CN114350586B - 高产l-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高产L‑半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用。本发明改造了大肠杆菌的L‑半胱氨酸代谢途径与转运通道，通过利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术将L‑半胱氨酸合成途径中的关键酶cysM、nrdH和cysE分别锚定到空间支架膜蛋白hflC、ybbK和hflK上，利用区室结构的优点，提升L‑半胱氨酸碳代谢重要中间产物O‑乙酰丝氨酸的积累，强化大肠杆菌L‑半胱氨酸硫代硫酸盐合成途径。同时过表达L‑半胱氨酸潜在的转运蛋白yeaS和alaE，进一步加强区室结构的优势，提高转运效率，得到L‑半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，L‑半胱氨酸的产量从6.56g/L提高到了8.31g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用。
背景技术
L-半胱氨酸是生物体内非常重要的必需氨基酸之一。与其他必需氨基酸相比，L-半胱氨酸是唯一具有活性巯基的氨基酸，这一特性使L-半胱氨酸与生物体内许多的生理过程有紧密的联系。L-半胱氨酸也是一种常见的工业原料，在许多行业中都有重要的应用，例如在食品行业中，L-半胱氨酸常是优良的食品风味剂和主要的面粉处理剂；在医药行业，L-半胱氨酸也可用生来产治疗放射性药物中毒、肝炎、血清病、白血球减少症等疾病，以及治疗和预防放射线对人造成的伤害；在化妆品行业中，因L-半胱氨酸结构中的巯基具有还原性，可以用来调节黑色素的产生，具有美白皮肤的作用。
随着生物技术的不断发展，微生物发酵方法已经成为一种极具前景的生产技术。目前，全世界已经有多种氨基酸实现了微生物发酵法的工业化生产，例如赖氨酸、苏氨酸等。在大多数细菌和植物中，半胱氨酸的前体是L-丝氨酸，L-丝氨酸来自糖酵解途径的3-磷酸甘油酸，L-丝氨酸在乙酰辅酶A的作用下发生乙酰化反应得到关键中间产物O-乙酰丝氨酸，O-乙酰丝氨酸可以接受来自不同硫同化途径的硫源生成L-半胱氨酸。
微生物发酵法是极具前景的工业生产方法，具有对环境友好，经济效益高等优点，但是目前，L-半胱氨酸的微生物发酵生产仍存在许多问题。微生物合成过量L-半胱氨酸的方法受到许多限制，例如野生型大肠杆菌中原始的L-半胱氨酸积累水平很低，以及过量的L-半胱氨酸积累会对细胞自身造成很强的毒害作用。因此通过基因工程、代谢工程等生物技术对L-半胱氨酸生产菌株进行改造，以减轻L-半胱氨酸对于细胞自身的毒性和提高L-半胱氨酸代谢途径的通量，是一种有效的得到L-半胱氨酸高产菌株的策略。
真核细胞经常利用许多细胞器来区分生化反应，这些细胞器多被单层或双层的磷脂所包围，此类通过膜的作用形成的细胞区室可以促使细胞能够更好地进行不同的代谢活动。通过与空间支架进行组装，进一步形成区室结构是常见的改善细胞新陈代谢的方式之一。细胞内的游离酶可以通过与空间支架进行组装，形成类似于无膜细胞器的区室结构，这种区室结构可以更好的控制代谢的进行，提高代谢途径的转化效率。
常见的空间支架包括蛋白质支架、RNA支架、DNA支架。结合空间支架结构的特性，利用膜蛋白作为空间支架，和L-半胱氨酸合成途径中的关键酶进行组装，将关键酶锚定在细胞膜上，同时提高L-半胱氨酸的输出泵的表达，可形成一个完整的L-半胱氨酸合成的区室结构。膜蛋白—酶复合体可以充分发挥区室结构的空间优势，加速L-半胱氨酸在细胞膜附近的聚集，同时提高L-半胱氨酸向细胞外的转运效率，有效改善L-半胱氨酸合成代谢通量，减轻有毒化合物的积累对细胞造成的毒性。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高产L-半胱氨酸能力的基因工程菌及其构建方法，以及该工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
（1）以菌株E.coil CCTCC NO：M 20191026为底盘菌株，将其基因组上的hflC基因替换为融合蛋白基因hflC-linker-cysM，得到工程菌E.coilW3110 EYC::hflC-cysM；
（2）将工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM基因组上的ybbK基因替换为融合蛋白基因ybbK-linker-nrdH基因，得到工程菌E.coilW3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH；
（3）将工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH基因组上的hflK基因替换为融合蛋白基因hflK-linker-cysE基因，得到工程菌E.coilW3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE；
（4）构建载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS，然后化转到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbk-nrdH::hflK-cysE中过表达基因yeaS，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pES；
（5）在载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS的基础上，构建载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS-alaE，然后化转到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE中过表达基因alaE，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pESE，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
