BR112012016908B1 - Linhagens e métodos para a produção de metionina - Google Patents

Abstract

linhagens e método para produção de metionina a presente invenção se refere a um método para a produção de metionina usando linhagens modificadas com transformação atenuada de treonina. isto pode ser conseguido através da redução da transformação de treonina em glicina, e/ou reduzindo a sua transformação para a-cetobutirato. a invenção também diz respeito a linhagens modificadas com transformação atenuada de treonina.

Description

“LINHAGENS E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE METIONINA

CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção se refere a um método para a produção de metionina usando linhagens modificadas com transformação atenuada de treonina. Isto pode ser conseguido através da redução da degradação de treonina a glicina e/ou pela redução da sua transformação para α-cetobutirato. A invenção também diz respeito às linhagens modificadas com transformação atenuada de treonina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Compostos contendo enxofre tais como cisteína, homocisteína, metionina ou S-adenosilmetionina são críticos para o metabolismo celular e são produzidas industrialmente para serem utilizados como alimentos ou aditivos para rações e produtos farmacêuticos. Em particular, a metionina, um aminoácido essencial, que não pode ser sintetizado pelos animais, desempenha um papel importante em muitas funções corporais. Além do seu papel na biossíntese de proteínas, a metionina está envolvida na transmetilação e na biodisponibilidade de selênio e de zinco. A metionina é também diretamente utilizada como um tratamento para distúrbios como alergia e febre reumática. No entanto, mais do que a metionina que é produzida é adicionada à ração animal.

[0003] Com a diminuição do uso de derivados de proteínas animais, como resultado da BSE e da gripe aviária, a procura por metionina pura aumentou. Quimicamente, a D,Lmetionina é normalmente produzida a partir de acroleína, mercaptano de metila e cianeto de hidrogênio. No entanto, a

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2/63 mistura racêmica não age da mesma forma que a L-metionina pura, como por exemplo em aditivos para alimentação de galinha (Saunderson CL, (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633). L-metionina pura pode ser produzida a partir de, por exemplo, metionina racêmica, através do tratamento com acilase de N-acetil-D,L-metionina, embora isto aumente os custos de produção dramaticamente. A crescente demanda por L-metionina pura mas que considera as preocupações ambientais torna a produção microbiana de metionina atraente.

[0004] A biossíntese de metionina depende da produção de unidades C1, cisteína e homoserina. A homoserina é um derivado de aspartato e fornece o esqueleto de carbono para metionina. A homoserina também pode ser transformada em treonina, que por sua vez é o precursor de (i) isoleucina, e que também pode ser transformada em glicina (ii). Estas duas reações consumem treonina e desviam mais homoserina para a via da treonina, reduzindo assim o fluxo para a via de metionina.

(i) Para a produção de isoleucina, treonina é desaminada para α-cetobutirato, em uma reação que é catalisada pela treonina desaminase ou treonina desidratase codificadas pelos genes ilvA (CE 4,3,1,19, Ramakrishnan et al., 1965, J Bacteriol, 89:661 ) e tdcB (CE 4,3,1,19, Goss et al., 1988, J Bacteriol, 170:5352), respectivamente. Serina desaminases codificadas por sdaA (CE 4,3,1,17;. Su et al 1989, J Bacteriol, 171:5095) e sdaB (CE 4,3,1,17, Su e Newman, 1991, 173:2473) são também conhecidas por codificar algumas atividades treonina desaminase.

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3/63 (ii) Duas vias para transformação de treonina em glicina estão presentes em E. coli. :

(a) a treonina pode ser transformada em glicina por duas reações consecutivas catalisadas por treonina desidrogenase (TDH; CE 1,1,1,103) e 2-amino 3-cetobutirato CoA-liase (KBL; CE 2,3,1,29) (Boylan SA et al., 1981, Journal of Biological Chemistry, 256, 4, pp 1809-1815; Mukherjee JJ et al, 1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30, pp 14,441-14,447). Estas reações geram uma molécula de acetil-CoA e NADH, cada (Komatsubara S. et al., 1978, Journal of Bacteriology, 1981, 135, pp 318-323).

(b) a treonina também pode ser transformada em glicina diretamente através de um mecanismo retroaldol catalisado por treonina aldolase. Esta reação gera um acetaldeído e uma glicina (Plamann MD et al., 1983, Gene, 22, 1, pp 9-18). A atividade treonina aldolase de enzimas em E. coli é codificada pelos seguintes genes: ItaE (Liu JL et al, 1998, European Journal of Biochemistry, 255, 1, pp 220-226.), kbl (Markus JP et al, 1993 , Biochemica et Biophysica Acta, 1164, pp 299304) e glyA (Schirch V. et al, 1968, Journal of Biological Chemistry, 243, pp 5561; Schirch V. et al, 1985, Journal of Bacteriology, 163, 1, pp 1-7).

[0005] A LtaE é uma treonina aldolase de baixa especificidade que se acredita estar envolvida na degradação de treonina para formar acetaldeído e glicina (Liu JL et al., 1998, European Journal of Biochemistry, 255, 1, pp 220226).

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4/63 [0006] A atividade primária da Kbl é ser uma 2-amino3-cetobutirato CoA-ligase (CE 2,3,1,29), que consiste na desacetilação do 2-amino 3-cetobutirato para formar glicina e acetil-coenzima A (Mukherjee JJ et al., 1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30, pp 14,441-14,447). Tem sido demonstrado que esta possui atividade TAL, o que a torna uma enzima versátil para degradação de treonina (Markus JP et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1164, pp 299-304).

[0007] A atividade primária da glyA é ser uma serina hidroximetil transferase (SHMT) (EC 2,1,2,1). Esta catalisa a conversão do aminoácido serina e tetrahidrofolato (THF) em glicina e 5,10-metileno-THF (ver revisão: Schirch V. et al, 2005, Current Opinion in Chemical Biology, 9, pp 482-487.). Entre as outras atividades secundárias catalisadas por glyA (ver revisão: Schirch L., 2006, Advances in enzymology and related areas of molecular biology, 53, pp 83-112), apenas a treonina aldolase (TAL) parece ser fisiologicamente relevante. A glyA foi cristalizada (Scarsdale et al., 2000, Journal of Molecular Biology, 296, pp 155-168) e estudos foram realizados para elucidar a origem da especificidade do substrato (Angelaccio S. et al., 1992, Biochemistry, 31, pp 155-162). Angelaccio et al. mutaram todas as treoninas na vizinhança do sítio ativo para alanina, e notaram que a mutação T226A aumentou o Km da treonina por um fator de 1,8 e diminuiu a atividade TAL para níveis inferiores ao seu limite de quantificação, enquanto não modificou o Km para THF, nem o Km para serina. No entanto, a mutação tem um forte impacto sobre a atividade SHMT, uma vez que o Kcat para a reação SHMT foi diminuído por um fator de 32.

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5/63 [0008] As linhagens modificadas para a produção de metionina com um rendimento melhorado são, atualmente, amplamente divulgadas no estado da técnica. Compreende-se, agora, que a via de biossíntese de metionina é particularmente complexa e tem genes envolvidos em muitas outras vias. Portanto, o aumento ou atenuação de um gene susceptível a ser benéfico para promover a síntese de metionina, em uma primeira vista, pode acabar levando a um resultado oposto. Sabe-se que genes envolvidos no consumo de treonina são também conhecidos por estar envolvidos na produção C1.

[0009] A inibição da atividade ou a atenuação da expressão de proteínas envolvidas na degradação da treonina já são divulgados em vários trabalhos. Simic e colaboradores (Simic et al, 2002, Applied and Environmental Microbiology, 68 (7), pp 3321-3327) descrevem a atenuação de clivagem aldol da atividade da proteína treonina glyA para aumentar a produção de treonina em Corynebacterium glutamicum. Martinez-Force e colaboradores (Martinez-Force et al, 1994, Progress Biotechnology, 10 (4), pp 372-376) descrevem a deleção do gene ilv1 em Saccharomyces cerevisiae para aumentar a produção de treonina. Além disso, neste estudo, os autores mostram que não há nenhuma correlação entre a acumulação de treonina e metionina e a diminuição da atividade treonina desaminase. Liu e colaboradores (Liu et al, 1998, European Journal of Biochemistry, 255 (1), pp 220226) detalharam a caracterização da enzima LtaE a partir de Escherichia coli e o seu papel no crescimento de células. Finalmente, Lee e colaboradores (Lee et al, 2007, Molecular

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Biology Systems, 3 (149), pp 1-8) divulgam a deleção de tdh e a mutação de genes ilvA para aumentar a produção de treonina.

[0010] Todos esses estudos são exclusivamente orientados para a produção de treonina. Nunca foi considerado, no estado da técnica, se evitar o consumo de treonina como uma solução para melhorar a biossíntese de metionina.

[0011] Apesar da complexidade da via metabólica da metionina, os inventores determinaram um método para aumentar a produção de metionina agindo sobre a transformação de treonina.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0012] A presente invenção diz respeito a um método para a produção de metionina, seus precursores ou derivados de um processo de fermentação compreendendo as seguintes etapas:

- cultivar um microrganismo modificado de um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono, uma fonte de enxofre e uma fonte de nitrogênio, e

- recuperando a metionina e/ou seus derivados a partir do meio de cultura, em que o microrganismo é modificado de forma a reduzir a transformação de treonina em outros compostos que não a metionina.

[0013] Em particular, a transformação de treonina em glicina ou isoleucina é reduzida.

[0014] A invenção também diz respeito a um microrganismo modificado para uma produção melhorada de

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7/63 metionina, em que a transformação de treonina em outros compostos que não a metionina é reduzida, em combinação com outras modificações genéticas para a melhoria da produção de metionina.

[0015] A produção de glicina a partir de treonina é reduzida, em particular, através da redução da atividade das enzimas que transformam a treonina em glicina. Em uma forma de realização particular, uma enzima GlyA mutante é expressa e tem uma atividade treonina aldolase atenuada, enquanto que a atividade de serina hidroximetil transferase da referida enzima GlyA é mantida.

[0016] A produção de isoleucina a partir de treonina é reduzida, particularmente, através da redução da desaminação e/ou a desidratação de treonina a alfacetobutirato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0017] A invenção está relacionada com um método para a produção de metionina, seus precursores ou derivados, a partir de um processo de fermentação compreendendo as seguintes etapas:

- cultivar um microrganismo modificado de um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono, uma fonte de enxofre e uma fonte de nitrogênio, e

- recuperar a metionina e/ou dos seus derivados a partir do meio de cultura, em que o microrganismo é modificado de forma a reduzir a transformação de treonina em outros compostos que metionina.

