WO2014083920A1 - １，４－ブタンジオールの製造方法及び微生物 - Google Patents

１，４－ブタンジオールの製造方法及び微生物 Download PDF

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coa
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青木　裕史
謙 小木戸
陽子 橋本
米田　正
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昭和電工株式会社
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    • C12Y101/01157—3-Hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (1.1.1.157)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 1,4-butanediol and a microorganism.
  • 1,4-butanediol is a compound that is expected to be converted to biomass.
  • 1,4-Butanediol is widely used as a raw material for synthesis of fine organic chemicals, monomer units of polyester and engineering plastics, and the market scale is large. For this reason, there is an increasing demand for a method for efficiently producing 1,4-butanediol by a biochemical process using renewable resources such as biomass as a raw material.
  • Examples of the method for producing 1,4-butanediol using a biochemical process include the methods described in Patent Documents 1 to 2 and Non-Patent Document 1.
  • Patent Documents 1 to 2 and Non-Patent Document 1 have complicated processes.
  • the present invention includes the following. [1] Using a microorganism and / or its culture, 1,4-butanediol is produced using an enzyme reaction system that sequentially passes through 3-hydroxybutyryl CoA, crotonyl CoA, and 4-hydroxybutyryl CoA.
  • the 3-hydroxybutyryl CoA is an optically active substance
  • the microorganism is (1) Gene encoding enoyl CoA hydratase (2) Gene encoding vinyl acetyl CoA delta isomerase (3) Gene encoding 4-hydroxybutyryl CoA dehydratase (4) Substrate specificity is the above-mentioned 3-hydroxybutyryl A method for producing 1,4-butanediol, which comprises a gene encoding an acyl CoA reductase having an optical selectivity opposite to that of CoA.
  • the microorganism further comprises a gene encoding acetoacetyl CoA reductase that gives optically active 3-hydroxybutyryl CoA.
  • the method for producing 1,4-butanediol according to [1].
  • the acetoacetyl CoA reductase is acetoacetyl CoA reductase (EC number: 1.1.1.136), 3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase (EC number: 1.1.1.135) or 3-hydroxy Acyl CoA dehydrogenase (EC number: 1.1.1.157), The method for producing 1,4-butanediol according to [2].
  • the gene encoding acetoacetyl CoA reductase is a gene according to any of the following (a) to (c): The method for producing 1,4-butanediol according to [2].
  • the acetoacetyl CoA reductase is an acetoacetyl CoA reductase (EC number: 1.1.1.16), 3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase (EC number: 1.1.1.135) or 3-hydroxy
  • the gene encoding the acetoacetyl CoA reductase is a gene according to any one of the following (a) to (c): [7] The microorganism according to [7].
  • the microorganism is Escherichia coli, yeast, coryneform bacterium, Clostridium bacterium, The microorganism according to [6].
  • CoA means “Coenzyme A”.
  • % Means “mass%” unless otherwise specified.
  • Ppm is based on mass.
  • This embodiment uses an enzyme reaction system for producing 1,4-butanediol using microorganisms through 3-hydroxybutyryl CoA, crotonyl CoA, and 4-hydroxybutyryl CoA in this order.
  • one of the features of the present invention is a method using a microorganism or a culture thereof that can selectively produce 1,4-butanediol with high productivity.
  • 3-hydroxybutyryl CoA as a substrate (may be an intermediate, a precursor, etc.) by an enzyme reaction system using microorganisms. Inhibits the enzymatic reaction pathway to produce 3-hydroxybutanal from microbial 3-hydroxybutyryl CoA in a process for producing 1,4-butanediol via crotonyl CoA and 4-hydroxybutyryl CoA sequentially As a result, the production of 1,3-butanediol from 3-hydroxybutyryl CoA was suppressed, and as a result, the production efficiency of 1,4 butanediol was improved.
  • the present inventors As a method for suppressing the enzyme reaction pathway for producing 3-hydroxybutanal from microbial 3-hydroxybutyryl CoA, the present inventors have developed an optically active 3-hydroxybutyryl CoA. The present inventors have found that it is effective to use an acyl CoA reductase having an optical selectivity opposite to that. That is, it has been found that it is effective to select either the S-form or R-form of 3-hydroxybutyryl CoA and to use an acyl CoA reductase having high selectivity for the opposite chiral.
  • the characteristics of the microorganism, the method for producing the microorganism, the method for using the microorganism (that is, the method for producing 1,4-butanediol), the method for obtaining the produced 1,4-butanediol, and the like used in this embodiment Will be described.
  • the host microorganism used in the present embodiment is not particularly limited as long as it is a host microorganism into which various genes described below can be introduced, and can be applied with a genetic recombination technique.
  • 1,4-butanediol is produced under appropriate culture conditions described later via crotonyl CoA and 4-hydroxybutyryl CoA in this order using 3-hydroxybutyryl CoA as a substrate. And can be transformed into a microorganism having a function of inhibiting the enzyme reaction pathway for producing 3-hydroxybutanal from 3-hydroxybutyl CoA.
  • host microorganisms that can be used in the present embodiment include Escherichia coli, yeast, coryneform bacteria, and Clostridium bacteria from the viewpoint of industrial use.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kriveromyces lactis, Kriveromyces marxianus and the like.
  • Coryneform bacteria include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Brevibacterium divaricatam, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariofilm, Brevibacterium lactofermentum, Brevi Bacterium Roseum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium carnae, Corynebacterium lilium, Corynebacterium Examples include melase cola, microbacteria and ammonia film.
  • Clostridium kriveli Clostridium acetobutylicum, Clostridium aminobutyricum, Clostridium begerinky, Clostridium saccharoperbutylacetonicum and the like.
  • Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Corynebacterium glutamicum because it is easy to transform, and it is more preferable to use Escherichia coli.
  • the transformed microorganism in the present embodiment may be used in the form of cultured microorganisms themselves or in various forms of the culture.
  • the culture of microorganisms in this embodiment is a suspension of microorganism cultured cells in a medium such as a medium or a buffer, a cell-free extract from the microorganism cultured cells, and further from the cell-free extract. Includes processed products such as those obtained by concentrating, purifying and extracting components that catalyze the reaction
  • the culture of microorganisms in this embodiment further includes a product obtained by immobilizing the processed microorganism product on a poorly soluble carrier.
  • immobilization carriers examples include polyacrylamide, polyvinyl alcohol, poly-N-vinylformamide, polyallylamine, polyethyleneimine, methylcellulose, glucomannan, alginate, carrageenan, and the like, as well as copolymers and cross-linked products thereof.
  • the compound which forms the poorly water-soluble solid content which encapsulated the microbial cell of this or its processed material is mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
  • microorganisms or their extract liquid / extraction components retained on a solid object such as activated carbon, porous ceramics, glass fiber, porous polymer molded body, nitrocellulose membrane, etc. It can also be used as a product.
  • the transformed microorganism used in the present embodiment further includes at least 3-hydroxybutyryl CoA as a substrate and crotonyl CoA and 4-hydroxybutyryl CoA sequentially.
  • the transformed microorganism according to the present embodiment is an S-form of R, R of 3-hydroxybutyryl CoA as one method for suppressing the enzyme reaction pathway for producing 3-hydroxybutanal from 3-hydroxybutyryl CoA.
  • the body has an acyl CoA reductase that has a high selectivity for chirality, which is the opposite of that. Preferably, it does not have an acyl CoA reductase having high selectivity for the S form or R form itself.
  • the gene encoding enoyl CoA hydratase used in the present embodiment is not particularly limited as long as it is a gene encoding an enzyme that catalyzes a reaction of dehydrating 3-hydroxybutyryl CoA to produce crotonyl CoA.
