KR20120114325A - 메티오닌 생산을 위한 균주 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 트레오닌의 변환이 약화된 변형된 균주를 사용하는 메티오닌 생산 방법에 관한 것이다. 이는 트레오닌의 글리신으로의 변환을 감소시킴으로써 및/또는 트레오닌의 α-케토부티레이트로의 변환을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 또한 본 발명은 트레오닌의 변환이 약화된 변형된 균주에 관한 것이다.
Description
발명의 분야
본 발명은 트레오닌의 변환이 약화된 변형된 균주를 사용하는 메티오닌 생산 방법에 관한 것이다. 이는 트레오닌의 글리신으로의 분해를 감소시킴으로써 및/또는 트레오닌의 α-케토부티레이트로의 변환을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 또한 본 발명은 트레오닌의 변환이 약화된 변형된 균주에 관한 것이다.
발명의 배경
시스테인, 호모시스테인, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌과 같은 황-함유 화합물이 세포 대사에 중요하고, 식품 또는 사료 첨가물 및 약제로서 사용되도록 공업적으로 생산된다. 특히, 동물이 합성할 수 없는, 필수 아미노산인 메티오닌은 다수의 신체 기능에서 중요한 역할을 한다. 단백질 생합성에서의 역할과는 별개로, 메티오닌은 트랜스메틸화 및 셀레늄 및 아연의 생체이용률에서 수반된다. 또한 메티오닌은 알레르기 및 류머티스성 열과 같은 장애의 치료법으로서 직접적으로 사용된다. 그럼에도 불구하고, 생산된 메티오닌 대부분은 동물 사료에 첨가된다.
BSE 및 조류 독감(chicken flu)으로 인해 동물에서 유래된 단백질을 사용하는 것이 감소되면서, 순수한 메티오닌에 대한 수요가 증가되었다. 화학적으로, D,L-메티오닌이 통상적으로 아크롤레인, 메틸 메르캅탄 및 시안화수소로부터 생산된다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어 닭 사료 첨가제에서와 같이 (문헌 [Saunderson C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633]), 라세미 혼합물은 순수한 L-메티오닌만큼 성능이 좋지 않다. 예를 들어 N-아세틸-D,L-메티오닌의 아실라제(acylase) 처리를 통해, 라세미 메티오닌으로부터 순수한 L-메티오닌을 생산할 수 있고, 이는 생산 비용을 극적으로 증가시킨다. 순수한 L-메티오닌에 대한 증가하고 있는 수요가 환경 문제와 연관되어 미생물에 의한 메티오닌 생산을 매력적이게 한다.
메티오닌 생합성은 호모세린, 시스테인 및 C1 단위 생산에 좌우된다. 호모세린은 아스파르테이트의 유도체이고, 메티오닌에 탄소 골격을 제공한다. 호모세린은 또한 트레오닌으로 변환될 수 있고, 차례로 이는 (i) 이소류신의 전구체이고, 글리신 (ii)로 또한 변환될 수 있다. 이러한 2가지 반응이 트레오닌을 소비하고, 더 많은 호모세린을 트레오닌 경로로 끌어들여서, 메티오닌 경로로의 유입을 감소시킨다.
(i) 이소류신의 생산을 위해, 트레오닌이 α-케토부티레이트로 탈아미노화고, 이러한 반응은 유전자 ilvA (EC 4.3.1.19, 문헌 [Ramakrishnan et al., 1965, J Bacteriol, 89:661]) 및 tdcB (EC 4.3.1.19, 문헌 [Goss et al., 1988, J Bacteriol, 170:5352])에 의해 각각 코딩되는 트레오닌 데아미나제(deaminase) 또는 트레오닌 데히드라타제(dehydratase)에 의해 촉매된다. sdaA (EC 4.3.1.17; 문헌 [Su et al. 1989, J Bacteriol, 171:5095]) 및 sdaB (EC 4.3.1.17, 문헌 [Su and Newman, 1991, 173:2473])에 의해 코딩되는 세린 데아미나제가 약간의 트레오닌 데아미나제 활성을 코딩하는 것으로 또한 공지되어 있다.
(ii) 트레오닌 글리신 변환을 위한 2가지 경로가 이. 콜라이 내에 존재한다:
(A) 트레오닌이 트레오닌 데히드로게나제(dehydrogenase) (Tdh; E.C. 1.1.1.103) 및 2-아미노-3-케토 부티레이트-coA-리아제(lyase) (Kbl; E.C. 2.3.1.29)에 의해 촉매되는 2개의 연속적인 반응에 의해 글리신으로 변환될 수 있다 (문헌 [Boylan S.A. et al., 1981, Journal of Biological Chemistry, 256, 4, pp 1809-1815]; [Mukherjee J.J. et al., 1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30, pp 14441-14447]). 이러한 반응들에서 아세틸-coA 분자 및 NADH 분자가 각각 생성된다. (문헌 [Komatsubara S. et al., 1978, Journal of Bacteriology, 1981, 135, pp 318-323]).
