão de PTS em resposta ao estado redox celular (Jeong, J-Y. e col. , 2004, Journal of Bio. Chem.) . A forma fosforilada de ArcA reprime a transcrição de ptsG do promotor PI. Mesmo se ArcA for fosforilado principalmente em condições anaeróbicas, ArcB sendo auto fosforilado na ausência de oxigênio, não podemos excluir que ArcA seria fosforilado por uma quinase de outro sistema de dois componentes (reação cruzada) em condições aeróbicas (Laub, M.T. e Goulian, M. Annu. Rev. Genet. (2007); 41:12145). Portanto, não podemos excluir uma repressão da expressão de ptsG por Arca-P em condições aeróbicas. Esta é outra razão da eliminação do gene arcA nas cepas produtoras de glicolato utilizadas no processo descrito na presente invenção.

Em outra modalidade da invenção, o microrganismo modificado inicialmente para a produção de ácido glicólico compreende ainda a atenuação da importação de membrana de glicolato. Em particular, pelo menos um dos genes glcA, lldP e yjcG, que codificam importadores de glicolato, é atenuado.

A proteína de importação de membrana (ou simplesmente importador) é uma proteína envolvida no movimento de íons, pequenas moléculas ou macromoléculas, tal como uma outra proteína através de uma membrana biológica. Proteínas de importação são proteínas integrais de membrana, isto é, que existem dentro e se espalham pela membrana, através da qual elas importam substâncias. As proteínas podem ajudar no movimento de substâncias por difusão facilitada ou importação ativa. As três proteínas mencionadas acima foram todas caracterizadas como importadoras de glicolato e lactato (Nunez, F. e col., 2001 Microbiology, 147, 10691077; Nunez, F. e col., 2002 Biochem. And Biophysical research communications 290, 824-829; Gimenez, R. e col., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455). Uma cepa modificada em cada glicolato permease não pode crescer em glicolato como fonte de carbono, demonstrando que a cepa é incapaz de importar glicolato (Gimenez, R. e col., 2003) . Ao atenuar a importação de glicolato para a célula usada para produzir ácido glicólico, o objetivo é melhorar a capacidade da cepa de resistir e acumular ácido glicólico e, assim, melhorar o título de produção.

Em uma modalidade específica da invenção, os três genes glcA, lldP e yjcG são atenuados.

Seria também vantajoso aumentar a exportação de ácido glicólico a partir deste microrganismo produtor de ácido glicólico. A pessoa versada na técnica conhece várias formas de obter tal aumento na exportação de um metabólito especifico, em particular, aumentando a atividade e/ou a expressão de uma proteína de exportação, capaz de exportar ácido glicólico do microrganismo para o meio.

Uma modalidade específica da invenção fornece um método para a produção fermentativa de ácido glicólico partir de um organismo recombinante compreendendo:

(a) contato do organismo recombinante da presente invenção com pelo menos uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo de glicose, sacarose, monossacarídeos (como frutose, manose, xilose, arabinose), oligossacarídeos (tais como galactose, celobiose, . . . ) , polissacarídeos (como a celulose), amido ou seus derivados, glicerol e substratos de carbono simples, por meio do que o ácido glioxílico é produzido, (b) opcionalmente, o processo compreende uma etapa de concentração do glicolato na bactéria ou no meio e isolamento do ácido glicólico do caldo de fermentação e/ou da biomassa opcionalmente restante nas porções ou na quantidade total (0 a 100%) no produto final.

Opcionalmente, o processo compreende uma etapa de recuperação do ácido glicólico produzido na etapa (a) através de uma etapa de polimerização para pelo menos dímeros de ácido glicólico e (c) isolamento e recuperação de ácido glicólico a partir do caldo de fermentação e/ou da biomassa, opcionalmente restante nas porções ou na quantidade total no produto final, por despolimerização dos dimeros, oligômeros e/ou polímeros de ácido glicólico.

As pessoas versadas na técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microrganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias gram negativas são fermentadas a uma temperatura entre 20 C e 55 C, preferencialmente entre 25°C e 40°C, e mais especificamente 10 a cerca de 37°C para E. coli.

Ά fermentação é geralmente efetuada em fermentadores com um meio de cultura inorgânico de composição definida conhecida, adaptado para as bactérias utilizadas, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e, se necessário, 15 um co-substrato necessário para a produção do metabólito.

A invenção também está relacionada com o microrganismo, como descrito previamente.

Preferencialmente, o dito microrganismo pertence à família das Enterobacteriaceae. Mais preferencialmente, o 20 microrganismo é do gênero Escherichia, e ainda mais preferencialmente é Escherichia coli.

EXEMPLOS

Vários protocolos foram usados para construir as cepas produtoras de ácido glicólico descritas nos seguintes exemplos. Os protocolos são detalhados abaixo.