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8/63 [0018] De acordo com a invenção, os precursores de metionina são definidos como metabólitos que são parte da via metabólica metionina específica ou podem ser derivados destes metabólitos. Derivados de metionina são originários de transformação de metionina e/ou das suas vias de degradação, tais como S-acil metionina e N-acil metionina. Em particular, estes produtos são S-adenosil-metionina (SAM) e N-acetilmetionina (NAM). Especialmente, NAM é um derivado facilmente recuperável de metionina que pode ser isolado e transformado em metionina por desacilação.

[0019] A expressão recuperar a metionina a partir do meio de cultura designa a ação de recuperação de metionina e, possivelmente, SAM e NAM e todos os outros derivados que possam ser úteis.

[0020] Os termos processo fermentativo, cultura ou fermentação são utilizados indiferentemente para denotar o crescimento de bactérias em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples, uma fonte de enxofre e uma fonte de nitrogênio.

[0021] Um meio de cultura adequado é um meio apropriado para a cultura e para o crescimento do microrganismo. Os referidos meios são bem conhecidos no estado da técnica de fermentação de microrganismos, dependendo do microrganismo a ser cultivado.

[0022] O termo microrganismo designa uma bactéria, levedura ou fungo. Preferencialmente, o microrganismo é selecionado dentre Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae. Mais preferencialmente, o microrganismo é uma espécie de

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Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella ou Corynebacterium. Ainda mais preferencialmente, o microrganismo é ou da espécie Escherichia coli ou da espécie Corynebacterium glutamicum.

[0023] O termo microrganismo modificado se refere a um microrganismo modificado para uma produção melhorada de metionina e denota um microrganismo que foi geneticamente modificado, com o objetivo de melhorar o rendimento da produção de metionina. De acordo com a invenção, os termos melhorada ou melhorar significam que a quantidade de metionina produzida pelo microrganismo, e particularmente o rendimento de metionina (razão de grama/mol metionina produzido por grama/mol de fonte de carbono), é maior no microrganismo modificado em comparação com o microrganismo correspondente não modificado. Modificações usuais incluem a introdução de deleções de genes em microrganismos por transformação e recombinação, substituições de genes e introdução de vetores para a expressão de genes heterólogos.

[0024] De acordo com a invenção, o microrganismo modificado utilizado no presente método compreende, por um lado, as modificações para uma produção melhorada de metionina e, por outro lado, modificações para uma produção reduzida de outros compostos que não a metionina a partir de treonina, em comparação com o microrganismo não modificado.

[0025] A expressão outros compostos que não a metionina designa, em especial, glicina e isoleucina.

[0026] Os genes envolvidos na produção de metionina em um microrganismo são conhecidos no estado da técnica, e incluem os genes envolvidos na via de biossíntese específica

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10/63 de metionina, bem como genes envolvidos nas vias envolvendo precursores e os genes envolvidos nas vias de consumo de metionina.

[0027] A produção eficiente de metionina requer a otimização da via específica de metionina e várias vias envolvendo precursores. Linhagens produtoras de metionina foram descritas nos pedidos de patente WO 2005/111202, WO 2007/077041 e WO 2009/043803, que são incorporados como referência no presente pedido.

[0028] Uma linhagem produtora de metionina que superexpressa alelos de homoserina succiniltransferase com sensibilidade de retroalimentação à inibidores SAM e metionina reduzida é descrita no pedido de patente WO 2005/111202. Este pedido descreve também a combinação destes alelos com uma supressão do repressor MetJ metionina (GenBank 1790373), responsável pela regulação negativa do regulon de metionina, como foi sugerido no pedido de patente JP 2000/157267. Além disso, combinações das duas modificações com a superexpressão de aspartoquinase/homoserina

desidrogenase	são descritos	no pedido	de patente	WO
2005/111202.
[0029]	A superexpressão	dos genes	cysE, metH e metF
foi sugerida	no documento WO 2007/077041.
[0030]	Para melhorar a	produção	de metionina,	o

microrganismo pode apresentar:

- um aumento da expressão de, pelo menos, um gene selecionado no grupo constituído por:

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11/63 • cysP que codifica uma proteína de ligação de sulfato periplasmático, como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • cysU que codifica um componente transportador de sulfato ABC, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • cysW que codifica uma proteína de transporte de sulfato ligada à membrana, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • cysA que codifica uma sulfato permease, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • cysM que codifica um serina O-acetil sulfhidralase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • cysl e cysJ codificados, respectivamente, em subunidades sulfito redutase alfa e beta, como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803. De preferência cysl e cysJ são, juntos, superexpressos, • cysH que codifica uma adenililsulfato redutase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • cysE que codifica uma serina aciltransferase, tal como descrito no documento WO 2007/077041, • gcvT que codifica uma aminometil transferase tetrahidrofolato dependente, tal como descrito no

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12/63 documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • gcvH que está envolvido na clivagem de glicina por codificação de um transportador de grupo aminoetila, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • gcvP que codifica uma glicina desidrogenase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • Ipd que codifica uma lipoamida desidrogenase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • serA que codifica uma fosfoglicerato desidrogenase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • serB que codifica uma fosfoserina fosfatase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • serC que codifica uma fosfo-aminotransferase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • glyA que codifica uma enzima hidroximetiltransferase serina, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • metF que codifica uma 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase, tal como descrito no documento WO

2007/077041, • alelos metA que codificam uma homoserina succiniltransferase com sensibilidade de

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13/63 retroalimentação à S-adenosilmetionina e/ou metionina reduzida como descrito no documento WO 2005/111202, • thrA ou alelos thrA que codificam aspartoquinase/homoserina desidrogenase com a inibição de retroalimentação à treonina reduzida, tal como descrito no documento WO 2009/043803 e no documento WO 2005/111202, • metH que codifica uma homocisteína-N5metiltetrahidrofolato transmetilase B12-dependente como descrito no documento WO 2007/077041,

- e/ou uma inibição da expressão de pelo menos um dos seguintes genes:

• pykA que codifica uma piruvato-quinase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • pykF que codifica uma piruvato-quinase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803, • purU que codifica uma formiltetrahidrofolato deformilase, tal como descrito no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2009/043803.

[0031] Microrganismos de acordo com a presente invenção podem ser ainda modificados para aumentar a produção de metionina usando um alelo metB alterado que utiliza preferencialmente ou exclusivamente H2S para a produção de homocisteína a partir de O-succinil-homoserina, tal como descrito no pedido de patente WO 2004/076659 que é aqui incorporado por referência.

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14/63 [0032] O perito no estado da técnica saberá que outros genes podem requerer modificações para otimizar a produção de metionina. Estes genes foram identificados no documento WO 2007/077041 e no documento WO 2007/020295.

[0033] Todas as referências a patentes e pedidos de patente relacionados com a produção de metionina citados acima são aqui incorporadas por referência.

[0034] Em um primeiro aspecto da invenção, a produção de glicina a partir de treonina é reduzida pela atenuação da atividade das enzimas que transformam a treonina em glicina.

[0035] Os termos reduzido e atenuado são usados indistintamente no texto e têm um significado similar. Neste texto, os termos denotam a supressão parcial ou completa da atividade de uma enzima ou da expressão de um gene, o qual é então dito ser reduzido ou atenuado.

[0036] A atividade enzimática pode ser reduzida através da mutação da enzima na sua sequência de aminoácidos, através da redução da tradução da enzima a partir do RNA correspondentes ou da redução da expressão do gene correspondente. O perito no estado da técnica sabe muitos métodos para a redução da tradução. A expressão da enzima pode ser reduzida por elementos estabilizadores ou ao se desestabilizar o RNA mensageiro correspondente (Carrier e Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) ou suas proteínas (por exemplo, etiquetas de GST, Amersham Biosciences). A expressão do gene pode ser reduzida parcialmente ou completamente. Esta redução da expressão do gene pode ser tanto uma inibição da expressão do gene, uma deleção do todo ou de parte da região promotora necessária

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15/63 para a expressão do gene, uma deleção na região de codificação do gene ou a troca do promotor de tipo selvagem mais fraco por um promotor natural ou sintético. Preferencialmente, a atenuação de um gene é essencialmente a supressão completa do gene, que pode ser substituído por um gene marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das linhagens.

[0037] Em um primeiro aspecto da invenção, a produção de glicina a partir de treonina é reduzida no microrganismo modificado.

[0038] Em um aspecto específico, a atividade de enzimas que transformam treonina em glicina é reduzida.

[0039] Em uma forma de realização mais específica da invenção, a expressão de pelo menos um dos seguintes genes é atenuada no microrganismo modificado: ltaE, kbl, glyA, tdh.

[0040] Em outra forma de realização específica da invenção, o microrganismo modificado expressa uma enzima GlyA mutante que tem uma atividade treonina aldolase (TAL) atenuada, enquanto que a atividade de serina hidroximetil transferase da referida enzima GlyA é mantida. Mais precisamente, de acordo com a invenção, a enzima GlyA pode ter pelo menos uma das seguintes alterações de aminoácidos na sua sequência polipeptídica: T128S e T224S e T225S e T226S e T227S e T230S e R235K. A mudança de aminoácido mais preferida é R235K.

[0041] Em uma forma de realização particular da invenção, o gene endógeno GlyA foi eliminado a partir do microrganismo.

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16/63 [0042] Em um segundo aspecto da invenção, o microrganismo é modificado de forma que a produção de isoleucina a partir de treonina é reduzida.

[0043] Em particular, a transformação de isoleucina a partir de treonina é reduzida através da redução da desaminação e/ou a desidratação de treonina a alfacetobutirato.

[0044] Em uma forma de realização particular da invenção, pelo menos uma das seguintes atividades enzimáticas é atenuada: treonina desaminase e treonina desidratase. Em uma modalidade mais particular da invenção, pelo menos um dos seguintes genes é atenuado no microrganismo modificado: ilvA, tdcB, sdaA, sdaB, tdcG.

[0045] De acordo com a invenção, a disponibilidade de serina no microrganismo modificado pode ser aumentada, adicionalmente, para a redução da produção de glicina e/ou isoleucina a partir de treonina.

[0046] A expressão disponibilidade de serina é aumentada designa o fato de que o pool interno de serina, disponível para as vias metabólicas, é aumentado em comparação com um microrganismo não modificado. Este referido aumento é obtido por meios diferentes: aumento da produção interna, diminuição da degradação, diminuição do transporte para o exterior e todas as outras formas conhecidas pelo perito no estado da técnica.

[0047] Particularmente, a produção de serina pode ser aumentada no microrganismo através do aumento da expressão de pelo menos um dos genes de serA, serB, serC. Além disso, a degradação de serina pode ser diminuída pela

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17/63 atenuação da atividade de pelo menos um dos genes sdaA ou sdaB, codificando enzimas com atividade serina desaminase. Em uma forma de realização preferida da invenção, o gene sdaA tem um nucleotídeo de timidina na posição 158 em vez de uma guanina.

