KR102558672B1 - 1,3-프로판디올 생산 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법 - Google Patents

1,3-프로판디올 생산 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1,3-프로판디올 외 부산물 생산에 관여하는 유전자를 결실시킨 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 변이 미생물은 글리세롤의 환원대사에 대한 에너지 흐름이 강화되어 부산물의 생성을 억제하는 동시에 1,3-프로판디올의 생성량을 향상시킬 수 있다.

Description

1,3-프로판디올 생산 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법{Mutant microorganism producing 1,3-propanediol and method for preparing 1,3-propanediol using the same}
본 발명은 1,3-프로판디올 외 부산물 생산에 관여하는 유전자를 결실시킨 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법에 관한 것이다.
1,3-프로판디올(1,3-Propanediol)은 폴리에테르, 폴리우레탄, PTT(polytrimethylene terephthalate)와 같은 고분자를 합성하는 단량체로 사용되는 화합물이다. 1,3-프로판디올의 생산 방법은 주로 화학적인 합성 방법에 의존하며, 아크롤레인(acrolein)의 수화, 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide)를 포스핀(phosphine) 존재 하에서 하이드로포밀화(hydroformylation)하는 등의 방법이 사용되고 있다. 이러한 화학적인 생산 방법은 고비용 및 환경유해 생산공정이 포함되어 있어 한계가 있다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 최근에는 미생물을 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법이 개발되고 있다. 주로 크렙시엘라(Klebsiella), 클로스트리디아(Clostridia), 엔테로박터(Enterobacter), 시트로박터(Citrobacter), 락토바실러스(Lactobacillus) 등의 미생물을 이용하며, 탄소원으로 글리세롤(glycerol)을 사용하여 1,3-프로판디올을 생산한다. 미생물은 글리세롤 환원대사 산물로 1,3-프로판디올을 생성하는 동시에 글리세롤 산화대사를 통해 젖산, 아세트산, 에탄올, 2,3-부탄디올 등의 다양한 부산물 또한 생산한다는 단점이 있어, 미생물에서의 1,3-프로판디올 생성량을 늘리기 위해 부산물의 생성을 억제시키려는 시도가 있었다. 대표적으로는 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 결실시킨 변이 미생물을 이용하여 젖산의 생성을 억제하면서 1,3-프로판디올의 생산량을 증가시킨 바가 있었다. 하지만 부산물 중 하나인 2,3-부탄디올 생산량 또한 증가한다는 문제점이 발생하였으며, 2,3-부탄디올 합성에 관여하는 유전자를 결실시키면 글리세롤 발효대사와 균체 증식이 저하되면서 오히려 1,3-프로판디올의 생성량이 감소하는 것으로 나타났다 (Oh et al. Appl Biochem Biotechnol 166:127-137, 2012).
따라서 미생물을 이용하여 부산물 생성을 억제하면서 1.3-프로판디올 생성량을 증가시키기 위해서는 여전히 많은 연구가 필요한 실정이다.
미국등록특허 제8,236,994호
본 발명은 부산물 생산이 억제되고 1,3-프로판디올 생성량이 증가된, 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 변이 미생물을 이용한 1,3-프로판디올의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자; 및 이소시트레이트 리아제 및 말레이트 신타아제 중 하나 이상을 암호화하는 유전자가 결실된 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 “락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase A)”는 ldhA 유전자에 의해 암호화된 효소로, 피루베이트(pyruvate)를 젖산(lactate)으로 전환하는데 관여한다.
본 발명에서 사용된 “이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase)”는 aceA 유전자에 의해 암호화된 효소로, 글리옥실산(glyoxylate) 회로에서 이소시트레이트를 글리옥실산과 숙신산(succinate)으로 분해하는 반응을 촉매한다.
본 발명에서 사용된 “말레이트 신타아제(malate synthase A)”는 aceB 유전자에 의해 암호화된 효소로, 글리옥실산 회로에서 생산된 글리옥실산, 아세틸-CoA 및 물(H2O)의 반응을 촉매하여 말산(malate)을 합성한다.