  • a specific example of a gene encoding an enzyme that catalyzes a reaction for producing crotonyl CoA from (S) -3-hydroxybutyryl CoA used in this embodiment is not particularly limited, but enoyl CoA hydratase (EC number: A gene encoding 4.2.1.17) or a homologue thereof.
  • enoyl CoA hydratase EC number: A gene encoding 4.2.1.17
  • J.M. M.M Metabolism of poly- ⁇ -hydroxybutyrate.
  • Non-patent literatures and the like can be referred to.
  • a specific example of a gene encoding an enzyme that catalyzes a reaction for producing crotonyl CoA from (R) -3-hydroxybutyryl CoA used in the present embodiment is not particularly limited, but enoyl CoA hydratase (EC No .: 4.2.155 (3-hydroxybutyryl CoA dehydratase) or EC number: 4.2.119) or a homologue thereof.
  • enoyl CoA hydratase EC No .: 4.2.155 (3-hydroxybutyryl CoA dehydratase) or EC number: 4.2.119
  • Fukui, T .; Shiomi, N. And Doi, Y.
  • the gene encoding vinylacetyl CoA delta isomerase is not particularly limited as long as it is a gene encoding an enzyme that catalyzes a reaction of rearranging the olefin of crotonyl CoA to produce vinylacetyl CoA.
  • the enzyme that catalyzes the reaction described above include, but are not limited to, vinylacetyl CoA delta isomerase (EC number: 5.3.3.3) or a homologue thereof.
  • vinylacetyl CoA delta isomerase EC number: 5.3.3.3
  • a homologue thereof for details of the above-mentioned enzyme, for example, Fermentation of 4-aminobutyrate by Clostridium aminobutyricum: Cloning of two-genes involved in the formation and dehydration.
  • Fermentation of 4-aminobutyrate by Clostridium aminobutyricum Cloning of two-genes involved in the formation and dehydration.
  • Non-patent literature such as can be referred to.
  • the gene encoding 4-hydroxybutyryl CoA dehumanlatase is not particularly limited as long as it is a gene encoding an enzyme that catalyzes the reaction of hydrating vinylacetyl CoA to produce 4-hydroxybutyryl CoA. Not.
  • the enzyme that catalyzes the reaction described above include, but are not limited to, 4-hydroxybutyryl CoA dehydratase (EC number: 4.2.1.120) or a homologue thereof.
  • 4-hydroxybutyryl CoA dehydratase EC number: 4.2.1.120
  • Fermentation of 4-aminobutyrate by Clostridium aminobutyricum Cloning of two-genes involved in the formation and dehydration.
  • Non-patent literature such as can be referred to.
  • the case in this non-patent document relates to a complex enzyme of 4-hydroxybutyryl CoA dehydratase and the aforementioned vinylacetyl CoA delta isomerase (EC number: 5.3.3.3) and a gene encoding the same. It is.
  • genes encoding each enzyme may be used separately, or genes encoding enzyme proteins or catalytic subunits may be used.
  • the gene encoding acyl CoA reductase is a gene encoding an enzyme that catalyzes a reaction that reduces 4-hydroxybutyryl CoA to produce 4-hydroxybutanal.
  • the gene encoding the acyl CoA reductase in the present embodiment is (S) -3-hydroxy when (R) -3-hydroxybutyryl CoA is produced in the upstream step of producing 3-hydroxybutyryl CoA.
  • a butyryl-CoA selective acyl-CoA reductase is used.
  • (R) -3-hydroxybutyryl CoA is produced in the upstream process for producing 3-hydroxybutyryl CoA
  • (R) -3-hydroxybutyryl CoA selective acyl CoA reductase is used.
  • aldehyde dehydrogenase acylation
  • a homologue thereof EC number: 1.2.1.10
  • the obtained 4-hydroxybutanal is led to 1,4-butanediol by an alcohol reductase usually possessed by the host described later, but a gene encoding the alcohol reductase is additionally expressed, 1,4-butanediol may be produced.
  • the gene can be introduced into the host microorganism by linking the above gene or a part thereof to an appropriate vector by using various known methods such as a restriction enzyme / ligation-based method, an In-Fusion cloning method, etc. It is possible to introduce the obtained recombinant vector into a host so that the target gene can be expressed. Alternatively, it is possible to insert the gene of interest or a part thereof at any position on the genome by homologous recombination. “Part” refers to a part of each gene capable of expressing the protein encoded by each gene when introduced into a host.
  • the gene includes DNA and RNA, preferably DNA.
  • the vector for ligating the gene is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and examples thereof include plasmids, phages and cosmids used for introducing foreign genes in E. coli.
  • the plasmid include pHSG398, pUC18, pBR322, pSC101, pUC19, pUC118, pUC119, pACYC117, pBluescript II SK (+), pET17b, pETDuet-1, pACYCDuet-1, pCDFDuDet, pCDFDuDet, et
  • the phage include ⁇ gt10, Charon 4A, EMBL-, M13mp18, M13mp19, and the like. Some of these are commercially available, and commercially available products (kits) can be used as they are or after being appropriately modified.
  • an appropriate expression promoter may be connected upstream of the inserted gene in order to ensure that the inserted gene is expressed.
  • the expression promoter to be used is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the host.
  • the promoter region of the Frd gene that is a nitrate reductase gene can also be used.
  • a method for gene disruption a known method used for gene disruption in E. coli can be used. Specifically, a method of destroying the gene using a vector (targeting vector) that causes homologous recombination at an arbitrary position of the target gene (gene targeting method), or a trap vector (promoter at an arbitrary position of the target gene).
  • a method used when producing knockout cells or the like in this technical field such as a method of destroying the gene by inserting a reporter gene that does not have it and losing its function (gene trap method), a method of combining them, etc. I can do it.
  • the position at which homologous substitution occurs or the position at which the trap vector is inserted is not particularly limited as long as it causes a mutation that eliminates the expression of the target gene to be disrupted, but is preferably a transcriptional regulatory region.
  • the method for introducing the vector into the host is not particularly limited, and examples thereof include a method using calcium ions, a protoplast method, and an electroporation method that are generally used for vector introduction into E. coli. Can do.
  • the target gene is inserted into a sequence homologous to the sequence on the genome together with a promoter, and this nucleic acid fragment is introduced into the cell by electroporation. Can be carried out by causing homologous recombination.
  • a strain in which homologous recombination has occurred can be easily selected by using a nucleic acid fragment in which a target gene and a drug resistance gene are linked.
  • a gene linked to a drug resistance gene and a gene that becomes lethal under specific conditions is inserted into the genome by homologous recombination by the above method, and then becomes lethal under specific conditions with the drug resistance gene.
  • the target gene can also be introduced by homologous recombination in the form of replacing the gene.
  • a method for selecting a recombinant microorganism into which a target gene is introduced is not particularly limited, but a method by which only a recombinant microorganism into which a target gene has been introduced can be easily selected is preferable.
  • FIG. 1 shows an example of an enzyme system of the method for producing 1,4-butanediol according to this embodiment.
  • 1,4-butanediol can be obtained using a culture in which the above-described series of genes are expressed in the microorganism by transformation or the like.
  • a gene is inserted in arbitrary vectors individually or as a series of clusters, and a host microorganism is transformed.
  • Each gene is expressed by culturing the obtained transformant in a medium using an appropriate carbon source, for example, glucose as a carbon source.
  • an appropriate carbon source for example, glucose as a carbon source.
