KR20140058206A - 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 제조방법 - Google Patents

글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리세롤 발효미생물의 변이체를 이용하여 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 2,3-부탄디올 생산 대사경로가 차단되고, 동시에 이소부탄올 합성 대사경로가 이식된 변이균주 및 이를 이용하여 글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올을 동시에 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 바이오디젤 산업의 부산물인 폐글리세롤을 이용하여 고부가가치 산물인 1,3-프로판디올과 이소부탄올을 동시에 생산하여 산업적으로 유용하다.

Description

글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 제조방법 {Microorganism Variants Having Co-Producing Ability of 1,3-Propanediol and Isobutanol Using Glycerol or Crude Glycerol and Method for Co-Producing 1,3-Propanediol and Isobutanol Using the Same}
본 발명은 글리세롤 발효미생물의 변이체를 이용하여 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 2,3-부탄디올 생산 대사경로가 차단되고, 동시에 이소부탄올 합성 대사경로가 도입된 변이균주 및 이를 이용하여 글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올을 동시에 생산하는 방법에 관한 것이다.
폐글리세롤(crude glycerol)은 현행 바이오 디젤 제조 공정의 주된 부산물로서, 바이오 디젤 전체 생산량의 약 10%(w/w)에 해당하는 양이 발생한다(Johnson and Taconi, Environ Prog, 26:338, 2007). 이러한 폐글리세롤은 기존의 전통적인 글리세롤 시장의 가격에 영향을 미칠 뿐 아니라, 직접 환경에 방출될 수 없기 때문에 처리 비용 등 중요한 환경 문제 요인으로 대두되고 있다 (da Silva et al. Biotechnol Adv, 27:30, 2009). 따라서 저가의 폐글리세롤을 이용하여 연료 및 생리 활성 물질을 포함한 산업적으로 가치 있는 물질로 전환하기 위한 방법의 개발이 활발하게 진행 중이다.
글리세롤의 발효 대사가 가능한 미생물로는 통성 혐기성 균주인 시트로박터(Citrobacter)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 일리오박터(Ilyobacter)속, 크렙시엘라(Klebsiella)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 펠로박터(Pelobacter)속 등이 알려져 있으며, 발효미생물에 의해 글리세롤은 1,3-프로판디올로 전환될 수 있다(미국특허 제5,254,467호). 1,3-프로판디올은 폴리에스터(polyester), 폴리에테르(polyether), 혹은 폴리우레탄(polyurethanes) 등의 합성원료로 사용될 수 있는 물질로, 고기능성 의류, 카펫, 자동차, 직물 등의 섬유와 플라스틱, 필름 등의 다양한 용도로 쓰이고 있다. 특히 1,3-프로판디올과 텔레프탈릭산(terephtalic acid)의 중합반응에 의해 생성되는 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(polytrimethylene terephtalate, PTT)는 물성이 우수하고 유점이 228℃로 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 보다 낮아 실질적인 효용성이 높아 향후 PET를 대체할 수 있는 차세대 섬유재료로서 주목을 받고 있다. 또한, 1,3-프로판디올을 단량체로 하여 만든 플라스틱과 중합체는 부탄디올, 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)로 만든 제품보다 더 우수한 광학 안정성을 가지는 특성을 나타낸다. 또한 1,3-프로판디올은 폴리글리콜 형태(polyglycol-type)의 윤활제와 용매로 사용될 수 있어 글리세롤에 비해 그 상업적 가치를 높게 평가 받고 있다.
한편, 1,3-프로판디올과 마찬가지로 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(polytrimethylene terephtalate, PTT)의 70% 비중을 차지하는 텔레프탈릭산의 전구물질인 이소부탄올(Isobutanol)을 효모, 박테리아 등 다양한 미생물의 변이체를 이용하여 포도당을 비롯한 단당류, 이당류, 이당류로 생산하는 기술이 개발되었다(미국특허 제7,851,188호; 미국특허 제8,017,375호). 이러한 바이오매스 자원으로부터 텔레프탈릭산을 생산하는 기술은 100% 바이오 기반 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(polytrimethylene terephtalate, PTT)을 생산한다는 측면에서 매우 중요한 가치를 지닌다. 그러나 글리세롤로부터 젖산 또는 2,3-부탄디올의 생성없이 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 동시에 생산하는 방법에 대한 선행기술은 없었다.
