CN101351558A - 使用硫酸盐通透酶表达增强的微生物制备甲硫氨酸及其前体高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物来生产甲硫氨酸或其衍生物的方法。要求保护的微生物以下述方式被修饰：半胱氨酸和/或C1单位的生产被增强和/或C1单位向高半胱氨酸上的转移的潜力被提高或优化。还要求保护甲硫氨酸或其衍生物从发酵培养基中的分离。
Description
技术领域
本发明涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物来生产甲硫氨酸或其衍生物的方法。要求保护的微生物以下述方式修饰：半胱氨酸和/或C1单位的产生被增强和/或C1单位向高半胱氨酸上的转移潜力被提高或优化。还要求保护从发酵培养基中分离甲硫氨酸或其衍生物。
背景技术
含硫的化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对于细胞代谢是关键性的，并被工业生产以用作食品或饲料添加剂和药物。尤其是甲硫氨酸(一种不能由动物合成的必需氨基酸)在许多身体功能中起重要作用。除了其在蛋白质生物合成中的作用以外，甲硫氨酸还涉及转甲基作用以及硒与锌的生物利用率。甲硫氨酸也被直接用于治疗病症如变态反应和风湿热。尽管如此，所生产的大部分甲硫氨酸被添加进动物饲料中。
BSE和禽流感导致动物来源蛋白质的使用减少，因此对纯甲硫氨酸的需求提高。从化学上讲，D，L-甲硫氨酸普遍由丙烯醛、甲基硫醇和氰化物产生。然而例如在鸡饲料添加剂中，外消旋混合物不如纯L-甲硫氨酸功效好(Saunderson，C.L.，(1985)British Journal of Nutrition 54，621-633)。纯L-甲硫氨酸可由外消旋甲硫氨酸产生，例如通过用酰基酶处理N-乙酰基-D，L-甲硫氨酸来产生，这显著提高了生产成本。与环境因素相关而对纯L-甲硫氨酸逐渐增加的需求使得甲硫氨酸的微生物生产很有吸引力。
微生物已经发展出高度复杂的调节机制，所述机制精细地调节细胞组分的生物合成，从而允许最大的生长速度。因此，只有需要量的代谢物(例如氨基酸)被合成，并且通常不能在野生型菌株的培养上清液中检测到。细菌主要通过酶的反馈抑制和基因转录的阻抑或激活来控制氨基酸生物合成。这些调节途径的效应物在多数情况下是相关途径的最终产物。因此，用于在微生物中过量生产氨基酸的策略需要解除这些控制机制的调节。
L-甲硫氨酸合成的途径在许多微生物中是公知的。甲硫氨酸来自氨基酸天冬氨酸，但是其合成需要汇聚两个其它途径——半胱氨酸生物合成和C1代谢(N-甲基四氢叶酸)。天冬氨酸通过一系列三个反应转化为高丝氨酸。高丝氨酸可随后进入苏氨酸/异亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途径。在大肠杆菌中，进入甲硫氨酸途径需要将高丝氨酸酰化成琥珀酰高丝氨酸。该活化步骤允许随后与半胱氨酸缩合，产生含硫醚的胱硫醚，胱硫醚水解得到高半胱氨酸。通过B12依赖性或B12非依赖性甲基转移酶进行最后产生甲硫氨酸的甲基转移。大肠杆菌中的甲硫氨酸生物合成受到MetJ和MetR蛋白分别阻抑和激活甲硫氨酸生物合成基因的调节(综述于Neidhardt，F.C.(主编)，R.Curtiss III，J.L.Ingraham，E.C.C.Lin，K.B.Low，B.Magasanik，W.S.Reznikoff，M.Riley，M.Schaechter，以及H.E.Umbarger(编辑)，1996，Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology.American Society for Microbiology；Weissbach等，1991 Mol.Microbiol.，5，1593-1597)。已知MetJ与其辅阻抑物S-腺苷甲硫氨酸调节基因metA、metB、metC、metE和metF。编码涉及甲硫氨酸产生的酶的其它基因(例如glyA、metE、metH和metF)由MetR激活，而metA被MetR阻抑。相应的酶均参与C1单位的产生及其从丝氨酸到甲硫氨酸的转移。GlyA编码的丝氨酸羟甲基转移酶催化丝氨酸转化成甘氨酸以及辅酶四氢叶酸(THF)上C1单位的并发转移。亚甲基-THF形式的C1单位需要还原成甲基-THF，然后才能转移到高半胱氨酸上，得到甲硫氨酸。该反应由MetF蛋白催化。甲基的转移由MetH通过维生素B12催化或直接由MetE催化。已知MetH酶的催化速率比MetE酶高一百倍。在没有B12、因此也没有活性MetH时，MetE可构成细胞总蛋白的多达5％。活性MetH的存在很可能通过减少高半胱氨酸的量来降低MetE活性，高半胱氨酸通常通过MetR激活metE的转录。因此，由于不表达大量的MetE，经由MetH的甲硫氨酸产生为细胞节约了重要的资源。高半胱氨酸的累积对于大肠杆菌是有毒的(Tuite等，2005 J.Bacterid，187，13，4362-4371.)，同时对经由MetR的metA表达具有负调节效应。因此，酶MetH和/或MetE的强表达显然是高效产生甲硫氨酸所需要的。
在大肠杆菌中，还原的硫整合进半胱氨酸中，然后转移至甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸上，该过程称作转硫化作用(transulfuration)(综述于Neidhardt，F.C.(主编)，R.Curtiss III，J.L.Ingraham，E.C.C.Lin，K.B.Low，B.Magasanik，W.S.Reznikoff，M.Riley，M.Schaechter以及H.E.Umbarger(编辑).1996.Escherichia coli and Salmonella：Cellularand Molecular Biology.American Society for Microbiology)。半胱氨酸由O-乙酰丝氨酸和H2S通过硫化氢解作用来产生。该过程受到产物半胱氨酸的负反馈调节，半胱氨酸作用于由CysE编码的丝氨酸转乙酰基酶。由O-乙酰丝氨酸自发产生的N-乙酰丝氨酸与转录因子CysB一起激活编码下述酶的基因，所述酶涉及转运硫化合物、将其还原成H2S和将其整合进入有机硫化合物半胱氨酸，半胱氨酸像甲硫氨酸一样是必需氨基酸。
不存在半胱氨酸时，MetB催化将甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸转化成氨、α-酮丁酸(ketobutyrate)和琥珀酸，该反应称作γ-消除(Aitken& Kirsch，2005，Arch Biochem Biophys 433，166-75)。α-酮丁酸可随后转化成异亮氨酸。该副反应对甲硫氨酸的工业生产而言是不想要的，因为两种氨基酸难以分离。因此，低γ-消除活性是甲硫氨酸工业生产的一个重要方面。2005年2月7日提交的临时专利申请US 60/650,124描述了如何通过优化酶MetB来降低γ-消除。优化半胱氨酸生物合成流也能够降低γ-消除，从而降低副产品异亮氨酸的产生，这构成本发明的一个实施方案。
发明内容
本发明涉及在发酵过程中使用微生物生产甲硫氨酸、其前体或其衍生产物的方法，所述微生物具有提高的半胱氨酸产生，并在确定的碳源和硫源上生长。
甲硫氨酸前体定义为属于甲硫氨酸特异性代谢途径一部分的代谢物，或者可来自于这些代谢物。甲硫氨酸特异性途径开始于高丝氨酸琥珀酰基转移酶(MetA)将高丝氨酸转化为琥珀酰高丝氨酸。
来自甲硫氨酸的产物来源于甲硫氨酸转化和/或降解途径。
为了提高半胱氨酸生产，发明人已经增强了涉及半胱氨酸生产的基因的表达。
术语“增强的”在本文中描述相应DNA所编码酶活性的胞内活性的提高，例如通过增加基因的拷贝数、使用强启动子或使用具有提高活性的等位基因以及在可能情况下这些手段的组合来实现。
术语“提高的表达”或“增强的表达”在本文中均有使用并具有相似的含义。
为了提高基因的表达，其可被染色体编码或染色体外编码。染色体编码时，基因组上可以有一个或若干个可通过本领域技术人员已知的重组方法引入的拷贝。染色体外编码时，基因可以被不同类型的质粒负载，所述质粒在复制起点方面不同，从而在细胞中的拷贝数不同。它们可以以1-5个拷贝存在，约20个或高达500个拷贝存在，对应于具有严紧型复制的低拷贝数质粒(pSC101，RK2)、低拷贝数质粒(pACYC，pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。
在本发明一个优选的实施方案中，所述基因可以使用具有不同强度的启动子来表达，所述启动子需要或不需要通过诱导物分子来诱导。这些启动子可以是同源的或异源的。实例为启动子Ptrc、Ptac、Plac、λ启动子cI或本领域技术人员已知的其它启动子。
靶基因的表达可以被使相应信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)或蛋白质(例如GST tags，AmershamBiosciences)稳定或去稳定的元件加强或降低.