[0048] Em uma modalidade mais particular da invenção, a expressão de alelos glyA com atividade reduzida treonina aldolase, tal como descrita acima, pode ser aumentada.

[0049] Na descrição do presente invento, os genes e proteínas são identificados usando as denominações dos genes correspondentes em E. coli. No entanto, e a menos que especificado de outro modo, o uso dessas denominações tem um significado mais geral, de acordo com a invenção, e abrange todos os genes e proteínas correspondentes em outros organismos, mais particularmente microrganismos.

[0050] Usando-se as referências indicadas no GenBank para os genes conhecidos, os peritos no estado da técnica são capazes de determinar os genes equivalentes em outros organismos, linhagens de bactérias, leveduras, fungos, mamíferos, plantas e etc. Este trabalho de rotina é vantajosamente feito usando-se sequências de consenso que podem ser determinadas através da realização de alinhamentos de sequências com genes derivados de outros microrganismos e concepção de sondas degeneradas para clonar o gene correspondente no outro organismo. Estes métodos de biologia molecular de rotina são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica e são reivindicados, por exemplo, em Sambrook et

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18/63 al. (1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 ^a ed Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0051] O banco PFAM (banco de dados de alinhamentos de famílias de proteínas e modelos ocultos de Markov; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa uma grande coleção de alinhamentos de sequências de proteínas. Cada PFAM torna possível a visualização de alinhamentos múltiplos, a visualização de domínios da proteína, avaliar a distribuição entre os organismos, ter acesso a outras bases de dados e a visualização de estruturas de proteínas conhecidas.

[0052] COGs (aglomerados de grupos ortólogos de proteínas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) são obtidos por meio da comparação de sequências de proteínas a partir de genomas sequenciados e representam grandes linhas filogenéticas. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhas, o que permite a identificação de domínios conservados precursores.

[0053] O meio de se identificar sequências homólogas e seus percentuais de homologia são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica e incluem, em particular, os programas BLAST, que podem ser utilizados a partir da página eletrônica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os

parâmetros padrão indicados no	site.	As sequências obtidas
podem então ser	exploradas	(por	exemplo,	alinhadas)
utilizando, por	exemplo,	o	programa	CLUSTALW
(http://www.ebi.ac	.uk/clustalw/		ou	MULTALIN

(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html), com os parâmetros padrão indicados nesses sites.

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19/63 [0054] O método para a produção de metionina, seus precursores ou derivados, a partir de um processo de fermentação é bem conhecido pelo perito no estado da técnica. Fatores diferentes do processo de fermentação podem ser modulados para a otimização do processo, tais como a escolha da fonte de enxofre, da fonte de carbono e da fonte de nitrogênio.

[0055] Em um aspecto preferido da invenção, a fonte de enxofre utilizada para a produção fermentativa de Lmetionina, adicionada no meio de cultura, é o sulfato, tiossulfato, sulfureto de hidrogênio, ditionato, ditionito, sulfito, metilmercaptano, dimetildisulfeto e outros sulfuretos metílicos ou uma combinação de diferentes fontes.

[0056] Mais preferencialmente, a fonte de enxofre no meio de cultura é o sulfato ou tiossulfato, ou uma sua mistura.

[0057] O termo “fonte de carbono”, de acordo com a presente invenção, se refere a qualquer fonte de carbono que pode ser usada por aqueles peritos no estado da técnica para suportar o crescimento normal de um microrganismo, que pode ser de hexoses (tal como glicose, galactose ou lactose), pentoses, monossacarídeos, dissacarídeos (tal como a sacarose, celobiose ou maltose), oligossacarídeos, melaço, amido ou os seus derivados, hemiceluloses, glicerol e suas combinações. Uma fonte de carbono especialmente preferida é a glicose. Outra fonte de carbono preferida é a sacarose.

[0058] Em uma forma de realização particular da invenção, a fonte de carbono é derivada a partir de fontes de alimentação estoque. Uma alimentação estoque renovável é

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20/63 definida como matéria-prima necessária para certos processos industriais que pode ser regenerada dentro de um pequeno período e em uma quantidade suficiente para permitir a sua transformação em produto desejado.

[0059] O termo “fonte de nitrogênio” corresponde tanto a um sal de amônio ou de gás amoníaco.

[0060] A fonte de nitrogênio é fornecida sob a forma de amônio ou amoníaco.

[0061] A fermentação é geralmente conduzida em fermentadores com um meio de cultura apropriado adaptado para o microrganismo a ser utilizado, contendo pelo menos uma fonte de carbono simples e, se necessário, co-substratos para a produção de metabólitos.

[0062] Os peritos no estado da técnica são capazes de definir as condições de cultura para os microrganismos de acordo com a invenção. Em particular, as bactérias são fermentadas a uma temperatura entre 20 °C e 55 °C, preferencialmente entre 25 °C e 40 °C, e mais especificamente cerca de 30 °C para C. glutamicum e cerca de 37 °C para E. coli .

[0063] Como um exemplo de meio de cultura conhecido para E. coli, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou semelhante a um meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. USA 32:120-128), um meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque) ou um meio tal como definido por Schaefer et al. (1999, Anal Biochem 270: 88-96).

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21/63 [0064] Como um exemplo de meio de cultura conhecido para C. glutamicum, o meio de cultura pode ser de composição idêntica ou similar ao meio BMCG (Liebl et al., 1989, Appl Microbiol Biotechnol 32: 205-210) ou um meio tal como descrito por Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol Biotechnol 3: 573-583).

[0065] Em um aspecto específico da invenção, a cultura é realizada em condições tais que o microrganismo é limitado ou carente de um substrato inorgânico, em particular em fosfato e/ou potássio.

[0066] Ao se sujeitar um organismo a uma limitação de um substrato inorgânico, se define uma condição sob a qual o crescimento dos microrganismos é regulado pela quantidade de um produto químico inorgânico fornecido que ainda permite o crescimento fraco.

[0067] Privar um microrganismo de um substrato inorgânico define a condição sob a qual o crescimento do microrganismo para completamente devido ao fato da ausência do substrato inorgânico.

[0068] A presente invenção também está relacionada com um método para a produção de metionina compreendendo a etapa de isolamento de metionina, seus precursores ou derivados, do caldo de fermentação e/ou da biomassa, opcionalmente restante em porções ou na quantidade total (0 - 100%) no produto final.

[0069] Após a fermentação, a L-metionina seus precursores ou compostos derivados, são recuperados e purificados, se necessário. Os métodos para a recuperação e purificação do composto produzido, tais como metionina e N

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22/63 acetil-metionina, nos meios de cultura, são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica.

[0070] Opcionalmente, a partir de 0 a 100%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99% da biomassa pode ser mantida durante a purificação do produto de fermentação.

[0071] Opcionalmente, o derivado de metionina Nacetil-metionina é transformado em metionina por desacilação, antes da metionina ser recuperada.

[0072] A presente invenção também está relacionada com um microrganismo modificado compreendendo:

- uma deleção do gene metJ,

- expressão de um alelo uma metA com sensibilidade de retroalimentação à metionina reduzida, e

- pelo menos uma das modificações, tais como descritas acima.

[0073] A presente invenção também está relacionada com um microrganismo modificado tal como descrito nos exemplos abaixo.

DESENHOS [0074] A Figura 1 mostra a via metabólica envolvendo piruvato, treonina, isoleucina e metionina.

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EXEMPLOS

EXEMPLO I: Construção da linhagem MG1655 metA*11 PtrcmetH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA (pME101-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11) [0075] Linhagens produtoras de metionina foram descritas nos pedidos de patente WO 2007/077041 e WO 2009/043372, que são incorporados como referência no presente pedido.

1. Construção da linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF AmetJ ApykF ApykA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) [0076] O plasmídeo pME101-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11, descrito nos documentos WO 2007/077041 e PCT/FR2009/052520, foi introduzido na linhagem recombinante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA por eletroporação, dando a linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF AmetJ ApykF ApykA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11).

EXEMPLO II: Construção da linhagem MG1655 metA*11 PtrcmetH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA AltaE Atdh (pME101-thrA*1cysE-PgapA-metA*11) [0077] Linhagens produtoras de metionina foram descritas nos pedidos de patente WO 2007077041 e WO

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2009/043372, que são incorporados como referência no presente pedido.

1. Construção da linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF AmetJ ApykF ApykA AltaE::Km [0078] Para inativar o gene ltaE, a estratégia de recombinação homóloga descrita por Datsenko e Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência à canamicina, ao eliminar a maioria dos genes em questão. Para tanto, 2 oligonucleotídeos, DltaEF e DltaER, foram utilizados (sequência de referência no site http://ecogen.org/).

DltaEF (SEQ ID NO 1) ggacatgccatgattgatttacgcagtgataccgttacccgaccaagccgcgccatgct cgaagcgatgatggccgccccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTC com

- uma região (em minúsculas) homóloga à sequência 908446-908526 da região ltaE,

- uma região (maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina (sequência de referência em Datsenko, KA e Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

DltaER (SEQ ID NO 2) gcgcaccagatgctgaccaatgtagccactggcaccgagaactaaaatgcgttgcggca cgtctctctccttaacgcgccCATATGAATATCCTCCTTAG com

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- uma região (em minúsculas) homóloga à sequência 907446-907525 da região ItaE,

- uma região (maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência à canamicina.

[0079] Os oligonucleotídeos DltaEF e DltaER foram usados para amplificar por PCR o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmídeo pKD4. O produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA (pKD46), em que a enzima recombinase Red expressa permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes à canamicina foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência é verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos ltaEF e ltaER definidos abaixo. A linhagem retida foi designada MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA AltaE::Km.

ltaEF (SEQ ID NO 3)

GCCACCTGGCGCTCCTGAGCG (homóloga à sequência de 907234907254 da região ItaE).

ltaER (SEQ ID NO 4)

GCTGCGCGCAATCATCAGCGG (homóloga à sequência de 908603908623 da região ltaE).

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2. Construção da linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF AmetJ ApykF ApykA AltaE::Km Atdh::Cm [0080] Para inativar o gene tdh a estratégia de recombinação homóloga descrito por Datsenko e Wanner (2000) foi usada. Esta estratégia permite a inserção de um cassete de resistência a cloranfenicol, ao excluir a maioria dos genes em questão. Para tanto, 2 oligonucleotídeos, DtdhF e DtdhR, foram utilizados (sequência de referência no site http://ecogen.org/).