Protocolo 1: Introdução de um produto de PCR para a recombinação e seleção dos recombinantes (sistema FRT)

Os oligonucleotideos escolhidos e apresentados na Tabela 1 para a substituição de um gene ou uma região intergênica foram utilizados para amplificar tanto o cassete de resistência a cloranfenicol do plasmideo pKD3 quanto o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)). O produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na cepa receptora, contendo o plasmideo pKD46 no qual o sistema ÀRed (γ,β,θχο) expresso favorece muito a recombinação

homóloga. Os	transformantes	de resistência	a	antibióticos
foram então	selecionados	e a inserção	do	cassete	de
resistência	foi verificada	pela análise	de	PCR com	os

oligonucleotideos apropriados dados na Tabela 2.

Protocolo 2: Eliminação do cassete de resistência (sistema FRT)

Os cassetes de resistência ao cloranfenicol e/ou canamicina foram eliminados de acordo com a técnica a seguir. O plasmideo pCP20 carregando a recombinase FLP que atua nos sítios FRT dos cassetes de resistência ao cloranfenicol e/ou canamicina foi introduzido na cepa por eletroporação. Após o cultivo em série a 42°C, a perda dos cassetes de resistência a antibióticos foi verificada pela análise de PCR com os oligonucleotídeos dados na Tabela 2.

Protocolo 3: Transdução com o fago PI para eliminação de um gene

A eliminação do gene escolhido pela substituição do gene por um cassete de resistência (canamicina ou cloranfenicol) na cepa de E. coli receptora foi realizada pela técnica de transdução com fago Pl. O protocolo foi em duas etapas, (i) a preparação do lisado de fago na cepa doadora com um único gene eliminado e (ii) a transdução da cepa receptora por este lisado de fago.

Preparação do lisado de fago

- Semear com 100 μΐ de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 com um único gene eliminado de 10 ml de LB + 30 pg/ml de Cm + 0,2% de glicose + CaCl₂ 5 mM.

- Incubação por 30 min a 37 °C com agitação.

- Adição de 100 μΐ de lisado de fago Pl preparado na cepa doadora MG1655 (aproximadamente 1 x 10⁹ fagos/ml).

- Agitação a 37 °C por 3 horas até que todas as células fossem lisadas.

- Adição de 200 μΐ de clorofórmio, e agitação por vórtice.

Centrifugação por 10 min a 4500 g para eliminar os fragmentos celulares.

- Transferência do sobrenadante em um tubo estéril e adição de 200 μΐ de clorofórmio.

- Armazenamento do lisado a 4 °C.

Transdução

- Centrifugação por 10 min a 1500 g de 5 mLl de uma cultura de um dia para o outro da cepa receptora de E. coli em meio LB.

- Suspensão do pelete celular em 2,5 ml de MgSO₄ 10 mM, CaCl₂ 5 mM.

- Tubos de Controle: 100 μΐ de células

100 μΐ de fagos PI da cepa MG1655 com um único gene eliminado.

- Tubo de ensaio: 100 μΐ de células + 100 μΐ de fagos P1 da cepa MG1655 com um único gene eliminado.

- Incubação por 30 min a 30 °C sem agitação.

- Adição de 100 μΐ de citrato de sódio 1 M em cada tubo, e agitação por vórtice.

- Adição de 1 ml de LB.

- Incubação por 1 hora a 37 °C com agitação.

- Plaqueamento em placas LB + Cm a 30 pg/ml após a centrifugação dos tubos por 3 min a 7000 rpm.

- Incubação a 37 °C de um dia para o outro.

Os transformantes resistentes a antibióticos foram então selecionados e a inserção da eliminação foi verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos apropriados dados na Tabela 2.

Protocolo 4: Introdução de um produto de PCR para a recombinação e seleção dos recombinantes (sistema Cre-LOX)

Os oligonucleotideos escolhidos e dados na Tabela 1 para a substituição de um gene ou uma região intergênica foram utilizados para amplificar tanto o cassete de resistência ao cloranfenicol do plasmideo loxP-cm-loxP (Gene Bridges) quanto o cassete de resistência à neomicina do plasmideo loxP-PGK-gb2-neo-loxP (Gene Bridges). O produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na cepa receptora contendo o plasmideo pKD46, no qual o sistema λ Red (γ,β exo) expresso favoreceu muito a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes a antibióticos foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos apropriados dados na Tabela 2.

Protocolo 5: Eliminação dos cassetes de resistência (sistema Cre-LOX)

Os cassetes de resistência ao cloranfenicol e/ou à canamicina foram eliminados de acordo com a seguinte técnica. O plasmideo pJW168 (Palmeros B. e col.(2000), Gene

247: 255-264) carregando a Cre recombinase atuando nos sítios Cre-LOX dos cassetes de resistência ao cloranfenicol e/ou à canamicina foi introduzido na cepa por eletroporação. Após o cultivo em série a 42 C, a perda dos 5 cassetes de resistência aos antibióticos foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotídeos apresentados na

Tabela 2.