  • the gene is expressed by culturing the transformant in a medium.
  • each encoded gene is expressed by adding an induction substrate and moving to an inductive environment.
  • the culture in the present embodiment includes all the usual culture conditions for microbial culture, and the culturing step means culturing for a sufficient time and condition for the microorganism to produce 1,4-butanediol. Means that.
  • butanediol produced by a combination of general enzymes encoded by the gene of the present embodiment is a mixture resulting from co-production of 1,3-butanediol and 1,4-butanediol. That is, when enoyl CoA hydratase and 4-hydroxybutyryl CoA dehydratase act in the presence of the precursor (or intermediate) 3-hydroxybutyryl CoA, 3-hydroxybutyryl CoA and 4-hydroxybutyrate are rapidly activated by these actions. An equilibrium state of butyryl CoA is formed.
  • (R) (or (S))-3-hydroxybutyryl CoA selective acyl-CoA reductase has reactivity with 4-hydroxybutyryl CoA and (R) (or (S))
  • acyl CoA reductase having reactivity with 3-hydroxybutyryl CoA.
  • it refers to those having a reactivity of 0.02 times or more, more preferably 0.2 times or more of the reactivity of the corresponding opposite phase optical isomer.
  • the substrate specificity of the enzyme is determined by coupling free CoA generated by a reduction reaction using each substrate with a coloring dye DTNB (5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)) for a certain time. It can be confirmed by a method of measuring the absorbance and the like. In addition, a conventional method for quantifying CoA produced sequentially as the reduction reaction proceeds may be used.
  • DTNB 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid
  • the ratio of the above can also be grasped by information such as high performance liquid chromatography (HPLC) or gas chromatography (GC) It can be relatively evaluated that the enzyme responsible for the reduction step is the desired chiral selective acyl-CoA reductase.
  • the method for producing 1,4-butanediol is not particularly limited, and various known methods can be used.
  • ⁇ -ketothiolase which gives acetoacetyl CoA by releasing one molecule of CoA from two molecules of acetyl CoA under the supply of acetyl CoA obtained by a known reaction pathway such as glycolysis.
  • Acetoacetyl-CoA is supplied using an enzyme reaction using a gene encoding 2.3.1.9) or a homologue thereof.
  • acetoacetyl CoA synthase (EC number: 2.3.1.194) that catalyzes a reaction for irreversibly producing acetoacetyl CoA or a homolog thereof is used. Then, acetoacetyl CoA may be supplied.
  • acetoacetyl CoA synthase see, for example, Unpreceded acetoacetyl-coenzyme A synthesizing enzyme of the thiolase infused in the mepaloneate. , Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A. 107, 11265-11270 (2010).
  • Non-patent literature such as can be referred to.
  • acetoacetyl CoA reductase EC number: 1.1.1.1.36
  • 3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase catalyst for the reaction of reducing the obtained acetoacetyl CoA to give 3-hydroxybutyryl CoA
  • EC number: 1.1.1.35 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase
  • an enzyme reaction using these homologs can give 3-hydroxybutyryl CoA. it can.
  • propionate CoA transferase (EC number: 2.8.3.1) is known as an enzyme that directly transfers CoA to 3-hydroxybutanoic acid.
  • S (or (R)) to a microorganism or a culture containing the microorganism under expression of a gene encoding a propionate CoA transferase or a homolog thereof and supply of acetyl CoA serving as a donor of a CoA transfer reaction
  • S (or (R))-3-hydroxybutyryl CoA corresponding to the chirality of the supplied 3-hydroxybutanoic acid can be generated.
  • the homolog in this embodiment includes an ortholog and a paralog.
  • the ortholog refers to a gene corresponding to a species generated by speciation from a common ancestral gene and a set of enzymes obtained from the gene.
  • Paralog refers to a gene corresponding to a species generated by gene duplication rather than speciation in the same species and an enzyme obtained from the gene.
  • a homolog refers to a gene having sequence identity regardless of an ortholog or paralog and an enzyme obtained from the gene.
  • the homologue (gene) of the gene described above is a gene having a base sequence having 90% or more identity, preferably 95% or more identity to the gene, more preferably the gene. Or a gene in which one or several of its bases are deleted, substituted or added.
  • the homologous gene includes a gene that hybridizes under stringent conditions with a gene having a base sequence complementary to the target gene.
  • a homology search program for a known database for example, BLAST, FASTA
  • a probe consisting of at least a part of an identified gene base sequence complementary to DNA consisting of the base sequence of the gene
  • PCR polymerase chain reaction
  • the conditions for hybridization are 6 ⁇ SSC (composition of 1 ⁇ SSC: 0.15M sodium chloride, 0.015M sodium citrate, pH: 7.0), 0.5% SDS, This is a condition in which a solution containing 5 ⁇ Denhart solution and 100 mg / mL herring sperm DNA is kept at a constant temperature at 65 ° C. for 8 to 16 hours together with the probe and hybridized.
  • the reaction of the present invention is most conveniently performed by, for example, cultivating a transformant in a nutrient medium such as LB medium at a temperature of 15 ° C. to 40 ° C., preferably 18 ° C. to 37 ° C. for about 24 hours.
  • a nutrient medium such as LB medium
  • 0.01 to 50%, preferably 0.1 to 30% glucose is transferred to a medium containing carbon as a carbon source, followed by culturing at the same temperature for about 1 hour to 200 hours.
  • the carbon source may be added continuously or intermittently according to the consumption of the carbon source due to the growth and reaction of the bacteria. In this case, the concentration of the carbon source in the reaction solution is not limited to the above.
  • sugars such as glucose, sucrose and fructose, polyols such as glycerol, organic substances such as ethanol, acetic acid, citric acid, succinic acid, lactic acid, benzoic acid and fatty acids, or alkalis thereof Metal salts, aliphatic hydrocarbons such as n-paraffins, aromatic hydrocarbons, or natural organic substances such as peptone, meat extract, fish extract, soy flour, bran, etc., alone or in combination, usually 0 It can be used at a concentration of about 0.01% to 30%, preferably about 0.1% to 20%.
  • inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, sodium nitrate and potassium nitrate, nitrogen-containing organic substances such as urea and uric acid, peptone, meat extract, fish extract, soybean powder, etc.
  • nitrogen-containing organic substances such as urea and uric acid, peptone, meat extract, fish extract, soybean powder, etc.
  • fungi with metal salts such as phosphates such as potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, calcium acetate, manganese chloride, copper sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, nickel sulfate Can be added to improve enzyme activity.
  • the addition concentration varies depending on the culture conditions, but is usually about 0.01% to 5% for phosphate, 10 ppm to 1% for magnesium salt, and about 0.1 ppm to 1,000 ppm for other compounds.
  • yeast extract, casamino acid, and yeast nucleic acid can be added as a source of vitamins, amino acids, nucleic acids and the like to improve bacterial growth and enzyme activity.
  • the pH of the medium should be adjusted to 4.5-9, preferably 5-8.
  • microbial cells previously cultured in the medium as described above are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or membrane filtration, and water containing the reaction raw material, physiological saline, or a pH equivalent to the culture pH. Suspending and reacting again in a buffer solution consisting of these salts with phosphoric acid, acetic acid, boric acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane, etc. adjusted to reduce the impurities in the reaction solution. It is useful to simplify the fractionation of the product.
  • the pH during the reaction can usually be maintained when a buffer solution having a sufficient concentration is used, but when the pH deviates from the above due to the progress of the reaction, sodium hydroxide, ammonia or the like is used so that the same pH is obtained. It is desirable to adjust accordingly.
