CN102782137A - 用于甲硫氨酸生产的菌株和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用具有苏氨酸的减弱转化的修饰菌株用于甲硫氨酸生产的方法。这可以通过减少苏氨酸转化成甘氨酸和/或通过减少其转化至α-酮丁酸来实现。本发明还涉及具有苏氨酸的减弱转化的修饰菌株。
Description
发明领域
本发明涉及使用具有苏氨酸的减弱转化的修饰菌株用于甲硫氨酸生产的方法。这可以通过减少苏氨酸降解成甘氨酸,和/或通过减少其转化成α-酮丁酸来实现。本发明还涉及具有苏氨酸的减弱转化的修饰菌株。
发明背景
含硫化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对于细胞代谢是关键的,并且工业生产以用作食物或饲料添加剂和药剂。特别地,不能由动物合成的必需氨基酸甲硫氨酸在许多机体功能中起重要作用。除其在蛋白质生物合成中的作用外,甲硫氨酸涉及转甲基作用以及硒和锌的生物利用度。甲硫氨酸还直接用作治疗用于病症如变态反应和风湿热。然而,生产的大多数甲硫氨酸加入动物饲料中。
由于BSE和鸡流感,动物衍生的蛋白质的使用减少,随之而来的是对于纯甲硫氨酸的需求增加。在化学上,D,L-甲硫氨酸通常由丙烯醛、甲硫醇和氰化氢产生。然而,外消旋混合物不如纯L-甲硫氨酸一样表现良好,如例如在鸡饲料添加剂中(Saunderson,C.L.,(1985)British Journal of Nutrition 54,621-633)。纯L-甲硫氨酸可以例如通过N-乙酰-D,L-甲硫氨酸的酰基酶处理自外消旋甲硫氨酸产生,这急剧增加生产成本。对于与环境问题相关的纯L-甲硫氨酸的渐增需求使甲硫氨酸的微生物生产变得有吸引力。
甲硫氨酸生物合成依赖于高丝氨酸、半胱氨酸和C1单位生产。高丝氨酸是天冬氨酸的衍生物并且提供用于甲硫氨酸的碳骨架。高丝氨酸还可以转化成苏氨酸,这继而又是(i)异亮氨酸的前体且还可以转化成甘氨酸(ii)。这两个反应消耗苏氨酸且将更多高丝氨酸拉进苏氨酸途径,从而减少进入甲硫氨酸途径的流量。
(i)对于异亮氨酸的生产,苏氨酸脱氨为α-酮丁酸,通过分别由基因ilvA(EC 4.3.1.19,Ramakrishnan等人,1965,J Bacteriol,89:661)和tdcB(EC 4.3.1.19,Goss等人,1988,J Bacteriol,170:5352)编码的苏氨酸脱氨酶或苏氨酸脱水酶催化的反应。由sdaA(EC 4.3.1.17;Su等人1989,J Bacteriol,171:5095)和sdaB(EC 4.3.1.17,Su和Newman,1991,173:2473)编码的丝氨酸脱氨酶也已知编码某些苏氨酸脱氨酶活性。
(ii)两种用于苏氨酸甘氨酸转化的途径存在于大肠杆菌(E.coli.)中:
(A)苏氨酸可以通过由苏氨酸脱氢酶(Tdh;E.C.1.1.1.103)和2-氨基3-酮丁酸-coA-裂解酶(Kbl;E.C.2.3.1.29)(Boylan S.A.等人,1981,Journal ofBiological Chemistry,256,4,第1809-1815页;Mukherjee J.J.等人,1987,Journal of Biological Chemistry,262,30,第14441-14447页)催化的两个连续反应转化成甘氨酸。这些反应各生成一分子的乙酰-coA和NADH。(Komatsubara S.等人,1978,Journal of Bacteriology,1981,135,第318-323页)。
(B)苏氨酸还可以经由通过苏氨酸醛缩酶催化的反醛醇(retroaldol)机制直接转化成甘氨酸。这种反应生成一个乙醛和一个甘氨酸(Plamann M.D.等人,1983,Gene,22,1,第9-18页)。在大肠杆菌中的苏氨酸醛缩酶活性携带酶由下述基因编码:ltaE(Liu JL等人,1998,European Journal of Biochemistry,255,1,第220-226页)、kbl(Markus J.P.等人,1993,Biochemica et BiophysicaActa,1164,第299-304页)和gkyA(Schirch V.等人,1968,Journal of BiologicalChemistry,243,第5561页;Schirch V.等人,1985,Journal of Bacteriology,163,1,第1-7页)。
LtaE是低特异性苏氨酸醛缩酶,其被认为涉及苏氨酸的降解,以形成乙醛和甘氨酸(Liu JL等人,1998,European Journal of Biochemistry,255,1,第220-226页)。
Kbl的主要活性是2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(E.C 2.3.1.29),其由2-氨基-3-酮丁酸的脱乙酰组成,以形成甘氨酸和乙酰-辅酶A(Mukherjee J.J.等人,1987,Journal of Biological Chemistry,262,30,第14441-14447页)。它已显示具有TAL活性,这使得其成为用于苏氨酸降解的通用酶(Markus J.P.等人,1993,Biochemica et Biophysica Acta,1164,第299-304页)。
GlyA的基本活性是丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)(E.C.2.1.2.1)。它催化氨基酸丝氨酸和四氢叶酸(THF)转化成甘氨酸和5,10亚甲基-THF(关于综述:Schirch V.等人,2005,Current opinion in Chemical biology,9,第482-487页)。在由GlyA催化的其他次级活性中(关于综述:Schirch L.,2006,Advances inenzymology and related areas of molecular biology,53,第83-112页),仅苏氨酸醛缩酶(TAL)看起来是生理学相关的。GlyA是结晶的(Scarsdale等人,2000,Journal of Molecular Biology,296,第155-168页),并且已进行了研究以阐明底物特异性的起源(Angelaccio S.等人,1992,Biochemistry,31,第155-162页)。Angelaccio等人将活性部位附近的所有苏氨酸突变为丙氨酸,并且注意到突变T226A使苏氨酸的Km增加1.8倍,并且使TAL活性减少至次于其定量限的水平,同时不修饰THF的Km也不修饰丝氨酸的Km。然而,该突变对SHMT活性具有强烈影响,因为SHMT活性的kcat减少了32倍。
经修饰用于改善得率的用于生产甲硫氨酸的菌株目前在本领域中广泛公开。目前理解甲硫氨酸生物合成途径特别地与涉及许多其他途径的基因复合。因此,增强或减弱乍一看对促进甲硫氨酸合成可能有利的基因可能以相反结果结束。已知涉及苏氨酸消耗的基因也已知涉及C1生产。
涉及苏氨酸降解的蛋白质的活性抑制或表达减弱已在几项工作中公开。Simic等人(Simic等人,2002,Applied and Environmental microbiology,68(7),第3321-3327页)公开GlyA蛋白的苏氨酸活性的醛醇(aldole)切割的减弱,以增强在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的苏氨酸生产。Martinez-Force等人(Martinez-Force等人,1994,Biotechnology Progress,10(4),第372-376页)公开了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中缺失ilv1基因以增强苏氨酸生产。此外,在这个研究中,作者显示在苏氨酸和甲硫氨酸累积与苏氨酸脱氨酶活性的减少之间不存在关联。Liu等人(Liu等人,1998,European Journal of Biochemistry,255(1),第220-226页)详述了对来自大肠杆菌(Escherichia coli)的LtaE酶的表征及其在细胞生长中的作用。最后,Lee等人(Lee等人,2007,Molecular Systems Biology,3(149),第1-8页)公开了tdh的缺失和ilvA基因的突变,以增强苏氨酸生产。
所有这些研究专一地定向朝向苏氨酸生产。在现有技术中从未考虑阻止苏氨酸消耗作为改善甲硫氨酸生物合成的解决方案。
尽管甲硫氨酸代谢途径的复杂性,本发明人已发现通过作用于苏氨酸转化增加甲硫氨酸生产的方法。
发明概述
本发明涉及用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法,其包括如下步骤:
-在包含碳源、硫源和氮源的合适培养基中培养经修饰的微生物,和
-从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物,
其中所述微生物是以减少在除甲硫氨酸外的其他化合物中的苏氨酸转化的方式修饰的。
特别地,苏氨酸成为甘氨酸或异亮氨酸的转化是减少的。
本发明还涉及经修饰用于改善的甲硫氨酸生产的微生物,其中在除甲硫氨酸外的其他化合物中的苏氨酸转化是减少的,与用于改善甲硫氨酸生产的其他遗传修饰组合。
自苏氨酸的甘氨酸产生是特别通过减少将苏氨酸转化为甘氨酸的酶的活性减少的。在特定实施方案中,表达突变型GlyA酶,其具有减弱的苏氨酸醛缩酶活性,同时维持所述酶GlyA的丝氨酸羟甲基转移酶活性。
自苏氨酸的异亮氨酸产生是特别通过减少苏氨酸至α-酮丁酸的脱氨基和/或脱水减少的。
发明详述
本发明涉及用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法,其包括如下步骤:
-在包含碳源、硫源和氮源的合适培养基中培养经修饰的微生物,和
-从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物,
其中所述微生物是以减少苏氨酸转化为除甲硫氨酸外的其他化合物的方式修饰的。