本发明还涉及微生物，所述微生物含有本发明待增强基因的一个或若干个等位基因。
在本发明一个具体的实施方案中，增强了半胱氨酸产生所涉及基因的表达。
半胱氨酸产生所涉及基因包括编码硫源输入、硫源转化为硫化氢以及硫化氢同化作用或硫源进入半胱氨酸或其衍生物所需蛋白质的基因。
在大肠杆菌中，这些蛋白质由以下基因(后面是登录号和相应多肽的功能)编码：
基因 登录号 功能
cysA 1788761 硫酸盐通透酶
cysU，cysT 1788764 硫酸盐ABC转运体的组件
cysW 1788762 膜结合的硫酸盐转运蛋白
cysZ 1788753 cysK上游的ORF
cysN 1789108 ATP硫酸化酶
cysD 1789109 硫酸腺苷酰转移酶
cysC 1789107 腺苷酰硫酸激酶
cysH 1789121 腺苷酰硫酸还原酶
cysI 1789122 亚硫酸盐还原酶，α亚基
cysJ 1789123 亚硫酸盐还原酶，β亚基
cysE 1790035 丝氨酸乙酰基转移酶
cysK 1788754 半胱氨酸合酶
cysM 2367138 0-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶
cysZ 1788753 硫酸盐转运
sbp 1790351 周质硫酸盐结合蛋白
在本发明的描述中，使用大肠杆菌中相应基因的命名来标识基因和蛋白质。然而，除非另有说明，这些名称的使用具有本发明更普遍的含义，并涵盖其它生物(更特别地是微生物)中所有的相应基因和蛋白质。
PFAM(比对和隐Markov模型的蛋白质家族数据库；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表了蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM使得有可能显示多重比对、察看蛋白质结构域、评价在生物间的分布、进入其它数据库，以及显示已知的蛋白质结构。
COG(clusters of orthologous groups of proteins，蛋白质直系同源组聚类；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通过比较来自66个完全测序的基因组(其代表了30条主要的种系发生线)的蛋白质序列而获得。每个COG通过至少三条线来定义，这样可以鉴定出以前的保守结构域。
鉴定同源序列及其同源性百分比的手段是本领域技术人员公知的，尤其是可在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上使用的BLAST程序，其以该网站上标明的默认参数使用。然后可以使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)，使用那些网站上标明的默认参数来利用(例如比对)获得的序列。
使用GenBank上针对已知基因给出的参考，本领域技术人员能够确定在其它生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等价基因。该常规工作有利地使用可如下确定的共有序列来完成：与来自其它微生物的基因进行序列比对，以及设计简并探针以克隆另一生物中的相应序列。这些分子生物学常规方法是本领域技术人员公知的，并描述于例如Sambrook等(1989 Molecular Cloning：a Laboratory Manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)中。
作为一个优选的实施方案，修饰本发明方法中使用的微生物以提高编码丝氨酸转乙酰基酶的cysE的表达。
本发明还涉及含有编码本发明丝氨酸转乙酰基酶的一个或多个等位基因的微生物。
这些菌株通过下述事实来表征：它们所具有的半胱氨酸代谢通过提供用于γ-胱硫醚合成(由MetB催化的反应)的底物浓度提高而允许朝向甲硫氨酸的通量提高。在低半胱氨酸浓度下，MetB酶从琥珀酰高丝氨酸生产氨、琥珀酸和α-酮丁酸，这是称作γ-消除的反应。提高的半胱氨酸浓度减少了所产生的α-酮丁酸的量，因此提高了朝向甲硫氨酸的流量。
丝氨酸转乙酰基酶活性的增强表达可以在使用丝氨酸和乙酰CoA的酶测试中验证。通过添加含丝氨酸转乙酰基酶活性的蛋白质提取物来开始反应，并在蛋白质沉淀和用硅烷化试剂衍生后通过GC-MS监测O-乙酰丝氨酸的形成。
本发明还涉及编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶的cysM基因的增强表达，这允许提高硫代硫酸盐进入硫代半胱氨酸的整合，这加强了半胱氨酸的产生。
本发明因此要求保护一种方法，其中通过优化半胱氨酸的生产来降低γ-消除，并从而降低异亮氨酸的产生。
本发明的异源启动子应理解为修饰的野生型启动子或者来自另一生物的任何启动子或者完全合成的启动子。优选地，异源启动子是强启动子，例如Ptrc、Ptac、λcI或本领域技术人员已知的其它启动子。
在本发明另一优选的实施方案中，要求保护一种方法，其中将微生物用于生产甲硫氨酸或其衍生物，其中提高或优化表达涉及C1单位产生和/或其向高半胱氨酸上转移的潜力的基因。
根据本发明，通过将目的基因的表达水平以获得最高甲硫氨酸产生的方式进行适应性改造来实现优化。在多数情况下，这通过使用例如异源启动子创建相关基因的表达文库并筛选最佳生产者来完成。
根据本发明，术语C1单位描述单个碳原子，所述碳原子作为甲基、亚甲基、次甲基或甲酰基与运载体分子四氢叶酸结合。
术语“转移潜力”描述了微生物将C1单位转移至高半胱氨酸上的能力。该潜力通过已经被发明人增强和/或优化的MetF和/或MetH的活性来测定。
涉及C1单位产生的基因列于以下：
serA 1789279 磷酸甘油酸脱氢酶
serB 1790849 磷酸丝氨酸磷酸酶
serC 1787136 磷酸丝氨酸氨基转移酶
glyA 1788902 丝氨酸羟甲基转移酶
gcvT 1789272 四氢叶酸依赖性氨甲基转移酶
gcvH 1789271 甘氨酸切割，氨甲基的载体
gcvP 1789269 甘氨酸脱氢酶(脱羧)
lpd 1786307 硫辛酰胺脱氢酶
涉及将C1单位转移至高半胱氨酸上的基因列于以下：
metF 1790377 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶
metH 1790450 B12-依赖性高半胱氨酸-N5-甲基
四氢叶酸转甲基酶
metE 2367304 四氢蝶酰三谷氨酸甲基转移酶
在本发明特别优选的一个实施方案中，修饰用于生产甲硫氨酸的微生物以提高metF或metH或二者的表达，或从异源启动子表达metF。
增强的维生素B12依赖性甲硫氨酸合酶(MetH)活性可以在酶测试中在维生素B12和SAM存在下使用甲基-THF和高半胱氨酸来进行验证。通过添加含亚甲基四氢叶酸还原酶活性的蛋白质提取物来开始反应，并在蛋白质沉淀和用硅烷化试剂衍生后通过GC-MS监测甲硫氨酸的形成。
可以通过提高甲硫氨酸生物合成中所涉及其它基因的表达来进一步提高甲硫氨酸产生，这也是本发明的一个目的。
这些基因列于以下：
metA 1790443 高丝氨酸琥珀酰转移酶
metB 1790375 胱硫醚-γ-合酶
metC 1789383 胱硫醚-β-裂合酶
metF 1790377 5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶
metR 1790262 metE、metH和metF的正调节基因
另外，可以降低降解甲硫氨酸或偏离甲硫氨酸生产途径的途径中基因的表达，或者可以缺失所述基因。
speD 1786311 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶
speC 1789337 鸟氨酸脱羧酶
astA 1788043 精氨酸琥珀酰基转移酶
dapA 1788823 二氢吡啶二羧酸合酶
可以通过表达以下基因来加强回补反应。
ppc 1790393 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
pps 1787994 磷酸烯醇式丙酮酸合酶
可以通过过表达以下基因来加强消耗乙酸的反应。
acs 1790505 乙酰CoA合成酶
L-甲硫氨酸、其前体或其衍生化合物的产生可通过过表达一个或多个下列基因来实现额外的提高：例如来自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的丙酮酸羧化酶(pyc，U51439)或其同系物之一，由基因thrA(高丝氨酸脱氢酶/天冬氨酸激酶，1786183)(优选具有降低的反馈敏感性)、metL(高丝氨酸脱氢酶/天冬氨酸激酶，g1790376)或lysC(天冬氨酸激酶，1790455)和asd(天冬氨酸半醛脱氢酶)编码的高丝氨酸合成酶。