本发明通过将cysM和nrdH分别锚定到细胞膜蛋白hflC和ybbK上，形成区室结构，强化大肠杆菌L-半胱氨酸硫代硫酸盐合成途径，增强大肠杆菌L-半胱氨酸的硫源的同化能力利用空间支架结构；将cysE锚定到细胞膜蛋白hflK上，增强L-半胱氨酸碳代谢途径，促进丝氨酸向O-乙酰丝氨酸（OAS）的转化，发挥区室结构的特性，增强碳流的通量，提高碳源的供给；通过质粒过表达潜在的L-半胱氨酸转运蛋白yeaS和alaE，提高细胞膜外转运L-半胱氨酸的能力，进一步增强区室结构的优势，提高L-半胱氨酸转运效率，将聚集在细胞膜附近的L-半胱氨酸及时转运到细胞外，降低L-半胱氨酸的过量积累对细胞自身造成的毒性影响。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
（1）以菌株E.coil CCTCC NO：M 20191026为底盘菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将其基因组上的hflC基因替换为融合蛋白基因hflC-linker-cysM，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM；
（2）应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM基因组上的ybbK基因替换为融合蛋白基因ybbK-linker-nrdH基因，得到工程菌E.coil W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH；
（3）应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH基因组上的hflK基因替换为融合蛋白基因hflK-linker-cysE基因，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE；
（4）构建载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS，然后化转到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbk-nrdH::hflK-cysE中过表达基因yeaS，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pES；
（5）在载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS的基础上，构建载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS-alaE，然后化转到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE中过表达基因alaE，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pESE，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌。
优选的 ，所述融合蛋白基因hflC-linker-cysM核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，融合蛋白基因ybbK-linker-nrdH核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，融合蛋白基因hflK-linker-cysE核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述融合蛋白使用Linker核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于325～37℃、200～800rpm条件下进行发酵培养，OD600＝10～30时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖25~35 g/L、（NH4）2SO45~20 g/L、KH2PO40.5~2 g/L、Na2S2O35~20 g/L、酵母提取物1~10 g/L、Na2HPO40.5~2 g/L、蛋白胨0.5~2g/L，0.5~2ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：0.15 g/LNa2MoO4·2H2O，2.5 g/L H3BO3，0.7g/L CoCl2·6H2O，0.25g/L CuSO4·5H2O，1.6g/LMnCl2·4H2O，0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
更为优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L、（NH4）2SO410g/L、KH2PO41g/L、Na2S2O310g/L、酵母提取物5g/L、Na2HPO41g/L、蛋白胨1g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然。
通常，所述基因工程菌发酵前，通常先接种至10ml LB培养基试管中，于温度37℃、转速180rpm的摇床上培养12h，然后以体积浓度1％接种量接种到二级种子液100ml发酵培养基中, 于温度30℃、转速180rpm的摇床上培养12h，然后以体积浓度10％接种量接种到发酵罐的发酵培养基中进行分批补料发酵。
本发明的有益效果主要体现在：本发明改造了大肠杆菌的L-半胱氨酸代谢途径与转运通道，通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术将L-半胱氨酸合成途径中的关键酶cysM、nrdH和cysE分别锚定到空间支架膜蛋白hflC、ybbK和hflK上，利用区室结构的优点，提升L-半胱氨酸碳代谢重要中间产物O-乙酰丝氨酸的积累，强化大肠杆菌L-半胱氨酸硫代硫酸盐合成途径，同时过表达L-半胱氨酸潜在的转运蛋白yeaS和alaE，进一步加强区室结构的优势，提高转运效率，得到L-半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，L-半胱氨酸的产量从6.56g/L提高到了8.31g/L。
附图说明
图1为本发明L-半胱氨酸代谢途径改造位点；
图2为实施例2构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量；
图3为实施例3构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量；
图4为实施例4构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量；