根据本发明,甲硫氨酸的前体定义为其为甲硫氨酸特异性代谢途径的部分的代谢产物或可以是这些代谢产物衍生的代谢产物。甲硫氨酸的衍生物源于甲硫氨酸转化和/或降解途径,例如S-酰基甲硫氨酸和N-酰基甲硫氨酸。特别地,这些产物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和N-乙酰甲硫氨酸(NAM)。尤其地,NAM是可容易回收的甲硫氨酸衍生物,其可以进行分离且通过脱酰基转化成甲硫氨酸。
短语“从培养基中回收甲硫氨酸”指回收甲硫氨酸和可能的SAM和NAM以及可能有用的所有其他衍生物的动作。
术语“发酵过程/工艺”、‘培养’、或‘发酵’可互换使用,以指在含有简单碳源、硫源和氮源的合适生长培养基上的细菌生长。
“合适的培养基”是适合于微生物的培养和生长的培养基。此类培养基是微生物发酵领域中众所周知的,取决于待培养的微生物。
术语“微生物”指细菌、酵母或真菌。优选地,微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地,微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优选地,微生物是菌种大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
术语“经修饰的微生物”是经修饰用于改善的甲硫氨酸生产的微生物,并且指已经遗传修饰的微生物,目的是改善甲硫氨酸的生产得率。根据本发明,“改善的”或“改善”意指与相应未经修饰的微生物相比较,通过微生物生产的甲硫氨酸量,且特别是甲硫氨酸得率(每克/摩尔碳源生产的克/摩尔甲硫氨酸的比)在经修饰的微生物中更高。通常的修饰包括通过转化和重组将基因的缺失引入微生物内、和用于表达异源基因的载体的引入。
根据本发明,在这种方法中使用的经修饰的微生物一方面包含用于改善的甲硫氨酸生产的修饰,并且另一方面包含与未经修饰的微生物相比较,用于减少自苏氨酸的除甲硫氨酸外的其他化合物生产的修饰。
短语“除甲硫氨酸外的其他化合物”特别指甘氨酸和异亮氨酸。
涉及微生物中的甲硫氨酸生产的基因是本领域已知的,并且包含涉及甲硫氨酸特异性生物合成途径的基因以及涉及前体提供途径的基因和涉及甲硫氨酸消耗途径的基因。
甲硫氨酸的有效生产要求甲硫氨酸特异性途径和几个前体提供途径的最佳化。甲硫氨酸生产菌株已在专利申请WO 2005/111202、WO2007/077041和WO2009/043803中描述,并且作为参考文献引入本申请内。
过表达对于其抑制剂SAM和甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性的高丝氨酸琥珀酰转移酶等位基因的甲硫氨酸生产菌株在专利申请WO 2005/111202中描述。这个申请还描述了这些等位基因与甲硫氨酸阻遏物MetJ(GenBank1790373)的缺失的组合,如专利申请JP 2000/157267中提出的,所述甲硫氨酸阻遏物MetJ负责甲硫氨酸调节子的下调。此外,两种修饰与天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的过表达的组合在专利申请WO 2005/111202中描述。
基因cysE、metH和metF的过表达已在WO 2007/077041中提出。
为了改善甲硫氨酸的生产,微生物可以显示出:
-选自下组的至少一种基因的表达增加:
·cysP,其编码周质硫酸盐结合蛋白,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·cysU,其编码硫酸盐ABC转运蛋白的组分,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·cysW,其编码膜结合的硫酸盐转运蛋白,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·cysA,其编码硫酸通透酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·cysM,其编码O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(O-acetyl serine sulfhydralase),如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·cysI和cysJ,分别编码亚硫酸还原酶的α和β亚基,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的。优选地,cysI和cysJ是一起过表达的,
·cysH,其编码腺苷酰硫酸还原酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·cysE,其编码丝氨酸酰基转移酶,如WO2007/077041中描述的,
·gcvT,其编码四氢叶酸依赖性氨甲基转移酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·gcvH,其通过编码氨乙基的载体涉及甘氨酸切割,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·gcvP,其编码甘氨酸脱氢酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·lpd,其编码硫辛酰胺脱氢酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·serA,其编码磷酸甘油酸脱氢酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·serB,其编码磷酸丝氨酸磷酸化酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·serC,其编码磷酸丝氨酸氨基转移酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·glyA,其编码丝氨酸羟甲基转移酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·metF,其编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶,如WO2007/077041中描述的,
·metA等位基因,其编码高丝氨酸琥珀酰转移酶,对于S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性,如WO2005/111202中描述的,
·thrA或thrA等位基因,其编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶,对于苏氨酸具有减少的反馈抑制,如WO2009/043803和WO2005/111202中描述的,
·metH,其编码B12依赖性高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲基酶,如WO2007/077041中描述的。
-和/或下述基因中的至少一种的表达的抑制:
·pykA,其编码丙酮酸激酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·pykF,其编码丙酮酸激酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的,
·purU,其编码甲酰四氢叶酸脱甲酰酶,如WO2007/077041和WO2009/043803中描述的。
根据本发明,微生物可以通过使用改变的metB等位基因进一步修饰用于增加甲硫氨酸生产,所述metB等位基因优选或专一地使用H2S用于自O-琥珀酰高丝氨酸生产高半胱氨酸,如引入本文作为参考的专利申请WO2004/076659中描述的。
本领域技术人员将了解其他基因可能需要修饰以最佳化甲硫氨酸生产。这些基因已在WO2007/077041和WO2007/020295中鉴定。
上文引用的与甲硫氨酸生产有关的专利和专利申请的所有参考文献引入本文作为参考。
在本发明的第一个方面,自苏氨酸的甘氨酸产生是通过减弱将苏氨酸转化为甘氨酸的酶的活性减少的。
术语“减少的”、‘减弱的’在正文中可互换使用,并且具有相似含义。在这个正文中,该术语指酶活性或基因表达的部分或完全抑制,则称其随后说成是“减少的”或‘减弱的’。
通过使酶在其氨基酸序列中突变、通过减少酶自相应RNA的翻译或通过减少相应基因的表达,可以减少酶活性。本领域技术人员了解用于减少翻译的许多方法。酶表达可以是通过稳定或去稳定相应信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64)或蛋白质(例如GST标签,Amersham Biosciences)的元件减少的。基因表达可以是部分或完全减少的。基因表达的这种减少可以是基因表达的抑制、基因表达所需的启动子区全部或部分的缺失、基因编码区中的缺失、或野生型启动子由更弱的天然或合成启动子的交换。优选地,基因的减弱基本上是那种基因的完全缺失,其可以由选择标记基因替换,所述选择标记基因促进菌株的鉴定、分离和纯化。
在本发明的第一个方面,自苏氨酸的甘氨酸产生在经修饰的微生物中是减少的。
在一个具体方面,将苏氨酸转化成甘氨酸的酶的活性是减少的。
在本发明的更具体的实施方案中,至少一种下述基因的表达在经修饰的微生物中是减弱的:ltaE、kbl、glyA、tdh。
在本发明的另一个具体的实施方案中,经修饰的微生物表达突变型GlyA酶,其具有减弱的苏氨酸醛缩酶(TAL)活性,同时维持所述酶GlyA的丝氨酸羟甲基转移酶活性。更确切地说,根据本发明,GlyA酶可以具有在其多肽序列中的至少一种下述氨基酸变化:T128S、T224S、T225S、T226S、T227S、T230S、R235K。最优选的氨基酸变化是R235K。
在本发明的特定实施方案中,内源基因glyA已从该微生物中缺失。
在本发明的第二个方面,该微生物是以减少自苏氨酸的异亮氨酸产生的方式修饰的。
特别地,自苏氨酸的异亮氨酸产生是通过减少苏氨酸至α-酮丁酸的脱氨基和/或脱水减少的。
在本发明的特定实施方案中,至少一种下述酶活性是减弱的:苏氨酸脱氨酶、苏氨酸脱水酶。在本发明的更特定的实施方案中,至少一种下述基因在经修饰的微生物中是减弱的:ilvA、tdcB、sdaA、sdaB、tdcG。