Tabela 1: Oligonucleotídeos utilizados para as construções descritas nos exemplos a seguir

	Gene	Nomes dos oligos	SEQ ID N°	Homologia com a região crornossomai	Sequências
		Ome 703 Ptrc-icd F	N°1	1194281- 1194345	ggacgcaaacgcatatgcaacgtggtggcag ACGAGCAAACCAGTAGCGCTCGAAGGAGAGG TGATCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCT TTCTGCCATATGAATATCCTCCTTAG
	icd	Oag 30 Ptrc icd R2	N°2	1194402- 1194347	gccgttttgcagggtgatcttcttgccttgt gccggaacaactactttactttccaaagctg TTTCCTTCTTACCACACAGTATACGAGCCGG ATGATTAATCGCCAACAGCTCTGTAGGCTGG AGCTGCTTCG
	IdhA	IdhAF (Opg 0013) DldhA F	N°3	1440865- 1410786	GAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTAC GACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGAACGAGT CCTTTGGCTTTGAGCTGGTGTAGGCTGGAGC TGCTTCG

	IdhAR (Opg 0014) DldhA R	N°4	1439878- 1439958	TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCT TTTTCCAGATTGCTTAAGTTTTGCAGCGTAG T C T GAGAAATAC TGGTCAGCATAT GAAT AT C CTCCTTAG
mgsA Km	DmgsAKF	N°5	1026316- 1026245	GCAGGCTTTTTCGGTCTTTATCTTGCAGCGA TAAGT GC T TACAGTAAT C T GTAGGAAAGT TA ACTACGGATGATTCCGGGGATCCGTCGACCT GCAGTTC
DmgsAKR	N°6	1025721- 1025800	GGATGTGCCGGTGGCGAGAAAACCGTAAGAA ACAGGTGGCGTTTGCCACCTGTGCAATATTA CTTCAGACGGTCCGCGAGTGTAGGCTGGAGC TGCTTCG
mgsA Cm	Obu 0085 DmgsA F	N°7	1026273- 1026193	GTAATCTGTAGGAAAGTTAACTACGGATGTA CATTATGGAACTGACGACTCGCACTTTACCT GCGCGGAAACATATTGCGCCATATGAATATC CTCCTTAG
	Obu 0086 DmgsA R	N°8	1025758- 1025838	GGCGTTTGCCACCTGTGCAATATTACTTCAG ACGGTCCGCGAGATAACGCTGATAATCGGGG ATCAGAATATCGACCGCGTGTAGGCTGGAGC TGCTTCG
arcA	Ome 914 DarcAF	N°9	4638322- 4638245	CCCCGCACATTCTTATCGTTGAAGACGAGTT GGTAACACGCAACACGT TGAAAAGTAT T T TC GAAGCGGAAGGCTATGTGTAGGCTGGAGCTG CTTCG
ome 915 DarcAR	N°10	4637621- 4637699	CCAGATCACCGCAGAAGCGATAACCTTCACC GTGAATGGTGGCGATGATTTCCGGCGTATCC GGCGTAGATTCGAAATGCATATGAATATCCT CCTTAG

glcA	DglcA-loxP F Oag 0123 DglcA-loxP F	N°ll	3119299- 3119221	GGTTACCTGGACCCAAATGTATATGCCGATG GGAGGACTGGGGCTATCCGCTCTGGTCGCCC TGATCCCGATAATATTCAATTAACCCTCACT AAAGGG
DglcA-loxP R Oag 0124 DglcA-loxP R	N°12	3117622- 3117701	CGAGACTAACATCCCGGTAAACACATACGCC TGCAGCAGGGTGATAATGCCGATAACGCTGG C AAAAAT C AG AC TGTGCTAATACGACTCACT ATAGGG
lldP	DlldP F Oag 0051 DlldP F	N°13	3775414- 3775493	GACCTGCAATGAATCTCTGGCAACAAAACTA CGATCCCGCCGGGAATATCTGGCTTTCCAGT CTGATAGCATCGCTTCCCCATATGAATATCC TCCTTAG
DlldP R Oag 0052 DlldP R	N°14	3777054- 3776976	CATAAGCCTG7XAGCGTGGTGATCACGCCCAC TATACAGGTGAAGATCAGGCTGTGTTTGACA GTAAAGCGGAACAAATCTGTAGGCTGGAGCT GCTTCG
yjcG	DyjcGF Oag 0133 Dyj cGF	N°15	4282916- 4282835	GTTCTGACGGCGCTTGCCGCCACACTCCCTT TCGCAGCTAACGCCGCGGATGCTATTAGCGG GGCCGTAGAGCGCCAGCCAATTAACCCTCAC TAAAGGG
Dyj cGR Oag 0134 Dyj cGR	N°16	4281281- 4281360	GCGCGCGGCCTTGCTCAACGCCAAAGCCGGT CTGGGAGCGGATAAACTGCGCGCGGAACAGT TCACGCTCACGCGCGCCTAATACGACTCACT ATAGGG
ρΜΕΙΟΙ- ycdW-TT7- PaceA-	Oag 0033	N°17	1097384- 1097416	CCTACCGGTATGGGCGAGCAAATGCAGGAAT ATGC Parte de ycdW