이에, 본 발명자들은 바이오디젤 산업의 활성화로 인해 대량으로 발생하고 있는 글리세롤로부터 1, 3-프로판디올을 고수율로 생산하는 미생물의 변이체를 이용하여 1,3-프로판디올과 텔레프탈릭산의 전구물질인 이소부탄올을 동시에 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올의 동시 생성능을 가지는 변이 미생물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 이용한 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올의 동시 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락테이트 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase, LdhA)를 코딩하는 유전자와 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase, adc)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있어, 젖산과 2,3-부탄디올 생산 대사경로가 차단된 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 락테이트 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시켜 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산의 생산없이 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 미생물에서 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase, adc)를 코딩하는 유전자를 항생제 apramycin 내성 유전자로 치환하여 제거시키는 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 것으로 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물에 아세토락테이트 합성효소(acetolactate synthase, ilvIH), 케톨 에시드 리덕토이소머라제(ketol-acid reductoisomerase, ilvC), 다이하이드록시 에시드 탈수효소(dihydroxy-acid dehydratase, ilvD), 알파-케토이소발레레이트 탈탄산효소(alpha-ketoisovalerate decarboxylase, kivd), 및 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase, adh)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있어, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 제조된 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물에 아세토락테이트 합성효소(acetolactate synthase), 케톨 에시드 리덕토이소머라제(ketol-acid reductoisomerase), 다이하이드록시 에시드 탈수효소(dihydroxy-acid dehydratase), 알파-케토이소발레레이트 탈탄산효소(alpha-ketoisovalerate decarboxylase), 및 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입하여, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 동시에 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 회수하는 것으로 특징으로 하는 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시제조방법을 제공한다.
본 발명은 글리세롤 발효미생물의 변이체를 이용하여 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 제조방법을 제공하여, 바이오디젤 산업의 부산물인 폐글리세롤을 이용하여 고부가가치 산물인 1,3-프로판디올과 이소부탄올을 동시에 생산하여 산업적으로 유용하다.
도 1은 K. pneumoniae 변이균주에서 글리세롤로부터 1,3-프로판디올과 이소부탄올의 동시 생산 대사경로를 나타낸 것이다.
도 2는 K. pneumoniae ΔldhAΔadc 변이균주의 제작방법을 나타낸 것이다.
도 3은 이소부탄올 생산 대사 유전자 플라스미드 pBR-iBO의 제작방법을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 락테이트 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase, LdhA)를 코딩하는 유전자와 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase, adc)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있어, 젖산과 2,3-부탄디올 생산 대사경로가 차단된 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 유전자의 '결실' 이란 상기 유전자가 염색체상 또는 플라스미드 상에서 삭제되어 상기 유전자가 코팅하는 단백질을 생산할 수 없게 된 상태를 의미한다.
본 발명에 있어서, 미생물 변이체는 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산의 생산없이 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물에서 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase, adc)를 코딩하는 유전자를 결실시킨 균주를 제조하고, 상기 균주를 글리세롤 함유 배지에서 배양한 결과, 젖산과 2,3-부탄디올은 전혀 생성되지 않고 1,3-프로판디올이 주요산물로 생성되는 것을 확인하였다(표 1).
본 발명은 다른 관점에서, (a) 락테이트 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시켜 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산의 생산없이 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 미생물에서 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase, adc)를 코딩하는 유전자를 항생제 apramycin 내성 유전자로 치환하여 제거시키는 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, 상기 변이 미생물을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 것으로 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시예에서 락테이트 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase, LdhA)를 코딩하는 유전자만 결실한 Klebsiella pneumoniae ΔldhA 균주와 Klebsiella pneumoniae ΔldhA 균주에 추가적으로 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase, adc)를 코딩하는 유전자를 결실한 Klebsiella pneumoniae ΔldhAΔadc 균주의 대사산물을 비교한 결과, Klebsiella pneumoniae ΔldhA 균주는 젖산 생성없이 1,3-프로판올 7.8g/l 뿐만 아니라 2,3-부탄디올 2.3g/l를 생성한 데 비해, Klebsiella pneumoniae ΔldhAΔadc 균주는 젖산과 2,3-부탄디올 모두 전혀 생성하지 않고, 1,3-프로판올 8.3g/l를 생성한 것으 확인하였다.