L-甲硫氨酸、其前体或其衍生化合物的产生通过缺失阻抑蛋白MetJ的基因来实现进一步提高，该阻抑蛋白如JP 2000157267-A/3(也参见GenBank 1790373)所述负责下调甲硫氨酸调节子。
通过使用高丝氨酸琥珀酰转移酶等位基因来进一步提高甲硫氨酸生产，所述等位基因对其抑制剂SAM和甲硫氨酸的反馈敏感性降低，如专利申请WO 2005/111202(并入本文中)中所述。
可以通过弱化以下基因之一的活性或缺失以下基因之一来提高L-甲硫氨酸、其前体或其衍生化合物的产生。
弱化在本文中描述通过下列手段降低酶的胞内活性，例如降低其表达、降低酶的稳定性、提高其降解和/或本领域技术人员已知的其它解决方案。
基因 Genbank条目 活性
ackA 1788633 乙酸激酶
pta 1788635 磷酸转乙酰基酶
aceE 1786304 丙酮酸脱氢酶E1
aceF 1786305 丙酮酸脱氢酶E2
lpd 1786307 丙酮酸脱氢酶E3
sucC 1786948 琥珀酰CoA合成酶，β亚基
sucD 1786949 琥珀酰CoA合成酶，α亚基
pck 1789807 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶
pykA 1788160 丙酮酸激酶II
pykF 1787965 丙酮酸激酶I
poxB 1787096 丙酮酸氧化酶
ilvB 1790104 乙酰羟酸合酶I，大亚基
ilvN 1790103 乙酰羟酸合酶I，小亚基
ilvG 1790202 乙酰羟酸合酶II，大亚基
1790203
ilvM 1790204 乙酰羟酸合酶II，小亚基
ilvI 1786265 乙酰羟酸合酶III，大亚基
ilvH 1786266 乙酰羟酸合酶III，小亚基
aroF 1788953 DAHP合成酶
aroG 1786969 DAHP合成酶
aroH 1787996 DAHP合成酶
thrB 1786184 高丝氨酸激酶
thrC 1786185 苏氨酸合酶
sdaA 1788116 丝氨酸脱氨酶
sdaB 1789161 丝氨酸脱氨酶
可通过使用改变的metB等位基因来进一步提高甲硫氨酸产生，所述等位基因优选地或排他地使用H2S并因此从O-琥珀酰高丝氨酸生产高半胱氨酸，如专利申请WO 2004/076659(其内容通过参考并入本文)中所述。
用于发酵生产L-甲硫氨酸、其前体或其衍生化合物的硫源可以是以下任何一种或其组合：硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、二硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐。
在本发明的一个优选的实施方案中，硫源是硫酸盐和/或硫代硫酸盐。
本发明还涉及用于生产L-甲硫氨酸、其前体或其衍生化合物的方法，所述方法包括发酵如上所述的产甲硫氨酸的微生物，浓缩甲硫氨酸、其前体或衍生物，以及分离发酵液中的目的产物。
根据本发明，术语“培养”和“发酵”可无差别地使用，表示微生物在含有简单碳源的适当培养基上生长。
根据本发明，简单碳源是本领域技术人员用于获得微生物(尤其是细菌)正常生长的碳源。特别地，它可以是可同化的糖，例如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖或糖蜜，或这些糖的副产物。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一优选的简单碳源是蔗糖。
本领域技术人员能够确定用于本发明微生物的培养条件。特别地，在20℃和55℃之间、优选25℃和40℃之间的温度下发酵细菌，更特别地，对谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)而言约30℃，对大肠杆菌而言约37℃。
发酵通常在含有具有适应所使用细菌的已知确定组成的无机培养基的发酵罐中进行，所述培养基含有至少一种简单碳源，以及必要时产生该代谢物所需的共底物(co-substrate)。
特别地，大肠杆菌的无机培养基可以与M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.ScL USA 32：120-128)和M63培养基(Miller，1992；AShort Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)或例如由Schaefer等(1999，Anal.Biochem.270：88-96)所定义的培养基具有相同或相似的组成。
类似地，用于谷氨酸棒杆菌的无机培养基可以与BMCG培养基(Liebl等，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32：205-210)或例如Riedel等(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3：573-583)所述的培养基具有相同或相似的组成。可以补充培养基以补偿由突变引入的营养缺陷(auxotrophy)。
发酵L-甲硫氨酸、其前体或其衍生化合物后，将其回收和纯化(必要时)。用于回收和纯化培养基中产生的化合物(例如甲硫氨酸)的方法是本领域技术人员公知的。
任选地，在纯化发酵产物期间可保留从0％到100％的生物量。
本发明还涉及经优化用于发酵生产甲硫氨酸的微生物。
术语“优化的微生物”描述了这样的微生物：其中整合了上述修饰，从而生产目的代谢产物时具有最佳的工业性能以及有可能副产物的生产最低。
在一个优选的应用中，所述生物为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在最优选的应用中，所述生物为大肠杆菌。
发明详述
2004年5月12日提交的PCT N°PCT/IB04/001901中描述了一种大肠杆菌菌株，其中由metJ基因编码的甲硫氨酸阻抑物被氯霉素盒代替(ΔmetJ::Cm)，并具有metA等位基因，所述metA等位基因对甲硫氨酸和SAM(metA＊11)具有的反馈敏感性降低。向该菌株中引入以下遗传修饰。
MG1655metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metF::Km的构建
为了克隆位于异源Ptrc启动子控制下的metF基因，使用Datsenko &Wanner(2000)描述的同源重组策略。该策略允许在目的基因附近插入氯霉素或卡那霉素抗性盒。为此，使用以下的寡核苷酸：
PtrcmetF R(SEQ ID NO 1)
其具有：
-与基因metF(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列)的序列(4130259-4160195)同源的区域(大写)
-与具有RBS(黑体)和-35与-10盒(黑体)的启动子Ptrc序列同源的区域(斜体)
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参照序列)的区域(大写)
Ptrc-metF F(SEQ ID NO 2)
ccttcatctttacatctggacgtctaaacggatagatgtgcacaacacaacatataactacaagcgattgatgaggtaaggt
其具有：
-与基因metF(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列)区域的序列(4130114-4130195)同源的区域(小写)
-与噬菌体T7末端序列(Genbank V01146)同源的区域(斜体，小写)
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参照序列)的区域(大写)
使用寡核苷酸Ptrc-metF F和Ptrc-metF R从质粒pKD4中扩增卡那霉素抗性盒。然后通过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ(pKD46)中，其中表达的Red重组酶允许进行同源重组。选择卡那霉素抗性转化体，并使用下文定义的Ptrc-metFv F和Ptrc-metFv R通过PCR分析来验证抗性盒的插入。
Ptrc-metFv F(SEQ ID NO 3)：GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG(与来自4129866到4129894的序列同源)