DtdhF (SEQ ID NO 5) gaaagcgttatccaaactgaaagcggaagagggcatctggatgaccgacgttcctgtac cggaactcgggcataacgatcCATATGAATATCCTCCTTAG com

- uma região (em minúsculas) homóloga à sequência 3789287-3789366 da região tdh,

- uma região (maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência a cloranfenicol (sequência de referência em Datsenko, KA e Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645),

DtdhR (SEQ ID NO 6) cccagctcagaataactttcccggactggcccgaacgcatagcgtcaaagcccttctgg aaatcatcgatagagaaacgatgggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- uma região (em minúsculas) homóloga à sequência 3788348-3788431 da região tdh,

- uma região (maiúsculas) para a amplificação do cassete de resistência a cloranfenicol.

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27/63 [0081] Os oligonucleotídeos DtdhF e DtdhR foram utilizados para amplificar por PCR o cassete de resistência a cloranfenicol a partir do plasmídeo pKD3. O produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA AltaE::Km (pKD46), na qual a enzima recombinase Red, expressa, permite a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes a cloranfenicol foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotídeos tdhF e tdhR, definidos abaixo. A linhagem retida foi designada MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF AmetJ ApykF ApykA AltaE::Km Atdh::Cm.

tdhF (SEQ ID NO 7)

GGGTAGAGAGATAATGAGAGCAGC (homóloga à sequência 37882103788233 da região tdh).

tdhR (SEQ ID NO 8)

GCCCAGCCAAAACTGTACAG (homóloga à sequência 3790719-3790738 da região tdh).

3. Construção da linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF AmetJ ApykF ApykA AltaE Atdh [0082] A canamicina e cassetes de resistência a cloranfenicol foram então eliminados. O plasmídeo pCP20, carregando recombinase FLP agindo nos sítios FRT da

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28/63 canamicina ou no cassete de resistência a cloranfenicol, foi introduzido na linhagem recombinante MG1655 metA*11 PtrcmetH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA AltaE::Km Atdh::Cm por eletroporação. Após uma série de culturas a 42 °C, a perda da canamicina e do cassete de resistência a cloranfenicol foi verificada por análise de PCR com os mesmos oligonucleotídeos utilizados anteriormente, ltaEF / ltaER e tdhF / tdhR. A linhagem retida foi designada MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA AltaE Atdh.

4. Construção da linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF AmetJ ApykF ApykA AltaE Atdh (pME101-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11) [0083] O plasmídeo pME101-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11, descrito nos pedidos de patente WO 2007/077041 e PCT/FR2009/052520, foi introduzido na linhagem recombinante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA AltaE Atdh por eletroporação, dando a linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF AmetJ ApykF ApykA AltaE Atdh (pME101-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11).

EXEMPLO III: Avaliação de linhagens de produção [0084] Linhagens de produção foram avaliadas em frascos pequenos de tipo Erlenmeyer. Um pré-cultura foi

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29/63 crescida em 5,5 mL a 37 °C durante 16 horas em um meio misto (meio LB a 10% (Sigma 25%) com 2,5 gL^-1 de glicose e 90% de meio mínimo PC1). Esta foi utilizada para inocular uma cultura de 50 mL para um OD600 de 0,2, em meio PC1. Espectinomicina foi adicionada a uma concentração final de 50 mgL^-1. A temperatura das culturas foi de 37 °C. Quando a cultura tinha atingido um OD600 de 5 a 7, os aminoácidos extracelulares foram quantificados por HPLC após Derivatização OPA/Fmoc e outros metabólitos foram analisados utilizando HPLC com detecção refractométrica (ácidos orgânicos e glicose) e GC-MS após sililação. Para cada linhagem, três replicatas foram feitas.

[0085] Linhagem 1 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcFcysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11).

[0086] Linhagem 2 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcFcysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApykA AltaE Atdh (pME101-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11).

Tabela 1: composição do meio mínimo (PC1)

Composto	Concentração (g.L1)
ZnSO4,7H2O	0,0040
CuCl2.2H2O	0,0020
MnSO4.H2O	0,0200
CoCl2.6H2O	0,0080
H3BO3	0,0010
Na2MoO4.2H2O	0,0004
MgSO4,7H2O	1,00
Ácido cítrico	6,00
CaCl2,2H2O	0,04
K2HPO4,3H2O	10,50

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Na2HPO4	2,00
(NH4)2HPO4	8,00
NH4Cl	0,13
NaOH 4M	Ajustada para pH 6,8
FeSO^^O	0,04
Tiamina	0,01
Glicose	10,00
Tiossulfato de amônio	5,60
Vitamina B12	0,01
MOPS	10,00
IPTG	0,0024

Tabela 2: produção de metionina (Y_met) em g% de metionina/g de glicose produzida em cultura de lote de diferentes linhagens. Para a definição exata da produção de metionina/glicose veja abaixo. SD indica o desvio padrão para o rendimento, que foi calculado com base de três replicatas.

Linhagem	Ymet	SD
Linhagem 1:	8,99	0,27
Linhagem 2:	9,56	0,3

[0087] A concentração de metionina extracelular foi quantificada por HPLC após derivatização OPA/Fmoc. A concentração de glicose residual foi analisada utilizando HPLC com detecção refractométrica. O rendimento de metionina foi expresso como se segue:

Y_met = metionina (g) / glicose consumida (g) * 100 [0088] Como pode ser visto na tabela 1, o rendimento de metionina/glicose (Ymet) é aumentado mediante a supressão dos genes tdh e ItaE.

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EXEMPLO IV: Construção de linhagens de produção de metionina 3 a 12, testadas nos exemplos V e VI abaixo

1. Protocolos [0089] Vários protocolos foram utilizados para construir linhagens produtoras de metionina e são descritos nos exemplos a seguir.

Protocolo 1: modificações cromossômicas por recombinação homóloga e seleção de recombinantes (Datsenko, KA & Wanner, BL (2000) [0090] Substituição alélica ou ruptura do gene em determinados loci cromossômicos foi realizada por recombinação homóloga, como descrito por Datsenko & Wanner (2000). A resistência cat a cloranfenicol (Cm), a resistência kan a canamicina (Km), ou os genes de resistência gm a gentamicina (Gt), ladeados por sítios de reconhecimento FLP, foram amplificados por PCR usando os plasmídeos pKD3 ou pKD4 ou p34S-Gm (Dennis et Zyltra, AEM julho de 1998, p 27102715) como modelo, respectivamente. Os produtos resultantes de PCR foram usados para transformar a linhagem receptora de E. coli abrigando o plasmídeo pKD46 que expressa λ Red (γ, β, exo) recombinase. Transformantes resistentes a antibióticos foram selecionados e a estrutura cromossômica dos loci mutados foi verificada por análise de PCR com os primers apropriados listados na Tabela 4.

[0091] Os genes de resistência a kan foram removidos usando o plasmídeo pCP20, como descrito por Datsenko & Wanner (2000), exceto pelo fato de que os clones portadores do

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32/63 plasmídeo pCP20 foram cultivados a 37 °C em LB e depois testados para a perda de resistência a antibióticos, a 30 °C. Clones sensíveis a antibiótico foram, então, verificados por PCR utilizando primers listados na Tabela 4.

Protocolo 2: transdução de fago P1 [0092] Modificações cromossômicas foram transferidas para uma dada linhagem receptora de E. coli por transdução de P1. O protocolo é composto de 2 etapas: (i) preparação do lisado de fagos em uma linhagem doadora contendo a modificação cromossômica associada ao gene de resistência e (ii) a infecção da linhagem receptora pelo fago lisado resultante.

[0093] Preparação do lisado de fago

- inocular 100 pl de uma cultura durante a noite da linhagem MG1655 com a modificação cromossômica de interesse em 10 ml de LB + km 50pg/ml + glicose 0,2% + CaCl₂ 5 mM;

- incubar por 30 minutos a 37 °C com agitação;

- adicionar 100 pl de lisado de fago P1 preparado da linhagem MG1655 doadora (aproximadamente 1 x 10⁹ fagos/ml);

- agitar a 37 °C durante 3 horas até que a lise completa das células;

- adicionar 200 pl de clorofórmio, e submeter a vórtex;

- centrifugar 10 minutos a 4500 g para eliminar os detritos celulares;

- transferir o sobrenadante para um tubo estéril;

- armazenar o ligado a 4 °C.

[0094] Transdução

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- centrifugar por 10 minutos a 1500 g 5 ml de uma cultura durante a noite da linhagem de E. coli destinatária cultivada em meio LB;

- suspender o pellet celular em 2,5 ml de MgSO4 10 mM, CaCl₂ 5 mM;

- infectar 100 pl de células com 100 pL de lisado de fago P1 da linhagem MG1655 com modificação cromossômica (tubo de ensaio) e como um tubo de controle: 100 pL de células sem fago P1 e 100 pL de células sem fago P1;

- incubar por 30 minutos a 30 °C sem agitação;

- adicionar 100 pl de citrato de sódio 1 M a cada tubo, e submeter a vórtex;

- adicionar 1 ml de LB;

- incubar 1 hora a 37 °C com agitação;

- centrifugar por 3 minutos a 7000 rpm;

- colocar em placa em LB + Km 50 mg / ml;

- incubar a 37 °C durante a noite.

[0095] Os transdutantes resistentes a antibióticos foram então selecionados e a estrutura cromossômica do locus mutado foi verificada por análise de PCR com os primers apropriados, listados na Tabela 4.

[0096] Os exemplos a seguir descrevem a construção de todas as linhagens listadas na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3: Lista dos genótipos e números correspondentes de linhagens intermediárias e linhagens produtoras que aparecem nos exemplos a seguir.

No. Linhagem	Genótipo
3	MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-

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	CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1
4	MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD: :TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AyobD::Km
5	MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD: :TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-P gapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA^*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AyobD::Km pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
6	MG1655 metA^*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-P gapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA^*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaArc AyobD::Km
7	MG1655 metA^*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-

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	metA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-P gapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AwcaM::TT02--TTadc-PlambdaR*(-35)--RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaArc AyobD ::Km pCL1920-PgapA-pycRe-TT07
8	MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD: :TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AglyA ::Km
9	MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD: :TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AglyA ::Km pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA
10	MG1655 metA^*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaA^BCD: :TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-P gapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA^*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sviaA'R AglyA ::Km pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)- TTglyA
11	MG1655 metA^*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaA^BCD: :TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-P gapA-metA*11 ACP4-6::TT02-

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TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AglyA ::Km pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA

12

MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD: :TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-P gapA-metA*11 ACP4-6::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC ssiaA'd AglyA ::Km pCL1920-PglyA-glyA* (R235K)TTglyA

2. Descrição da linhagem 3 [0097] Modificações genéticas da linhagem produtora de metionina 3 (Tabela 3) foram descritas nos pedidos de patente EP103061644 e US61/406249, que são incorporados como referência no presente pedido. Após sequenciação de DNA da linhagem 3, uma mutação mis-sense foi identificada no gene sdaA inesperadamente. Esta mutação está localizada na posição 158 do gene estrutural (T158G) que gera uma alteração de aminoácidos na proteína correspondente: Leucina 53 para arginina. O alelo foi chamado sdaA*1.