图5为实施例5构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量；
图6为实施例6构建工程菌OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明亲本E .coli菌株来自中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC NO：M20191026，已在CN111019877A中公开。
菌株E .coli W3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心（Coli Genetic Stock Center），保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135A1，US2010/0248311A1中公开。
实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述氨苄霉素在培养基中终浓度为0.10mg/L。
LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。LB平板是在LB液体培养基中添加终浓度2g/L琼脂。
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
表2：引物序列
实施例1：L-半胱氨酸含量的测定
发酵液处理：取1mL菌液于2mL的EP管中，在12000×g条件下离心1 min，将上清和沉淀分离。上清用于L-半胱氨酸以及其他代谢产物的检测。
衍生化反应体系：称取0.27g的CNBF溶于10 mL乙腈中作为Ⅰ液；以0.2M硼酸溶液和0.05M硼砂溶液作为母液，4:1体积混合配成pH=9.0标准缓冲溶液记为Ⅱ液。将样品稀释成0至5g/L浓度，按照样品100μL，Ⅰ液300μL和Ⅱ液500μL比例混合，在恒温振荡器中60℃，600rpm反应1h。样品过膜装入液相瓶中待测。
液相检测：仪器为赛默飞UPLC超高压液相色谱仪。色谱柱为C18柱（4.6×250mm，5μm）；紫外检测器检测波长260nm；进样量10μL；柱温30℃；流速0.8mL/min；流动相使用AB两相，A相纯乙腈，B相50mM HAc-NaAc缓冲液：乙腈：三乙胺=82.8：17：0.2，pH=4.9。梯度洗脱程序如表3所示。
表3：梯度洗脱程序
实施例2：构建有效菌株E.coil W3110 EYC::hflC-cysM及其发酵
以Escherichia coli W3110 EYC（即CCTCC NO：M 20191026）为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术（Yu Jiang et al .2015 Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System. AppliedEnvironmentalMicrobiology. 81:2506-2514），将基因组上的hflC基因替换为融合蛋白基因hflC-linker-cysM。
（1）构建pTarget质粒：构建能够表达靶定目的基因hflC序列的sgRNA的pTarget-hflC质粒。以pTarget F质粒（Addgene Plasmid#62226）为模版，以pT-TB-hflC-F和pT-TB-hflC-R为引物进行PCR扩增。用Dpn I对PCR产物进行消化，将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落用验证引物pT-YZ-F进行测序验证筛选突变成功的pTarget-hflC质粒。以pTarget-hflC质粒为模板，使用引物pT-line-F和pT-line-R将环形质粒pTarget-hflC线性化。
（2）构建pTD质粒：以E .coli W3110基因组为模版，Donor-hflC-up-F与Donor-hflC-up-R为引物扩增获得hflC上游同源臂部分Donor up，Donor-hflC-down-F与Donor-hflC-down-R为引物扩增获得hflC下游同源臂部分Donor down，Donor-hflC-F与Donor-hflC-R为引物扩增获得hflC片段Donor hflC，Donor-cysM-F与Donor-cysM-R为引物扩增获得cysM片段Donor cysM。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化PCR片段。回收的4个DNA片段使用融合PCR融合成一条完整Donor片段，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。融合蛋白基因hflC-linker-cysM核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因条带中已将linker序列插入至片段DonorhflC和Donor cysM之间。按照一步克隆试剂盒（One stepclonekit，Vazyme Biotech，Nanjing，China）说明书将线性化pTarget-hflC质粒与Donor片段连接，转化到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落用验证引物pTD-YZ-F和pTD-YZ-F进行测序验证筛选克隆成功的pTD-hflC质粒。
（3）电转感受态制备：将pCas质粒（Addgene Plasmid#62225）导入E.coliW3110EYC中。详细过程见（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102）的描述。挑选单克隆到含0.05mg/L卡那霉素的10mlLB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD6000.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102）的描述。
（4）电击转化：取150ng pTD-hflC质粒与200μl电转感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪（MicroPluserTM，BIO-RAD）进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养18～20h，以hflC-VF和hflC-VR为引物进行菌落PCR验证，若能成功扩增出3000bp左右的片段，则证明是E.coliW3110EY::hflC-cysM阳性菌落。