본 발명에서 사용된 “결실(deletion)”은 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환 또는 삭제시켜 해당 유전자가 암호화하는 단백질을 생산할 수 없거나 생산된 단백질이 본연의 활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념이다. 본 발명에서의 유전자 결실은 미생물 내 해당 유전자가 관여하는 반응 또는 경로를 차단하게 한다.
본 발명에서와 같이 ldhA 유전자와 함께 aceA 유전자 및/또는 aceB 유전자가 결실된 경우에는 글리세롤 산화대사가 차단되어 젖산, 숙신산, 에탄올 등의 대사산물 생산이 억제되고 1,3-프로판디올을 생산하는 글리세롤 환원대사에 에너지 흐름이 강화됨으로써 미생물 내 1,3-프로판디올 생성능이 향상된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 변이 미생물은 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 포함한 두 개의 유전자가 결실된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 변이 미생물은 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자; 및 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 유전자가 결실되거나, 또는 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자; 및 말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자가 결실된 것일 수 있다.
이러한 락테이트 디하이드로게나제 및 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 유전자가 결실되거나, 또는 락테이트 디하이드로게나제 및 말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자가 결실된 경우에는 락테이트 디하이드로게나제 단독이 결실된 경우에 비해 1,3-프로판디올 생성량이 3 내지 50%, 보다 구체적으로 5 내지 30% 증가할 수 있으며, 숙신산, 에탄올 등의 부산물 생성량이 3 내지 50%, 보다 구체적으로 5 내지 30% 감소할 수 있다.
또한 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 변이 미생물은 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자; 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 유전자; 및 말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자가 결실된 것일 수 있다.
이러한 락테이트 디하이드로게나제, 이소시트레이트 리아제 및 말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자가 모두 결실된 경우에는 락테이트 디하이드로게나제 단독이 결실된 경우에 비해 1,3-프로판디올 생성량이 3 내지 50%, 보다 구체적으로 10 내지 40% 증가할 수 있으며, 숙신산, 에탄올, 2,3-부탄디올 등의 부산물 생성량이 3 내지 50%, 보다 구체적으로 5 내지 30% 감소할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 변이 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 전술한 변이 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 변이 미생물 또는 변이 미생물이 배양된 배지로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 생산 방법을 제공한다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하는 것일 수 있다. 상기 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양 과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 탄소원으로 글리세롤을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 변이 미생물을 배지에서 배양하는 단계에서, pH 조절제로 암모니아를 사용하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 암모니아는 전체 배지 중 1 내지 20 중량%, 구체적으로는 5 내지 15 중량%를 포함할 수 있다.
또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있으며, 교반기 사용도 할 수 있다. 교반 속도는 통상 20 내지 300 rpm, 예를 들면 120 내지 250 rpm일 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20 내지 45℃, 예를 들면 25 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 유용물질 (예를 들면, 1,3-프로판디올)이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 4 내지 160 시간일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 변이 미생물 또는 변이 미생물이 배양된 배지에서 1,3-프로판디올을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 1,3-프로판디올을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 1,3-프로판디올을 회수하는 단계는 배양 배지를 저속 원심분리하여 고형분을 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 1,3-프로판디올을 회수하는 단계는 1,3-프로판디올을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 변이 미생물은 글리세롤의 환원대사에 대한 에너지 흐름이 강화되어 부산물의 생성을 억제하는 동시에 1,3-프로판디올의 생성량을 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. ldhA 및 aceA 유전자가 결손된 변이 미생물 제작
1-1. ldhA 유전자가 결손된 변이 미생물
락테이트 디하이드로게나제(Lactate dehydrogenase, ldhA) 유전자가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 균주 (ΔldhA)를 제작하였다.