3. Construção de linhagens com um gene sdaA modificado - Modificação da degradação de serina

3.1. Construção da linhagem 5 contendo sdaA*(T158G) [0098] Para se eliminar o gene yobD na linhagem 3, o Protocolo 1 foi utilizado, exceto pelo fato de que os primers Ome1983-DyobD-amplif-F (SEQ ID N ° 09) e Ome 1986 - DyobDamplif-R (SEQ ID N ° 10) (Tabela 4) foram utilizados para

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37/63 amplificar a supressão AyobD::km a partir da linhagem BW25113 AyobD::km (Keio collection Baba. et al., Mol Syst Biol., 2, 2006-0).

[0099] Recombinantes resistentes à canamicina foram selecionados. A inserção do cassete de resistência foi verificada por PCR com primers Ome 1987-DyobD-verif-F (SEQ ID N°11) e Ome 1988- DyobD-verif-R (SEQ ID N°12) (Tabela 4) e pelo sequenciamento de DNA. O alelo sdaA*1 do gene sdaA foi também verificado por sequenciação de DNA. Após a eliminação do plasmídeo pKD46, a linhagem resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE

ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1 -cysE-P gapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-P gapA-metA*11 AtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AyobD::Km foi chamada linhagem 4 (Tabela 3).

[0100] O pCL1920-PgapA-pycRe-TT07, descrito nos pedidos de patente EP103061644 e US61/406249, foi então introduzido por eletroporação na linhagem 4 (Tabela 3). A presença do plasmídeo pCL1920-PgapA-pycre-TT07 foi verificada e a consequente linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11

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AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1 -cysE-PgapAmetA*11 ACP4-6::TT02--TTadc--PllambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1cysE-P gapA-iuetA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AyobD::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07 foi chamada linhagem 5 (Tabela 3).

3.2. Construção da linhagem 7 contendo um alelo sdaAwt reconstruído (sdaArc) [0101] Os genes sdaA e yobD são próximos uns dos outros no cromossoma de E. coli; 40, 84 min e 41,01 min, respectivamente, e uma vez que o fago P1 pode empacotar 2 min do cromossoma de E. coli, os genes sdaA e yobD são cotransducíveis. Desta forma, o alelo sdaA de tipo selvagem e a deleção AyobD::km, foram co-transduzidos na linhagem 3 (Tabela 3) usando um lisado de fago P1 a partir da linhagem BW25113 sdaA AyobD::km (Keio collection Baba. et al., Mol Syst Biol., 2, 2006-0) de acordo com protocolo 2.

[0102] Transdutantes resistentes à canamicina foram selecionados. A presença da deleção AyobD::km foi verificada por PCR com primers Ome 1987-DyobD-verif-F (SEQ ID N°11) e Ome 1988- DyobD-verif-R (SEQ ID N°12) (Tabela 4) seguida por sequenciação de DNA. A troca de um alelo sdaA*1 pelo alelo sdaA de tipo selvagem foi verificada por sequenciamento de DNA e chamada sdaArc (rc para reconstruído). A linhagem resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)thrA*1--cysE ApgaABCD::TT02-TTadc--PlambdaR*(-35)-RBS01Petição 870190023169, de 11/03/2019, pág. 62/164

39/63 thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadcP lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-P gapA-metA*11 AwcaM:: TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AtreBC::TT02-serA-serC sdaArc AyobD::Km foi chamada linhagem 6 (Tabela 3).

[0103] O plasmídeo pCL1920-PgapA-pycre-TT07, descrito nos pedidos de patente EP103061644 e US61/406249, foi então introduzido por eletroporação na linhagem 6 (Tabela 3). A presença do plasmídeo pCL1920-PgapA-pycre-TT07 foi verificada e a consequente linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11

AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1 -cysE-PgapAmetA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AtreBC::TT02-serA-serC sdaArc AyobD::Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07 foi chamada linhagem 7 ( Tabela 3).

4. Construção de linhagens super-produzindo proteínas GlyA ou GlyA* (R235K) - modificação da via de treonina/glicina

4.1. Construção da linhagem 8 por deleção do gene glyA [0104] Para eliminar o gene glyA na linhagem 3, o Protocolo 1 foi utilizado exceto pelo fato de que os Ome 0641-DglyA R (SEQ ID N°13) e Ome 0642-DglyA F (SEQ ID N°14)

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40/63 (ver abaixo) foram utilizados para amplificar o cassete de resistência à canamicina a partir do plasmídeo pKD4.

[0105] Recombinantes resistentes à canamicina foram selecionados. A inserção do cassete de resistência foi verificada por PCR com primers Ome 0643-glyA R (SEQ ID N°15) e Ome 0644-glyA F (SEQ ID N°16) (Tabela 4) e por sequenciação de DNA. A linhagem resultante foi chamada MG1655 metA*11 AglyA::Km pKD46.

Ome 0641-R DglyA (SEQ ID N°13) ATGTTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCGATTATGATGCCGAACTGTGGCAGGCTATGGA GCAGGAAAAAGTACGTCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG com

- a sequência de letras maiúsculas sendo homóloga à sequência antes do gene glyA (2683451-2683529, sequência de referência no sítio http://ecogene.org/V)

- a sequência sublinhada de maiúsculas correspondente ao local 2 do primer do plasmídeo pKD4 (Datsenko, KA e Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6640-6645)

Ome 0642-DglyA F (SEQ ID N°14) GCGCAGATGTCGAGAACTTTACCTTTGATGCGCTCGATAACGGCTTCATCATTGATGCT GTCCAG CACGTCACACATCCCATATGAATATCCTCCTTAG com

- a sequência de letras maiúsculas sendo homóloga à sequência antes do gene GlyA (2682298 - 2682376, sequência de referência no sítio http://ecogene.org/V)

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- a sequência sublinhada de maiúsculas correspondente ao local 1 do primer do plasmídeo pKD4 (Datsenko, KA e Wanner, BL, 2000, PNAS, 97: 6,640-6,645) [0106] A supressão AglyA::km foi então transduzida na linhagem 3 (Tabela 3) usando um lisado de fago P1 a partir da linhagem MG1655 metA*11 AGlyA::Km pKD46 acima descrita de acordo com protocolo 2.

[0107] Transdutantes resistentes à canamicina foram selecionados. A presença da supressão AglyA::km foi verificada por PCR com primers Ome 0643-glyA R (SEQ ID N°15) e Ome 0644-glyA F (SEQ ID N°16) (Tabela 4). A linhagem resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)thrA*1--cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM:: TT02TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AglyA ::Km foi chamada linhagem 8 (Tabela 3).

4.2. Construção da linhagem 9, que expressa glyA [0108] A fim de superexpressar o gene serina hidroximetiltransferase de Escherichia coli, o plasmídeo pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA foi construído, que é derivado dos plasmídeos pCC1BAC (Epicentre) e JCSP (Stratagene).

[0109] Para se construir o plasmídeo pCC1BAC-PglyAglyA-TTglyA, o inserto PglyA-glyA-TTglyA foi amplificado por PCR com primers Ome 1162-glyAR-EcoRI-HindIII (SEQ ID N°17)

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42/63 e Ome 1165-PglyAF-HindIII (SEQ ID N°18), utilizando DNA genômico MG1655 como molde, e foi clonado no plasmídeo pSCB (Stratagene). O vetor resultante foi verificado por sequenciação e chamado pSCB-PglyA-glyA-TTglyA.

[0110] O plasmídeo pSCB-PglyA-glyA-TTglyA foi então digerido por HindIII e o fragmento resultante HindIII-PglyAglyA-TTglyA-HindIII foi clonado entre os sítios HindIII do plasmídeo pCC1BAC. O plasmídeo selecionado tem o inserto PGlyA-GlyA-TTGlyA na orientação oposta ao promotor lacZ do plasmídeo pCC1BAC, e foi verificado por sequenciação de DNA e chamado pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA .

Ome 1162-glyAR-EcoRI-HindIII (SEQ ID N°17)

ATCTAGTAAGCTTAGTGAATTCGTTACGACAGATTTGATGGCGCG com

- uma sequência de maiúsculas sublinhada para sítios de restrição HindIII e EcoRI e extrabases,

- uma sequência de maiúsculas em negrito homóloga à sequência do promotor glyA (2682063-2682085, sequência de referência no sítio http://ecogene.org/V).

Ome 1165-PglyAF-HindIII (SEQ ID N°18)

TCATCGGATCCATCAAGCTTGAAAGAATGTGATGAAGTG com

- uma sequência de maiúsculas sublinhada para sítios BamHI e HindIII de restrição e extrabases,

- uma sequência de maiúsculas em negrito homóloga ao terminador de transcrição do gene glyA (2683744-2683762), sequência de referência no sítio http://ecogene.org/).

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43/63 [0111] O pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA , descrito acima, foi então introduzido por eletroporação na linhagem 8 (Tabela 3). A presença do plasmídeo pCC1BAC-P glyA-glyA-TTglyA foi verificada e a consequente linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11

AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1 -cysE-PgapAmetA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1cysE-P gapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AglyA ::Km pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA foi chamada linhagem 9 (Tabela 3).

4.3. Construção da linhagem 10, que expressa glyA*

Construção de pSCB-PglvA-glvA*(R235K)-TTglyA [0112] Para construir o plasmídeo pSCB-PglyAglyA*(R235K) -TTglyA, o plasmídeo pSCB-PglyA-glyA-TTglyA foi amplificado com primers Ome 1483-glyA* R R235K (SEQ ID N°19) e Ome 1482-glyA* F R235K (SEQ ID N°20). O produto de PCR foi digerido por DpnI, a fim de eliminar o molde de DNA parental. A saliência restante coesa foi fosfatada e introduzida em uma linhagem de E. coli para formar o plasmídeo pSCB-PglyAglyA*(R235K) -TTglyA. O inserto PglyA-glyA*(R235K) -TTglyA e especialmente a presença da mutação R235K (703-AAA-705) no gene glyA foram verificados por sequenciação de DNA.

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44/63

Ome 1483 glyA* R R235K (SEQ ID N°19)

CCTTTCGCCAGGATCAGGCCTCCTTTCGGACCCGCCAGGGTTTTGTGAG com

- uma sequência de maiúsculas homóloga ao gene glyA (2682802-2682850, sequência de referência no sítio http://ecogene.org/).