Ptrc-metFv R(SEQ ID NO 4)：CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG(与来自4130524到4130497的序列同源)。
得到的菌株称为MG1655metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF：Km。
质粒pME101-thrA＊1-cysE的构建
pME101-thrA＊1
为了加强高丝氨酸的产生，使用启动子Ptrc从质粒pCL1920(Lerner& Inouye，1990，NAR 18，15p 4631)中表达编码thrA＊，其编码对苏氨酸的反馈抗性降低的天冬氨酸激酶/高丝氨酸。为了构建质粒pME101-thrA＊1，使用以下的寡核苷酸从基因组DNA中PCR扩增thrA：
BspH1thrA(SEQ ID NO 5)：ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc
Sma1thrA(SEQ ID NO 6)：ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc
用限制性酶BspHI和SmaI切割PCR扩增片段，并克隆进载体pTRC99A(Stratagene)的NcoI/SmaI位点中。为了从低拷贝载体中表达，如下构建质粒pME101。使用寡核苷酸PME101F和PME101R来PCR扩增质粒pCL1920，并将来自载体pTRC99A的带有lacI基因和Ptrc启动子的BstZ17I-XmnI片段插入所扩增的载体中。用ApaI和SmaI限制性处理所得载体和带有thrA基因的载体，并将含有thrA的片段克隆进载体pME101中。为了将ThrA从反馈抑制中释放，使用寡核苷酸ThrAF F318S和ThrAR F318S通过定点诱变(Stratagene)引入突变F318S，得到载体pME101-thrA＊1。
PME101F(SEQ ID NO 7)：Ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R(SEQ ID NO 8)：Agcttagtaaagccctcgctag
ThrAF F318S(SmaI)(SEQ ID NO 9)：Ccaatctgaataacatggcaatg
agcgtttctggcccggg
ThrAR F318S(SmaI)(SEQ ID NO 10)：Cccgggccagaaacgct
cattgccatgttattcagattgg
pME101-thrA＊1-cysE
为了构建pME101-thrA＊1-cysE，使用寡核苷酸Ome B001和OmeB002通过PCR扩增cysE基因，用限制性酶PvuII切割PCR产物并克隆进载体pME101-thrA＊1的SmaI位点中，得到载体pME101-thrA＊1-cysE。
Ome B001_cysER-PvuII(SEQ ID NO 11)
GGAGGGACAGCTG 
Ome B002_cysEF-PvuII(SEQ ID NO 12)
Atacgcagctg 
PvuII位点加有下划线。黑体序列对应于cysE(Colibri)(3780423-3780397)
MG1655metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metH::Km的构建
为了加强甲硫氨酸的产生，使用Ptrc启动子过表达metH基因。使用以下寡核苷酸进行构建：
DiclR-metHF(SEQ ID NO 13)
其具有：
-与基因metH(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列)的序列(4221461-4221408)同源的区域(小写)
-与具有RBS(黑体)和-35与-10盒(黑体)的启动子Ptrc序列同源的区域(斜体，大写)
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参照序列)的区域(大写)
iclR-metHF(SEQ ID NO 14)
其具有：
-与基因metR(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列)区域的序列(4221327-4221406)同源的区域(斜体，大写)
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参照序列)的区域(大写)。
使用寡核苷酸DiclR-metHF和iclR-metHF从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后通过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG 1655metA＊11ΔmetJ(pKD46)中，其中表达允许同源重组的Red重组酶。选择卡那霉素抗性转化体并使用下文定义的寡核苷酸iclF和iclR通过PCR分析验证抗性盒的插入。
iclF(SEQ ID NO 15)：CCTTTGAGGTCGCATGGCCAGTCGGC(与从4221558到4221533的序列同源)。
iclR(SEQ ID NO 16)：GCTTTTTAATAGAGGCGTCGCCAGCTCCTTGCC(与从4219917到4219949的序列同源)。
得到的菌株称为MG1655metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF：Km。
MG1655metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metF：Km Ptrc-metH的构建
为了构建菌株MG1655metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metF：KmPtrc-metH，将氯霉素和卡那霉素抗性盒从菌株MG 1655 metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metH：Km中去除。
将带有FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔引入该重组菌株中，所述FLP重组酶作用于氯霉素抗性盒的FRT位点。在42℃的一系列培养后，通过PCR分析证实两个盒的缺失。保留的菌株命名为MG 1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metH。
为了将启动子构建体Ptrc::metF：Km转移进菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metH中，使用噬菌体P1转导法。所遵循的方案在2个步骤中实现：制备菌株MG1655 MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF::Km的噬菌体裂解液并随后转导进菌株MG1655metA＊11ΔmetJ Ptrc-metH中。
制备噬菌体裂解液P1：
-用100μl菌株MG 1655metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF：Km的过夜培养物接种10ml LB+Km 50μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl2 5mM
-在37℃下摇动孵育30分钟。
-添加100μl用菌株MG 1655制备的噬菌体裂解液P1(约1.109个噬菌体/ml)。
-在37℃摇动3小时直到所有的细胞被裂解。
-添加200μl氯仿并振荡。
-在4500g离心10分钟以去除细胞碎片。
-转移上清液至无菌管中并添加200μl氯仿。
-将裂解液储存于4℃。
转导
-将5ml菌株MG 1655metA＊11ΔmetJ Ptrc-metH在LB培养基中的过夜培养物在1500g离心10分钟。
-将细胞沉淀悬浮于2.5ml 10mM MgSO4、5mM CaCl2中
-对照管：100μl细胞
100μl菌株MG1655metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF：Km的噬菌体P1
-测试管：100μl细胞+100μl菌株MG1655 metA＊11ΔmetJPtrc-metF：Km的噬菌体P1
-在30℃不摇动孵育30分钟。
-向每管中添加100μl 1M柠檬酸钠并振荡。
-添加1ml LB。