（5）pTD和pCas质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落，其pTD-hflC质粒成功消除。挑取pTD-hflC质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落，其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒E.coliW3110EYC::hflC-cysM。
（6）导入发酵质粒：制备E.coli W3110 EYC::hflC-cysM化学转化感受态，详细过程见（Molecular Cloning:A LaboratoryManual，3ed Edition，99-102）的描述。将发酵质粒pTrc99a-cysE转化到E.coli W3110 EYC::hflC-cysM中，得到含质粒菌株E.coliW3110EYC::hflC-cysM/pE。
（7）发酵验证：将E.coli W3110EYC::hflC-cysM/pE，以E.coliW3110EYC/pE为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜。接种1mL预培养物到装有100mL的SM培养基的500mL摇瓶中，30℃、200rpm培养12h。接种100mL预培养物到装有1L的SM培养基的发酵罐中，25～37℃、200～800rpm条件下进行发酵培养，OD600＝10～30时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h。发酵结束后取1mL发酵液测定OD600，取1mL发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释5倍，根据实施例1方法进行检测，OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图2所示。
由图可见，将cysM锚定到空间支架hflC上后，L-半胱氨酸产量从6.56g/L增加到6.97g/L，同时OD600=22.14提升至OD600=24.06。说明区室结构增强了L-半胱氨酸的合成，并减轻了L-半胱氨酸对细胞自身的毒性。
实施例3：构建有效菌株E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH及其发酵
（1）构建pTarget质粒：构建能够表达靶定目的基因ybbK序列的sgRNA的pTarget-ybbK质粒。以pTarget F质粒（Addgene Plasmid#62226）为模版，以pT-TB-ybbK-F和pT-TB-ybbK-R为引物进行PCR扩增。用Dpn I对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落用验证引物pT-YZ-F进行测序验证筛选突变成功的pTarget-ybbK质粒。以pTarget-ybbK质粒为模板，使用引物pT-line-F和pT-line-R将环形质粒pTarget-ybbK线性化。
（2）构建pTD质粒：以E .coli W3110基因组为模版，Donor-ybbK-up-F与Donor-ybbK-up-R，Donor-ybbK-down-F与Donor-ybbK-down-R，Donor-ybbK-F与Donor-ybbK-R，Donor-nrdH-F与Donor-nrdH-R为引物，构建步骤同实施例2（2），得到pTD-ybbK质粒。融合蛋白基因ybbK-linker-nrdH核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
（3）电转感受态制备：将pCas质粒（Addgene Plasmid#62225）导入到E.coliW3110EYC::hflC-cysM化转感受态中后，开始制备电转感受态，制备方法同实施例2（3）。
（4）电击转化：将质粒pTD-ybbK电转到W3110EYC::hflC-cysM电转感受态后进行筛选，构建得到E.coli W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH阳性菌落，构建方法同实施例2（4）。
（5）pTD和pCas质粒消除：实施方法同实施例2（5），获得无质粒E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH。
（6）导入发酵质粒：将发酵质粒pTrc99a-cysE转化到E.coli W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH中，得到含质粒菌株E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH/pE。实施方法同实施例2（6）。
（7）发酵验证：将构建的E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH/pE生产菌株以实施例2构建的E.coli W3110EYC::hflC-cysM/pE为对照组，按照实施例2（7）方法进行发酵测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图3所示。
由图可见，将nrdH锚定到空间支架ybbK上后，L-半胱氨酸产量从6.97g/L增加到7.21g/L，提高了L-半胱氨酸硫代硫酸盐合成途径的合成效率，促进L-半胱氨酸的积累，进一步说明区室结构有利于L-半胱氨酸的合成。
实施例4：构建有效菌株E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE及其发酵
（1）构建pTarget质粒：构建能够表达靶定目的基因hflK序列的sgRNA的pTarget-hflK质粒。以pTarget F质粒（Addgene Plasmid#62226）为模版，以pT-TB-hflK-F和pT-TB-hflK-R为引物进行PCR扩增。用Dpn I对PCR产物进行消化。将消化产物化转到E.coli DH5α中，涂布于壮观酶素平板，挑取单菌落用验证引物pT-YZ-F进行测序验证筛选突变成功的pTarget-hflK质粒。以pTarget-hflK质粒为模板，使用引物pT-line-F和pT-line-R将环形质粒pTarget-hflK线性化。