aceA-TTOl	Oag 0034	N°18	1098047- 1098016	GCATGCATCCCGGGGCAGAAAGGCCCACCCG AAGGTGAGCCAGTGTGAAGATCTTTAGTAGC CGCGTGCGCGGTCGACTTGCCCGC Fim de ycdW + o finalizador TT7
	Oag 0037	N°19	4213337- 4213361	CCCAAGCTTCATATTGTTATCAACAAGTTAT C Promotor aceBAK e inicio de aceA
	Oag 0038	N°20	4216438- 4216419	TCCCCCGGGGCTTAGAACTGCGATTCTTC Extremidade de aceA

Tabela 2: Oligonucleotideos utilizados para verificar a inserção de um cassete de resistência ou a perda de um cassete de resistência

Gene	Nomes dos oligos	SEQ ID N°	Homologia com a região cromossomal	Sequências
led	Ome 704 seq Ptrc-icd F	N°21	1194153-1194173	CAGAGATTATGAATTGCCGCA
Ome 705 seq Ptrc-icd R	N°22	1194540-1194520	CCAGGAGATTTTACGCTCGCC
IdhA	Opg 0011 IdhAF	N°23	1439724-1439743	GCCATCAGCAGGCTTAGCGC
Opg 0012 IdhAR	N°24	1441029-1441007	GGGTATTGTGGCATGTTTAACCG
mgsA Km et' Cm	Opg 0122 yccT R	N°25	1026499-1026480	GATGGCAGATGACAGTACGC
Opg 0123	N°26	1025689-1025704	CCCTCTCCCTTTGTGG

	helD F2
arcA	Ome 0916 arcAF	N°27	4638746-4638727	CGACAATTGGATTCACCACG
Ome 0917 arcAR	N°28	4637308-4637328	GCGGTATTGAAAGGTTGGTGC
glcA	Oag 0049 glcA F	N°29	3119492-3119473	CGATACTCTGCGTCTGCGTG
Oag 0050 glcA R	N°30	3117387-3117408	GCAAAAGCAACAGATAGAACGG
11Ô2	Oag 0053 lldP F	N°31	3775227-3775247	CGCTTATCTGACCTCTGGTTC
Oag 0054 lldR R	N°32	3777257-3777239	GCACGCCTTCACTCACCAG
yjcG	Opg 0076 yj cHF	N°33	4283167-4283147	CGGTTTGCCACCATCCTGTCG
Opg 0077 yj cFR	N°34	4281047-4281066	CGTTAATCAGGCAAAGAGGG

EXEMPLO 1

Construção do plasmídeo pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 (Fig.2) plasmídeo pMElOl—ycdW—TT07—PaceA—aceA—TT01 foi construído em três etapas a partir do plasmídeo pMElOlycdW, cuja descrição é dada nos pedidos de patente

PCT/EP2006/063046 e PCT/EP2007/055625, e a partir do plasmídeo pJB137-aceA.

A primeira etapa foi a construção do plasmídeo pME101-ycdW-TT07 pela adição de um finalizador à extremidade de ycdW. A extremidade do gene ycdW é amplificada por PCR feito em DNA genômico com os oligonucleotídeos, incluindo ο TT07, em suas sequências e apresentados na tabela 1. 0 fragmento de PCR digerido com Agel/Smal foi clonado no corte pME101-ycdW de plasmideo pelas mesmas enzimas de restrição para chegar ao plasmideo pME101-ycdW-TT7.

- 0 plasmideo pJB137-aceA foi construído por clonagem de um fragmento de PCR no plasmideo pJB137 (Número de acesso EMBL U75326) digerido com Smal/HindIII. O fragmento de PCR foi obtido no DNA genômico purificado a partir de uma cepa MG1655 AaceB descrita nos pedidos de patente PCT/EP2006/063046 e PCT/EP2007/055625 e os oligonucleotídeos (Oag0037 e Cag0038) descritos na tabela 1. O gene aceA, assim como o seu próprio promotor foram amplificados antes de serem clonados no plasmideo.