(B) 또한 트레오닌이 트레오닌 알돌라제(aldolase)에 의해 촉매되는 레트로알돌 메카니즘을 통해 직접적으로 글리신으로 변환될 수 있다. 이러한 반응에서 아세트알데히드 및 글리신이 생성된다 (문헌 [Plamann M.D. et al., 1983, Gene, 22, 1, pp 9-18]). 하기의 유전자들에 의해 이. 콜라이 내의 트레오닌 알돌라제 활성을 보유하는 효소들이 코딩된다: ltaE (문헌 [Liu JL et al., 1998, European Journal of Biochemistry, 255, 1, pp 220-226]), kbl (문헌 [Markus J.P. et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1164, pp 299-304]) 및 glyA (문헌 [Schirch V. et al., 1968, Journal of Biological Chemistry, 243, pp 5561]; [Schirch V. et al., 1985, Journal of Bacteriology, 163, 1, pp 1-7]).
LtaE는 트레오닌의 분해로 아세트알데히드 및 글리신이 형성되는 것에서 수반되는 것으로 생각되는 특이성이 낮은 트레오닌 알돌라제이다 (문헌 [Liu JL et al., 1998, European Journal of Biochemistry, 255, 1, pp 220-226).
Kbl의 제1 활성은 2-아미노-3-케토부티레이트 CoA 리가제(ligase) (E.C 2.3.1.29)이고, 이는 2-아미노-3-케토부티레이트의 탈아세틸화로 글리신 및 아세틸-코엔자임 A를 형성하는 것으로 이루어진다 (문헌 [Mukherjee J.J. et al., 1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30, pp 14441-14447]). 이는 TAL 활성을 지니는 것으로 나타났고, 이러한 활성은 이를 트레오닌 분해를 위한 만능 효소이게 한다 (문헌 [Markus J.P. et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1164, pp 299-304]).
GlyA의 제1 활성은 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT) (E.C. 2.1.2.1)이다. 이는 아미노산 세린 및 테트라히드로폴레이트 (THF)의 글리신 및 5,10 메틸렌-THF로의 전환을 촉매한다 (리뷰를 위해, 문헌 [Schirch V. et al., 2005, Current opinion in Chemical biology, 9, pp 482-487]). GlyA에 의해 촉매되는 다른 제2 활성들 중에서 (리뷰를 위해, 문헌 [Schirch L., 2006, Advances in enzymology and related areas of molecular biology, 53, pp 83-112]), 트레오닌 알돌라제 (TAL)만이 생리학적으로 관련이 있는 것으로 보인다. GlyA가 결정화되었고 (문헌 [Scarsdale et al., 2000, Journal of Molecular Biology, 296, pp 155-168]), 기질 특이성의 기원을 해명하도록 연구가 이루어졌다 (문헌 [Angelaccio S. et al., 1992, Biochemistry, 31, pp 155-162]). 안젤라시오(Angelaccio) 등은 활성 부위에 인접한 모든 트레오닌을 알라닌으로 돌연변이시켰고, 돌연변이 T226A가 트레오닌의 Km을 1.8배만큼 증가시켰고, TAL 활성을 정량 한계보다 낮은 수준으로 감소시킨 한편, THF에 대한 Km 또는 세린에 대한 Km은 변형시키지 않았음을 주목하였다. 그럼에도 불구하고, SHMT 반응에 대한 kcat이 32배만큼 감소되었기 때문에, 이러한 돌연변이는 SHMT 활성에 대한 강한 효과가 있다.
개선된 수율을 위해 변형된 메티오닌 생산용 균주가 현재 당업계에 광범위하게 개시되어 있다. 유전자들이 다수의 다른 경로에서 수반되면서 메티오닌 생합성 경로가 특히 복잡한 것으로 현재 이해된다. 따라서, 언뜻 보기에는 메티오닌 합성을 촉진하는데 이롭기 쉬운 유전자를 강화 또는 약화시키는 것이 반대의 결과로 귀결될 수 있다. 트레오닌 소비에서 수반되는 유전자가 C1 생산에서 수반되는 것으로 또한 공지된다는 것이 공지되어 있다.