-在37℃摇动孵育1小时。
-将管在7000rpm离心3分钟后涂布在平板LB+Km 50μg/ml上。
-在37℃孵育过夜。
菌株的验证
选择卡那霉素抗性转化体并使用上述寡核苷酸Ptrc-metFv F和Ptrc-metFv R通过PCR分析验证启动子构建体Ptrc-metF：Km的存在。保留的菌株命名为MG 1655 metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metHPtrc-metF：Km。
MG1655 metA＊11 ΔmetJ::Cm Ptrc-cysM::Km的构建
为了克隆位于异源Ptrc启动子控制下的cysM基因，使用Datsenko &Wanner(2000)描述的同源重组策略。该策略允许在相关基因附近插入氯霉素或卡那霉素抗性盒。为此使用以下的寡核苷酸：
Ptrc-cysM F
gcctgatgcgacgcttgcgcgtcttatcaggtctacaggttacaaaccttgccat
(SEQ ID NO 17)
其具有：
-与基因cysM(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列)的序列(2537627-2537681)同源的区域(小写)
-与具有RBS(黑体)和-35与-10盒(黑体)的启动子Ptrc序列同源的区域(斜体，小写)
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参照序列)的区域(大写)
Ptrc-cysM R
ggttgagtgaatgttaaacgcccggaggcgcttcccgcgatccgggctttt
(SEQ ID NO 18)
其具有：
-与基因cysM(网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列)区域的序列(2537734-2537684)同源的区域(小写)
-与噬菌体T7末端序列(Genbank V01146)同源的区域(斜体，大写)
-用于扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.& Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参照序列)的区域(大写)。
使用寡核苷酸Ptrc-cysM F和Ptrc-cysM R从质粒pKD4中扩增卡那霉素抗性盒。然后通过电穿孔将获得的PCR产物引入菌株MG1655metA＊11 ΔmetJ(pKD46)中，其中表达允许同源重组的Red重组酶。选择卡那霉素抗性转化体并使用下文定义的寡核苷酸Ptrc-cysMv F和Ptrc-cysMv R通过PCR分析验证抗性盒的插入。
Ptrc-cysMv F：ggtgacaagaatcagttccgc(与来自2537262到2537282的序列同源)。(SEQ ID NO 19)
Ptrc-cysMv R：GCGTTTATTCGTTGGTCTGC(与来自2537833到2537814的序列同源)。(SEQ ID NO 20)
得到的菌株称为MG 1655 metA＊11ΔmetJ J Ptrc-cysM::Km。
MG1655metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH Ptrc-cysM：Km的构建
为了构建菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF Ptrc-metHPtrc-cysM：Km，如上所述使用质粒pCP20将氯霉素和卡那霉素抗性盒从菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metF：Km Ptrc-metH中去除。得到的菌株命名为MG 1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH。
为了将启动子构建体Ptrc-cysM：Km转移进菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF Ptrc-metH中，使用噬菌体P1转导法。所遵循的方案在2个步骤中完成：制备菌株MG1655 MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-cysM::Km的噬菌体裂解液，以及随后转导进菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metFPtrc-metH中。获得的菌株命名为MG 1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metFPtrc-metH Ptrc-cysM::Km。
用等位基因metA＊11和ΔmetJ将增强cysE和met表达与优化metF和cysM表达组合
为了构建菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ::Cm(pME101-thrA＊1)、MG1655 metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metH：Km(pME101-thrA＊1-cysE)、MG1655 metA＊11 ΔmetJ::Cm Ptrc-metH Ptrc-metF：Km(pME101-thrA＊1-cysE)和MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metF Ptrc-metHPtrc-cysM：Km(pME101-thrA＊1-cysE)，将质粒(pME101-thrA＊1)或(pME101-thrA＊1-cysE)通过转化引入菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ::Cm、MG1655 metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metH：Km、MG1655metA＊11ΔmetJ::Cm Ptrc-metH Ptrc-metF：Km和MG1655 metA＊11ΔmetJPtrc-m etF Ptrc-m etH Ptrc-cysM：Km中。
评价甲硫氨酸生产菌株，所述菌株具有异源启动子控制下增强的cysE、metH和/或cysM和/或metF表达
首先在小锥形瓶中评价生产菌株。在含有2.5g/l葡萄糖的LB培养基中培养预培养物，并用于接种基本培养基PC1中的过夜培养物。该培养物用于在培养基PC1中接种50ml培养物至OD600为0.2，所述培养基PC1中补充有0.01g.L-1的维生素B12。如果指明的话，将硫酸铵替换为5.6g/l的硫代硫酸铵。适当时，以100mg/l的浓度添加大观霉素。在4.5到5的OD600下，在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC定量细胞外氨基酸，并在硅烷化后使用GC-MS分析其它相关代谢物。
表1.基本培养基PC1的组成
| 化合物 | 浓度 |
| ZnSO4.7H2O | 0.0040g.L-1 |
| CuCl2.2H2O | 0.0020g.L-1 |
| MnSO4.H2O | 0.0200g.L-1 |
| CoCl2.6H2O | 0.0080g.L-1 |
| H3BO3 | 0.0010g.L-1 |
| Na2MoO4.2H2O | 0.0004g.L-1 |
| MgSO4.7H2O | 1.00g.L-1 |
| 柠檬酸 | 6.00g.L-1 |
| CaCl2 2H2O | 0.04g.L-1 |
| (NH4)2SO4 | 5.00g.L-1 |
| K2HPO4 | 8.00g.L-1 |
| Na2HPO4 | 2.00g.L-1 |
| (NH4)2HPO4 | 8.00g.L-1 |
| NH4Cl | 0.13g.L-1 |
| NaOH4M | 调节至pH6.8 |
| FeSO4，7H2O | 0.04g.L-1 |
| 硫胺 | 0.01g.L-1 |
| 葡萄糖 | 5.00g.L-1 |
| 维生素B12(氰钴铵素) | 0.01g.L-1 |
| 大观霉素 | 0.2g.L-1 |
| MOPS | 5.00g.L-1 |