- A última etapa foi cortar o plasmideo pJB137-aceA para obter o fragmento PaceA-aceA-TT01, TT01 sendo o finalizador do pJB137. O plasmideo pJB137—aceA foi cortado com HindIII, tratado com a enzima Klenow e finalmente digerido pela enzima de restrição PstI. 0 fragmento de DNA resultante foi então clonado no plasmideo pME101-ycdW-TT07, aberto sequencialmente com Smal e PstI. O plasmideo resultante foi pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01, chamado de pAG025.

EXEMPLO 2

Construção de uma cepa capaz de produzir ácido glicólico por fermentação: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd; : Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ &ackA.+pta (pMElOlycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

A cepa E.coli MG1655 AaceB hgcl AgicDEFGB HaldA /licTR Hedd+eda ΔροχΒ kackA+pta foi construída de acordo com a descrição dada nos pedidos de patente PCT/EP2006/063046 e PCT/EP2007/055625.

A atenuação da transcrição de icd foi obtida pela substituição do promotor icd natural por uma artificial chamado de Ptrc50/RBSB/TTG, carregando um cassete de resistência ao cloranfenicol, na cepa de E.coli MG1655 AaceB kgcl AgicDEFGB AaidA kiclR kedd+eda ΔροχΒ BackA+pta. A construção é realizada de acordo com a técnica descrita no Protocolo 1 com os respectivos oligonucleotídeos (Seq. No. 1 e No. 2) dados na tabela 1. 0 cassete de cloranfenicol não é eliminado.

O fragmento de PCR Ptrc50/RBSB/TTG—icd::Cm foi primeiramente introduzido por eletroporação na cepa MG1655 (pKD46) para fornecer a cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTGicd::Cm, validada por sequenciamento.

Em uma segunda etapa, a atenuação da construção icd foi introduzida na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR hedd+eda ΔροχΒ AackA+pta por transdução (ver o protocolo 3), para fornecer a cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTGicd ::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta.

O plasmideo pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TTC)l (Exemplo 1) foi então introduzido na cepa para dar origem à MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd; : Cm AaceB Agcl AgrlcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta (pME101-ycdW-TTC)7-PaceA-aceATT01), chamada de AG0662.

EXEMPLO 3

Construção de uma cepa para melhorar a produção de ácido glicólico por fermentação: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd;:Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA. AiclR Aedd+eda ApoxB AacÀA+pta AldhA. (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

O gene IdhA foi inativado na cepa de E.coli MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd: : Cm AaceB Agcl hgrlcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta (pKD46)por recombinação com um produto de PCR feito com os oligos N° 3 e N° 4, mostrados na tabela 1 (ver Protocolo 1). A cepa resultante foi MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm AaceB hgcl hglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AldhA::Km, em que o plasmideo pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 (Exemplo 1) foi introduzido em uma última etapa. A cepa final foi chamada de AG0708.

EXEMPLO 4

Construção de uma cepa para melhorar a produção de ácido glicólico por fermentação: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd.' : Cm AaceB Agcl AglcOEEGSt AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AacJcA+pta AmgsA (pME101-ycdtf-TT07-PaceA-aceA-TT01) gene mgsA foi inativado na cepa de E.coli MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta pela técnica de transdução com o fago PI descrito no protocolo 3. A cepa doadora MG1655 AmgsA::Km foi construída por introdução de um fragmento de PCR na cepa MG1655 (pKD46). Os oligonucleotídeos utilizados para a construção estão apresentados na tabela 1. A cepa foi validada por sequenciamento.

plasmídeo pAG025 foi então introduzido na cepa de E.coli MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA::Km para levar à cepa final, chamada de AG0819 : MG1655 Ptrc50/RBSB/TTGicd::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA: (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01) .

EXEMPLO 5

Construção de uma cepa para melhorar a produção de ácido glicólico por fermentação: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm

AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA. AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AarcA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01) gene arcA foi inativado na cepa de E.coli MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd:: Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta pela técnica de transdução com o fago Pl descrito no protocolo 3. A cepa doadora MG1655 AarcA::Km foi construída por introdução de um fragmento de PCR na cepa MG1655 (pKD46). Os oligonucleotideos utilizados para a construção estão apresentados na tabela 1. A cepa foi validada por sequenciamento.

O plasmideo pAG025 foi então introduzido na cepa de E.coli MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AarcA::Km para levar à cepa final, chamada de AG0956 : MG1655 Ptrc50/RBSB/TTGicd::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AarcA::Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01). EXEMPLO 6

Construção de uma cepa para melhorar a produção de ácido glicólico por fermentação: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA. AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AldhA AmgsA (pME101-ycdN-TT07-PaceA-aceA-TT01)

Em uma primeira etapa, a eliminação de AmgsA: : Cm foi feita por transdução de fago (protocolo 3) na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA:: Cm. A cepa doadora MG1655 AmgsA::Cm foi construída por introdução de um fragmento de PCR na cepa MG1655 (pKD4 6) . Os oligonucleotideos utilizados para a construção estão apresentados na tabela 1. A cepa foi validada por sequenciamento.