본 발명은 또다른 관점에서, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산 또는 2,3-부탄디올의 생산없이 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물 Klebsiella pneumoniae Δ ldhA Δadc/pBR-iBO에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산 또는 2,3-부탄디올의 생산없이 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물 Klebsiella pneumoniae Δ ldhA Δadc/pBR-iBO 제조방법에 관한 것에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산 또는 2,3-부탄디올 생산 대사경로가 차단된 변이가 발생되어 있는 미생물을 제조하고, 제조된 변이 미생물이 글리세롤 또는 폐글리세롤을 단일 탄소원으로 하여 젖산 또는 2,3-부탄디올의 생산없이 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 동시에 생산할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 2,3-부탄디올이 생성되지 않으면서, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산의 생성없이 1,3-프로판디올을 생산하는 Klebsiellea pneumoniae ΔldhA에 acetolactate decarboxylase (adc) 유전자를 결실시키고, 아세토락테이트 합성효소(acetolactate synthase), 케톨 에시드 리덕토이소머라제(ketol-acid reductoisomerase), 다이하이드록시 에시드 탈수효소(dihydroxy-acid dehydratase), 알파-케토이소발레레이트 탈탄산효소(alpha-ketoisovalerate decarboxylase), 및 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 과발현하는 플라스미드가 도입된 K. pneumoniae ΔldhAΔadc/pBR-iBO를 제조하고, 상기균주가 2,3-부탄디올이 생성되지 않으면서, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산의 생성없이 1,3-프로판디올을 생산하는 것을 확인하였다.
본 발명은 또다른 관점에서, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산 또는 2,3-부탄디올의 생산없이 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물 Klebsiella pneumoniae Δ ldhA Δadc/pBR-iBO을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 동시에 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 회수하는 것으로 특징으로 하는 1,3-프로판디올 및 이소부탄올의 동시제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시예에서는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산 또는 2,3-부탄디올의 생산없이 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시 생성능을 가지는 변이 미생물 Klebsiella pneumoniae Δ ldhA Δ adc/pBR-iBO를 제조한 후, 이를 배양한 결과, 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 이용하여 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 동시에 생산할 수 있음을 확인하였다.
모균주인 Klebsiella pneumoniae Δ ldhA의 글리세롤 발효결과 1,3-프로판디올 및 2,3-부탄디올이 주요산물인데 비해, 젖산 또는 2,3-부탄디올의 생산없이 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물 Klebsiella pneumoniae ΔldhAΔ adc/pBR-iBO의 발효결과 2,3-부탄디올을 전혀 생산하지 않고, 1,3-프로판디올 및 아이소부탄올을 동시에 생산하는 것을 확인하였다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 이소부탄올 합성 대사경로가 이식된 글리세롤 발효미생물의 제작
1-1. 2,3- 부탄디올 생산 대사경로가 차단된 Klebsiella pnumoninae 변이균주의 제작
일차적으로 글리세롤로부터 젖산의 생성없이 1,3-프로판디올을 고수율로 생산하는 Klebsiella pneumoniae ΔldhA 균주(KCTC 11929BP)에서 2,3-부탄디올 생산 대사경로가 차단된 변이균주를 제작하였다 (도 1). Klebsiella pneumoniae에서 2,3-부탄디올 생산 대사경로가 차단된 변이균주의 염색체 상에 존재하는 acetolactate decarboxylase (adc) 유전자를 항생제 apramycin 내성 유전자로 치환하여 제거하였다 (도 2). adc 유전자의 상류와 하류부위 약 500 bp를 하기의 서열번호 1 내지 4로 표시되는 프라이머를 사용하여 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편을 주형으로 사용하여 하기의 프라이머 adcP1과 adcP4로 퓨전 PCR을 수행하였다. 생성된 DNA 단편을 pGEM TEasy 벡터를 이용하여 클로닝한 후, adc 유전자의 상류와 하류부위 사이에 apramycin 내성유전자를 삽입하였다. 제작된 DNA 카세트를 Klebsiella pneumoniae ΔldhA 균주의 염색체상으로 삽입된 변이균주 Klebsiella pneumoniae ΔldhAΔadc를 제작하였다.