如表2中所示，甲硫氨酸的量随着过表达cysE、cysE与metH或者cysE、metH与metF表达改变而增加。增强cysM的表达可进一步提高甲硫氨酸产生。某些菌株在硫代硫酸盐存在下生产更大量的甲硫氨酸。当cysE、cysM和metH过表达、metF表达位于Ptrc启动子的控制下且存在硫代硫酸盐时，获得最高的甲硫氨酸生产。cysE和metH表达时异亮氨酸生产被强烈降低，指示γ-消除活性的降低。在过表达cysE和metH并从异源启动子表达metF的菌株中，cysM的过表达降低γ-消除。
表2.在使用硫酸盐(S)或硫代硫酸盐(T)作为硫源的分批培养中，由上述菌株生产的以mmol/g DW计的甲硫氨酸和异亮氨酸，n.d.，未测定。
| 基因型 | 甲硫氨酸(mmol/gDW)(S) | 甲硫氨酸(mmol/gDW)(T) | 异亮氨酸(mmol/gDW)(S) | 异亮氨酸(mmol/gDW)(T) |
| MG1655 metA*11ΔmetJ(pME101-thrA*1) | 0.55 | 0.68 | 0.28 | 0.32 |
| MG1655 metA*11ΔmetJ(pME101-thrA*1-cysE) | 1.02 | 0.86 | 0.15 | 0.23 |
| MG1655 metA*11ΔmetJ Ptrc-metH：Km(pME101-thrA*1-cysE) | 1.23 | 1.19 | 0.07 | 0.1 |
| MG1655 metA*11ΔmetJ Ptrc-metHPtrc-metF：Km(pME101-thrA*1-cysE) | 1.36 | 1.77 | 0.17 | 0.23 |
| MG1655 metA*11ΔmetJ Ptrc-metHPtrc-metF Ptrc-cysM(pME101-thrA*1-cysE) | n.d. | 2.04 | n.d. | 0.02 |
3.测定CysE和MetH的酶活性改变
为了验证CysE表达和MetH表达的改变，在粗提物中测定相应酶的活性。
为了体外测定酶活性，在如上所述的基本培养基中培养大肠杆菌并在对数中期(mid log phase)收集。将细胞重悬于冷的磷酸钾缓冲液中并在冰上超声处理(Branson超声波仪，70W)。离心后，定量上清液中含有的蛋白质(Bradford，1976)。
为了测定丝氨酸乙酰基转移酶活性(CysE)，在100mM磷酸钾pH7.5、4mM乙酰CoA、30mM L-丝氨酸中将10μl提取物于25℃下测定10分钟。用丙酮沉淀蛋白质并在用硅烷化试剂衍生化后通过GC-MS检测O-乙酰基丝氨酸。
为了测定维生素B12依赖性甲硫氨酸合酶活性(MetH)，在100mM磷酸钾pH7.2、1mM高半胱氨酸、0.25mM甲基四氢叶酸、50μM维生素B12、20μM S-腺苷甲硫氨酸和25mM DTT中将100μl提取物于37℃下测定10分钟。用丙酮沉淀蛋白质并在用硅烷化试剂衍生化后通过GC-MS检测产生的甲硫氨酸。
如表3所示，基因cysE和metH的过表达提高相应的酶活性。因此，这些基因活性的提高导致甲硫氨酸产生的提高。
表3.在硫代硫酸盐存在下培养的甲硫氨酸生产菌株中以mUI/g DW计的丝氨酸乙酰基转移酶(CysE)和甲硫氨酸合酶(MetH)活性
| 基因型 | CysE | MetH |
| MG1655 metA*11ΔmetJ(pME101-thrA*1) | 65 | 3.2 |
| MG1655 metA*11ΔmetJ(pME101-thrA*1-cysE) | 453 | 1.2 |
| MG1655 metA*11ΔmetJ Ptrc-metH(pME101-thrA*1-cysE) | 475 | 12 |
| MG1655 metA*11ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF：Km(pME101-thrA*1-cysE) | 292 | 6.8 |
验证发酵条件下的甲硫氨酸生产
随后使用分批补料方案，在300ml发酵罐(DASGIP)中在生产条件下测试生产大量目的代谢物的菌株。
为此，使用在含2.5g/l葡萄糖的LB培养基中培养8小时的培养物来接种基本培养基PC1(见上文)中的过夜预培养物。用150ml基本培养基(B1)填充发酵罐并用1.5ml浓缩的预培养物(9g/l和12g/l之间)接种至近0.09g/l的生物量浓度。
表4.基本培养基B1的组成
| 化合物 | 浓度 |
| ZnSO4.7H2O | 0.0040g.L-1 |
| CuCl2.2H2O | 0.0020g.L-1 |
| MnSO4.H2O | 0.0200g.L-1 |
| CoCl2.6H2O | 0.0080g.L-1 |
| H3BO3 | 0.0010g.L-1 |
| Na2MoO4.2H2O | 0.0004g.L-1 |
| MgSO4.7H2O | 1.00g.L-1 |
| CaCl2 2H2O | 0.08g.L-1 |
| (NH4)2SO4 | 5.00g.L-1 |
| K2HPO4 | 8.00g.L-1 |
| Na2HPO4 | 2.00g.L-1 |
| (NH4)2HPO4 | 8.00g.L-1 |
| NH4Cl | 0.13g.L-1 |
| 柠檬酸 | 6.00g.L-1 |
| FeSO4，7H2O | 0.04g.L-1 |
| 硫胺 | 0.01g.L-1 |
| 葡萄糖 | 5.00g.L-1 |
| PPG | 0.4mL.L-1 |
| 大观霉素 | 0.2g.L-1 |
| 维生素B12(氰钴铵素) | 0.01g.L-1 |
| NaOH4M | 调节至pH6.8 |
表5.T1型基本培养基FB
| 化合物 | 浓度 |
| ZnSO4.7H2O | 0.0040g.L-1 |
| CuCl2.2H2O | 0.0020g.L-1 |
| MnSO4.H2O | 0.0200g.L-1 |
| CoCl2.6H2O | 0.0080g.L-1 |
| H3BO3 | 0.0010g.L-1 |
| Na2MoO4.2H2O | 0.0004g.L-1 |
| MgSO4 | 5.00g.L-1 |
| 柠檬酸 | 6.00g.L-1 |
| (NH4)2SO4 | 8.32g.L-1 |
| Na2SO4 | 8.95g.L-1 |
| (NH4)2S2O3 | 22.32g.L-1 |
| FeSO4，7H2O | 0.04g.L-1 |
| 硫胺 | 0.01g.L-1 |
| 葡萄糖 | 500g.L-1 |
| 大观霉素 | 0.2g.L-1 |
| 维生素B12(氰钴铵素) | 0.01g.L-1 |
| NH4OH 28％ | 添加硫代硫酸盐之前调节至pH6.0 |
表6.S型基本培养基FB
| 化合物 | 浓度 |
| ZnSO4.7H2O | 0.0040g.L-1 |
| CuCl2.2H2O | 0.0020g.L-1 |
| MnSO4.H2O | 0.0200g.L-1 |
| CoCl2.6H2O | 0.0080g.L-1 |
| H3BO3 | 0.0010g.L-1 |
| Na2MoO4.2H2O | 0.0004g.L-1 |
| MgSO4 | 5.00g.L-1 |
| 柠檬酸 | 6.00g.L-1 |
| (NH4)2SO4 | 20.0g.L-1 |
| Na2SO4 | 10.0g.L-1 |
| FeSO4，7H2O | 0.04g.L-1 |
| 硫胺 | 0.01g.L-1 |
| 葡萄糖 | 500g.L-1 |
| 大观霉素 | 0.2g.L-1 |
| 维生素B12(氰钴铵素) | 0.01g.L-1 |
| NH4OH 28％ | 调节至pH6.8 |
保持培养温度恒定在37℃，并使用NH4OH溶液将pH恒定调节至6.5和8之间的值，优选6.7。分批期(batch phase)期间将搅动速率维持在600rpm并在分批补料期结束时提高到多至1000rpm。通过使用气体控制器将溶解氧浓度维持在20％和40％之间、优选30％的饱和度。当细胞量达到0.9g/l到1.2g/l的浓度时，以0.1ml/h和1.5ml/h之间(优选0.43ml/h)的起始流速开始分批补料，并S形(24小时)提高至0.5ml/h和5.8ml/h之间(优选1.7ml/h)的流速。确切的补料条件通过下式计算：
其中Q(t)是对于150ml批体积的补料流速(以mL/h计)
P1为0.025至0.35，优选0.100。
P2为0.400至5.600，优选1.600。
P3为0.068至0.95，优选0.270。
P4为1.250至17.5，优选5.000。
在该情况下，使用含有浓度为300g/l至800g/l(优选500g/L)葡萄糖的FB培养基。
当生物量的浓度达到20g/l至50g/l(优选35g/L，40至80h)的值时停止发酵，并使用HPLC测定细胞外甲硫氨酸和异亮氨酸浓度。