（2）构建pTD质粒：以E.coli W3110基因组为模版，Donor-hflK-up-F与Donor-hflK-up-R，Donor-hflK-down-F与Donor-hflK-down-R，Donor-hflK-F与Donor-hflK-R为引物以及Escherichia coli W3110 EYC基因组为模板，Donor-cysE-F与Donor-cysE-R为引物，构建步骤同实施例2（2），得到pTD-hflK质粒。融合蛋白基因hflK-linker-cysE核苷酸序列如SEQID NO.3所示。Escherichia coli W3110 EYC基因组上的cysE基因已进行定点突变（T167A/G245S）解除了反馈抑制。
（3）电转感受态制备：将pCas质粒（Addgene Plasmid#62225）导入到E.coliW3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH化转感受态中后，开始制备电转感受态，制备方法同实施例2（3）。
（4）电击转化：将质粒pTD-hflK电转到W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH电转感受态后进行筛选，构建得到E.coli W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE阳性菌落，构建方法同实施例2（4）。
（5）pTD和pCas质粒消除：实施方法同实施例2（5），获得无质粒E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE。
（6）导入发酵质粒：将发酵质粒pTrc99a-cysE转化到E.coli W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE中，得到含质粒菌株E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pE。实施方法同实施例2（6）。
（7）发酵验证：将构建的E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pE生产菌株以实施例3构建的E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH/pE为对照组，按照实施例2（7）方法进行发酵测试和检测。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图4所示。
由图可见，将cysE锚定到空间支架hflK上后，L-半胱氨酸产量从7.21g/L增加到7.64g/L。L-半胱氨酸碳代谢途径的区室化，有效提高了丝氨酸向L-半胱氨酸的转化效率，充分发挥区室结构的特点，进一步促进L-半胱氨酸的积累。
实施例5：过表达质粒pTrc99a-cysE-yeaS菌株的构建及其发酵
（1）构建pTrc99a-cysE-yeaS质粒：以pTrc99a-cysE质粒为模板，以pE-line-F和pE-line-R为引物进行PCR扩增得到线性载体pE-line。PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h后用Clean up试剂盒回收DNA片段。以E.coli W3110基因组为模板，以yeaS-F和yeaS-R为引物进行PCR扩增获得yeaS片段（GenbBank登录号：NP_416312.1），Clean up试剂盒回收DNA片段。按照（One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China）说明书将线性化pE-line质粒、片段yeaS连接在一起，将连接产物通过化学转化法转化到DH5α感受态中。用引物pTrc99a-VF和yeaS-R进行菌落PCR挑选阳性克隆子，通过测序验证得到pTrc99a-cysE-yeaS质粒。
（2）导入发酵质粒：制备E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE化学转化感受态，详细过程见（MolecularCloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102）的描述。将构建好的pTrc99a-cysE-yeaS质粒，通过化学转化法转化到E.coliW3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE感受态中，获得E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pES。
（3）发酵验证：将构建的生产菌株E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pES，以实施例4构建的E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pE为对照组，按照实施例2（7）方法进行发酵测试。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图5所示。
由图可见，在质粒上过表达yeaS基因，L-半胱氨酸产量从7.64g/L增加到7.98g/L，这说明质粒上yeaS基因，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成，丰富了L-半胱氨酸合成区室的作用，加快L-半胱氨酸从细胞内转运至胞外。
实施例6：过表达质粒pTrc99a-cysE-yeaS-alaE菌株的构建及其发酵
（1）构建pTrc99a-cysE-yeaS-alaE质粒：以pTrc99a-cysE-yeaS质粒为模板，以pES-line-F和pES-line-R为引物进行PCR扩增得到线性载体pES-line。PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h后用Clean up试剂盒回收DNA片段。以E.coli W3110基因组为模板，以alaE-F和alaE-R为引物进行PCR扩增获得alaE片段（GenBank登录号：NP_417156.1），Cleanup试剂盒回收DNA片段。按照（One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China）说明书将线性化pES-line质粒、片段alaE连接在一起，将连接产物通过化学转化法转化到DH5α感受态中。用引物pTrc99a-VF和alaE-R进行菌落PCR挑选阳性克隆子，通过测序验证得到pTrc99a-cysE-yeaS-alaE质粒。