根据本发明,除了自苏氨酸的甘氨酸和/或异亮氨酸产生减少,在经修饰的微生物中的丝氨酸可用度可以是增加的。
短语‘丝氨酸可用度是增加的’指对于代谢途径可用的丝氨酸的内部库与未经修饰的微生物相比较是增加的事实。所述增加通过下述各种手段获得:内部生产的增加、降解的减少、朝向外部的转运的减少、和由本领域技术人员已知的所有其他方式。
特别地,丝氨酸生产可以是通过增加serA、serB、serC中的至少一种基因的表达在微生物中增加的。此外,丝氨酸降解可以是通过减弱基因sdaA或sdaB中的至少一种的活性减少的,所述基因编码具有丝氨酸脱氨酶活性的酶。在本发明的优选实施方案中,sdaA基因具有代替鸟嘌呤在位置158上的胸苷核苷酸。
在本发明的更特定的实施方案中,如上所述,具有减少的苏氨酸醛缩酶活性的glyA等位基因的表达可以是增加的。
在本发明的描述中,基因和蛋白质使用相应基因在大肠杆菌中的命名进行鉴定。然而,且除非另有说明,这些命名的使用根据本发明具有更一般的含义,且覆盖在其他生物更具体而言微生物中的所有相应基因和蛋白质。
使用在GenBank中对于已知基因给出的参考,本领域技术人员能够测定在其他生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等价基因。这个常规工作使用共有序列有利地完成,所述共有序列可以通过下述进行测定:进行与衍生自其他微生物的基因的序列比对,并且指定简并探针以克隆另一种生物中的相应基因。分子生物学的这些常规方法是本领域技术人员众所周知的,并且例如在Sambrook等人(1989 Molecular Cloning:a LaboratoryManual.第2版Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York.)中请求保护。
PFAM(比对和隐马尔可夫模型(hidden Markov models)的蛋白质家族数据库;http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)呈现了蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM使得能够显现多重比对,看见蛋白质结构域,评价在多种生物中的分布,获得对于其他数据库的访问,且显现已知蛋白质结构。
COGs(蛋白质的直向同源物组的簇;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通过比较来自代表主要种系发生系的完全测序基因组的蛋白质序列获得。每个COG由至少3个系进行定义,其允许鉴定以前保守的结构域。
鉴定同源序列及其同源性百分比的方法是本领域技术人员众所周知的,并且特别包括BLAST程序,其可以由网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/使用,使用在那个网站上指示的缺省参数。获得的序列随后可以使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)加以利用(例如比对),使用在那个网站上指示的缺省参数。
用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法是本领域技术人员众所周知的。可以调整发酵工艺的不同因素用于工艺的最佳化,例如硫源、碳源和氮源的选择。
在本发明的优选方面,加入培养基中的用于L-甲硫氨酸的发酵生产的硫源是硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、甲硫醇、二甲基二硫化物及其他甲基封端硫化物或不同来源的组合。
更优选地,在培养基中的硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐或其混合物。
根据本发明,术语‘碳源’指可以由本领域技术人员使用以支持微生物的正常生长的任何碳的来源,其可以是己糖(例如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、二糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、寡糖、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油及其组合。特别优选的碳源是葡萄糖。另一种优选的碳源是蔗糖。
在本发明的特定实施方案中,碳源衍生自可再生原料。可再生原料定义为特定工业工艺所需的原始材料,其可以在短暂延迟内和以足够量再生,以允许其转化成所需产物。
术语氮源对应于铵盐或氨气。
氮源以铵或氨的形式供应。
发酵一般在具有适合于待使用的微生物的合适培养基的发酵罐中进行,所述合适培养基含有至少一种简单碳源和需要时用于生产代谢产物的协同底物。
本领域技术人员能够限定用于根据本发明的微生物的培养条件。特别地,细菌在20℃-55℃之间的温度发酵,优选在25℃-40℃之间,并且更具体而言对于谷氨酸棒状杆菌约30℃和对于大肠杆菌约37℃。
作为用于大肠杆菌的已知培养基的例子,培养基可以具有与M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)、M63培养基(Miller,1992;A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)或例如由Schaefer等人(1999,Anal.Biochem.270:88-96)定义的培养基相同或相似的组成。
作为用于谷氨酸棒状杆菌的已知培养基的例子,培养基可以具有与BMCG培养基(Liebl等人,1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210)或例如由Riedel等人(2001,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583)描述的培养基相同或相似的组成。
在本发明的具体方面,培养在此类条件下执行,从而使得微生物对于无机底物特别是磷酸盐和/或钾是有限的或饥饿的。
对生物实施无机底物的限制限定这样的条件,在该条件下微生物的生长由供应的、仍允许弱生长的无机化学制品的量控制。
使微生物对于无机底物饥饿限定这样的条件,在该条件下由于不存在无机底物,微生物的生长完全停止。
本发明还涉及用于生产甲硫氨酸的方法,其包括分离发酵肉汤和/或生物质的甲硫氨酸、其前体或衍生物的步骤,其任选地剩余在最终产物的部分或总量(0-100%)中。
在发酵后,如果需要的话,回收且纯化L-甲硫氨酸、其前体或其衍生的化合物。用于回收和纯化在培养基中所生产的化合物例如甲硫氨酸和N-乙酰甲硫氨酸的方法是本领域技术人员众所周知的。
任选地,0-100%、优选至少90%、更优选95%、甚至更优选至少99%的生物质可以在发酵产物的纯化过程中得到保留。
任选地,在回收甲硫氨酸前,通过脱酰基将甲硫氨酸衍生物N-乙酰甲硫氨酸转化成甲硫氨酸。
本发明还涉及经修饰的微生物,其包含:
-MetJ基因的缺失,
-对于甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性的等位基因MetA的表达,和
-例如如上所述的至少一种修饰。
本发明还涉及例如在下文实施例中描述的经修饰的微生物。
附图
图1显示了涉及丙酮酸盐、苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的代谢途径。
实施例
实施例I:菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)的构建
甲硫氨酸生产菌株已在引入本申请作为参考的专利申请WO2007/077041和WO2009/043372中描述。
1.菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtc09-gcvTHP Ptc36-ARNmst17-metF ΔmeJ ΔpykF ΔpykA(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)的构建
通过电穿孔将在申请WO2007/077041和PCT/FR2009/052520中描述的质粒pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11引入重组菌株MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA,得到菌株MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA(pME 101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)。
实施例II:菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykAΔltaE Δtdh(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)的构建
甲硫氨酸生产菌株已在引入本申请作为参考的专利申请WO2007/077041和WO2009/043372中描述。
1.菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km的构建
为了灭活ltaE基因,使用由Datsenko & Wanner(2000)描述的同源重组策略。这个策略允许卡那霉素抗性盒的插入,同时缺失所涉及的大部分基因。为了这个目的,使用2种寡核苷酸,DltaEF和DltaER (在网站http://ecogen.org/上的参考序列)。
DltaEF(SEQ ID NO 1)
ggacatgccatgattgatttacgcagtgataccgttacccgaccaagccgcgccatgctcgaagcgatgatggccgccccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与ltaE区域从908446到908526的序列同源的区域(小写情况),