- uma sequência de maiúsculas em negrito correspondente à mutação códon inserida CGC-708-TTT (R235K)

- uma sequência de maiúsculas sublinhadas corresponde a um ponto de mutação silenciosa (G704T) que faz aparecer um sítio de restrição StuI.

Ome 1482 glyA* F R235K (SEQ ID N°20)

CTCACAAAACCCTGGCGGGTCCGAAAGGAGGCCTGATCCTGGCGAAAGG

- uma sequência de maiúsculas homóloga ao gene glyA (2682802-2682850, sequência de referência no sítio http://ecogene.org/).

- uma sequência de maiúsculas em negrito correspondente à mutação códon inserida CGC-708-TTT (R235K)

- uma sequência de maiúsculas sublinhadas corresponde a um ponto de mutação silenciosa (G704T) que faz aparecer um sítio de restrição StuI.

Construção de pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K) - TTglyA [0113] Para se construir pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K) TTglyA, o fragmento HindIII-PglyA-glyA*(R235K) -TTglyA, purificado a partir de pSCB-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA, descrito abaixo, foi clonado entre os sítios HindIII do plasmídeo pCC1BAC. O plasmídeo selecionado tem a inserção PGlyA-GlyA*(R235K)-TTGlyA na orientação oposta em relação à

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45/63 orientação do promotor lacZ do plasmídeo pCCIBAC, e foi verificado por sequenciação de DNA e chamado pSCB-PglyAglyA*(R235K) - TTglyA [0114] O pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA, descrito acima, foi então introduzido por eletroporação na linhagem 8 (Tabela 3). A presença do plasmídeo pCC1BAC-PglyAglyA*(R235K)-TTglyA foi verificada e a consequente linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 DtreBC::TT02-serA--serC sdaA*1 AglyA ::Km pCC1BACPglyA-glyA*(R235K)-TTglyA foi chamada linhagem 10 (Tabela 3).

4.4. Construção da linhagem 11, que superexpressa glyA

Construção de pCL1920-P glyA-glyA-TTglyA [0115] O plasmídeo pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA é derivado dos plasmídeos pCL1920 (Lerner e Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4,631) e pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA descritos acima.

[0116] Para se construir pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA, o fragmento HindIII PglyA-glyA-TTglyA, purificado a partir de pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA, foi clonado entre os sítios HindIII do plasmídeo pCL1920. O plasmídeo selecionado tem o inserto PglyA-glyA-TTglyA na orientação oposta em relação à orientação do promotor lacZ do plasmídeo pCL1920, e foi

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46/63 verificado por sequenciação de DNA e chamado pCL1920-PglyAglyA-TTglyA.

[0117] O pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA, descrito acima, foi então introduzido por eletroporação na linhagem 8 (Tabela 3). A presença do plasmídeo pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA foi verificada e a consequente linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11

AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1 -cysE-PgapAmetA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC::TT02-serA-serC sdaA*1 AglyA ::Km pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA foi chamada linhagem 11 (Tabela 3).

4.5. Construção da linhagem 12, que superexpressa glyA*

Construção de pCL1920-PglyA-glyA*(R235K) -TTglyA [0118] O plasmídeo pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)TTglyA é derivado dos plasmídeos pCL1920 (Lerner e Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631) e pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA descritos acima.

[0119] Para se construir pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)TTglyA, o fragmento HindIII-PglyA-glyA*(R235K) -TTglyA, purificado a partir de pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA, foi clonado entre os sítios HindIII do plasmídeo pCL1920. O plasmídeo selecionado, que tem a inserção PglyAglyA*(R235K)-TTglyA na orientação oposta em relação à orientação do promotor lacZ do plasmídeo pCL1920, foi

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47/63 verificado por sequenciação de DNA e chamado pCL1920-PglyAglyA*(R235K) -TTglyA.

[0120] O pCL192 0-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA, foi então introduzido por eletroporação na linhagem 8 (Tabela 3). A presença do plasmídeo pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)TTglyA foi verificada e a consequente linhagem MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS: :TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapAmetA*11 DtreBC::TT02-serA--serC sdaA*1 AglyA ::Km pCL1920PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA foi chamada linhagem 12 (Tabela 3).

Tabela 4: Primers de PCR utilizados para verificações das modificações cromossômicas descritas acima

Name dos genes	Nome dos primers	SEQ ID N°	Localização da homologia com a região cromoss.	Sequências
yobD	Ome 1983- DyobD-amplif-F	9	1902261-1902280	CTGGCTGGTGTAGGCGACCC
	Ome 1986- DyobD-amplif-R	10	1903864-1903883	CCATTCCCCAGCCGATCAGC
	Ome 1987DyobD-veri f-F	11	1902185-1902207	GGAAGAACAGCGTGCTAATGGCG
	Ome 1988- DyobD-veri f-R	12	1903984-1904008	CGGCTCTTCATCTTCATCATCTGCG
GlyA	Ome 0643-GlyA R	15	2683575-2683597	CGCCGTTGTCCAACAGGACCGCC
Ome 0644-GlyA F	16	2682140-2682159	CCTGATGCGCTACGCTTATC

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EXEMPLO V: Efeito da atenuação da atividade treonina aldolase de uma proteína mutante GlyA* sobre a produção de metionina

1. Avaliação de linhagens de produção tendo ou glyA ou alelo glyA* [0121] Linhagens de produção foram avaliadas em frascos pequenos de tipo Erlenmeyer. Uma pré-cultura foi crescida em 5,5 mL a 30 °C durante 21 horas em um meio misto (meio LB a 10% (Sigma 25%) com 2,5 gL^-1 de glicose e 90% de meio mínimo PC1). Esta foi utilizada para inocular uma cultura de 50 mL de uma DO600 de 0,2 em meio de PC1 (composição na Tabela 5). Canamicina e espectinomicina foram adicionadas a uma concentração de 50 mg L^-1 e cloranfenicol a 30 mg L^-1, quando foi necessário. A temperatura das culturas foi de 37 °C. Quando a cultura tinha atingido um OD600 de 5 a 7, os aminoácidos extracelulares foram quantificados por HPLC após derivatização OPA/Fmoc e outros metabólitos foram analisados utilizando HPLC com detecção refractométrica (ácidos orgânicos e glicose) e GC-MS após sililação.

Tabela 5: composição do meio mínimo (PC1).

Composto	Concentração (g.L1)
ZnSO4.7H2O	0,0040
CuCl2.2H2O	0,0020
MnSO4.H2O	0,0200
CoCl2.6H2O	0,0080
H3BO3	0,0010
Na2MoO4.2H2O	0,0004
MgSO4.7H2O	1,00
Ácido cítrico	6,00
CaCl2.2H2O	0,04
K2HPO4	8,00

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Na2HPO4	2,00
(NHJ2HPO4	8,00
NH4Cl	0,13
NaOH 4M	Ajustada para pH 6,8
FeSO4.7H2O	0,04
Tiamina	0,01
Glicose	15,00
Tiossulfato de amônio	5,61
Vitamina B12	0,01

Tabela 6: Rendimento de metionina (Y_met) em % g de metionina/g de glicose produzida em cultura de lote por diferentes linhagens cultivadas nas condições descritas acima. Para a definição precisa do rendimento metionina / glicose veja abaixo. SD indica o desvio padrão para os rendimentos que foi calculado com base em várias replicatas (n = número de replicatas).

linhagem	Ymet	SD	N
Linhagem 3	9,75	1,29	110
Linhagem 9 - alelo glyA wt	9,80	0,19	3
Linhagem 10 - alelo glyA*	10,53	0,53	3
Linhagem 11 - alelo glyA wt	10,95	0,35	3
Linhagem 12 - alelo glyA*	11,89	0,66	3

[0122] Além disso, para catalisar a transformação de serina em glicina, a enzima GlyA também é capaz de clivar a L-treonina. Isto foi demonstrado pelos inventores com uma linhagem carregando uma deleção glyA. Esta linhagem não tinha serina hidroximetiltransferase (SHMT) detectável e não apresentava mais atividade treonina aldolase (TAL) (dados não mostrados).

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50/63 [0123] Como pode ser visto na tabela 6, o rendimento de metionina/glicose (Ymet) é aumentado após expressão (linhagem 10) ou superexpressão (linhagem 12) do alelo glyA* em comparação com glyAwt (respectivamente linhagem 9 e 11 para a expressão e superexpressão de glyAwt) .

[0124] A atenuação da atividade treonina aldolase sem afetar a serina hidroximetil transferase (SHMT) de GlyA é benéfica para a produção de metionina (ver atividades na tabela 7 abaixo).

[0125] A concentração de metionina extracelular foi quantificada por HPLC após derivatização OPA/FMOC. A concentração de glicose residual foi analisada utilizandose HPLC com detecção refractométrica. O rendimento de metionina foi expresso como se segue:

Ymet = metionina (g) / glicose consumida (g) * 100

2. Determinação das atividades SHMT e TAL das linhagens superexpressando ou glyAwt ou o alelo glyA* [0126] Para a determinação in vitro da atividades das enzimas serina hidroximetiltransferase (SHMT), treonina aldolase (TAL) e allotreonina aldolase (aTAL), as linhagens de E. coli foram cultivadas em meio mínimo, tal como descrito acima, e a biomassa foi colhida em fase log final por centrifugação. Os pellets foram ressuspensos em 20 mM tampão fosfato de potássio pH 7,2 frio, contendo um coquetel de inibidores de protease com EDTA. Em seguida, as células foram lisadas por batimento de cordão, com um Precellys (Bertin Technologies; 2x10s em 6500rpm) seguido por centrifugação a 12000g a 4 °C durante 30 minutos. Os sobrenadantes foram dessalinizados e utilizados para as análises enzimáticas. As

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51/63 concentrações de proteína foram determinadas usando-se reagente de ensaio de Bradford (Bradford, 1976).

[0127] A atividade SHMT foi monitorada espectrofotometricamente a 37 °C usando um ensaio enzimático Desidrogenase metileno tetrahidrofolato (MTHFD) acoplado, como descrito nas equações (1) e (2). Neste ensaio, a formação de 5,10-metenil-THF produzida por oxidação de 5,10metileno-THF produzido pela reação da enzima SHMT foi monitorado a 350 nm.