（2）导入发酵质粒：制备E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE化学转化感受态，详细过程见（MolecularCloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102）的描述。将构建好的pTrc99a-cysE-yeaS-alaE质粒，通过化学转化法转化到E.coliW3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE感受态中，获得E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pESE。
（3）发酵验证：将构建的生产菌株E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pESE，以实施例4构建的E.coli W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pES为对照组，按照实施例2（7）方法进行发酵测试。OD600及发酵液上清中的L-半胱氨酸含量如图6所示。
由图可见，在质粒上过表达alaE基因，L-半胱氨酸产量从7.98g/L增加到8.31g/L，这说明质粒上alaE基因，有利于大肠杆菌L-半胱氨酸的合成，丰富了L-半胱氨酸合成区室的作用，提高了L-半胱氨酸从细胞内转运至胞外的效率。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgcgtaagt cagttatcgc gattatcatc atcgtgctgg tagtgcttta catgtctgtc 60
tttgtcgtca aagaaggtga gcgcggtatt acgctgcgtt ttggtaaggt actgcgtgac 120
gatgacaaca aacctctggt ttatgagccg ggtctgcatt tcaagatacc gttcattgaa 180
acggtgaaaa tgctcgacgc acgtattcag accatggaca accaggccga ccgctttgtg 240
accaaagaga agaaagacct gatcgtcgac tcttacatca aatggcgcat cagcgatttc 300
agccgttact acctggcaac gggtggtggc gacatttcgc aagcggaagt gctgttgaaa 360
cgtaagttct ctgaccgtct gcgttctgaa attggtcgcc tggacgtgaa agatatcgtc 420
accgattccc gtggtcgtct gaccctcgaa gtacgtgacg cgctgaactc cggttctgcg 480
ggtacagaag atgaagttac taccccggcg gcagataacg ccattgccga agcggcagag 540
cgcgtaacgg ctgagacgaa gggcaaagtt ccggtcatca acccgaacag tatggcggcg 600
ctgggtattg aagttgtcga tgtgcgtatc aagcagatca acctgccgac cgaagtgtct 660
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgtgag tacattagaa 720
caaacaatag gcaatacgcc tctggtgaag ttgcagcgaa tggggccgga taacggcagt 780
gaagtgtggt taaaactgga aggcaataac ccggcaggtt cggtgaaaga tcgtgcggca 840
ctttcgatga tcgtcgaggc ggaaaagcgc ggggaaatta aaccgggtga tgtcttaatc 900
gaagccacca gtggtaacac cggcattgcg ctggcaatga ttgccgcgct gaaaggctat 960
cgcatgaaat tgctgatgcc cgacaacatg agccaggaac gccgtgcggc gatgcgtgct 1020
tatggtgcgg aactgattct tgtcaccaaa gagcagggca tggaaggtgc gcgcgatctg 1080
gcgctggaga tggcgaatcg tggcgaagga aagctgctcg atcagttcaa taatcccgat 1140
aacccttatg cgcattacac caccactggg ccggaaatct ggcagcaaac cggcgggcgc 1200
atcactcatt ttgtctccag catggggacg accggcacta tcaccggcgt ctcacgcttt 1260
atgcgcgaac aatccaaacc ggtgaccatt gtcggcctgc aaccggaaga gggcagcagc 1320
attcccggca ttcgccgctg gcctacggaa tatctgccgg ggattttcaa cgcttctctg 1380
gtggatgagg tgctggatat tcatcagcgc gatgcggaaa acaccatgcg cgaactggcg 1440
gtgcgggaag gaatattctg tggcgtcagc tccggcggcg cggttgccgg agcactgcgg 1500
gtggcaaaag ctaaccctga cgcggtggtg gtggcgatca tctgcgatcg tggcgatcgc 1560
tacctttcta ccggggtgtt tggggaagag cattttagcc agggggcggg gatttaa 1617
<210> 2
<211> 951
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atgcttatct ttatcccgat tctcattttt gtcgcgctgg tcattgtcgg cgcgggtgtc 60
aaaatcgtac cgcagggcta tcagtggaca gtagaacgct ttggtcgcta taccaaaacg 120