Em uma segunda etapa, a eliminação AldhA::Km foi feita na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA::Cm por transdução da cepa doadora MG1655 AldhA::Km (descrita no Exemplo 3) para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA ;;Cm AldhA :.'Km. Os cassetes de resistência ao cloranfenicol e à canamicina foram eliminados de acordo com a técnica descrita no Protocolo 2. A cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA foi validada por PCR com os oligos mostrados na tabela 2.

Numa terceira etapa, a construção Ptrc50/RBSB/TTGicd::Cm foi introduzida pela transdução da cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm descrita no Exemplo 2. A cepa resultante foi MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd.- : Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA.

Finalmente, o plasmideo pAG25 (Exemplo 1) foi introduzido na cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd :: Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA para fornecer a cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTGicd::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AmgsA AldhA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01), chamada de AG0873.

EXEMPLO 7

Construção de uma cepa para melhorar a produção de ácido glicólico por fermentação: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd ::Cm AaceB Agcl AgldDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AldhA AmgsA AarcA (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

A eliminação AarcA:: Km foi introduzida por transdução na cepa descrita no Exemplo 6, MG1655 Ptrc50/RBSB/TTGicd ::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AmgsA AldhA para fornecer a cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd ::Cm AaceB Agcl AglcBEEGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta EmgsA EldhA AarcA :;Km. A cepa doadora MG1655 AarcA::Km usada no experimento de transdução é descrita no Exemplo 5.

Em seguida, o plasmideo pAG25 foi introduzido na cepa para fornecer a cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd ::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AmgsA AldhA AarcA ::Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01) chamada de AG1099.

EXEMPLO 8

Construção de uma cepa capaz de importar glicolato MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd: :Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AglcA AlldP AyjcG (pME101-ycdW5 TT07-PaceA-aceA-TT01)

Em uma primeira etapa, a construção AyjcG::Nm (Cre/Lox) foi introduzida na cepa MG1655 AaceB Agcl AgicDEFGB AaidA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta (pKD4 6) por produto de PCR (ver protocolo 4) para fornecer a cepa 10 MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ

AackA+pta AyjcG;;Nm. Os oligonucleotídeos utilizados são mostrados na tabela 1 · A cepa resultante foi validada por sequenciamento.

cassete de resistência à Neomicina foi eliminado de 15 acordo com a técnica descrita no protocolo 5 para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcBEEGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AyjcG.

Em uma segunda etapa, a construção AglcAz :Nm foi introduzida na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR 20 Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AyjcG (pKD46) por produto de PCR (ver protocolo 4) para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AyjcG AglcA :;Nm. Os oligonucleotídeos utilizados são mostrados na tabela 1. A cepa resultante foi validada por sequenciamento.

O cassete de resistência à neomicina foi eliminado de acordo com a técnica descrita no protocolo 5 para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AgricDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AyjcG AglcA.

Em uma terceira etapa, a eliminação AlldP::Km foi introduzida na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AyjcG AglcA por transdução para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AyjcG AglcA AlldP :;Km. A cepa doadora MG1655 AlldP::Km usada no experimento de transdução foi construída por recombinação de um fragmento de PCR introduzido na MG1655 (pKD46). Os oligonucleotídeos são apresentados na tabela 1. A cepa MG1655 AlldP::Km foi validada por sequenciamento.

A etapa seguinte foi para transduzir a atenuação Ptrc50/RBSB/TTG-lcd::Cm por transdução da cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm descrita no Exemplo 2, na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AyjcG AglcA AlldP ;;Km para fornecer a cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd ::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ΔροχΒ AackA+pta AyjcG AglcA AlldP :;Km.

A última etapa foi a introdução do plasmídeo pAG25 (Exemplo 1) para obter a cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG50 icd ::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AyjcG AglcA AlldP : :Kio. (pME101-ycdW-TT07-PaceAaceA-TTOl) , chamada de AG1056.

EXEMPLO 9

Construção de uma cepa para melhorar a produção de ácido glicólico por fermentação e incapaz de importar glicolato: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd; :Cm AaceB Agcl AgldDB&GB AaldA. AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AldhA AmgsA AglcA. AlldP Ayj cG (pMEl01-ycdW-TTO7-PaceA-aceA-TTO1)

Em uma primeira etapa, a construção AyjcG::Nm foi introduzida por produto de PCR (Protocolo 4) na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA (pKD46) descrita no Exemplo 6, para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA AyjcG :;Nm.

O cassete de resistência foi eliminado de acordo com o protocolo 5 para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA Ayj cG.