-用于扩增卡那霉素抗性盒(在Datsenko,K.A.& Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)的区域(大写情况),
DltaER(SEQ ID NO 2)
gcgcaccagatgctgaccaatgtagccactggcaccgagaactaaaatgcgttgcggcacgtctctctccttaacgcgccCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与ltaE区域从907446到907525的序列同源的区域(小写情况),
-用于扩增卡那霉素抗性盒的区域(大写情况)。
寡核苷酸DltaEF和DltaER用于PCR扩增来自质粒pKD4的卡那霉素抗性盒。随后通过电穿孔将所得到的PCR产物引入菌株MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA(pKD46)内,其中所表达的Red重组酶允许同源重组。随后选择卡那霉素抗性转化体,并且通过PCR分析用下文定义的寡核苷酸ltaEF和ltaER验证抗性盒的插入。将保留的菌株指定为MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km。
ltaEF(SEQ ID NO 3)
GCCACCTGGCGCTCCTGAGCG (与ltaE区域从907234到907254的序列同源)。
ltaER(SEQ ID NO 4)
GCTGCGCGCAATCATCAGCGG (与ltaE区域从908603到908623的序列同源)。
2.菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::KmΔtdh::Cm的构建
为了灭活tdh基因,使用由Datsenko & Wanner(2000)描述的同源重组策略。这个策略允许氯霉素抗性盒的插入,同时缺失所涉及的大部分基因。为了这个目的,使用2种寡核苷酸,DtdhF和DtdhR (在网站http://ecogen.org/上的参考序列)。
DtdhF(SEQ ID NO 5)
gaaagcgttatccaaactgaaagcggaagagggcatctggatgaccgacgttcctgtaccggaactcgggcataacgatcCATATGAATATCCTCCTTAG
具有
-与tdh区域从3789287到3789366的序列同源的区域(小写情况),
-用于扩增氯霉素抗性盒(在Datsenko,K.A.& Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)的区域(大写情况),
DtdhR(SEQ ID NO 6)
cccagctcagaataactttcccggactggcccgaacgcatagcgtcaaagcccttctggaaatcatcgatagagaaacgatgggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
具有
-与tdh区域从3788348到3788431的序列同源的区域(小写情况),
-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(大写情况)。
寡核苷酸DtdhF和DtdhR用于PCR扩增来自质粒pKD3的氯霉素抗性盒。随后通过电穿孔将所得到的PCR产物引入菌株MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km(pKD46)内,其中所表达的Red重组酶允许同源重组。随后选择氯霉素抗性转化体,并且通过PCR分析用下文定义的寡核苷酸tdhF和tdhR验证抗性盒的插入。将保留的菌株指定为MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::KmΔtdh::Cm。
tdhF(SEQ ID NO 7)
GGGTAGAGAGATAATGAGAGCAGC(与tdh区域从3788210到3788233的序列同源)。
tdhR(SEQ ID NO 8)
GCCCAGCCAAAACTGTACAG(与tdh区域从3790719到3790738的序列同源)。
3.菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh的构建
随后将卡那霉素和氯霉素抗性盒消除。通过电穿孔将携带作用于卡那霉素或氯霉素抗性盒的FRT位点的重组酶FLP的pCP20质粒引入重组菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km Δtdh::Cm。在42℃的一系列培养后,通过PCR分析用与先前使用那些相同的寡核苷酸ltaEF/ltaER和tdhF/tdhR,验证卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失。将保留的菌株指定为MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh。
4.菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)的构建
通过电穿孔将申请WO2007/077041和PCT/FR2009/052520中描述的质粒pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11引入重组菌株MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh,得到菌株MG1655metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)。
实施例III:生产菌株的评价
生产菌株在小锥形瓶中进行评价。将5.5mL预培养物在37℃在混合培养基(10%具有2.5g.L-1葡萄糖的LB培养基(Sigma 25%)和90%基本培养基PC1)中生长16小时。将它用于接种50mL培养物至在培养基PC1中0.2的OD600。将壮观霉素加入至50mg.L-1的终浓度。培养物的温度是37℃。当培养物已达到5-7的OD600时,在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC定量细胞外氨基酸,并且使用HPLC伴随折射计检测(有机酸和葡萄糖)和在硅烷基化之后的GC-MS,来分析其他相关代谢产物。对于每种菌株,进行3次重复。
菌株1MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)。
菌株2MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)。
表1:基本培养基组成(PC1)
化合物 | 浓度(g.L-1) |
ZnSO4.7H2O | 0.0040 |
CuCl2.2H2O | 0.0020 |
MnSO4.H2O | 0.0200 |
CoCl2.6H2O | 0.0080 |
H3BO3 | 0.0010 |
Na2MoO4.2H2O | 0.0004 |
MgSO4.7H2O | 1.00 |
柠檬酸 | 6.00 |
CaCl2.2H2O | 0.04 |
K2HPO4.3H2O | 10.50 |
Na2HPO4 | 2.00 |
(NH4)2HPO4 | 8.00 |
NH4Cl | 0.13 |
NaOH 4M | 调整至pH 6.8 |
FeSO4.7H2O | 0.04 |
硫胺 | 0.01 |
葡萄糖 | 10.00 |
硫代硫酸铵 | 5.60 |
维生素B12 | 0.01 |
MOPS | 10.00 |
IPTG | 0.0024 |
表2:在分批培养物中通过不同菌株生产的以%g甲硫氨酸/g葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymet)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的确切定义,参见下文。SD指示关于基于3次重复计算的得率的标准差。
菌株 | Ymet | SD |
菌株1: | 8.99 | 0.27 |
菌株2: | 9.56 | 0.3 |
在OPA/FMOC衍生化后通过HPLC定量细胞外甲硫氨酸浓度。使用HPLC伴随折射计检测,分析残留葡萄糖浓度。甲硫氨酸得率如下表示:
如表1中可见的,甲硫氨酸/葡萄糖得率(Ymet)在基因tdh和ltaE缺失后是增加的。
实施例IV:在下文实施例V和VI中测试的甲硫氨酸生产菌株3–12的构建
1.方案
几种方案已用于构建甲硫氨酸生产菌株且在下述实施例中描述。
方案1:通过同源重组的染色体修饰和重组体的选择(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000)
通过如由Datsenko.& Wanner(2000)所述的同源重组进行在特定染色体基因座中的等位基因替换或基因破坏。通过分别使用pKD3或pKD4或p34S-Gm(Dennis et Zyltra,AEM july 1998,第2710-2715页)质粒作为模板,通过PCR扩增了氯霉素(Cm)抗性cat、卡那霉素(Km)抗性kan、或庆大霉素(Gt)抗性gm基因,其侧翼为Flp识别位点。所得到的PCR产物用于转化具有质粒pKD46的受体大肠杆菌菌株,所述质粒pKD46表达λRed(γ,β,exo)重组酶。选择抗生素抗性转化体,并且通过PCR分析用表4中列出的合适引物验证突变的基因座的染色体结构。
通过使用如由Datsenko.& Wanner(2000)所述的质粒pCP20,去除kan抗性基因,除了具有pCP20质粒的克隆在37℃在LB上培养且随后在30℃测试抗生素抗性的丧失外。随后通过PCR使用表4中列出的引物验证抗生素敏感的克隆。
方案2:P1噬菌体转导
通过P1转导将染色体修饰转移至给定大肠杆菌受体菌株。该方案由2个步骤组成:(i)在含有与抗性基因相关的染色体修饰的供体菌株上制备噬菌体裂解产物和(ii)通过所得到的噬菌体裂解产物感染受体菌株。
噬菌体裂解产物的制备
-将具有目的染色体修饰的菌株MG1655的100μl过夜培养物接种到10ml LB+Km 50μg/ml或+葡萄糖0.2%+CaCl25mM中。