ttacagccgg ggctcagtct ggtggtgccg tttatggatc gcattggtcg caagatcaat 180
atgatggagc aagtgctcga tatcccttcc caggaagtta tctcgaaaga taacgccaac 240
gttaccatcg acgccgtgtg ctttattcag gtgattgacg cgccgcgcgc ggcttatgaa 300
gtcagcaatc tggagctggc gatcatcaac ctgaccatga ctaacatccg taccgtgctg 360
ggttcaatgg aacttgacga aatgctctct cagcgcgaca gcatcaactc acgcctgctg 420
cgtattgtcg atgaagccac caacccgtgg gggattaaag tcacccgtat tgaaattcgc 480
gacgtgcgcc caccggcaga gcttatctct tcaatgaacg cgcagatgaa agcggaacgt 540
accaaacgcg cttacattct tgaagcggaa gggatccgtc aggcggaaat cctcaaagcc 600
gaaggtgaaa aacagtcgca aatcctgaaa gcggaaggcg aacgtcagtc ggcgttttta 660
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcatgcg cattactatt 720
tacactcgta acgattgcgt tcagtgccac gccaccaaac gggcgatgga aaaccggggc 780
tttgattttg aaatgattaa tgtcgatcgc gttcctgaag cggcagaagc gttgcgtgct 840
cagggctttc gtcagttgcc ggtagtgatt gctggcgatc ttagctggtc tggtttccgt 900
ccggacatga ttaaccgtct gcatccagcg ccacacgcgg ccagtgcatg a 951
<210> 3
<211> 1527
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
atggcgtgga atcagcccgg taataacgga caagaccgcg acccgtgggg aagcagcaaa 60
cctggcggca actctgaggg aaatggaaac aaaggcggtc gcgatcaagg gccacctgat 120
ttagatgata tcttccgcaa actgagcaaa aagctcggtg gtctgggcgg cggtaaaggc 180
accggatctg gcggtggcag ttcatcgcaa ggcccgcgcc cgcagcttgg cggtcgtgtc 240
gttaccatcg cagcggcagc gattgtcatt atctgggcgg ccagtggttt ctataccatt 300
aaagaagccg aacgcggcgt ggtaacacgc tttggtaaat tcagccatct ggttgagccg 360
ggtctgaact ggaaaccgac gtttatcgac gaagtcaaac cggtgaacgt ggaagccgtg 420
cgtgaactgg ccgcttctgg tgtgatgctg acgtcggacg agaacgtagt gcgcgttgag 480
atgaacgtgc agtaccgcgt caccaatccg gaaaaatatc tgtatagcgt gaccagcccg 540
gatgacagcc tgcgtcaggc taccgacagc gccctgcgtg gagttatcgg taaatacacc 600
atggaccgca ttctgacgga aggtcgtacc gtgattcgta gcgatactca gcgcgaactg 660
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcatgtc gtgtgaagaa 720
ctggaaattg tctggaacaa tattaaagcc gaagccagaa cgctggcgga ctgtgagcca 780
atgctggcca gtttttacca cgcgacgcta ctcaagcacg aaaaccttgg cagtgcactg 840
agctacatgc tggcgaacaa gctgtcatcg ccaattatgc ctgctattgc tatccgtgaa 900
gtggtggaag aagcctacgc cgctgacccg gaaatgatcg cctctgcggc ctgtgatatt 960
caggcggtgc gtacccgcga cccggcagtc gataaatact caaccccgtt gttatacctg 1020
aagggttttc atgccttgca ggcctatcgc atcggtcact ggttgtggaa tcaggggcgt 1080
cgcgcactgg caatctttct gcaaaaccag gtttctgtga cgttccaggt cgatattcac 1140
ccggcagcaa aaattggtcg cggtatcatg cttgaccacg cgacaggcat cgtcgttggt 1200
gaagcggcgg tgattgaaaa cgacgtatcg attctgcaat ctgtgacgct tggcggtacg 1260
ggtaaatctg gtggtgaccg tcacccgaaa attcgtgaag gtgtgatgat tggcgcgggc 1320
gcgaaaatcc tcggcaatat tgaagttggg cgcggcgcga agattggcgc aggttccgtg 1380
gtgctgcaac cggtgccgcc gcataccacc gccgctggcg ttccggctcg tattgtcagc 1440
aaaccagaca gcgataagcc atcaatggat atggaccagc atttcaacgg tattaaccat 1500
acatttgagt atggggatgg gatctaa 1527
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagc 45