  • reaction rate decreases due to accumulation of 1,4-butanediol in the reaction solution
  • water, physiological saline, reaction buffer, etc. are added to the reaction solution according to the product concentration.
  • the method of diluting to a suitable value is preferred.
  • the bacteria are collected, the supernatant is recovered as a product solution, and the collected bacteria are returned to the solution or suspension containing the reaction raw material again to restore the reaction rate.
  • This operation can be carried out continuously or batchwise using a centrifuge, a separation membrane or the like.
  • the separation, recovery and purification of 1,4-butanediol produced in the reaction solution is carried out by removing the cells from the reaction solution by centrifugation when the production amount of 1,4-butanediol reaches a substantial amount. Or in the reaction solution as it is, by using means for separation and recovery of general organic compounds and purification. For example, extraction is performed using a suitable organic solvent from a filtrate obtained by removing bacterial cells and the like from the culture solution. In addition to distilling off this extract as it is, high-purity 1,4-butanediol can be obtained by re-extraction with an appropriate solvent, purification using silica gel or other chromatography, or multistage distillation. can get.
  • Table 1 shows a summary of the assumed reaction steps, enzymes that catalyze each reaction step, and the sequence numbers of the genes used that encode the enzymes.
  • the sequence number in the gene corresponds to the sequence number in the sequence listing.
  • a plasmid pETBD2 containing sequence 2 was obtained by inserting the gene sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the NdeI site of pET17b as a target.
  • the EcoRI site derived from the pET17b multicloning site located downstream of the stop codon of sequence 1 of pETBD1 was cleaved by restriction enzyme treatment to prepare an open ring fragment of pETBD1.
  • the obtained two fragments were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit to obtain plasmid pETBD1-2 containing sequences 1 and 2.
  • SEQ ID NOS: 4, 6, and 7 were sequentially added with the sequence downstream of sequence 2 of pETBD1-2 as a target to obtain plasmid pETBD1-2-4-6-7.
  • opening of the inserted plasmid is performed by cleavage with an appropriate restriction enzyme site on the vector that does not cleave the inserted sequence, and when there is no such site. This was performed by inverse PCR from the target insertion site.
  • Escherichia coli pETBD1-2-4-6-7 / JM109 (DE3) was obtained by transforming Escherichia coli JM109 (DE3) strain.
  • Example 1 In the same manner as in Comparative Example 1, the genes of sequences 2 and 4 on plasmid pETBD1-2-4-6-7 were replaced with the genes of SEQ ID NOs: 3 and 5 encoding the enzyme corresponding to the enzyme that catalyzes the step.
  • a substituted plasmid pETBD1-3-5-6-7 was prepared and transformed into E. coli pETBD1-3-5-6-7 / JM109 (DE3).
  • the transformants obtained in Examples and Comparative Examples were cultured in 5 mL of LB medium containing 100 mg / L of ampicillin at 37 ° C. for 12 hours under aerobic conditions.
  • the culture solution (0.1 mL) was transplanted to 5 mL of LB medium containing 1% glucose, ampicillin 100 mg / L, and IPTG 0.2 mM, and cultured under aerobic conditions at 30 ° C. for 48 hours.
  • the culture supernatant was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC: column; Shodex SH-1011 (manufactured by Showa Denko)), column temperature: 60 ° C., eluent: 25 mM sulfuric acid aqueous solution, flow rate 0.6 mL / min, detection: differential refraction detection Was used for the test.
  • Table 2 shows the relationship between the gene constituting the plasmid of the transformant used and the amount of 1,4-butanediol produced in the culture solution.
  • Example 1 the production ratio of 1,4-butanediol (production amount of 1,4-butanediol / production amount of 1,3-butanediol) in Example 1 is the same as that in Comparative Example 1. It was about 1.5 times.
  • the difference in the ratio between 1,3-butanediol and 1,4-butanediol obtained extracellularly is the process of the catalytic reaction of acyl CoA reductase, which is a process in which CoA is removed and derived extracellularly. It is thought to depend on the selectivity for each CoA intermediate.
  • reaction route so as to pass through a 3-hydroxybutyryl CoA intermediate having an appropriate chirality for the chiral selectivity of acyl CoA reductase, more specifically, by acyl CoA reductase
  • an enzyme that catalyzes the reaction and a gene encoding the enzyme so as to pass through 3-hydroxybutyryl CoA having a chirality that is difficult to be converted / extracted, 1,
  • a method for producing 4-butanediol can be provided.
  • the set chirality of 3-hydroxybutyryl CoA can be obtained.
  • an acyl CoA reductase that is difficult to convert and excrete and a gene encoding the enzyme a method for producing 1,4-butanediol having higher productivity can be provided.

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Abstract

　微生物及び／又はその培養物を用いて、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡ、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを順次経由する酵素反応系を利用して１，４－ブタンジオールを製造する方法であって、前記３－ヒドロキシブチリルＣｏＡが光学活性体であり、前記微生物は、（１）エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（２）ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼをコードする遺伝子（３）４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子（４）基質特異性が、前記３－ヒドロキシブチリルＣｏＡとは逆の光学選択性を有するアシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、１，４－ブタンジオールの製造方法。

Description

１，４－ブタンジオールの製造方法及び微生物
　本発明は１，４－ブタンジオールの製造方法及び微生物に関する。
　近年、化石資源の枯渇や地球温暖化対策などの観点から、再生可能資源を原料とした化合物製造プロセスが注目されている。特に、バイオマスを原料として、生物化学的プロセスで種々のポリマー原料化合物や化学品原料化合物を製造する、所謂バイオリファイナリーが広く検討されている。
　バイオマスへの原料転換が期待されている化合物として、１，４－ブタンジオールが挙げられる。１，４－ブタンジオールは、精密有機化学品の合成原料、ポリエステル及びエンジニアリングプラスチックのモノマー単位などで広く使用されており、その市場規模は大きい。そのため、バイオマスなどの再生可能資源を原料とした生物化学的プロセスで、効率良く１，４－ブタンジオールを製造する方法に対する要求が大きくなっている。
　生物化学的プロセスを用いた１，４－ブタンジオールの製造方法としては、例えば、特許文献１乃至２及び非特許文献１に記載された方法が挙げられる。
特許第４３８０７０４号明細書 国際公開２００８／１１５８４０号公報 Ｈａｒｒｙ　Ｙｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，　　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｆｏｒ　ｄｉｒｅｃｔ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　７，　４４５－４５２　（２０１１）．