-伴随振荡在37℃温育30分钟。
-加入在供体菌株MG1655上制备的100μl P1噬菌体裂解产物(约1x 109噬菌体/ml)。
-在37℃振荡3小时直至细胞的完全裂解。
-加入200μL氯仿且涡旋。
-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。
-将上清液转移至无菌管。
-将裂解产物贮存于4℃。
转导
-将在LB培养基中培养的5ml大肠杆菌受体菌株过夜培养物以1500g离心10分钟。
-将细胞团块悬浮于2.5mL MgSO4 10mM、CaCl2 5mM中。
-用染色体修饰菌株MG1655的100μl P1噬菌体裂解产物(测试管)和作为对照管的不含P1噬菌体的100μl细胞和不含细胞的100μl P1噬菌体感染100μl细胞。
-不伴随振荡在30℃温育30分钟。
-将100μl柠檬酸钠1M加入每个管中且涡旋。
-加入1ml LB。
-伴随振荡在37℃温育1小时。
-以7000rpm离心3分钟。
-在LB+Km 50μg/ml上铺平板。
-在37℃温育过夜。
随后选择抗生素抗性转导株,并且通过PCR分析用表4中列出的合适引物验证突变的基因座的染色体结构。
下述实施例描述了下表3中列出的所有菌株的构建。
表3:在下述实施例中出现的中间菌株和生产菌株的基因型和相应编号列表
2.菌株3的描述
甲硫氨酸生产者菌株3(表3)的遗传修饰已在专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述,所述专利申请作为参考文献引入本申请。在菌株3的DNA测序后,已在sdaA基因中出乎意料地鉴定了错义突变。这个突变位于结构基因的位置158上(T158G),这生成相应蛋白质中的氨基酸变化:亮氨酸53至精氨酸。将该等位基因命名为sdaA*1。
3.具有经修饰的sdaA基因的菌株的构建–丝氨酸降解途径的修饰
3.1.含有sdaA*(T158G)的菌株5的构建
为了缺失菌株3中的yobD基因,使用了方案1,除了引物Ome1983-DyobD-amplif-F(SEQ ID N°09)和Ome 1986-DyobD-amplif-R(SEQID N°10)(表4)用于扩增来自菌株BW25113ΔyobD:-:Km(Keio collection Baba.等人,Mol Syst Biol.,2,2006-0)的ΔyobD::Km缺失外。
选择卡那霉素抗性重组体。通过PCR用引物Ome 1987-DyobD-verif-F(SEQ ID N°11)和Ome 1988-DyobD-verif-R(SEQ ID N°12)(表4)和通过DNA测序验证了抗性盒的插入。还通过DNA测序验证了sdaA基因的sdaA*1等位基因。在质粒pKD46消除后,将所得到的菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metHPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metFPtc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serCΔyobD::Km命名为菌株4(表3)。
随后通过电穿孔将专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述的pCL1920-PgapA-pycRe-TT07引入菌株4(表3)。验证质粒pCL1920-PgapA-pycre-TT07的存在,并且将所得到的菌株MG1655metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serCΔyobD::Km pCL 1920-PgapA-pycre-TT07命名为菌株5(表3)。
3.2.含有重构的sdaAwt等位基因(sdaArc)的菌株7的构建
基因sdaA和yobD在大肠杆菌染色体上彼此接近;分别在40.84分钟和41.01分钟,并且因为噬菌体P1可以包装大肠杆菌染色体的2分钟,所以基因sdaA和yobD是可共转导的。因此,根据方案2,通过使用来自菌株BW25113sdaA ΔyobD::Km(Keio collection Baba.等人,Mol Syst Biol.,2,2006-0)的P1噬菌体裂解产物,将sdaA野生型等位基因和ΔyobD::Km缺失共转导到菌株3(表3)内。
选择卡那霉素抗性转导体。通过PCR用引物Ome 1987-DyobD-verif-F(SEQ ID N°11)和Ome 1988-DyobD-verif-R(SEQ ID N°12)(表4)随后为DNA测序验证ΔyobD::Km缺失的存在。通过DNA测序验证sdaA*1等位基因与sdaA野生型等位基因的交换,并且命名为sdaArc(rc用于重构的)。将所得到的菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurUΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serCΔyobD::Km命名为菌株6(表3)。
随后通过电穿孔将专利申请EP10306164.4和US61/406249中描述的质粒pCL1920-PgapA-pycre-TT07引入菌株6(表3)。验证质粒pCL1920-PgapA-pycre-TT07的存在,并且将所得到的菌株MG1655 metA*11Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serCΔyobD::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07命名为菌株7(表3)。
4.过度产生蛋白质GlyA或GlyA*(R235K)的菌株的构建–苏氨酸/甘氨酸途径的修饰
4.1.通过glyA基因的缺失构建菌株8
为了缺失菌株3中的glyA基因,已使用方案1,除了引物Ome 0641-DglyAR(SEQ ID N°13)和Ome 0642-DglyA F(SEQ ID N°14)(参见下文)用于扩增来自质粒pKD4的卡那霉素抗性盒外。
选择卡那霉素抗性重组体。通过PCR用引物Ome 0643-glyA R(SEQ IDN°15)和Ome 0644-glyA F(SEQ ID N°16)(表4)和通过DNA测序验证了抗性盒的插入。将所得到的菌株命名为MG1655 metA*11ΔglyA::KmpKD46。
Ome 0641-DglyA R(SEQ ID N°13)
ATGTTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCGATTATGATGCCGAACTGTGGCAGGCTATGGAGCAGGAAAAAGTACGTCAGGTGTAGGCTGGAGCT GCTTCG
具有
-大写情况序列与glyA基因上游的序列(2683451-2683529,参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源
-加下划线的大写情况序列对应于质粒pKD4(Datsenko,K.A.& Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的引物位点2
Ome 0642-DglyA F(SEQ ID N°14)
GCGCAGATGTCGAGAACTTTACCTTTGATGCGCTCGATAACGGCTTCATCATTGATGCTGTCCAGCACGTCACACATCCCATATGAATATCCTCCT TAG
具有
-大写情况序列与glyA基因上游的序列(2682298-2682376,参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源
-加下划线的大写情况序列对应于质粒pKD4(Datsenko,K.A.& Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的引物位点1
随后根据方案2,通过使用来自上文描述的菌株MG1655 metA*11ΔglyA::Km pKD46的P1噬菌体裂解产物,将ΔglyA::Km缺失转导到菌株3(表3)内。
选择卡那霉素抗性转导体。通过PCR用引物Ome 0643-glyA R(SEQ IDN°15)和Ome 0644-glyA F(SEQ ID N°16)(表4)验证了ΔglyA::Km缺失的存在。将所得到的菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykFΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 ΔglyA::Km命名为菌株8(表3)。
4.2.表达glyA的菌株9的构建
为了过表达大肠杆菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因,构建了质粒pCC 1BAC-PglyA-glyA-TTglyA,其衍生自质粒pCC 1BAC(EpiCentre)和pSCB(Stratagene)。
为了构建质粒pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA,使用MG1655基因组DNA作为模板,通过PCR用引物Ome 1162-glyAR-EcoRI-HindIII(SEQ IDN°17)和Ome 1165-PglyAF-HindIII(SEQ ID N°18)扩增PglyA-glyA-TTglyA插入片段,并且克隆至质粒pSCB(Stratagene)中。通过测序验证了所得到的载体,并且命名为pSCB-PglyA-glyA-TTglyA。
随后通过HindIII消化质粒pSCB-PglyA-glyA-TTglyA,并且将所得到的片段HindIII-PglyA-glyA-TTglyA-HindIII克隆到质粒pCC 1BAC的HindIII位点之间。所选择的质粒具有与质粒pCC1BAC的lacZ启动子相反方向的PglyA-glyA-TTglyA插入片段,并且通过DNA测序验证,且命名为pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA。