表7.在下述菌株的分批补料发酵中获得的甲硫氨酸效价，所述菌株在异源启动子下过表达cysE，以及metH或metF，或三者的组合。参照对应于MG1655 metA＊11ΔmetJ。菌株在硫代硫酸盐(T)或硫酸盐(S)存在下生长。
| 基因型 | 硫代硫酸盐/硫酸盐 | 甲硫氨酸(mM) | 异亮氨酸(mM) |
| Ref+(pME101-thrA*1) | S | 70mM | 25mM |
| Ref+(pME101-thrA*1) | T | 94mM | 35mM |
| Ref+(pME101-thrA*1-cysE) | S | 74mM | 2mM |
| Ref+(pME101-thrA*1-cysE) | T | 101mM | 0mM |
| Ref+Ptrc-metH Ptrc-metF：Km(pME101-thrA*1-cysE) | T | 121mM | 1mM |
如表7所示，在异源启动子控制下增强cysE；cysE和metH以及cysE、metH和metF的表达或者在硫代硫酸盐存在下培养菌株可显著地提高甲硫氨酸生产。异亮氨酸生产被cysE和/或metH的过表达显著降低。
随后使用分批补料方案在2.5L发酵罐(PIERRE GUERIN)中于生产条件下对在300ml发酵罐中生产最大量甲硫氨酸的菌株进行测试。
为此，使用在含2.5g/l葡萄糖的LB培养基中培养了8小时的培养物来接种基本培养基PC1中的过夜预培养物。用600ml基本培养基(B2)填充发酵罐并用6ml浓缩的预培养物(9g/l至12g/l)接种至0.9g/l的生物量。
将培养物的温度维持恒定在37℃，并使用NH4OH 28％溶液将pH恒定调节至6.3至8、优选6.8。在分批阶段将最初的搅动速率设定在200rpm并在补料分批期时提高至至多1200rpm。分批期将最初的气流速度设定为40Nl/h并在分批补料期时提高到多至250Nl/h。通过提高搅动速度和气流速度将溶解氧浓度维持在20％至40％(优选30％)饱和度。当生物量浓度达到1.2g/l到1.5g/l时，以0.5ml/h至4ml/h(优选1.0ml/h)的起始流速开始分批补料，并指数式提高(15小时)到3ml/h至35ml/h(优选20.1ml/h)的流速。在该点，将流速维持恒定10到45个小时，优选30h。对于补料而言，使用含有浓度300g/l至800g/l(优选750g/l)葡萄糖的FB型T2(见表8)。
当生物量的浓度达到40g/l和110g/l之间(优选90g/L)的值时停止发酵，并使用HPLC测定细胞外甲硫氨酸浓度。在这些条件下菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF(pME101-thrA＊1-cysE)生产169mM甲硫氨酸。
表8.基本培养基FB T2
| 化合物 | 浓度 |
| ZnSO4.7H2O | 0.0040g.L-1 |
| CuCl2.2H2O | 0.0020g.L-1 |
| MnSO4.H2O | 0.0200g.L-1 |
| CoCl2.6H2O | 0.0080g.L-1 |
| H3BO3 | 0.0010g.L-1 |
| Na2MoO4.2H2O | 0.0004g.L-1 |
| MgSO4 | 5.00g.L-1 |
| 柠檬酸 | 6.00g.L-1 |
| K2HPO4，3H2O | 3.93g.L-1 |
| (NH4)2SO4 | 5.54g.L-1 |
| Na2SO4 | 5.96g.L-1 |
| (NH4)2S2O3 | 33.48g.L-1 |
| FeSO4，7H2O | 0.04g.L-1 |
| 硫胺 | 0.01g.L-1 |
| 葡萄糖 | 750g.L-1 |
| 大观霉素 | 0.2g.L-1 |
| 维生素B12(氰钴铵素) | 0.01g.L-1 |
| NH4OH 28％ | 添加硫代硫酸盐之前调节至pH6.0 |
表9.基本培养基B2的组成
| 化合物 | 浓度 |
| ZnSO4.7H2O | 0.0040g.L-1 |
| CuCl2.2H2O | 0.0020g.L-1 |
| MnSO4.H2O | 0.0200g.L-1 |
| CoCl2.6H2O | 0.0080g.L-1 |
| H3BO3 | 0.0010g.L-1 |
| Na2MoO4.2H2O | 0.0004g.L-1 |
| MgSO4.7H2O | 1.00g.L-1 |
| CaCl2 2H2O | 0.16g.L-1 |
| (NH4)2SO4 | 5.00g.L-1 |
| K2HPO4 | 15.00g.L-1 |
| Na2HPO4 | 2.00g.L-1 |
| (NH4)2HPO4 | 8.00g.L-1 |
| NH4Cl | 0.13g.L-1 |
| 柠檬酸 | 6.00g.L-1 |
| FeSO4，7H2O | 0.04g.L-1 |
| 硫胺 | 0.01g.L-1 |
| 葡萄糖 | 5.00g.L-1 |
| PPG | 0.4mL.L-1 |
| 大观霉素 | 0.2g.L-1 |
| 维生素B12(氰钴铵素) | 0.01g.L-1 |
| NaOH4M | 调节至pH6.8 |
序列表
<110>代谢探索者公司
<120>使用硫酸盐通透酶表达增强的微生物制备甲硫氨酸及其前体高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸的方法
<130>349179 D24084
<160>20
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>127
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>1
gccaggctct gattcagggc atcccgctgg ctggcgtgaa aaaagctcat aatatacctc 60
cttattccac acattatacg agccggatga ttaattgtca acagctctgt aggctggagc 120
tgcttcg 127
<210>2
<211>136
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>2
ccttcatctt tacatctgga cgtctaaacg gatagatgtg cacaacacaa catataacta 60
caagcgattg atgaggtaag gttcacactg gctcaccttc gggtgggcct ttctgccata 120
tgaatatcct ccttag 136
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>3
gcccggtact catgttttcg ggtttatgg 29
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>4
ccgttattcc agtagtcgcg tgcaatgg 28
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>5
ttatcatgag agtgttgaag ttcggcggta catcagtggc 40
<210>6
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>6
ttacccgggc cgccgccccg agcacatcaa acccgacgc 39
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>7
ccgacagtaa gacgggtaag cctg 24
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>8
agcttagtaa agccctcgct ag 22
<210>9
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>9
ccaatctgaa taacatggca atgtccagcg tttctggccc ggg 43
<210>10
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>10
cccgggccag aaacgctgga cattgccatg ttattcagat tgg 43
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>11
ggagggacag ctgatacgaa agaagtccgc gaactggcgc 40