　しかしながら、特許文献１乃至２及び非特許文献１に記載された方法は、プロセスが複雑である。
　上記課題に対して、１，４－ブタンジオールの選択的、経済的な製造方法を提供する。
　本発明は以下のものを含む。
［１］微生物及び／又はその培養物を用いて、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡ、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを順次経由する酵素反応系を利用して１，４－ブタンジオールを製造する方法であって、
　前記３－ヒドロキシブチリルＣｏＡが光学活性体であり、
　前記微生物は、
　（１）エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子
　（２）ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼをコードする遺伝子
　（３）４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子
　（４）基質特異性が、前記３－ヒドロキシブチリルＣｏＡとは逆の光学選択性を有するアシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子
　を含むことを特徴とする、１，４－ブタンジオールの製造方法。
［２］前記微生物は更に、光学活性な３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを与えるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を含む、
　［１］に記載の１，４－ブタンジオールの製造方法。
［３］前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼが、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）である、
　［２］に記載の１，４－ブタンジオールの製造方法。
［４］前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である、
　［２］に記載の１，４－ブタンジオールの製造方法。
　（ａ）配列番号３の塩基配列を有する遺伝子
　（ｂ）配列番号３の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号３の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
　（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子。
［５］前記アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である、［１］に記載の１，４－ブタンジオールの製造方法。
　（ａ）配列番号７の塩基配列を有する遺伝子
　（ｂ）配列番号７の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号７の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
　（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
［６］（１）エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子
　（２）ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼをコードする遺伝子
　（３）４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子
　（４）３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに対する基質特異性が光学選択的であるアシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子及び
　（５）３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに対する基質特異性が前記アシルＣｏＡ還元酵素とは逆の光学選択性を有するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子
　を含むことを特徴とする微生物。
［７］前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼが、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）である、［６］に記載の微生物。
［８］前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である、
　［７］に記載の微生物。
　（ａ）配列番号３の塩基配列を有する遺伝子
　（ｂ）配列番号３の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号３の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
　（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子。
［９］前記アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である、［６］に記載の微生物。
　（ａ）配列番号７の塩基配列を有する遺伝子
　（ｂ）配列番号７の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号７の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
　（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
［１０］前記微生物は、大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌である、
　［６］に記載の微生物。
　１，４－ブタンジオールの選択的、経済的な製造方法を提供できる。
本実施形態の１，４－ブタンジオールの製造方法の酵素系の一例である。
　以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、「ＣｏＡ」とは、「コエンザイムＡ」を意味する。また、「％」は、特に記載のない限り、「質量％」を意味する。「ｐｐｍ」は質量基準である。
　本実施形態は、微生物を用いて、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡ、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを順次経由して、１，４－ブタンジオールを製造する酵素反応系を利用する。ここで、本発明の特徴の１つは、１，４－ブタンジオールを選択的に、高い生産性で製造し得る微生物又はその培養物を用いる方法である。
　本発明者らは、上記課題を解決する手段を鋭意研究した結果、微生物を用いて酵素反応系により、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質（中間体、前駆体などであっても良い。）として、クロトニルＣｏＡ、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを順次経由して、１，４－ブタンジオールを製造する方法において、微生物の３－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブタナールを生成する酵素反応経路を抑制することにより、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡから１，３－ブタンジオールの生成が抑制され、その結果、１，４ブタンジオールの生成効率が向上するとの考えに至った。
　そして、本発明者らは、微生物の３－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブタナールを生成する酵素反応経路を抑制するための１つの方法として、光学活性な３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに対して、それとは逆の光学選択性を有するアシルＣｏＡ還元酵素を用いることが有効であることを見出した。すなわち、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのＳ体又はＲ体のいずれかを選択し、それとは逆のキラルに対して高い選択性を有するアシルＣｏＡ還元酵素を用いることが有効であることを見出した。
　以下、本実施形態で使用される、微生物の特徴、微生物の作製方法、微生物の使用方法（即ち、１，４－ブタンジオールの製造方法）及び製造された１，４－ブタンジオールの取得方法などについて、説明する。
　（宿主微生物）
　本実施形態で使用される宿主微生物は、後述する種々の遺伝子を導入することができる宿主微生物であり、遺伝子組み換え技術を適用することができる宿主微生物であれば、特に限定されない。
　より具体的には、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質として、クロトニルＣｏＡ、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを順次経由して、後述する適切な培養条件下で、１，４－ブタンジオールを生産することができ、３－ヒドロキシブチルＣｏＡから３－ヒドロキシブタナールを生成する酵素反応経路を抑制する機能を有する微生物に形質転換できるものである。
　本実施形態で使用可能な宿主微生物の具体例としては、産業上の利用の観点から、大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、クリベロマイセス・ラクティス、クリベロマイセス・マルキシアヌス等が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エフィシエンス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・リリウム、コリネバクテリウム・メラセコーラ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等が挙げられる。クロストリジウム属細菌としては、クロストリジウム・クリベリ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・アミノブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムなどが挙げられる。これらの中でも、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、コリネバクテリウム・グルタミカムを使用することが、形質転換が容易であるため、好ましく、大腸菌を使用することが、より好ましい。
　また、本実施形態における形質転換微生物は、微生物培養菌体そのもの又はその培養物の各種形態で使用されても良い。本実施形態における微生物の培養物は、具体的には、微生物培養菌体の培地・緩衝液等媒体による懸濁物、微生物培養菌体からの無細胞抽出液、さらにこの無細胞抽出液から当該反応を触媒する成分を濃縮・精製・抽出したもの等の処理物を含む。本実施形態における微生物の培養物は更に、前記の微生物の処理物を難溶性の担体に固定化したものを含む。このような固定化担体としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ－Ｎ－ビニルホルムアミド、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、メチルセルロース、グルコマンナン、アルギン酸塩、カラギーナン等、更にこれらの共重合、架橋化物など、前述の微生物菌体もしくはその処理物を包合した水難溶性の固形分を形成するような化合物が挙げられる。これらは１種類を単独で使用しても良く、２種類以上を混合して使用しても良い。また、活性炭、多孔質セラミックス、グラスファイバー、多孔質ポリマー成形体、ニトロセルロース膜など、予め固形物として形成された物体上に微生物もしくはその抽出液・抽出成分を保持させたものも、微生物の培養物として用いることもできる。
　（形質転換微生物）
　本実施形態で使用される形質転換微生物は、宿主微生物が本来有する酵素系の他に、更に少なくとも、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質として、クロトニルＣｏＡ、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを順次経由して、１，４－ブタンジオールを生産することができる酵素反応系の各々の酵素系を有し、かつ３－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブタナールを生成する酵素反応経路を抑制する機能を有する。また、本実施形態における形質転換微生物は、3－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブタナールを生成する酵素反応経路を抑制するための１つの方法として、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのＳ体、Ｒ体を選択し、それとは逆のキラルに対して高い選択性を有するアシルＣｏＡ還元酵素を有する。好ましくは、当該Ｓ体又はＲ体そのものに対して高い選択性を有するアシルＣｏＡ還元酵素を有しない。
　以下、各々の酵素系をコードする遺伝子について説明する。
　　［エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子］
　本実施形態で使用されるエノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子は、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質として脱水し、クロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。