Ome 1162-glyAR-EcoRI-HindIII(SEQ ID N°17)
ATCTAGTAAGCTTAGTGAATTCGTTACGACAGATTTGATGGCGCG
具有
-用于HindIII和EcoRI限制位点和额外碱基的加下划线的大写情况序列,
-与glyA启动子序列(2682063-2682085,在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源的粗体大写情况序列。
Ome 1165-PglyAF-HindIII(SEQ ID N°18)
TCATCGGATCCATCAAGCTTGAAAGAATGTGATGAAGTG
具有
-用于BamHI和HindIII限制位点和额外碱基的加下划线的大写情况序列,
-与glyA基因的转录终止子(2683744-2683762),在网站http://ecogene.org/上的参考序列)同源的粗体大写情况序列。
随后通过电穿孔将上文描述的pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA引入菌株8(表3)。验证质粒pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA的存在,并且将所得到的菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-ThrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-ThrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-ThrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-ThrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-ThrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 ΔglyA::Km pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA命名为菌株9(表3)。
4.3.表达glyA*的菌株10的构建
pSCB-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA的构建
为了构建质粒pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA,用引物Ome1483-glyA*R R235K(SEQ ID N°19)和Ome 1482-glyA*F R235K(SEQ IDN°20)扩增了质粒pSCB-PglyA-glyA-TTglyA。通过DpnI消化PCR产物,以便消除亲本DNA模板。将剩余粘性突出端磷酸化且引入大肠杆菌菌株,以形成质粒pSCB-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA。通过DNA测序验证了glyA基因中PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA插入片段且尤其是R235K(703-AAA-705)突变的存在。
Ome 1483 glyA*R R235K(SEQ ID N°19)
CCTTTCGCCAGGATCAGGCCTCCTTTCGGACCCGCCAGGGTTTTGTGAG
具有
-大写情况序列与glyA基因(2682802-2682850,参考序列在网站http://ecogene.org/上)同源。
-粗体大写情况对应于插入的密码子突变CGC-708-TTT(R235K)
-加下划线的大写情况对应于沉默点突变(G704T),这使得StuI限制位点出现。
Ome 1482 glyA*F R235K(SEQ ID N°20)
CTCACAAAACCCTGGCGGGTCCGAAAGGAGGCCTGATCCTGGCGAAAGG
-大写情况序列与glyA基因(2682802-2682850,参考序列在网站http://ecogene org/上)同源。
-粗体大写情况对应于插入的密码子突变CGC-708-TTT(R235K)
-加下划线的大写情况对应于沉默点突变(G704T),这使得StuI限制位点出现。
pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA的构建
为了构建pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA,将下文描述的自pSCB-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA纯化的HindIII片段PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA克隆到质粒pCC1BAC的HindIII位点之间。所选择的质粒具有与质粒pCC1BAC的lacZ启动子方向相比较以相反方向的PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA插入片段,通过DNA测序验证,且命名为pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA。
随后通过电穿孔将上文描述的pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA引入菌株8(表3)。验证质粒pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA的存在,并且将所得到的菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykFΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-ThrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-ThrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-ThrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-ThrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 ΔglyA::KmpCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA命名为菌株10(表3)。
4.4.超表达glyA的菌株1的构建
pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA的构建
质粒pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA衍生自质粒pCL1920(Lerner & Inouye,1990,NAR 18,15第4631页)和上文描述的pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA。
为了构建pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA,将自pCC 1BAC-PglyA-glyA-TTglyA纯化的HindIII片段PglyA-glyA-TTglyA克隆到质粒pCL1920的HindIII位点之间。所选择的质粒具有与质粒pCL1920的lacZ启动子方向相比较为相反方向的PglyA-glyA-TTglyA插入片段,通过DNA测序验证,且命名为pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA。
随后通过电穿孔将上文描述的pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA引入菌株8(表3)。验证质粒pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA的存在,并且将所得到的菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPPtc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncAΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 ΔglyA::Km pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA命名为菌株11(表3)。
4.5.过表达glyA*的菌株12的构建
pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA的构建
质粒pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA衍生自质粒pCL1920(Lerner& Inouye,1990,NAR 18,15第4631页)和上文描述的pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA。
为了构建pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA,将自pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA纯化的HindIII片段PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA克隆到质粒pCL1920的HindIII位点之间。所选择的质粒具有与质粒pCL1920的lacZ启动子方向相比较为相反方向的PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA插入片段,通过DNA测序验证,且命名为pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA。