먼저, 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) MGH78578 (ATCC 700721)의 염색체 상에 존재하는 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 ldhA 유전자를 항생제 아프라마이신(apramycin) 내성 유전자로 치환하면서 염색체상에서 제거하였다. 아프라마이신 내성 유전자로 치환하기 위해 ldhA 유전자의 상류(up) 및 하류(down) 영역의 약 900 bp씩 포함하는 2개의 DNA 단편을 각각 PCR로 증폭시키고, 이 2개의 DNA 단편을 중첩 PCR로 서로 연결한 후 아프라마아신 내성 유전자를 삽입하였다. 만들어진 카세트를 최종적으로 크렙시엘라 뉴모니아 MGH78578에 도입한 후 아프라마이신이 첨가된 배지에서 콜로니를 형성하는 균주를 분리하였다. 얻어진 콜로니는 PCR을 통해 상동재조합(homologous recombination)이 정확하게 일어났음을 확인하였으며 최종적으로 ldhA 유전자가 결손된 균주 (ΔldhA)를 확보하였다.
여기서 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호
ldhA up F : CAGCCAGACGGGAATAGCTT 1
R : CGCCAATTTTCTGGTGCTTCAGATATCGCCTCAAGGTCGACGTTGTTAA 2
ldhA down F : TTAACAACGTCGACCTTGAGGCGATATCTGAAGCACCAGAAAATTGGCG 3
R : AGCTCGATGGTTCGGCGATT 4
1-2. ldhA 및 aceA 유전자가 결손된 변이 미생물
실시예 1-1에서 제작된 ldhA 유전자가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 균주 (ΔldhA)를 모균주로 하여 ldhA 및 aceA 유전자가 결손된 변이 미생물 (ΔldhAΔaceA)을 제작하였다.
우선, ldhA 유전자가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 균주 (ΔldhA)의 aceA 유전자의 상류 및 하류 영역의 500 bp씩 포함하는 2개의 DNA 단편을 각각 PCR로 증폭시키고, 이 2개의 DNA 단편을 중첩 PCR로 서로 연결하였다. 이어서 중첩된 단편을 NotI 및 XbalI 또는 BamHI 제한 자리를 이용해 Pkov 벡터 (Addgene, Cat No. 25769)에 클로닝하였다. 이후 생성된 플라스미드로 ΔldhA 균주를 형질전환한 후 클로람페니콜(chloramphenicol)을 항생제 마커로 사용하여 스크리닝하였고, 30℃에서의 밤새(overnight) 배양과 42℃에서 12시간의 배양을 순차적으로 진행함으로써 상동재조합을 통한 aceA 유전자 결실을 진행하였다. 이렇게 재조합된 결실 균주에 대해 PCR을 실시하여 결실부위의 서열 및 사이즈 확인을 통해 최종 선정하였다. 또한 유전자 결실을 위해 도입된 플라스미드는 수크로스(sucrose)가 포함된 배지에 배양하여 큐어링(curing)하여, 최종적으로 ΔldhAΔaceA 균주를 스크리닝하였다.
여기서 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.
프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호
aceA F: ATGGAGCATCTGCACATGAA 5
R: TTAAAACTGATCTTCTTCGG 6
실시예 2. ldhA 및 aceB 유전자가 결손된 변이 미생물 제작
실시예 1-1에서 제작된 ldhA 유전자가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 균주 (ΔldhA)를 모균주로 하여 ldhA 및 aceB 유전자가 결손된 변이 미생물 (ΔldhAΔaceB)을 제작하였다.
우선, ldhA 유전자가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 균주 (ΔldhA)의 aceB 유전자의 상류 및 하류 영역의 500 bp씩 포함하는 2개의 DNA 단편을 각각 PCR로 증폭시키고, 이 2개의 DNA 단편을 중첩 PCR로 서로 연결하였다. 이어서 중첩된 단편을 NotI 및 XbalI 또는 BamHI 제한 자리를 이용해 pKOV 벡터에 클로닝하였다. 이후 생성된 플라스미드로 ΔldhA 균주를 형질전환한 후 항생제 마커를 이용하여 스크리닝하였고, 30℃에서의 밤새 배양과 42℃에서 12시간의 배양을 순차적으로 진행함으로써 상동재조합을 통한 aceB 유전자 결실을 진행하였다. 이렇게 재조합된 결실 균주에 대해 PCR을 실시하여 결실부위의 서열 및 사이즈 확인을 통해 최종 선정하였다. 또한 유전자 결실을 위해 도입된 플라스미드는 수크로스(sucrose)가 포함된 배지에 배양하여 큐어링(curing)하여, 최종적으로 ΔldhAΔaceB 균주를 스크리닝하였다.