　本実施形態で使用される（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の具体例としては、特に限定されないが、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子又はそのホモログが挙げられる。上記酵素の詳細については、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ，　Ｇ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｃｋ，　Ｊ．Ｍ．　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｐｏｌｙ－β－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ．　ＩＩ．　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｄ－（-）－β－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｂｙ　ａｎ　ｅｎｏｙｌ　ｈｙｄｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８　（１９６９）　２７４８－２７５５．の非特許文献などを参照することができる。
　また、本実施形態で使用される（Ｒ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の具体例としては、特に限定されないが、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．５５（３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ）又はＥＣ番号：４．２．１．１１９）をコードする遺伝子又はそのホモログなどが挙げられる。上記酵素の詳細については、Ｆｕｋｕｉ，　Ｔ．，　Ｓｈｉｏｍｉ，　Ｎ．　ａｎｄ　Ｄｏｉ，　Ｙ．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　（Ｒ）－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１８０　（１９９８）　６６７－６７３．、またはＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｐｏｌｙ－ｂｅｔａ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ．　ＩＩ．　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｄ－（－）－ｂｅｔａ　ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｂｙ　ａｎ　ｅｎｏｙｌ　ｈｙｄｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ．，　Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ　ＧＪ，　Ｍｅｒｒｉｃｋ　ＪＭ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，　８　２７４８－２７５５　（１９６９）．等の非特許文献などを参照することができる。
　　［ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼをコードする遺伝子］
　本実施形態において、ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼをコードする遺伝子は、クロトニルＣｏＡのオレフィンを転位してビニルアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。
　上述した反応を触媒する酵素の具体例としては、限定されないが、ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．３．３）又はそのホモログなどが挙げられる。上記酵素の詳細については、例えば、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　４－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ　ｂｙ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ：　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＣｏＡ，　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１７４（３）　１８９－１９９　（２０００）．などの非特許文献を参照することができる。
　　［４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子］
　本実施形態において、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒトラターゼをコードする遺伝子は、ビニルアセチルＣｏＡを水和して４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。
　上述した反応を触媒する酵素の具体例としては、限定されないが、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１２０）又はそのホモログなどが挙げられる。上記酵素の詳細については、例えば、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　４－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ　ｂｙ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ：　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＣｏＡ，　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１７４（３）　１８９－１９９　（２０００）．などの非特許文献を参照することができる。なお、この非特許文献における事例は、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼと、前述のビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．３．３）との複合酵素及びこれをコードする遺伝子に関するものである。しかしながら、各々の酵素の機能を適切に提供することができれば、各々の酵素をコードする遺伝子を別個に使用しても良いし、酵素タンパク質又は触媒サブユニットをコードする遺伝子を使用しても良い。
　　［アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子］
　本実施形態において、アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子は、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを還元して４－ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子である。また、本実施形態におけるアシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子は、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する上流工程において（Ｒ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを製造した場合、（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ選択的アシルＣｏＡ還元酵素を使用する。また、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する上流工程において（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを製造した場合、（Ｒ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ選択的アシルＣｏＡ還元酵素を使用する。
　上述した反応を触媒する酵素の具体例としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）（ＥＣ番号：１．２．１．１０）又はそのホモログが挙げられる。
　なお、得られた４－ヒドロキシブタナールは、後述する宿主が通常有するアルコール還元酵素により、１，４－ブタンジオールへと導かれるが、アルコール還元酵素をコードする遺伝子を追加的に発現させて、１，４－ブタンジオールを製造しても良い。
　（形質転換微生物の作製方法）
　宿主微生物への遺伝子の導入は種々の知られた方法、例えば制限酵素／ライゲーションに基づく方法、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング方法などを適宜組み合わせて用いることで上記遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより可能である。又は相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子又はその一部を挿入することにより可能である。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる各遺伝子の一部分を指す。本発明において遺伝子には、ＤＮＡ及びＲＮＡが包含され、好ましくはＤＮＡである。
　前記遺伝子を連結するベクターとしては、宿主で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば大腸菌において外来遺伝子導入に利用されているプラスミド、ファージ及びコスミド等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、ｐＨＳＧ３９８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＥＴ１７ｂ、ｐＥＴＤｕｅｔ－１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１等が挙げられ、ファージとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ、ＥＭＢＬ－、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。これらのいくつかは市販されており、市販品（キット）をその手順書に従いそのまま、又は適宜改変して使用することができる。
　上記ベクターにおいては、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続してもよい。使用する発現プロモーターは、特に制限されず、宿主に応じて当業者が適宜選択可能である。例えば大腸菌において外来遺伝子発現に利用されているＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λ－ＰＬプロモーター、又は大腸菌由来の硝酸呼吸に関与する硝酸還元遺伝子ｎａｒＧＨＪＩオペロンのＮａｒプロモーター領域や、大腸菌の硝酸還元酵素遺伝子であるＦｒｄ遺伝子のプロモーター領域を利用することもできる。
　また場合により宿主微生物の本来の遺伝子を破壊してその遺伝子を発現させないようにすることも好ましい。遺伝子破壊の方法については、大腸菌における遺伝子破壊に利用されている公知の方法を使用できる。具体的には、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングベクター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法（ジーンターゲティング法）や、標的遺伝子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たないレポーター遺伝子）を挿入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法（遺伝子トラップ法）、それらを組み合わせた方法等の当技術分野でノックアウト細胞等を作製する際に用いられる方法を用いることが出来る。
　相同置換を起こす位置又はトラップベクターを挿入する位置は、破壊したい標的遺伝子の発現を消失させる変異を生じる位置であれば特に限定されないが、好ましくは転写調節領域である。
　さらに、前記ベクターの宿主への導入方法としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌へのベクター導入に一般的に利用されているカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
　相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、この核酸断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と薬剤耐性遺伝子を連結した核酸断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えにより導入することもできる。
　さらに目的とする遺伝子が導入された組換え微生物を選択する方法は、特に制限されないが、目的とする遺伝子が導入された組換え微生物のみを、容易に選択できる手法によるものが好ましい。
　（１，４－ブタンジオールの製造のための微生物の使用方法、培養条件及び得られた１，４－ブタンジオールの取得方法）
　　［１，４－ブタンジオールの生成系］
　図１に、本実施形態の１，４－ブタンジオールの製造方法の酵素系の一例を示す。本実施形態において、１，４－ブタンジオールは、前述した一連の遺伝子を形質転換などにより微生物体内で発現さえた培養物を用いて得ることができる。なお、遺伝子は、個別に又は一連のクラスターとして、任意のベクターに挿入して宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体を、適当な炭素源、例えばグルコースを炭素源として培地中で培養することで、各遺伝子を発現させる。宿主で構成発現し得る遺伝子の場合には、培地中で形質転換体を培養することで、遺伝子が発現する。一方、各遺伝子をベクター上に配されたレギュレーターの制御下で構成した場合には、誘導基質を添加し、誘導的環境へ移行することにより、各々のコードする遺伝子が発現する。なお、本実施形態における培養とは、通常の微生物培養の培養条件を全て含み、また、培養するステップとは、微生物が１，４－ブタンジオールを製造するための十分な時間及び条件で培養することを意味する。