随后通过电穿孔将pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA引入菌株8(表3)。验证质粒pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA的存在,并且将所得到的菌株MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurUΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysEΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 ΔglyA::KmpCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA命名为菌株12(表3)。
表4:用于上文描述的染色体修饰的PCR验证的引物
实施例V:GLYA*突变蛋白的苏氨酸醛缩酶活性的减弱对甲硫氨酸生产的作用
1.具有glyA或glyA*等位基因的生产菌株的评价
生产菌株在小锥形瓶中进行评价。将5.5mL预培养物在混合培养基(10%具有2.5g.L-1葡萄糖的LB培养基(Sigma 25%)和90%基本培养基PC1)中在30℃生长21小时。将它用于接种50mL培养物至在培养基PC1(表5中的组成)中0.2的OD600。当需要时,将卡那霉素和壮观霉素以50mg.L-1的浓度、和氯霉素以30mg.L-1的浓度加入。培养的温度是37℃。当培养物已达到5–7的OD600时,在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC定量细胞外氨基酸,并且使用HPLC伴随折射计检测(有机酸和葡萄糖)和在硅烷基化之后的GC-MS,来分析其他相关代谢产物。
表5:基本培养基组成(PC1)。
化合物 | 浓度(g.L-1) |
ZnSO4.7H2O | 0.0040 |
CuCl2.2H2O | 0.0020 |
MnSO4.H2O | 0.0200 |
CoCl2.6H2O | 0.0080 |
H3BO3 | 0.0010 |
Na2MoO4.2H2O | 0.0004 |
MgSO4.7H2O | 1.00 |
柠檬酸 | 6.00 |
CaCl2.2H2O | 0.04 |
K2HPO4 | 8,.00 |
Na2HPO4 | 2.00 |
(NH4)2HPO4 | 8.00 |
NH4Cl | 0.13 |
NaOH 4M | 调整至pH 6.8 |
FeSO4.7H2O | 0.04 |
硫胺 | 0.01 |
葡萄糖 | 15.00 |
硫代硫酸铵 | 5.60 |
维生素B12 | 0.01 |
表6:通过在上文描述的条件下生长的不同菌株在分批培养物中生产的以%g甲硫氨酸/g葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymet)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的准确定义参见下文。SD指示关于基于几次重复计算的得率的标准差(N=重复次数)。
菌株 | Ymet | SD | N |
菌株3 | 9.75 | 1.29 | 110 |
菌株9-glyA wt等位基因 | 9.80 | 0.19 | 3 |
菌株10-glyA*等位基因 | 10.53 | 0.53 | 3 |
菌株11-glyA wt等位基因 | 10.95 | 0.35 | 3 |
菌株12-glyA*等位基因 | 11.89 | 0.66 | 3 |
除了催化丝氨酸转化成甘氨酸外,GlyA酶还能够切割L-苏氨酸。这由本发明人用携带glyA缺失的菌株加以证实。这种菌株不再具有可检测的丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)和苏氨酸醛缩酶(TAL)活性(数据未显示)。
如表6中可见的,与glyAwt相比较(分别地,菌株9和11用于glyAwt的表达和过表达),甲硫氨酸/葡萄糖得率(Ymet)在glyA*等位基因的表达(菌株10)或过表达(菌株12)后是增加的。
不影响GlyA的丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的苏氨酸醛缩酶活性的减弱对于甲硫氨酸产生是有利的(参见下表7中的活性)。
在OPA/FMOC衍生化后通过HPLC定量细胞外甲硫氨酸浓度。使用HPLC伴随折射计检测,分析残留葡萄糖浓度。甲硫氨酸得率如下表示:
2.过表达glyA wt或glyA*等位基因的菌株的SHMT和TAL活性的测定
对于丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)、苏氨酸醛缩酶(TAL)和别苏氨酸醛缩酶(aTAL)活性的体外测定,将大肠杆菌菌株在如上所述的基本培养基中培养,并且通过离心在对数末期时收获生物质。将团块重悬于含有蛋白质抑制剂与EDTA的混合物(cocktail)的冷20mM磷酸钾缓冲液pH 7.2中。随后,通过用Precellys(Bertin Technologies;以6500rpm的2x10s)的珠磨(beadbeating)裂解细胞,随后在4℃以12000g离心30分钟。将上清液脱盐且用于酶促分析。使用Bradford测定试剂(Bradford,1976)测定蛋白质浓度。
如化学式(equations)(1)和(2)中所述,使用亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)偶联酶测定在37℃分光光度计监控SHMT活性。在这个测定中,在350nm监控通过经由SHMT酶反应产生的5,10-亚甲基-THF氧化获得的5,10-甲川-THF形成。
(1)L-丝氨酸+THF+2H+←→甘氨酸+5,10-亚甲基-THF(SHMT反应)
(2)5,10-亚甲基-THF+NADP+←→5,10-甲川-THF+NADPH(MTHFD反应)
对于SHMT活性的测定,在50mM Bicine-KOH缓冲液pH 8.6、10mM L-丝氨酸、0.4mM THF、10mM 2-巯基乙醇和1.5mM NADP+中测定2μg粗细胞提取物。在37℃温育10分钟后,通过加入粗细胞提取物和自大肠杆菌纯化的MTHFD酶开始反应。随后,将反应混合物在37℃温育10分钟,并且通过加入2%(v/v)高氯酸停止反应。高氯酸的添加破坏在反应(2)中形成的还原的吡啶核苷酸。在室温10分钟后,在350nm处读取吸光度。在每次实验中,运行不含L-丝氨酸的对照且用作用于分光光度计测量的空白对照。
使用4-肼基-7-硝基苯并呋喃(4-hydrazino-7-nitrobenzofurazane)(NBDH)检测系统,在37℃荧光测定生成甘氨酸加上乙醛的TAL活性。乙醛的形成速率通过用NBDH衍生所产生的乙醛进行测定,以获得在530nm处的荧光腙衍生物。在20mM HEPES-HCl缓冲液pH8.0、0.01mM磷酸吡哆醛和10mML-苏氨酸中测定200-250μg粗细胞提取物。通过加入粗细胞提取物开始反应。在37℃温育10和40分钟后,通过加入2,5%(v/v)TCA停止反应。在室温以10000g离心5分钟后,将0.001%(w/v)NBDH的0.33M乙酸钠pH5.2溶液加入上清液,并且在室温10分钟温育后,用FLx800荧光微板读取器(Fluorescence Microplate Reader)(λ激发=485nm;λ发射=530nm,Biotek)定量所产生的荧光腙。在每次实验中,运行不含L-苏氨酸的对照且用作用于荧光测量的空白对照。
表7:对于不同菌株测定丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)和苏氨酸醛缩酶(TAL)活性,并且以mUI/mg蛋白质给出。基于几个独立培养物计算标准差(N=重复次数)。
菌株 | SHMT | TAL | N |
菌株3 | 921±1 | 9.2±0.4 | 3 |
菌株9-glyA wt等位基因 | 1078±55 | 9.8±0.8 | 3 |
菌株10–glyA*等位基因 | 875±30 | 4.6±0.5 | 3 |
菌株11-glyA wt等位基因 | 3908±42 | 50.5±2.2 | 3 |
菌株12–glyA*等位基因 | 3721±46 | 8.7±0.6 | 3 |
如表7中可见的,菌株10和12(具有glyA*)的TAL活性分别比对照菌株3、9和菌株11(具有glyAwt)的那些小约2和6倍。此外,在GlyA酶中引入的导致GlyA*的R235K突变减少TAL活性,而不显著影响其就野生型酶而言的SHMT活性。不影响GlyA的主要丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)活性的苏氨酸醛缩酶活性的减弱对于甲硫氨酸生产是有利的(参见前表6中的甲硫氨酸得率)。
与菌株3和11相比较,这可以增强菌株10和12中从丝氨酸到甘氨酸的碳流量,并且与甲硫氨酸生产结果良好一致(表6)。
实施例VI:丝氨酸脱氨酶活性(SDA)的减弱对甲硫氨酸生产的作用
1.具有sdaArc(菌株7)或sdaA*(菌株5)的生产菌株的评价
菌株使用分批补料策略在2.5L发酵罐(Pierre Guerin)中在生产条件下进行测试。
卡那霉素和壮观霉素在每种培养基中以50mg.L-1的浓度加入。
简言之,在具有2.5g.L-1葡萄糖的10mL LB培养基中生长的24小时培养物用于接种在基本培养基(B1a)中的24小时预培养物。这些温育在旋转振荡器(200RPM)中含有50mL基本培养基(B1a)的500mL带挡板的烧瓶(baffled flasks)中进行。第一种预培养物在30℃的温度生长,第二种预培养物在34℃的温度生长。
第三个预培养步骤在充满用5mL浓缩预培养物接种至1.2g.L-1生物质浓度的200mL基本培养基(B1b)的生物反应器(Sixfors)中进行。预培养温度维持恒定在34℃,并且使用10%NH4OH溶液将pH自动调整至6.8的值。伴随空气供给和/或搅动,将溶解氧浓度连续调整至30%空气分压饱和的值。在来自分批培养基的葡萄糖耗尽后,以0.7mL.小时-1的最初流速开始分批补料,以0.13小时-1的生长速率指数增加24小时,以便获得约18g.L-1的最终细胞浓度。