<210>12
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>12
atacgcagct gggacattag atcccatccc catactcaaa tgtatgg 47
<210>13
<211>140
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>13
gcaccagaat acgttcattt aactgcgcac gcagttgttc cactttgctg ctcatgtctg 60
tcctccagta catgcaaccc cacacattat acgagccgga tgattaattg tcaacagctc 120
tgtaggctgg agctgcttcg 140
<210>14
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>14
gcttttacca cagatgcgtt tatgccagta tggtttgttg aatttttatt aaatctgggt 60
tgagcgtgtc gggagcaagt catatgaata tcctccttag 100
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>15
cctttgaggt cgcatggcca gtcggc 26
<210>16
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>16
gctttttaat agaggcgtcg ccagctcctt gcc 33
<210>17
<211>130
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>17
gcctgatgcg acgcttgcgc gtcttatcag gtctacaggt tacaaacctt gccataatat 60
acctccttac cacacattat acgagccgga tgattaattg tcaacagctc catatgaata 120
tcctccttag 130
<210>18
<211>107
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>18
ggttgagtga atgttaaacg cccggaggcg cttcccgcga tccgggcttt ttatcacact 60
ggctcacctt cgggtgggcc tttctgctgt aggctggagc tgcttcg 107
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>19
ggtgacaaga atcagttccg c 21
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>20
gcgtttattc gttggtctgc 20
Claims (27)
1.用于生产甲硫氨酸、其衍生物或前体的方法，所述方法通过在含有碳源和硫源的适当培养基中培养微生物并从培养基中回收甲硫氨酸来实现，其中所述微生物被修饰以增强半胱氨酸的生产。
2.权利要求1的方法，其中涉及半胱氨酸生产的至少一个基因的表达被提高。
3.权利要求2的方法，其中所述涉及半胱氨酸生产的至少一个基因选自：
cysA 硫酸盐通透酶
cysU，cysT 硫酸盐ABC转运体的组件
cysW 膜结合的硫酸盐转运蛋白
cysZ cysK上游的ORF
cysN ATP硫酸化酶
cysD 硫酸腺苷酰转移酶
cysC 腺苷酰硫酸激酶
cysH 腺苷酰硫酸还原酶
cysI 亚硫酸盐还原酶，α亚基
cysJ 硫酸盐还原酶，β亚基
cysE 丝氨酸乙酰基转移酶
cysK 半胱氨酸合酶
cysM O-乙酰基硫化氢解酶
cysZ 硫酸盐转运
sbp 周质硫酸盐结合蛋白
4.权利要求2的方法，其中至少cysE的表达被提高。
5.权利要求2的方法，其中至少cysM的表达被提高。
6.权利要求1到5中任一项的方法，其中涉及C1单位的产生以及向高半胱氨酸上进行转移的潜力的至少一个基因的表达被提高和/或被异源启动子驱动。
7.权利要求6的方法，其中涉及C1单位的产生以及向高半胱氨酸上进行转移的潜力的至少一个基因选自：
·编码甲硫氨酸合酶的metE、metH
·编码5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶的metF
·编码丝氨酸羟甲基转移酶的glyA
·编码甘氨酸切割复合体的gcvTHP，lpd。
8.权利要求7的方法，其中metE、metH和/或metF的表达被提高和/或至少所述基因之一由异源启动子表达。
9.权利要求1到8中任一项的方法，其中通过优化半胱氨酸生物合成流来维持低γ-消除活性，并因此减少副产物异亮氨酸的产生。
10.权利要求1到9中任一项的方法，其中提高了涉及甲硫氨酸产生的另外基因的表达。
11.权利要求1到10中任一项的方法，其中弱化了减少甲硫氨酸产生的基因的表达。
12.权利要求1到11中任一项的方法，其中由metJ基因编码的甲硫氨酸阻抑物被缺失或突变，和/或高丝氨酸琥珀酰基转移酶(MetA)等位基因被整合进菌株中，所述等位基因编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性降低的酶。
13.权利要求1到12中任一项的方法，其中培养基中的硫源是硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、二硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐或所述不同来源的组合。
14.权利要求13的方法，其中培养基中的硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐或二者的混合物。
15.权利要求1到14中任一项的方法，所述方法包括下述步骤：分离任选地部分或全部(0-100％)保留在终产物中的所需氨基酸/发酵液组分和/或生物量。
16.用于发酵生产甲硫氨酸或其衍生物的微生物，其中所述微生物被优化以增强半胱氨酸的产生。
17.权利要求16的微生物，其中涉及半胱氨酸产生的至少一个基因的表达被提高。
18.权利要求17的微生物，其中涉及半胱氨酸产生的至少一个基因选自：
cysA 硫酸盐通透酶
cysU，cysT 硫酸盐ABC转运体的组件
cysW 膜结合的硫酸盐转运蛋白
cysZ cysK上游的ORF
cysN ATP硫酸化酶
cysD 硫酸腺苷酰转移酶
cysC 腺苷酰硫酸激酶
cysH 腺苷酰硫酸还原酶
cysI 亚硫酸盐还原酶，α亚基
cysJ 硫酸盐还原酶，β亚基
cysE 丝氨酸乙酰基转移酶
cysK 半胱氨酸合酶
cysM O-乙酰基硫化氢解酶
cysZ 硫酸盐转运
sbp 周质硫酸盐结合蛋白
19.权利要求17的微生物，其中至少cysE的表达被提高。
20.权利要求17的微生物，其中至少cysM的表达被提高。
21.权利要求16到20中任一项的微生物，其中涉及C1单位的产生和至高半胱氨酸上的转移潜力的至少一个基因的表达被提高和/或受外源启动子驱动。
22.权利要求21的微生物，其中涉及C1单位的产生以及向高半胱氨酸上的转移潜力的至少一个基因选自：
·编码甲硫氨酸合酶的metE、metH
·编码5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶的metF
·编码丝氨酸羟甲基转移酶的glyA
·编码甘氨酸切割复合体的gcvTHP，lpd。
23.权利要求21的微生物，其中metE、metH和/或metF的表达被提高和/或至少所述基因之一由异源启动子表达。
24.权利要求16到23中任一项的微生物，其中通过优化半胱氨酸生物合成流来维持低γ-消除活性，并因此降低副产物异亮氨酸的产生。
25.权利要求16到24中任一项的微生物，其中涉及甲硫氨酸产生的另外基因的表达被提高。
26.权利要求16到25中任一项的微生物，其中减少甲硫氨酸产生的基因的表达被弱化。
27.权利要求16到26中任一项的微生物，其中缺失或突变了由metJ基因编码的甲硫氨酸阻抑物，和/或整合了高丝氨酸琥珀酰基转移酶(MetA)等位基因，所述等位基因编码对S-腺苷基甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性降低的酶。
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