서열번호 1 : ATCGAAAACGTCTCAAACCAGC
서열번호 2 :
GATCGTCGAGGACGTCGGTCGTTAACATAGACCTGACTGCTGAAGG
서열번호 3：
CCTTCAGCAGTCAGGTCTATGTTAACGACCGACGTCCTCGACGATC
서열번호 4 : CCTTAACTTTCTACGGAACGGA
1-2. 이소부탄올 합성 대사 유전자 플라스미드의 제작
실시예 1-1에서 제작된 Klebsiella pneumoniae ΔldhAΔadc 변이균주에서 이소부탄올 생산 대사를 활성화하기 위하여, Klebsiella pneumoniae가 원래 보유하고 있는 대사경로를 포함하여 피루브산(pyruvate)으로부터 이소부탄올의 생산에 관여하는 효소 유전자들을 과발현하는 플라스미드를 제작하였다(도 1, 도 3; acetolactate synthase (K. pneumoniae ilvIH; GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) accession number ABR75542.1,ABR75543.1), keto-acid reductoisomerase(K. pneumoniae ilvC; GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) accession number ABR79645.1), dihydroxy-acid dehydratase (K. pneumoniae ilvD; GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) accession number ABR79642.1), alpha-ketoisovalerate decarboxylase (Lactococcus lactis kivd; GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) accession number CAG34226.1), alcohol dehydrogenase (Lacto . lactis adh; GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) accession number AAK05905.1)). 도 3에서 나타낸 바와 같이, 양쪽 말단에 XbaI (TCTAGA), SpeI (ACTAGT) 제한효소 사이트를 부착한 ilvIH , ilvC , ilvD , kivd , adh 유전자들을 합성하여 pGEM TEasy 벡터에 클로닝 한 후, 미리 lacZ 프로모터를 삽입해 둔 pGEM -PlacZ 벡터에 순차적으로 연결하여 플라스미드 pGEM-iBO를 제작하였다. 또한 도 3에 나타낸 방법으로 pGEM-iBO으로부터 pBR-iBO를 제작하였다.
1-3. 이소부탄올 생산 Klebsiella pneumoniae 변이균주의 제작
상기에서 제작된 pBR-iBO 플라스미드를 전기충격법으로 K. pneumoniae ΔldhAΔadc 변이균주에 도입하여, apramycin이 첨가된 배지 (50μg/ml)에서 콜로니를 형성하는 재조합 균주들을 분리하였다. 그 결과, 형질전환 재조합균주 K. pneumoniae ΔldhAΔadc/pBR-iBO를 제작하였다.
실시예 2. 글리세롤을 탄소원으로 이용한 발효에 의한 1,3- 프로판디올과 이소부탄올의 동시 생산
250 ml 플라스크를 이용하여 Klebsiellea pneumoniae ΔldhAΔadc/pBR-iBO균주를 배양하여 1,3-프로판디올과 이소부탄올을 비롯한 다양한 대사산물의 생성량을 크로마토그래피법으로 분석하였다. 사용한 배지조성은 다음과 같으며, 20 g/l 글리세롤, 3.4 g/l K2HPO4, 1.3 g/l KH2PO4, 0.2 g/l MgSO4, 0.002 g/l CaCl22H2O, 1 g/l 효모추출물, 1 ml 철 용액 [5 g/l FeSO47H2O, 4 ml HCl(37%,w/v)] 및 1 ml 미량원소용액 [70 mg/l ZnCl2, 100 mg/l MnCl24H2O, 60 mg/l H3BO3, 200 mg/l CoCl24H2O, 20 mg/l CuCl22H2O, 25 mg/l NiCl26H2O, 35 mg/l Na2MoO42H2O, 4 ml HCl(37%,w/v)], 배양조건은 250 ml 플라스크에 유효용적을 5 0ml로하고, 최종농도가 IPTG 0.5 mM, 테트라사이클린 10 μg/ml으로 하였으며, 접종량은 2%, 배양온도 37°C, 교반속도 180 rpm으로 하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 배양 24시간째에 첨가해준 2%의 글리세롤을 모두 소모하고, 1,3-프로판디올, 에탄올, 숙신산과 아세트산이 각각 8.0 g/l, 1.3 g/l, 0.6 g/l, 0.4 g/l가 생성되었으며, 동시에 0.427 g/L의 이소부탄올이 생성되는 것으로 나타났다. 반면, adc 유전자가 결손된 결과로 2,3-부탄올은 전혀 생성되지 않는 것이 확인되었다.
한편, 모균주인 K. pneumoniae ΔldhA에서는 1,3-프로판디올과 함께 2,3-부탄디올이 생성되면서, 이소부탄올은 생성되지 않는 것으로 나타났다.