表8:预培养分批矿物质培养基组成(B1a和B1b)。
表9:预培养分批补料矿物质培养基组成(F1)
化合物 | 浓度(g.L-1) |
Zn(CH3COO)2.H2O | 0.0104 |
CuCl2.2H2O | 0.0012 |
MnCl2.4H2O | 0.0120 |
CoCl2.6H2O | 0.0020 |
H3BO3 | 0.0024 |
Na2MoO4.2H2O | 0.0020 |
Fe(III)柠檬酸H2O | 0.0424 |
EDTA | 0.0067 |
MgSO4 | 5.00 |
(NH4)2SO4 | 8.30 |
Na2SO4 | 8.90 |
(NH4)2S2O3 | 24.80 |
硫胺 | 0.01 |
葡萄糖 | 500.00 |
维生素B12 | 0.01 |
NH4OH 28% | 调整至pH 6.8 |
表10:培养分批矿物质培养基组成(B2)。
化合物 | 浓度(g.L-1) |
Zn(CH3COO)2.2H2O | 0.0130 |
CuCl2.2H2O | 0.0015 |
MnCl2.4H2O | 0.0150 |
CoCl2.6H2O | 0.0025 |
H3BO3 | 0.0030 |
Na2MoO4.2H2O | 0.0025 |
Fe(III)柠檬酸H2O | 0.1064 |
EDTA | 0.0084 |
MgS2O3.6H2O | 1.00 |
CaCl2.2H2O | 0.08 |
柠檬酸 | 1.70 |
KH2PO4 | 2.97 |
K2HPO4.3H2O | 1.65 |
(NH4)2HPO4 | 0.72 |
(NH4)2S2O3 | 3.74 |
硫胺 | 0.01 |
维生素B12 | 0.01 |
生物素 | 0.10 |
葡萄糖 | 10 |
NH4OH 28% | 调整至pH 6.8 |
表11:培养分批补料培养基组成(F2)。
化合物 | 浓度(g.L-1) |
Zn(CH3COO)2.2H2O | 0.0104 |
CuCl2.2H2O | 0.0012 |
MnCl2.4H2O | 0.0120 |
CoCl2.6H2O | 0.0020 |
H3BO3 | 0.0024 |
Na2MoO4.2H2O | 0.0020 |
Fe(III)柠檬酸H2O | 0.0524 |
EDTA | 0.0067 |
MgS2O3.6H2O | 10.20 |
(NH4)2S2O3 | 55.50 |
硫胺 | 0.01 |
维生素B12 | 0.01 |
生物素 | 0.10 |
葡萄糖 | 500 |
随后,将2.5L发酵罐(Pierre Guerin)装满600mL基本培养基(B2),并且用范围为55-70mL的预培养物体积接种至2.1g.L-1的生物质浓度。
培养温度维持恒定在37℃,并且通过NH4OH溶液的自动添加(NH4OH10%共9小时和28%直至培养结束时),将pH维持在工作值(6.8)。将最初搅动速率在分批期过程中设为200RPM,并且在分批补料期增加直到1000RPM。将最初空气流速在分批期过程中设为40NL.小时-1,并且在分批补料期开始时增加至100NL.小时-1。通过增加搅动,将溶解氧浓度维持在20-40%,优选30%饱和的值。
当细胞群达到接近于5g.L-1的浓度时,以5mL.小时-1的最初流速开始分批补料。以S形分布(profile)用在26小时后达到24mL.小时-1的逐渐增加的流速注入进料溶液。通过下述等式计算精确进料条件:
其中Q(t)是对于600mL的分批体积以mL.小时-1表示的进料流速,其中p1=1.80、p2=22.40、p3=0.270、p4=6.5。
在26小时分批补料后,停止进料溶液泵且在葡萄糖耗尽后停止培养。
在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC定量细胞外氨基酸,并且使用HPLC伴随折射计检测(有机酸和葡萄糖)和在硅烷基化之后的GC-MS,来分析其他相关代谢产物。
表12:通过菌株在分批补料培养物中产生的以%g甲硫氨酸/g葡萄糖表示的最大限度甲硫氨酸得率(Ymet max)。关于甲硫氨酸/葡萄糖得率的定义,参见下文。SD指关于基于几次重复计算的得率的标准差(N=重复次数)。
菌株 | Ymet max | SD | N |
菌株7-sdaArc等位基因 | 22.4 | 0.2 | 2 |
菌株5-sdaA*等位基因 | 23.9 | nd | 1 |
如表12中可见的,与sdaAwt的表达相比较,甲硫氨酸/葡萄糖得率(Ymet)在sdaA*等位基因的表达后是增加的。SdaA酶的丝氨酸脱氨酶活性的减弱增加用于甲硫氨酸生产的丝氨酸可用度。
通过将为调节pH且补料培养物而加入的溶液量加入起始体积且通过扣除用于取样的体积和因蒸发的丧失,来计算发酵罐体积。
通过称重进料原液连续跟踪分批补料体积。随后基于注入的重量、溶液的密度和通过Brix([葡萄糖])的方法测定的葡萄糖浓度,来计算注入的葡萄糖的量。
甲硫氨酸得率如下表示:
Ymet=(甲硫氨酸t*Vt-甲硫氨酸0*V0x100)/消耗的萄萄糖t
对于每种菌株在培养过程中获得的最大限度得率在此处呈现。
其中甲硫氨酸0和甲硫氨酸t分别为起始和最终甲硫氨酸浓度,并且V0和Vt分别为起始时和t时瞬时的体积。
消耗的葡萄糖如下计算:
进料体积t=(进料重量0-进料重量t)/进料溶液密度
注入的葡萄糖t=进料体积t*[葡萄糖]
消耗的葡萄糖t=[葡萄糖]0*V0+注入的葡萄糖–[葡萄糖]残留*Vt,其中[葡萄糖]0、[葡萄糖]、[葡萄糖]残留分别为起始、进料和残留葡萄糖浓度。
2.在菌株5和7中丝氨酸脱氨酶活性(SDA)的测定
对于SDA活性的体外测定,将大肠杆菌菌株在如上所述的基本培养基中培养,并且通过离心收获。将团块悬浮于具有3mM FeSO4、30mM DTT、和不含EDTA的蛋白质抑制剂混合物(cocktail)的冷50mM甘氨酰甘氨酸缓冲液(pH 8)中。随后,通过用Precellys(Bertin Technologies;以6500rpm的2x 10s)的珠磨裂解细胞,随后以12000g(4℃)离心30分钟。上清液不脱盐且用于酶促分析。使用Bradford测定试剂(Bradford,1976)测定蛋白质浓度。
对于SDA活性的测定,在具有3mM FeSO4、30mM DTT和50mM L-丝氨酸的50mM甘氨酰甘氨酸缓冲液(pH 8)中测定100μg粗细胞提取物。通过加入粗细胞提取物开始反应。在37℃温育5和20分钟后,加入0.4mL甲苯,并且用2-4-二硝基苯肼的HCl溶液停止反应。在均质化后,将制备混合物在室温以3500rpm离心5分钟,并且将上层相用10%(w/v)碳酸钠处理。在均质化后,将制备混合物在室温以3500rpm离心1分钟,并且将下层相用1,5M NaOH处理。在10分钟温育后,通过测量在碱性溶液中酮酸腙的颜色,在540nm处分光光度计测定所产生的丙酮酸盐的量。颜色强度在15分钟时期内不改变。在每次实验中,运行不含L-丝氨酸的对照且用作用于分光光度计测量的空白对照。
表13:在上述培养物中测定丝氨酸脱氨酶(SDA)活性,并且以mUI/mg蛋白质给出。基于几个独立培养物计算标准差(N=重复次数)。
菌株 | SDA | N |
菌株7-sdaArc等位基因 | 1517±142 | 2 |
菌株5-sdaA*等位基因 | 12.4 | 1 |
如表13中可见的,菌株5的SDA活性低于野生型菌株7的SDA活性超过100倍。SDA活性的这种显著减少与甲硫氨酸生产的改善关联(参见表12)。
必须指出存在具有SdaA*的残留丝氨酸脱氨酶活性,这对于细胞的生理学可能是重要的。
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Claims (16)
1.一种用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法,其包括如下步骤:
-在包含碳源、硫源和氮源的合适培养基中培养经修饰的微生物,和
-从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物,
其中所述微生物是以减少苏氨酸转化为除甲硫氨酸外的其他化合物的方式修饰的。
2.权利要求1的方法,其中自苏氨酸的甘氨酸产生是减少的。
3.权利要求2的方法,其中将苏氨酸转化为甘氨酸的酶的活性是减少的。
4.权利要求3的方法,其中至少一种下述基因的表达是减弱的:ltaE、kbl、glyA、tdh。
5.权利要求4的方法,其中表达突变型GlyA酶,其具有减弱的苏氨酸醛缩酶活性,同时维持所述酶GlyA的丝氨酸羟甲基转移酶活性。
6.权利要求5的方法,其中所述GlyA酶具有在其多肽序列中的至少一种下述氨基酸变化:T128S、T224S、T225S、T226S、T227S、T230S、R235K。
7.根据权利要求4-6中任一项的方法,其中所述内源基因glyA已从所述微生物中缺失。
8.权利要求1的方法,其中所述微生物是以减少自苏氨酸的异亮氨酸产生的方式修饰的。
9.权利要求8的方法,其中苏氨酸至α-酮丁酸的脱氨基和/或脱水是减少的。
10.权利要求9的方法,其中至少一种下述酶活性是减弱的:苏氨酸脱氨酶、苏氨酸脱水酶。
11.权利要求10的方法,其中至少一种下述基因的表达是减弱的:ilvA、tdcB、sdaA、sdaB、tdcG。
12.权利要求1-11的方法,其中所述微生物中的丝氨酸可用度是增加的。
13.权利要求12的方法,其中所述微生物中的丝氨酸产生是通过增加基因serA、serB、serC中的至少一种的表达增加的。
14.权利要求12或13的方法,其中丝氨酸降解是通过减弱基因sdaA或sdaB中的至少一种的活性减少的,所述基因编码具有丝氨酸脱氨酶活性的酶。
15.权利要求11或14的方法,其中sdaA基因在其核酸序列中具有T158G核苷酸变化。
16.一种经修饰的微生物,其包含:
-metJ基因的缺失,
-对于甲硫氨酸具有减少的反馈敏感性的等位基因metA的表达,和
-例如权利要求1–15中任一项中所述的至少一种修饰。
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