(1) L-serina + THF + 2H⁺ Glicina + 5,10-metileno-

THF (reação SHMT) (2) 5,10-metileno-THF + NADP+ 5,10-metenil-THF +

NADPH (reação MTHFD) [0128] Para a determinação da atividade SHMT, 2pg de extratos celulares brutos foram ensaiados em 50 mM de tampão bicina-KOH de pH 8,6, 10 mM de L-serina, THF 0,4 mM, 10 mM 2-mercaptoetanol, e NADP + 1,5 mM. Após incubação durante 10 minutos a 37 °C, a reação foi iniciada pela adição de extrato celular em bruto e da enzima purificada MTHFD a partir de E. coli. Em seguida, a mistura de reação foi incubada durante 10 minutos a 37 °C e a reação foi parada pela adição de 2% (v/v) de ácido perclórico. A adição de ácido perclórico destrói a piridina reduzida do nucleotídeo formado na reação (2). Após 10 minutos à temperatura ambiente, a absorbância foi lida a 350 nm. Em cada experiência, um controle sem Lserina foi executado e usado como um branco para as medições espectrofotométricas.

[0129] A atividade TAL gerando glicina mais acetaldeído foi ensaiada fluorimetricamente a 37 °C,

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52/63 utilizando o sistema de detecção 4-hidrazino-7nitrobenzofurazano (NBDH). A taxa de formação de acetaldeído foi determinada por derivatização de acetaldeído produzido com NBDH para originar um derivado de hidrazona de fluorescência a 530 nm. 200-250 pg de extratos celulares brutos foram ensaiados em 20 mM HEPES-HCl pH 8,0, 0,01 mm de fosfato de piridoxal, e 10 mM L-treonina. A reação foi iniciada pela adição do extrato celular em bruto. Após incubação a 37 °C durante 10 e 40 minutos, a reação foi interrompida pela adição de 2,5% (v/v) TCA. Após centrifugação 5 minutos a 10000g à temperatura ambiente, 0,001% (p/v) em NBDH 0,33M de acetato de sódio pH5,2 foi adicionado ao sobrenadante e as hidrazonas fluorescentes produzidas foram quantificadas após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente com um equipamento FLx800 Fluorescence Microplate Reader (Àexcitação = 485nm; Xemissão = 530nm, Biotek). Em cada experiência, um controle sem Ltreonina foi executado e utilizado como um branco para as medições fluorimétricas.

Tabela 7: Atividades serina hidroximetil transferase (SHMT) e treonina aldolase (TAL) foram determinadas para as diferentes linhagens e são dadas em mUI/mg de proteína. Os desvios padrão foram calculados com base em várias culturas independentes (N = número de replicatas).

Linhagem	SHMT	TAL	N
Linhagem 3	921 ± 1	9,2 ± 0,4	3
Linhagem 9 - alelo glyA wt	1078 ± 55	9,8 ± 0,8	3
Linhagem 10 - alelo glyA*	875 ± 30	4,6 ± 0,5	3
Linhagem 11 - alelo glyA wt	3908 ± 42	50,5 ± 2,2	3
Linhagem 12 - alelo glyA*	3721 ± 46	8,7 ± 0,6	3

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53/63 [0130] Como pode ser visto na tabela 7, a atividade de TAL das linhagens de 10 e 12 (com glyA*) foram, respectivamente, cerca de 2 e 6 vezes menores do que aquela das linhagens de controle 3, 9 e de formação 11 (com glyAwt). Além disso, a mutação R235K introduzida na enzima GlyA levando a GlyA* diminuir a atividade TAL sem afetar drasticamente a sua atividade SHMT com respeito à enzima do tipo selvagem. A atenuação da atividade treonina aldolase sem afetar a atividade principal serina hidroximetiltransferase (SHMT) de GlyA é benéfica para a produção de metionina (ver rendimento metionina na tabela anterior 6).

[0131] Isto pode aumentar o fluxo de carbono a partir da serina para glicina na linhagem 10 e 12 em comparação com as linhagens 3, e 11 e está em boa concordância com os resultados da produção de metionina (Tabela 6).

EXEMPLO VI: Efeito da atenuação da atividade de serinadesaminase (SDA) sobre a produção de metionina

1. Avaliação de linhagens de produção tendo ou sdaArc (linhagem 7) ou sdaA* (linhagem 5) [0132] As linhagens foram testadas sob condições de produção em fermentadores de 2,5 L (Pierre Guerin), utilizando uma estratégia descontínua alimentada (fedbatch).

[0133] Canamicina e spectromicina foram adicionadas a uma concentração de 50 mg.L^-1 de cada meio.

[0134] Resumidamente, uma cultura de 24 horas cultivada em 10 mL de meio LB com 2,5 gL^-1 de glicose foi usada para inocular uma pré-cultura de 24 horas em meio mínimo (B1a). Estas incubações foram realizadas em frascos

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54/63 de 500 mL desconectados contendo 50 mL de meio mínimo (B1a) em um agitador rotativo (200 RPM). A pré-cultura foi crescida primeiro a uma temperatura de 30 °C e posteriormente a uma temperatura de 34 °C.

[0135] Uma terceira etapa de pré-cultura foi realizada em biorreatores (Síxfors) cheios com 200 mL de meio mínimo (B1b) e inoculada a uma concentração de biomassa de 1,2 gL^-1 com 5 mL de pré-cultura concentrada. A temperatura de pré-cultura foi mantida constante a 34 °C e o pH foi ajustado automaticamente para um valor de 6,8 usando uma solução de NH₄OH 10%. A concentração de oxigênio dissolvido foi continuamente ajustada para um valor de 30% da saturação parcial de pressão de ar com fornecimento de ar e/ou agitação. Após esgotamento da glicose a partir do meio do lote, o processo descontínuo alimentado foi iniciado com uma taxa de fluxo inicial de 0,7 mL.h^-1, aumentada exponencialmente durante 24 horas com uma taxa de crescimento de 0,13 h^-1, a fim de obter uma concentração celular final de cerca de 18 gL^-1.

Tabela 8: composição do meio mineral de lote de précultura (B1a e B1b).

Composto	Concentração B1a (g.L-1)	Concentração B1b(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.2H2O	0,0130	0,0130
CuCl2.2H2O	0,0015	0,0015
MnCl2.4H2O	0,0150	0,0150
CoCl2.6H2O	0,0025	0,0025
H3BO3	0,0030	0,0030
Na2MoO4.2H2O	0,0025	0,0025
Citrato Fe(III) H2O	0,1064	0,1064
EDTA	0,0084	0,0084
MgSO4,7H2O	1,00	1,00
CaCl2.2H2O	0,08	0,08

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55/63

Ácido cítrico	1,70	1,70
KH2PO4	4,57	4,57
K2HPO4.3H2O	2,54	2,54
(NH4)2HPO4	1,11	1,11
(NH4)2SO4	4,90	4,90
(NH4)2S2O3	1,00	1,00
Tiamina	0,01	0,01
Vitamina B12	0,01	0,01
Glicose	30,00	5,00
MOPS	30,00	0,00
NH4OH 28%	Ajustada para pH 6,8	Ajustada para pH 6,8

Tabela 9: composição do meio mineral de lote de cultura (F1)

Composto	Concentração (g.L1)
Zn(CH3COO)2.H2O	0,0104
CuCl2.2H2O	0,0012
MnCl2.4H2O	0,0120
CoCl2.6H2O	0,0020
H3BO3	0,0024
Na2MoO4.2H2O	0,0020
Citrato Fe(III) H2O	0,0424
EDTA	0,0067
MgSO4	5,00
(NH4)2SO4	8,30
Na2SO4	8,90
(NHJ2S2O3	24,80
Tiamina	0,01
Glicose	500,00
Vitamina B12	0,01
NH4OH 28%	Ajustada para pH 6,8

Tabela 10: composição do meio mineral de lote de cultura (B2).

Composto	Concentração (g.L1)
Zn(CH3COO)2.2H2O	0,0130
CuCl2.2H2O	0,0015
MnCl2.4H2O	0,0150
CoCl2.6H2O	0,0025
H3BO3	0,0030

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56/63

Na2MoO4.2H2O	0,0025
citrato Fe(III)H2O	0,1064
EDTA	0,0084
MgS2O3.6H2O	1,00
CaCl2.2H2O	0,08
Ácido cítrico	1,70
KH2PO4	2,97
K2HPO4.3H2O	1,65
(NH4)2HPO4	0,72
(NH4)2S2O3	3,74
Tiamina	0,01
Vitamina B12	0,01
Biotina	0,10
Glicose	10
NH4OH 28%	Ajustada para pH 6,8

Tabela 11: composição do meio de cultura descontínuo alimentado (F2).

Composto	Concentração (g.L1)
Zn(CH3COO)2.2H2O	0,0104
CuCl2.2H2O	0,0012
MnCl2.4H2O	0,0120
CoCl2.6H2O	0,0020
H3BO3	0,0024
Na2MoO4.2H2O	0,0020
Citrato Fe(III)H2O	0,0524
EDTA	0,0067
MgS2O3.6H2O	10,20
(NHJ2S2O3	55,50
Tiamina	0,01
Vitamina B12	0,01
Biotina	0,10
Glicose	500

[0136] Subsequentemente, fermentadores de 2,5 L (Pierre Guerin) foram cheios com 600 ml de meio mínimo (B2) e foram inoculados a uma concentração de biomassa de 2,1 gL^-1 com um volume de pré-cultura variando entre 55 e 70 mL.

[0137] A temperatura da cultura foi mantida constante a 37 °C e o pH foi mantido no valor de trabalho

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57/63 (6,8) por adição automática de soluções NH₄OH (NH4OH a 10% durante 9 horas e 28%, até ao final da cultura). A taxa de agitação inicial foi fixada em 200 RPM durante a fase de lote e foi aumentada até 1000 RPM durante a fase de processo descontinuo alimentado. A taxa de fluxo de ar inicial foi fixada em 40 NL.h^-1 durante a fase de lote e foi aumento de

100 NL.h^-1 no início da fase de processo descontinuo alimentado.

A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em valores entre 20 e

40%, preferencialmente de saturação a

30%, aumentando-se a agitação.

[0138]

Quando a massa celular atingiu uma concentração próxima a 5 gL ¹, o processo descontinuo alimentado foi iniciado com uma taxa de fluxo inicial de 5 mL.h^-1. A solução de alimentação foi injetada com um perfil de sigmóide com uma taxa de fluxo crescente que atingiu 24 mL.h^-1 depois de horas

As condições precisas de alimentação foram calculados pela equação:

p1 +

P ² ₊ e -p 3(‘-p⁴) onde Q (t) é a taxa de fluxo de alimentação em mL.h^-1 para um volume do lote de 600 mL com p1 = 1,80, p2 = 22,40 p3

0,270, P4

6,5.

[0139]

Após processo descontinuo alimentado por 26 horas, a bomba de solução de alimentação foi parada e a cultura foi parada após esgotamento da glicose.