여기서 사용된 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호
aceB F: ATGACGCAGCAGGCGACAAT 7
R: TTAGGCCAGCAGGCGGTAGC 8
실시예 3. ldhA , aceA 및 aceB 유전자가 결손된 변이 미생물 제작
실시예 1-2에서 제작된 ldhA 및 ldhA 유전자가 결실된 크렙시엘라 뉴모니아 균주 (ΔldhAΔaceA)를 모균주로 하여 ldhA, aceA 및 aceB 유전자가 결손된 변이 미생물 (ΔldhAΔaceAΔaceB)을 제작하였다.
우선, ΔldhAΔaceA 균주의 aceB 유전자의 상류 및 하류 영역의 500 bp씩 포함하는 2개의 DNA 단편을 각각 PCR로 증폭시키고, 이 2개의 DNA 단편을 중첩 PCR로 서로 연결하였다. 이어서 중첩된 단편을 NotI 및 XbalI 또는 BamHI 제한 자리를 이용해 pKOV 벡터에 클로닝하였다. 이후 생성된 플라스미드로 ΔldhAΔaceA 균주를 형질전환한 후 항생제 마커를 이용하여 스크리닝하였고, 30℃에서의 밤새 배양과 42℃에서 12시간의 배양을 순차적으로 진행함으로써 상동재조합을 통한 aceB 유전자 결실을 진행하였다. 이렇게 재조합된 결실 균주에 대해 PCR을 실시하여 결실부위의 서열 및 사이즈 확인을 통해 최종 선정하였다. 또한 유전자 결실을 위해 도입된 플라스미드는 수크로스(sucrose)가 포함된 배지에 배양하여 큐어링(curing)하여, 최종적으로 ΔldhAΔaceAΔaceB 균주를 스크리닝하였다.
여기서 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나타내었다.
프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호
aceB F: ATGACGCAGCAGGCGACAAT 7
R: TTAGGCCAGCAGGCGGTAGC 8
실험예 1. 변이 미생물의 대사산물 생산능 측정
실시예 1 내지 3에서 제작된 변이 미생물 ΔldhA, ΔldhAΔaceA, ΔldhAΔaceB 및 ΔldhAΔaceAΔaceB의 대사산물 생산능을 측정하기 위해, 5 L 발효기에서 각 균주를 배양하여 1,3-프로판디올 생산 및 대사산물의 변화를 확인하였다.
균주 배양은 고체배지 (LB Agar)에 배양한 각 균주를 루프(loop)로 긁어서 30 mL의 LB 액체배지에 균주를 접종하고 37℃, 200 rpm에서 12 시간 동안 배양하였다. LB 액체배지에서 배양된 균주를 배양 부피의 10% 비율로 300 mL의 플라스크 배지에 접종하고 37℃, 200 rpm, 4시간 동안 배양을 진행한다. 이후 플라스크 배지에 배양된 균주를 3 L의 발효기 배지에 접종하고, crude glycerol의 농도가 20 ~ 40 g/L를 유지하도록 피딩(feeding)을 하면서 37℃, 200 rpm, 40시간 발효를 진행하였다. 발효 진행중에 2 ~ 6시간 간격으로 샘플을 채취하여 대사산물을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
여기서 사용된 배지의 조성은 하기 표 5 내지 7에 나타내었으며, HPLC 분석 조건은 하기 표 8에 나타내었다.