Em uma segunda etapa, a eliminação AglcA::Nm (Cre/Lox) foi introduzida por produto de PCR na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA AyjcG (pKD46) para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA

AldhA AyjcG AglcA : :Nm.

O cassete de resistência foi eliminado de acordo com ο protocolo 5 para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA AyjcG AglcA.

A terceira etapa foi a introdução de AlldP::Km por transdução da cepa MG1655 AlldP : : Km descrita no Exemplo 8, na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA AyjcG AglcA para fornecer a cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA AyjcG AglcA AlldP : ;Km.

Em seguida, o fragmento Ptrc50/RBSB/TTG-icd ::Cm foi transduzido na cepa MG1655 AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA AyjcG AglcA AlldP r.-Km para fornecer a cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTGicd ::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA AyjcG AglcA AlldP : .-Km. A cepa MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd ::0m descrita no Exemplo 2 foi a cepa doadora para o experimento de transdução.

Finalmente, o plasmideo pAG25 foi introduzido na cepa por eletroporação para fornecer a cepa denominada AG0960: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd ::Cm AaceB Agcl AglcDEFGB AaldA AiclR Aedd+eda ApoxB AackA+pta AmgsA AldhA AyjcG AglcA AlldP : : Km (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

A pessoa versada na técnica conhece as técnicas usadas para modificar geneticamente um microrganismo e sabe que existem maneiras diferentes para obter uma eliminação. EXEMPLO 10

Fermentação de cepas produtoras de ácido glicólico em frascos Erlenmeyer

Os desempenhos das cepas foram inicialmente avaliados em culturas em frascos Erlenmeyer com defletores de 250 ml utilizando meio M9 modificado (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 32:120-128), que foi suplementado com 40 g/1 de MOPS e 10 g/1 de glicose e ajustado em pH 6,8.

Espectinomicina foi adicionada, se necessário, a uma concentração de 50 mg/1. Uma pré-cultura de 72 horas foi usada para inocular uma cultura de 50 ml a uma OD₆oo nm de cerca de 0,3. As culturas foram mantidas em um agitador a 30°C e 200 rpm até que a glicose no meio de cultura fosse esgotada. No final da cultura, glicose e ácido glicólico foram analisados por HPLC utilizando uma coluna HPX 97H Biorad para a separação e um refratômetro para a detecção.

A comparação dos desempenhos das diferentes cepas é dada na tabela 3 abaixo. A cepa descrita no exemplo 2 poderia ser considerada como a referência. Cada valor é a média de n repetições (n = 1 até n = 6).

Tabela 3: Desempenhos de produção de ácido glicólico das diferentes cepas descritas acima

Cepa do exemplo nc	2	3	4	5	6	7	8	9
Nome da cepa	AGO662	AG0708	AG0S19	AG0873	AGO956	AGIO99	AGIOS6	AGO960
Produção de ácido glicólico (g/i)	4,01 ± 0,3	4,0 ± 0,3	4,44	4,45	4,36	5,14	2,46	4,37
Rendimento (g de ácido glicólico/ g de glicose)	0,38 x 0, 03	0, 39 ± 0,04	0,40	0,43	0,40 ± 0,01	0,52	0,40	0,50

EXEMPLO 11

Fermentação de cepas produtoras de ácido glicólico no fermentador de alimentação por batelada

As cepas descritas nos exemplos acima foram avaliadas sob condições de produção em um fermentador de 600 ml utilizando um protocolo de alimentação por batelada.

Uma única pré-cultura foi realizada em um frasco

Erlenmeyer de 500 ml preenchido com 50 ml de meio sintético suplementado com 40 g/1 de MOPS, 10 g/1 de glicose (o mesmo meio utilizado para culturas de frasco) e 10% de meio LB a 30°C durante 3 dias. Esta pré-cultura foi usada para inoculação do fermentador.

O fermentador preenchido com 200 ml de meio sintético suplementado com 20 g/1 de glicose, 50 mg/1 de espectinomicina foi inoculado em uma densidade ótica inicial de cerca de 2. A cultura foi realizada a 37 C com agitação e aeração ajustadas para manter o oxigênio dissolvido em 30% acima da saturação. O pH foi ajustado em 6,8 com a adição de base. A cultura foi conduzida em um modo de batelada até a exaustão de glicose. Naquele momento, uma solução de 700 g/1 de glicose suplementada com sulfato de magnésio, oligoelementos e espectinomicina foi adicionada (Pulso de glicose) para restaurar uma concentração de 20 g/1 de glicose no meio. Após o 5^o pulso de alimentação, o pH é ajustado em 7,4 até o final da cultura.

Rotineiramente, a cepa descrita no exemplo 5 produziu melhores desempenhos de produção no fermentador do que a cepa de referência descrita no exemplo 2.