Claims (5)
1.高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
（1）以菌株E.coil CCTCC NO：M 20191026为底盘菌株，将其基因组上的hflC基因替换为融合蛋白基因hflC-linker-cysM，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM；所述融合蛋白基因hflC-linker-cysM核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；（2）将工程菌E.coil W3110EYC::hflC-cysM基因组上的ybbK基因替换为融合蛋白基因ybbK-linker-nrdH，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH；所述融合蛋白基因ybbK-linker-nrdH核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（3）将工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH基因组上的hflK基因替换为融合蛋白基因hflK-linker-cysE，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE；所述融合蛋白基因hflK-linker-cysE核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（4）构建载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS；所述yeaS基因GenbBank登录号为NP_416312.1；
（5）在载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS的基础上，构建载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS-alaE，然后化转到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE中过表达基因alaE和yeaS，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pESE，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌；所述alaE基因GenBank登录号为NP_417156.1。
2.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
（1）以菌株E.coil CCTCC NO：M 20191026为底盘菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将其基因组上的hflC基因替换为融合蛋白基因hflC-linker-cysM，得到工程菌E.coilW3110 EYC::hflC-cysM；所述融合蛋白基因hflC-linker-cysM核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM基因组上的ybbK基因替换为融合蛋白基因ybbK-linker-nrdH基因，得到工程菌E.coil W3110EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH；所述融合蛋白基因ybbK-linker-nrdH核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
（3）应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH基因组上的hflK基因替换为融合蛋白基因hflK-linker-cysE基因，得到工程菌E.coilW3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE；所述融合蛋白基因hflK-linker-cysE核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（4）构建载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS；所述yeaS基因GenbBank登录号为NP_416312.1；
（5）在载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS的基础上，构建载体质粒pTrc99a-cysE-yeaS-alaE，然后化转到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE中过表达基因alaE和yeaS，得到工程菌E.coil W3110 EYC::hflC-cysM::ybbK-nrdH::hflK-cysE/pESE，即为所述高产L-半胱氨酸的基因工程菌；所述alaE基因GenBank登录号为NP_417156.1。
3.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于325～37℃、200～800rpm条件下进行发酵培养，OD600＝10～30时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到L-半胱氨酸。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖25~35 g/L、(NH4)2SO45~20 g/L、KH2PO40.5~2 g/L、Na2S2O35~20 g/L、酵母提取物1~10 g/L、Na2HPO40.5~2 g/L、蛋白胨0.5~2 g/L，0.5~2 ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：0.15 g/L Na2MoO4·2H2O，2.5 g/L H3BO3，0.7g/L CoCl2·6H2O，0.25g/LCuSO4·5H2O，1.6g/L MnCl2·4H2O，0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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