트레오닌 분해에서 수반되는 단백질의 활성 억제 또는 발현 약화가 이미 여러 연구에서 개시되어 있다. 문헌 [Simic et al., 2002, Applied and Environmental microbiology, 68(7), pp 3321-3327]에는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서의 트레오닌 생산을 강화하기 위한 GlyA 단백질의 트레오닌의 알돌 분해 활성의 약화가 개시되어 있다. 문헌 [Martinez-Force et al., 1994, Biotechnology Progress, 10(4), pp 372-376]에는, 트레오닌 생산을 강화하기 위한 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 ilv1 유전자의 결실이 개시되어 있다. 또한, 이러한 연구에서, 저자는 트레오닌 및 메티오닌 축적과 트레오닌 데아미나제 활성에서의 감소 사이에 상관관계가 없음을 나타냈다. 문헌 [Liu et al., 1998, European Journal of Biochemistry, 255(1), pp 220-226]에는, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)으로부터의 LtaE 효소의 특성화 및 세포 성장에서의 그의 역할이 상술되어 있다. 마지막으로, 문헌 [Lee et al., 2007, Molecular Systems Biology, 3(149), pp 1-8]에는, 트레오닌 생산을 강화하기 위한 tdh 유전자의 결실 및 ilvA 유전자의 돌연변이가 개시되어 있다.
이러한 연구 모두는 전적으로 트레오닌 생산을 지향한다. 종래 기술에서는 메티오닌 생합성을 개선시키기 위한 해법으로서 트레오닌 소비를 방지하는 것이 한번도 고려되지 않았다.
메티오닌 대사 경로의 복잡성에도 불구하고, 본 발명가들은 트레오닌 변환에 대해 작용함으로써 메티오닌 생산을 증가시키기 위한 방법을 발견하였다.
발명의 간단한 설명
본 발명은
- 변형된 미생물을 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계, 및
- 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계
를 포함하고, 이때 미생물이 트레오닌의 메티오닌 이외의 화합물로의 변환을 감소시키는 방식으로 변형된 것인, 발효 공정에서의 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체의 생산 방법에 관한 것이다.
특히, 트레오닌의 글리신 또는 이소류신으로의 변환이 감소된다.
또한 본 발명은 메티오닌 생산의 개선을 위한 기타 유전자 변형과 조합되어 트레오닌의 메티오닌 이외의 화합물로의 변환이 감소된, 개선된 메티오닌 생산을 위해 변형된 미생물에 관한 것이다.
트레오닌으로부터의 글리신 생산은, 특히 트레오닌을 글리신으로 변환시키는 효소의 활성을 감소시킴으로써, 감소된다. 한 특정 실시양태에서, 트레오닌 알돌라제 활성이 약화된 돌연변이체 GlyA 효소가 발현되는 한편, 상기 효소 GlyA의 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 활성은 유지된다.
트레오닌으로부터의 이소류신의 생산은 특히 트레오닌의 알파-케토부티레이트로의 탈아미노화 및/또는 탈수를 감소시킴으로써 감소된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은
- 변형된 미생물을 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계, 및
- 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계
를 포함하고, 이때 미생물이 트레오닌의 메티오닌 이외의 화합물로의 변환을 감소시키는 방식으로 변형된 것인, 발효 공정에서의 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 메티오닌의 전구체는 메티오닌 특이적 대사 경로의 일부분인 대사산물로 정의되거나, 또는 이러한 대사산물로부터 유도될 수 있다. 메티오닌의 유도체는 S-아실 메티오닌 및 N-아실 메티오닌과 같이 메티오닌 변환 및/또는 분해 경로로부터 유래된다. 특히, 이러한 생성물은 S-아데노실-메티오닌 (SAM) 및 N-아세틸메티오닌 (NAM)이다. 특히 NAM은 단리되어 탈아실화에 의해 메티오닌으로 변환될 수 있는 용이하게 회수가능한 메티오닌 유도체이다.
"배양 배지로부터의 메티오닌을 회수함"이라는 구절은 메티오닌, 그리고 가능하게는 SAM 및 NAM 및 유용할 수 있는 모든 기타 유도체를 회수하는 작용을 가리킨다.
용어 "발효 공정", "배양" 또는 "발효"는 단순 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 함유하는 적합한 성장 배지 상에서의 박테리아의 성장을 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다.
"적합한 배양 배지"는 미생물의 배양 및 성장에 적합한 배지이다. 이같은 배지는 배양되는 미생물에 따라 미생물 발효 업계에 주지되어 있다.