[0140]

Os aminoácidos extracelulares foram quantificados por

HPLC após derivatização OPA/Fmoc e outros metabólitos foram analisadas utilizando HPLC com detecção refractométrica (ácidos orgânicos e glicose) e GC-MS após sililação.

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58/63

Tabela 12: produção de metionina máxima (Y_{met max}) em % g de g por metionina de glicose produzida em cultura descontínua alimentado por linhagem. Para a definição de rendimento metionina/glicose ver abaixo. SD indica o desvio padrão para os rendimentos o qual foi calculado com base em várias replicatas (n = número de replicatas).

Linhagem	Ymet max	SD	N
Linhagem 7 - alelo sdaArc	22,4	0,2	2
Linhagem 5 - alelo sdaA*	23,9	nd	1

[0141] Como pode ser visto na tabela 12, o rendimento de metionina/glicose (Ymet) é aumentado após a expressão do alelo sdaA* em comparação com a expressão de sdaAwt. A atenuação da atividade de serina-desaminase da enzima sdaA disponibiliza um aumento da produção de metionina pela serina.

[0142] O volume do fermentador foi calculado adicionando ao volume inicial da quantidade de soluções adicionado para regular o pH e para alimentar a cultura e subtraindo o volume utilizado para a amostragem e perdido por evaporação.

[0143] O volume do processo descontinuo alimentado foi seguido continuamente por pesagem do estoque de alimentação. A quantidade de glicose injetada foi então calculada com base no peso do injetado, da densidade da solução e da concentração de glicose determinada pelo método de Brix ([Glicose]).

[0144] O rendimento de metionina foi expresso como segue:

Y_met = metionina_t * V_t - metionina₀ * V₀ x 100/glicose consumida_t

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59/63 [0145] O rendimento máximo obtido durante a cultura foi apresentado aqui para cada linhagem, onde metionina₀ e metionina_t, respectivamente, representam as concentrações iniciais e finais de metionina e V0 e VT representam os volumes inicial e no instante t.

[0146] A glicose consumida foi calculada como se segue:

volume de alimentação_t = peso de alimentação₀ -peso de alimentação_t /densidade da solução de alimentação

Injetado Glicose_t = volume_t de alimentação * [Glicose]

Glicose_t consumida = [Glicose]₀ * V₀ + Glicose Injetada - [Glicose]residual * Vt com [Glicose]0, [Glicose], [Glicose]residual sendo, respectivamente, as concentrações inicial, de alimentação e a concentração de glicose residual.

2. Determinação da atividade de serina desaminase (SDA) nas linhagens 5 e 7 [0147] Para a determinação in vitro da atividade de SDA, linhagens de E. coli foram cultivadas em meio mínimo, tal como descrito acima, e colhidas por centrifugação. Os pellets foram suspensos em tampão glicilglicina 50 mM frio (pH 8) com 3 mM FeSO₄, 30 mM DTT e um coquetel de inibidores de protease livre de EDTA. Em seguida, as células foram lisadas por batimento de cordão, com um equipamento Precellys (Bertin Technologies; 2x10s em 6500rpm) seguido por centrifugação a 12000g (4 °C) durante 30 minutos. Os sobrenadantes não foram dessalinizados e foram utilizados para análise enzimática. As concentrações de proteína foram

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60/63 determinadas usando-se reagente de ensaio de Bradford (Bradford, 1976).

[0148] Para a determinação da atividade SDA, 100pg de extratos celulares brutos foram ensaiados em tampão de glicilglicina 50 mM (pH 8) com 3 mM FeSO₄, 30 mM DTT e 50 mM L-serina. A reação foi iniciada pela adição dos extratos celulares brutos. Após incubação a 37 °C durante 5 e 20 minutos, 0,4 ml de tolueno foi adicionado e a reação foi parada com 2-4-dinitrofenilhidrazina em HCl. Após homogeneização, a preparação da mistura foi centrifugada por 5 minutos a 3500rpm em temperatura ambiente e a fase superior foi tratada com 10% (p/v) de carbonato de sódio. Após homogeneização, a preparação da mistura foi centrifugada por 1 minuto a 3500 rpm em temperatura ambiente e a fase inferior foi tratada com 1,5 M de NaOH. Após a incubação por 10 minutos, a quantidade de piruvato produzido foi determinada espectrofotometricamente a 540 nm através da medição da cor da hidrazona ceto-ácido na solução alcalina. A intensidade da cor não se alterou dentro de um período de 15 minutos. Em cada experiência, um controle sem L-serina foi executado e utilizado como um branco para as medições espectrofotométricas.

Tabela 13: As atividades serina desaminase (SDA) foram determinadas nas culturas acima descritas e foram dadas em mUI/mg de proteínas. Os desvios padrão foram calculados com base em várias culturas independentes (N = número de replicatas).

Linhagem	SDA	N
Linhagem 7 - alelo sdaArc	1517 ± 142	2
Linhagem 5 - alelo sdaA*	12,4	1

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61/63 [0149] Como pode ser visto na tabela 13, a atividade SDA da linhagem 5 é mais de 100 vezes menor do que a da linhagem de tipo selvagem 7. Esta diminuição significativa da atividade SDA foi correlacionada com um aumento da produção de metionina (ver tabela 12).

[0150] É importante notar que existe uma atividade residual serina desaminase com o sdaA*, isto pode ser importante para a fisiologia da célula.

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Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para a produção de metionina, seus precursores ou derivados S-acil metionina (SAM) e N-acil metionina (NAM) a partir de um processo de fermentação caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

   - cultivar um microrganismo modificado que super expressa alelos de homoserina succiniltransferase com sensibilidade de retroalimentação à S-acil metionina (SAM) e/ou metionina reduzida em um meio de cultura apropriado que compreende uma fonte de carbono, uma fonte de enxofre e uma fonte de nitrogênio, e

   - recuperar a metionina e/ou os seus metabólitos que são parte da via metabólica metionina específica ou derivados destes metabólitos a partir do meio de cultura, em que o referido microrganismo é modificado pela mutação da sequência do gene serina desaminase (sdaA) na posição 158 com um nucleotídeo G quando comparado com a forma selvagem do gene sdaA da E. coli de SEQ ID NO:21, assim, aumentando a disponibilidade de serina no microrganismo, em que a expressão do gene sdaA é atenuada pela supressão parcial ou completa da expressão do referido gene, em que a referida supressão é selecionada do grupo que consiste em uma deleção do todo ou de parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma deleção na região de codificação do gene ou a troca do promotor de tipo selvagem mais fraco por um promotor natural ou sintético, pela inibição completa do referido gene ou substituição por um gene marcador de seleção, em que preferencialmente a atenuação do referido gene é

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2. 2/5 essencialmente a supressão completa do gene pela substituição por um gene marcador de seleção.

   2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a produção de glicina a partir de treonina é reduzida pela supressão parcial ou completa da expressão do gene, em que a referida supressão é selecionada do grupo que consiste em uma deleção do todo ou de parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma deleção na região de codificação do gene ou a troca do promotor de tipo selvagem mais fraco por um promotor natural ou sintético, pela inibição completa do referido gene ou pela substituição por um gene marcador de seleção.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a atividade de enzimas que transformam treonina em glicina é reduzida pela supressão parcial ou completa da expressão do gene, em que a referida supressão é selecionada do grupo que consiste em uma deleção do todo ou de parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma deleção na região de codificação do gene ou a troca do promotor de tipo selvagem mais fraco por um promotor natural ou sintético, pela inibição completa do referido gene ou pela substituição por um gene marcador de seleção.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos seguintes genes é atenuada: treonina aldolase (ItaE), 2-amino 3-cetobutirato-CoA-liase (kbl), treonina aldolase (glyA)ou treonina desidrogenase (tdh), em que a expressão

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   3/5 do gene é atenuada pela supressão parcial ou completa da expressão do referido gene, em que a referida supressão é selecionada do grupo que consiste em uma deleção do todo ou de parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma deleção na região de codificação do gene ou a troca do promotor de tipo selvagem mais fraco por um promotor natural ou sintético, pela inibição completa do referido gene ou substituição por um gene marcador de seleção.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma enzima GlyA mutante é expressa e que esta tem uma atividade treonina aldolase atenuada, enquanto a atividade de serina hidroximetil transferase da referida enzima GlyA é mantida, em que a expressão do gene é atenuada pela supressão parcial ou completa da expressão do referido gene, em que a referida supressão é selecionada do grupo que consiste em uma deleção do todo ou de parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma deleção na região de codificação do gene ou a troca do promotor de tipo selvagem mais fraco por um promotor natural ou sintético, pela inibição completa do referido gene ou substituição por um gene marcador de seleção.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida enzima GlyA possui pelo menos uma das seguintes alterações de aminoácidos na sua sequência polipeptídica: T128S, T224S, T225S, T226S, T227S, T230S, R235K, quando comparada com a forma selvagem da enzima GlyA de E. coli de SEQ ID NO:22.

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   4/5
7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o gene endógeno glyA foi eliminado do microrganismo.
8. 8. Microrganismo modificado caracterizado pelo fato de compreender:

   - uma deleção do gene metJ,

   - expressão de um alelo metA com sensibilidade de retroalimentação à S-adenosil-metionina (SAM) e/ou metionina reduzida,

   - expressão atenuada do gene serina desaminase (sdaA) devido a modificação do microrganismo pela mutação da sequência do gene sdaA na posição 158 com um nucleotídeo G quando comparado com a forma selvagem do gene sdaA da E. coli de SEQ ID NO:21, e, opcionalmente, pelo menos uma das seguintes modificações:

   - a expressão de pelo menos um dos seguintes genes é atenuada: treonina aldolase (ItaE), 2-amino 3-cetobutiratoCoA-liase (kbl), treonina aldolase (glyA)ou treonina desidrogenase (tdh);

   - a expressão de uma enzima GlyA mutante é expressa e que esta tem uma atividade treonina aldolase atenuada, enquanto a atividade de serina hidroximetil transferase da referida enzima GlyA é mantida;

   - a referida enzima GlyA possui pelo menos uma das seguintes alterações de aminoácidos na sua sequência polipeptídica: T128S, T224S, T225S, T226S, T227S, T230S, R235K, quando comparada com a forma selvagem da enzima GlyA de E. coli de SEQ ID NO:22; and

   - deleção do gene endógeno glyA do microrganismo,

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   5/5 em que a expressão de um gene é atenuada pela supressão parcial ou completa da expressão do referido gene, em que a referida supressão é selecionada do grupo que consiste em uma deleção do todo ou de parte da região promotora necessária para a expressão do gene, uma deleção na região de codificação do gene ou a troca do promotor de tipo selvagem mais fraco por um promotor natural ou sintético, pela inibição completa do referido gene ou substituição por um gene marcador de seleção.