미량 원소 용액(Trace element solution)
성분 함량
ZnCl2 0.07 g (70 mg/L)
MnCl2·4H2O 0.1 g (100 mg/L)
H3BO3 0.6 g (60 mg/L)
CoCl2·6H2O 2 g (200 mg/L)
CuCl2·2H2O 0.02 g (20 mg/L)
NiCl2·6H2O 0.025 g (25 mg/L)
Na2MoO4·2H2O 0.35 g (35 mg/L)
HCl (37%) 4 mL
정제수 to 1,000 mL
플라스크 배지 조성 (Flask)
성분 농도 (g/L)
Crude glycerol 36
K2HPO4 10.7
KH2PO4 5.024
Yeast extract 1
(NH4)2SO4 2
CaCl2·2H2O 0.002
MgSO4·7H2O 0.2
FeSO4·7H2O 0.005
Trace element solution 0.1
발효기 배지 조성 (Fermentation)
성분 농도 (g/L)
Crude glycerol 24
K2HPO4 0.85
KH2PO4 0.33
Yeast extract 0
(NH4)2SO4 2
CaCl2·2H2O 0.002
MgSO4·7H2O 0.2
FeSO4·7H2O 0.005
Trace element solution 0.1
HPLC 분석 조건
분석장치 Agilent 1260 HPLC (Bio-rad 87H) (Column 300 x 7.8 mm)
이동상 5 mM H2SO4 solution
유량 0.6 ml/min
또한, 각 균주의 대사산물 생성량은 하기 표 9에 나타내었다.
ΔldhA ΔldhAΔaceA ΔldhAΔaceB ΔldhAΔaceAΔaceB
Glycerol consumed (g/L) 126.63 126.61 126.13 125.23
Cell growth (OD600) 18.90 16.51 17.00 15.60
1,3-Propanediol (g/L) 38.33 43.45 41.05 46.34
2,3-Butanediol (g/L) 13.51 14.84 14.62 12.60
Lactate (g/L) 0 0 0 0
Succinate (g/L) 4.69 2.45 4.44 1.78
Ethanol (g/L) 9.37 7.23 6.82 6.79
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, ldhA 유전자와 함께 aceA 또는 aceB 유전자가 결실된 변이주는 ldhA 유전자만 결실된 변이주에 비해 1,3-프로판디올 생성량이 각각 약 13% 및 7% 증가한 반면, 부산물인 숙신산(succinate) 및 에탄올(ethanol)의 생성량이 감소하였다.
또한 ldhA, aceA 및 aceB 유전자가 모두 결실된 변이주는 ldhA 유전자만 결실된 변이주에 비해 1,3-프로판디올 생성량이 약 21%로 현저히 증가하였고, ldhA 및 aceA, 또는 ldhA 및 aceB 유전자가 결실된 다른 변이주에 비해서도 1,3-프로판디올 생성량이 각각 약 6% 및 13% 증가하였다. 그리고 ldhA, aceA 및 aceB 유전자가 모두 결실된 변이주는 ldhA 유전자 또는 이와 다른 유전자가 결실된 변이주에 비해 숙신산 및 에탄올뿐만 아니라 2,3-부탄디올(2,3-butanediol)의 부산물 생성량이 현저히 감소하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> ActivON Co.,Ltd. <120> Mutant microorganism producing 1,3-propanediol and method for preparing 1,3-propanediol using the same <130> BPN221038 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhA up F <400> 1 cagccagacg ggaatagctt 20 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhA up R <400> 2 cgccaatttt ctggtgcttc agatatcgcc tcaaggtcga cgttgttaa 49 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhA down F <400> 3 ttaacaacgt cgaccttgag gcgatatctg aagcaccaga aaattggcg 49 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhA down R <400> 4 agctcgatgg ttcggcgatt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceA F <400> 5 atggagcatc tgcacatgaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceA R <400> 6 ttaaaactga tcttcttcgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceB F <400> 7 atgacgcagc aggcgacaat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aceB R <400> 8 ttaggccagc aggcggtagc 20

Claims (7)

  1. 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자, 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 유전자 및 말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자가 결실되어, 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 결실된 경우에 비해 에탄올 생산량이 3 내지 50% 감소되고 1,3-프로판디올 생산량이 3 내지 50% 증가된 변이 미생물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자, 이소시트레이트 리아제를 암호화하는 유전자 및 말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자가 결실된 변이 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 변이 미생물 또는 변이 미생물이 배양된 배지로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하며,
    상기 변이 미생물은 락테이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 결실된 변이 미생물에 비해 에탄올 생산량이 3 내지 50% 감소되고 1,3-프로판디올 생산량이 3 내지 50% 증가된 것인 1,3-프로판디올의 생산 방법.

  7. 삭제
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