　通常、本実施形態の遺伝子がコードする一般的な酵素の組み合わせにより生成するブタンジオールは、１，３－ブタンジオールと１，４－ブタンジオールとの併産による混合物となる。即ち、前駆体（又は中間体）３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの存在下、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼが作用すると、それらの作用により速やかに３－ヒドロキシブチリルＣｏＡと４－ヒドロキシブチリルＣｏＡの平衡状態が形成される。この平衡状態下で、アシルＣｏＡ還元酵素を作用させると、これら両アシルＣｏＡ体を基質としたＣｏＡ依存的なアルデヒドへの還元反応によって、平衡比依存的に３－ヒドロキシブタナール、４－ヒドロキシブタナールが生成する。これらのアルデヒド体は、宿主由来のアルコール還元酵素などにより、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオールへと導かれる。
　本実施形態においては、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの生成工程において、（Ｒ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを製造した場合、（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ選択的アシルＣｏＡ還元酵素を適用する。一方、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの生成工程において（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを製造した場合、（Ｒ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ選択的アシルＣｏＡ還元酵素を適用する。これにより、中間体である３－ヒドロキシブチリルＣｏＡが還元酵素により１，３－ブタンジオールが導かれる副反応が低減され、結果、１，４－ブタンジオールの生産性が向上する。
　本発明において、「（Ｒ）（乃至（Ｓ））－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ選択的アシルＣｏＡ還元酵素」とは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに対する反応性を有し、かつ（Ｒ）（乃至（Ｓ））－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに反応性を有するアシルＣｏＡ還元酵素である限りにおいて制限はない。好ましくは、各々対応する逆相の光学異性体の反応性に対して０．０２倍以上、より好ましくは０．２倍以上の反応性を有するものを指す。
　なお、酵素の基質特異性は、各々の基質を用いた還元反応により一定時間に生じた遊離のＣｏＡを、発色色素ＤＴＮＢ（５、５'－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸））とのカップリングで呈色させ、その吸光度を測定する方法などで確認することができる。他にも、還元反応の進行に伴い逐次生成するＣｏＡを定量するための常法を使用しても良い。さらに、本実施形態の一部又は全部を実施する過程で生じる１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオールの生成量の比率、又は３－ヒドロキシブタナール、４－ヒドロキシブタナールの生成量の比率を、経由する中間体を（Ｒ）又は（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡである場合において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等の情報により把握することでも、当該還元工程を担う酵素が所望のキラル選択的アシルＣｏＡ還元酵素であることを相対的に評価することができる。
　　［３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの供給］
　本実施形態の１，４－ブタンジオールの製造方法における、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの供給方法には特に制限はなく、既知の様々な方法が用いられる。
　一例として、先ず、解糖系などの既知の反応経路により得られるアセチルＣｏＡの供給下で、２分子のアセチルＣｏＡから１分子のＣｏＡが脱離し、アセトアセチルＣｏＡを与える、β－ケトチオラーゼ（ＥＣ番号：２．３．１．９）をコードする遺伝子又はそのホモログを用いた酵素反応を利用してアセトアセチルＣｏＡを供給する。また、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを基質として、不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ＥＣ番号：２．３．１．１９４）をコードする遺伝子又はそのホモログを使用して、アセトアセチルＣｏＡを供給しても良い。アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の詳細については、例えばＵｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ　ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ－ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｉｏｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ　ｐａｔｈｗａｙ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　Ｕ．Ｓ．Ａ．　１０７，　１１２６５－１１２７０　（２０１０）．などの非特許文献を参照することができる。次に、得られたアセトアセチルＣｏＡを還元して３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを与える反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）、３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１番号：．１．１．１５７）又はこれらのホモログを用いた酵素反応により、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。なお、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）を使用した場合、（Ｒ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができ、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）を使用した場合、（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。
　また、他の例として、３－ヒドロキシブタン酸に直接ＣｏＡを転移する酵素として、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＥＣ番号：２．８．３．１）が知られている。プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子又はそのホモログの発現下、かつ、ＣｏＡ転移反応のドナーとなるアセチルＣｏＡの供給下で、微生物又は該微生物を含む培養物に（Ｓ）（乃至（Ｒ））－３－ヒドロキシブタン酸を供給することにより、供給した３－ヒドロキシブタン酸のキラリティに対応した（Ｓ）（乃至（Ｒ））－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成することができる。
　本実施形態におけるホモログは、オーソログ及びパラログを含む。オーソログとは、共通祖先の遺伝子から種分化により生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素の組を指す。パラログとは、同種内において、種分化でなく遺伝子重複によって生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素を指す。ホモログとは、オーソログ、パラログに関係なく配列に同一性を有する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素を指す。
　より具体的には、上述した遺伝子のホモログ（遺伝子）は、当該遺伝子に対して９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上の同一性のある塩基配列を有する遺伝子、より好ましくは、その遺伝子と全く同一又はその塩基の１個若しくは数個が欠失、置換又は付加された遺伝子を指す。
　また、ホモログ遺伝子は、対象の遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を含む。具体的には、公知のデータベースに対するホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）を適用して、又は、同定遺伝子の少なくとも一部から成るプローブ（当該遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）を用いたストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション若しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの常法に基づいて、遺伝子又はその遺伝子による形質転換で得られる酵素として取得することができる。また、当業者であれば、塩基配列を置換等することによって、自ら設計することが可能である。なお、ここで言うストリンジェントな条件としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｄａｖｉｄ　Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）の非特許文献に記載されたハイブリダイズさせる条件が挙げられる。ハイブリダイズさせる条件とは、より具体的には、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウムで、ｐＨ：７．０）、０．５％　ＳＤＳ、５×デンハート溶液及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液に、プローブとともに６５℃で８～１６時間恒温保持し、ハイブリダイズさせる条件である。
　　［培養方法］
　本発明の反応は、もっとも簡便には、例えば形質転換体をＬＢ培地などの栄養培地で１５℃～４０℃、望ましくは１８℃～３７℃の温度で２４時間程度培養したのち、通常の炭素源、例えば０．０１～５０％、望ましくは０．１～３０％のグルコースを炭素源とする培地に移殖し、引き続き同様の温度で１時間～２００時間程度培養し、その過程で培養液中に１，４－ブタンジオールを蓄積させることにより達せられる。また菌の増殖・反応の進行による炭素源の消費に応じて、連続的あるいは間欠的に炭素源を添加してもよく、この場合の炭素源の反応液中濃度は前記の限りではない。
　微生物を培養するための培地炭素源としては、グルコースやシュークロース、フルクトース等の糖類、グリセロール等のポリオール、エタノールや酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、安息香酸、脂肪酸などの有機物またはこれらのアルカリ金属塩、ｎ－パラフィンなどの脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、または例えばペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉、ふすま等の天然有機物を、単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常０．０１％～３０％、望ましくは０．１％～２０％程度の濃度で用いることができる。
　微生物を培養するための培地窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素化合物、また尿素、尿酸などの含窒素有機物、ペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉等の天然有機物を単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常０．０１％～２０％、望ましくは０．１％～１０％程度の濃度で用いることができる。
　さらに必要に応じて、リン酸２水素カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、硫酸ニッケルなどの金属塩を菌の生育、酵素活性の改善のために添加することができる。添加濃度は培養条件により異なるが、通常、リン酸塩に関しては０．０１％～５％、マグネシウム塩においては１０ｐｐｍ～１％、他の化合物では０．１ｐｐｍ～１，０００ｐｐｍ程度である。また選択する培地により、ビタミン類、アミノ酸、核酸などの供給源として例えば酵母エキス、カザミノ酸、酵母核酸を１ｐｐｍ～１００ｐｐｍ程度、菌の生育、酵素活性を改善のために添加することができる。