K. pneumoniae Δ ldhA Δ adc /pBR-iBO의 글리세롤 발효 대사체 분석
대사산물 (g/l) K. pneumoniae
ΔldhA 		K. pneumoniae
ΔldhAΔadc 		K. pneumoniae
ΔldhAΔadc/
pBR-iBO
Glycerol used 20.0 20.0 20.0
1,3-프로판디올 7.8 8.3 8.0
아이소부탄올 0.0 0.0 0.32
2,3-부탄디올 2.3 0.0 0.0
에탄올 1.0 1.4 1.3
젖산 0.0 0.0 0.0
숙신산 0.4 0.6 0.6
아세트산 0.5 0.8 0.4
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Microorganism Variants Having Co-Producing Ability of 1,3-Propanediol and Isobutanol Using Glycerol or Crude Glycerol and Method for Co-Producing 1,3-Propanediol and Isobutanol Using the Same <120> Microorganism Variants Having Co-Producing Ability of 1,3-Propanediol and Isobutanol Using Glycerol or Crude Glycerol and Method for Co-Producing 1,3-Propanediol and Isobutanol Using the Same <130> P12-B222 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide <400> 1 atcgaaaacg tctcaaacca gc 22 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide <400> 2 gatcgtcgag gacgtcggtc gttaacatag acctgactgc tgaagg 46 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide <400> 3 ccttcagcag tcaggtctat gttaacgacc gacgtcctcg acgatc 46 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide <400> 4 ccttaacttt ctacggaacg ga 22

Claims (19)

  1. 락테이트 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase, LdhA)를 코딩하는 유전자와 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase, adc)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있어, 젖산과 2,3-부탄디올 생산 대사경로가 차단된 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 박테리아는 크렙시엘라 속(genus Klebsiella), 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 클로스트리듐 속(genus Clostridium) 및 엔테로박터 속(genus Enterobacter)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물.
  4. 제1항의 1,3-프로판디올을 고생성능을 가지는 변이 미생물에 아세토락테이트 합성효소(acetolactate synthase, ilvIH), 케톨 에시드 리덕토이소머라제(ketol-acid reductoisomerase, ilvC), 다이하이드록시 에시드 탈수효소(dihydroxy-acid dehydratase, ilvD), 알파-케토이소발레레이트 탈탄산효소(alpha-ketoisovalerate decarboxylase, kivd), 및 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase, adh)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있어, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 크렙시엘라 속(genus Klebsiella), 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 클로스트리듐 속(genus Clostridium) 및 엔테로박터 속(genus Enterobacter)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 아세토락테이트 합성효소(acetolactate synthase)를 코딩하는 유전자는 크랩시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae) 유래인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 케톨 에시드 리덕토이소머라제(ketol-acid reductoisomerase)를 코딩하는 유전자는 크랩시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae) 유래인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  9. 제4항에 있어서, 상기 다이하이드록시 에시드 탈수효소(dihydroxy-acid dehydratase)를 코딩하는 유전자는 크랩시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae) 유래인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  10. 제4항에 있어서, 상기 알파-케토이소발레레이트 탈탄산효소(alpha-ketoisovalerate decarboxylase)를 코딩하는 유전자는 락토코커스 락티스(Lacto . lactis) 유래인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  11. 제4항에 있어서, 상기 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 락토코커스 락티스(Lacto . lactis) 유래인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  12. 다음의 단계를 포함하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법:
    (a) 락테이트 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase, LdhA)를 코딩하는 유전자를 결실시켜 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 젖산의 생산없이 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득된 미생물에서 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase, adc)를 코딩하는 유전자를 항생제 apramycin 내성 유전자로 치환하여 제거시키는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 박테리아는 크렙시엘라 속(genus Klebsiella), 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 클로스트리듐 속(genus Clostridium) 및 엔테로박터 속(genus Enterobacter)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법.
  15. 제12항에 의해 제조된 변이 미생물에 아세토락테이트 합성효소(acetolactate synthase), 케톨 에시드 리덕토이소머라제(ketol-acid reductoisomerase), 다이하이드록시 에시드 탈수효소(dihydroxy-acid dehydratase), 알파-케토이소발레레이트 탈탄산효소(alpha-ketoisovalerate decarboxylase), 및 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입하여, 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 박테리아는 크렙시엘라 속(genus Klebsiella), 락토바실러스 속(genus Lactobacillus), 클로스트리듐 속(genus Clostridium) 및 엔테로박터 속(genus Enterobacter)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글리세롤 또는 폐글리세롤로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올 동시생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하는 방법.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변이 미생물을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 것으로 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법.
  19. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항의 변이 미생물을 글리세롤 또는 폐글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 동시에 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올 및 이소부탄올을 회수하는 것으로 특징으로 하는 1,3-프로판디올 및 이소부탄올의 동시제조방법.
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