Um curso de tempo representativo da fermentação para a produção de ácido glicólico utilizando a cepa do exemplo 5 (AG0956) é dado abaixo.

Tabela 5: Curso de tempo de fermentação para a produção de ácido glicólico pela cepa AG0956 em Fermentador Multifors (600ml)

Tempo (h) OD₆oo nm (AU)

0,0	1,8
15,33	35, 3
17,83	49,4
20,33	58,6
22,83	63, 6
25,33	60,4
30, 92	58,2
39,33	52,0

Glicose	Acido glicólico
(g/1)	(g/L)
17,4	0,4
12,3	16, 9
12,7	23,7
11, 9	28,9
12,4	33,3
12,2	39,7
11,0	47,1
0, 0	52,2

titulo final obtido foi de 52,2 g/1 de ácido glicólico com um rendimento a partir da glicose de 0,38 g/g e uma produtividade de l,33g/l/h.

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Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção fermentativa de ácido glicólico caracterizado pelo fato do referido método compreender as seguintes etapas:

a) cultivar um microrganismo modificado em um meio de cultura apropriado compreendendo uma fonte de carbono; e

b) recuperar ácido glicólico a partir do meio de cultura;

em que o microrganismo modificado é uma bactéria

Escherichia coli geneticamente modificada para a produção de ácido glicólico, que compreende pelo menos uma das sequintes modificações:

- atenuação de aceB, glcB, gcl e eda, desse modo,

atenuando a conversão de glioxilato em outros produtos além

de glicolato;

- atenuação de glcDEFG e aldA, de forma que o

microorganismo é incapaz de metabolizar glicolato;

- atenuação de icd, aceK, pta, ackA, poxB, iclR ou fadR e/ou superexpressão da aceA, desse modo, aumentando o fluxo da via do glioxilato;

- superexpressão de ycdW, desse modo, aumentando a

conversão de glioxilato em glicolato;

- atenuação de pgi, udhA ou edd, desse modo,

aumentando a disponibilidade de NADPH, e

Petição 870190048966, de 24/05/2019, pág. 29/39

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo modificado para a produção de ácido glicólico compreende ainda pelo menos uma das seguintes modificações:

- deleção do gene arcA;

- deleção de pelo menos um dos genes glcA, lldP e yjcG;

e combinações dos mesmos.

2/4 que compreende ainda a deleção dos genes IdhA e mgsA.

3/4 caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreender ainda as seguintes etapas:

a) Concentrar glicolato nas bactérias ou no meio; e

b) Isolar ácido glicólico a partir do caldo de fermentação e/ou da bactéria, opcionalmente remanescente em porções ou na quantidade total (0 a 100%) no produto final.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o microrganismo inicialmente modificado para a produção de ácido glicólico compreende uma atenuação do gene aceK.

4/4

- atenuação de icd, aceK, pta, ackA, poxB, iclR ou

fadR e/ou superexpressão da aceA, desse modo, aumentando o

fluxo da via do glioxilato;

- superexpressão de ycdW, desse modo, aumentando a

conversão de glioxilato em glicolato; ou

- atenuação de pgi, udhA ou edd, desse modo,

aumentando a disponibilidade de NADPH,

e que compreende ainda a deleção dos genes ldhA e

mgsA.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os três genes glcA, lldP e yjcG são deletados.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é pelo menos uma dentre as seguintes: glicose, sacarose, mono ou oligossacarídeos, amido ou seus derivados ou glicerol.

6. Método para a produção fermentativa de glicolato, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5,

Petição 870190048966, de 24/05/2019, pág. 30/39

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o glicolato é isolado através de uma etapa de polimerização para pelo menos dímeros de glicolato.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o glicolato é recuperado a partir da despolimerização de dímeros, oligômeros e/ou polímeros de glicolato.

9. Microrganismo modificado caracterizado pelo fato de ser conforme definido na reivindicação 1, em que o referido microrganismo é uma bactéria Escherichia coli geneticamente modificada para produção ácido glicólico, que compreende pelo menos uma das seguintes modificações:

- atenuação de aceB, glcB, gcl e eda, desse modo, atenuando a conversão de glioxilato em outros produtos além de glicolato;

- atenuação de glcDEFG e aldA, de forma que o microorganismo é incapaz de metabolizar glicolato;

Petição 870190048966, de 24/05/2019, pág. 31/39

10. Microrganismo modificado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido

microrganismo compreende ainda pelo menos uma das seguintes

modificações:

- deleção do gene arcA;

- deleção de pelo menos um dos genes glcA, lldP e

yjcG;

e combinações dos mesmos.

11. Microrganismo modificado, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o

referido microorganismo compreende ainda a atenuação do

gene acek.

12. Microrganismo modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de

que os três genes glcA, lldP e yjcG são deletados.