　培地のｐＨは、４．５～９、望ましくは５～８に調整することが望ましい。また前記のような培地であらかじめ培養された微生物菌体を、遠心分離、膜ろ過などの方法により培養液から分取し、反応原料を含む水、生理食塩水、または培養のｐＨと同等のｐＨに調整されたリン酸、酢酸、ホウ酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどとこれらの塩よりなる緩衝液などに再度懸濁し、反応させることは、反応液中の夾雑物を低減し、後の生成物の分取を簡便にするために有用である。反応中のｐＨは、充分な濃度の緩衝液を用いる場合においては通常維持されうるが、反応の進行により上記ｐＨを逸脱する場合においては、同様のｐＨとなるよう水酸化ナトリウム、アンモニアなどを用いて適宜調整することが望ましい。
　反応液中に１，４－ブタンジオールが蓄積することにより、反応速度が低下する場合、生成物の濃度に応じて反応液中に、水、生理食塩水、反応緩衝液等を追加し連続的に希釈してゆく方法は好適である。また反応速度が低下した時点で菌を分取し、上清を生産物溶液として回収し、分取した菌は再度反応原料を含む溶液あるいは懸濁液に戻すことにより、反応速度を回復することができる。この操作は、遠心分離器や分離膜等を用いて連続的に、あるいは回分的にも実施することができる。
　反応液中に生成した１，４－ブタンジオールの分離回収および精製は、１，４－ブタンジオールの生成量が実質的な量に達した時点で、反応液から菌体を遠心分離により除去してから、あるいはそのままの反応液に、一般の有機化合物の分離回収および精製の手段を用いることで行うことができる。例えば、培養液から菌体その他を除去したろ液より、適当な有機溶媒を用いて抽出する。この抽出物をそのまま留去するほか、更に適当な溶媒で再抽出する、あるいはシリカゲル等のクロマトグラフィーを用いて精製する、もしくは多段蒸留等に供することにより、高純度の１，４－ブタンジオールが得られる。
　（実施例及び比較例）
　次に、実施例を説明することにより、本発明をより詳細に説明する。
　表１に、想定する反応工程と、各々の反応工程を触媒する酵素と、該酵素をコードする使用した遺伝子の配列番号についてまとめたものを示す。なお、遺伝子における配列番号は、配列表における配列番号に対応している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　　［比較例１］
　配列番号１で示される遺伝子配列の上下流に、発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト中、ＮｄｅＩサイトの上流側ＣＡＴ、下流側ＡＴＧをそれぞれ含む上流側、下流側１５塩基対分に対応する配列をそれぞれ５'末端側、３'末端側に付加した平滑末端断片を常法により調製した。この断片と、ｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩ処理した断片とをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）によりライゲーションし、プラスミドｐＥＴＢＤ１を得た。
　ｐＥＴＢＤ１と同様の方法により、配列番号２で示される遺伝子配列をｐＥＴ１７ｂのＮｄｅＩサイトをターゲットとして挿入した、配列２を含むプラスミドｐＥＴＢＤ２を得た。
　ｐＥＴＢＤ１の配列１の終止コドン下流に位置する、ｐＥＴ１７ｂマルチクローニングサイト由来のＥｃｏＲＩサイトを制限酵素処理により切断し、ｐＥＴＢＤ１の開環断片を調製した。次にｐＥＴＢＤ２の配列２の領域と上流のｐＥＴ１７ｂ由来Ｔ７プロモーターを含む領域の上下流に、前記ｐＥＴＢＤ１のＥｃｏＲＩサイトを含む上流側１５ｂｐ分、下流側１５ｂｐ分に対応する配列を付加した断片を、ＰＣＲにより調製した。得られた２つの断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔによりライゲーションし、配列１及び２を含むプラスミドｐＥＴＢＤ１－２を得た。
　以下同様にして、さらにｐＥＴＢＤ１－２の配列２の下流の配列をターゲットとして、順次、配列番号４、６、７を追加し、プラスミドｐＥＴＢＤ１－２－４－６－７を得た。なお、配列の追加に際して、被挿入側プラスミドの開環は、挿入済配列を切断しない適切な制限酵素サイトがベクター上にある場合はその制限酵素による切断で、またそのようなサイトがない場合は目的挿入部位からのインバースＰＣＲにより行った。これにより大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を形質転換した、大腸菌ｐＥＴＢＤ１－２－４－６－７／ＪＭ１０９（ＤＥ３）を得た。
　　［実施例１］
　比較例１と同様の方法により、プラスミドｐＥＴＢＤ１－２－４－６－７上の配列２および４の遺伝子を、当該工程を触媒する酵素に対応する酵素をコードする配列番号３および５の遺伝子で置換した、プラスミドｐＥＴＢＤ１－３－５－６－７を調製し、これにより形質転換した、大腸菌ｐＥＴＢＤ１－３－５－６－７／ＪＭ１０９（ＤＥ３）を得た。
　実施例及び比較例で得られた形質転換体を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、１２時間、好気下で培養した。培養液０．１ｍＬを、グルコース１％、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含むＬＢ培地５ｍＬに移植し、３０℃、４８時間、好気下で培養した。培養液上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：カラム；Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ－１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供試した。用いた形質転換体のプラスミドを構成する遺伝子と、培養液中に生成した１，４－ブタンジオール量の関係を、表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２より明らかであるように、実施例１における１，４－ブタンジオールの生成比率（１，４－ブタンジオールの生産量／１，３－ブタンジオールの生産量）は、比較例１の場合と比して、約１．５倍であった。
　実施例と比較例とでは、反応ルートが経由する３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのキラリティが、各々、（Ｓ）体、（Ｒ）体である以外は、共通である。また、一連の反応は可逆反応であることは知られており、全体として細胞内での単純な化学平衡であることから、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを含む物理化学的に等価な一連のアシルＣｏＡ中間体群の細胞内平衡もまた、両ルートで同様に形成されていると考えられる。したがって、細胞外に得られる１，３－ブタンジオールと１，４－ブタンジオールとの比率の差異は、ＣｏＡが除去され細胞外に導出される工程である、アシルＣｏＡ還元酵素の触媒反応の、各ＣｏＡ中間体に対する選択性に依存すると考えられる。
　即ち、アシルＣｏＡ還元酵素のキラル選択性に対して適切なキラリティを有する３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ中間体を経由するように反応ルートを構成することにより、より具体的には、アシルＣｏＡ還元酵素により変換・排出されにくいキラリティを有する３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを経由するように、反応ルート及びその反応を触媒する酵素及びその酵素をコードする遺伝子を選択することにより、より高い生産性を有する１，４－ブタンジオールの製造方法を提供することができる。
　また、経由する３－ヒドロキシブチリルＣｏＡのキラリティを予め設定しておき、適切なキラリティを有するアシルＣｏＡ還元酵素を用いることにより、より具体的には、設定したキラリティの３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを変換・排出しにくいアシルＣｏＡ還元酵素及びその酵素をコードする遺伝子を用いることにより、より高い生産性を有する１，４－ブタンジオールの製造方法を提供することができる。
　本出願は、２０１２年１１月２７日に日本国特許庁に出願された特願２０１２－２５８５１６号に基づく優先権を主張するものであり、特願２０１２－２５８５１６号の全内容を本出願に援用する。

Claims (10)

  1. 　微生物及び／又はその培養物を用いて、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ、クロトニルＣｏＡ、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを順次経由する酵素反応系を利用して１，４－ブタンジオールを製造する方法であって、
    　前記３－ヒドロキシブチリルＣｏＡが光学活性体であり、
    　前記微生物は、
    　（１）エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子
    　（２）ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼをコードする遺伝子
    　（３）４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子
    　（４）基質特異性が、前記３－ヒドロキシブチリルＣｏＡとは逆の光学選択性を有するアシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子
    　を含むことを特徴とする、１，４－ブタンジオールの製造方法。
  2. 　前記微生物は更に、光学活性な３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを与えるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子を含む、
    　請求項１に記載の１，４－ブタンジオールの製造方法。
  3. 　前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼが、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）である、
    　請求項２に記載の１，４－ブタンジオールの製造方法。
  4. 　前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である、
    　請求項２に記載の１，４－ブタンジオールの製造方法。
    　（ａ）配列番号３の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｂ）配列番号３の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号３の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子。
  5. 　前記アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である、請求項１に記載の１，４－ブタンジオールの製造方法。
    　（ａ）配列番号７の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｂ）配列番号７の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号７の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
  6. 　（１）エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子
    　（２）ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼをコードする遺伝子
    　（３）４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子
    　（４）３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに対する基質特異性が光学選択的であるアシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子及び
    　（５）３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに対する基質特異性が前記アシルＣｏＡ還元酵素とは逆の光学選択性を有するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子
    　を含むことを特徴とする微生物。
  7. 　前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼが、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）である、請求項６に記載の微生物。
  8. 　前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である、
    　請求項７に記載の微生物。
    　（ａ）配列番号３の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｂ）配列番号３の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号３の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子。
  9. 　前記アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である、請求項６に記載の微生物。
    　（ａ）配列番号７の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｂ）配列番号７の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号７の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
  10. 　前記微生物は、大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌である、
    　請求項６に記載の微生物。
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