용어 "미생물"은 박테리아, 효모 또는 진균을 가리킨다. 우선적으로, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 중에서 선택된다. 더욱 우선적으로, 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 종이다. 더욱 더 우선적으로, 미생물은 에스케리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종이다.
용어 "변형된 미생물"은 개선된 메티오닌 생산을 위해 변형된 미생물이고, 메티오닌의 생산 수율을 개선시키기 위한 목적으로 유전적으로 변형된 미생물을 가리킨다. 본 발명에 따르면, "개선된" 또는 "개선시키다"는 미새물에 의해 생산되는 메티오닌의 양, 특히 메티오닌 수율 (탄소 공급원 g/몰 당 생산된 메티오닌 g/몰의 비율)이 상응하는 변형되지 않은 미생물과 비교하여 변형된 미생물에서 더 높다는 것을 의미한다. 일반적인 변형에는 형질전환 및 재조합에 의해 미생물 내로 유전자 결실을 도입하는 것, 유전자 교체, 및 이종 유전자의 발현을 위한 벡터 도입이 포함된다.
본 발명에 따르면, 이러한 방법에서 사용되는 변형된 미생물은 변형되지 않은 미생물과 비교하여 한편으로는 개선된 메티오닌 생산을 위한 변형을, 다른 한편으로는 트레오닌으로부터의 메티오닌 이외의 화합물의 생산 감소를 위한 변형을 포함한다.
"메티오닌 이외의 화합물"이라는 구절은 특히 글리신 및 이소류신을 가리킨다.
미생물에서의 메티오닌 생산에 수반되는 유전자가 당업계에 공지되어 있고, 이는 메티오닌 특이적 생합성 경로에서 수반되는 유전자, 뿐만 아니라 전구체를 제공하는 경로에서 수반되는 유전자 및 메티오닌 소비 경로에서 수반되는 유전자를 포함한다.
효율적인 메티오닌 생산은 메티오닌 특이적 경로 및 전구체를 제공하는 여러 경로의 최적화를 필요로 한다. 메티오닌 생산 균주는 특허 출원 WO 2005/111202, WO2007/077041 및 WO2009/043803에서 기술되었고, 본 출원에 참고로 포함된다.
자신의 억제제인 SAM 및 메티오닌에 대한 피드백(feed-back) 감수성이 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 대립유전자들을 과다발현하는 메티오닌 생산 균주가 특허 출원 WO 2005/111202에 기술되어 있다. 이 출원은 이러한 대립유전자들을 특허 출원 JP 2000/157267에서 시사된 바와 같이 메티오닌 레귤론(regulon)의 하향조절을 담당하는 메티오닌 억제인자 MetJ (진뱅크(GenBank) 1790373)의 결실과 조합하는 것을 또한 기술한다. 또한, 이러한 2가지 변형을 아스파르토키나제(aspartokinase)/호모세린 데히드로게나제의 과다발현과 조합하는 것이 특허 출원 WO 2005/111202에 기술되어 있다.
유전자 cysE, metH 및 metF의 과다발현이 WO 2007/077041에서 제안되었다.
메티오닌 생산을 개선하기 위해, 미생물이 하기를 나타낼 수 있다:
- 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 증가:
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 주변세포질 술페이트 결합 단백질을 코딩하는 cysP,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 술페이트 ABC 수송체의 성분을 코딩하는 cysU,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 막에 결합된 술페이트 수송 단백질을 코딩하는 cysW,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 술페이트 퍼미아제(permease)를 코딩하는 cysA,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, O-아세틸 세린 술프히드랄라제(sulfhydralase)를 코딩하는 cysM,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 술파이트 리덕타제(reductase)의 알파 및 베타 서브유닛에 의해 각각 코딩되는 cysI 및 cysJ. 바람직하게는, cysI 및 cysJ가 함께 과다발현된다,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 아데닐릴술페이트 리덕타제를 코딩하는 cysH,
ㆍ WO2007/077041에 기술된 바와 같은, 세린 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 cysE,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 테트라히드로폴레이트 의존적 아미노메틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 gcvT,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 아미노에틸 기의 캐리어를 코딩함으로써 글리신 절단에서 수반되는 gcvH,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 글리신 데히드로게나제를 코딩하는 gcvP,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 lpd,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 포스포글리세레이트 데히드로게나제를 코딩하는 serA,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 포스포세린 포스파타제(phosphatase)를 코딩하는 serB,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 serC,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 glyA,
ㆍ WO2007/077041에 기술된 바와 같은, 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 metF,
ㆍ WO2005/111202에 기술된 바와 같은, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 metA 대립유전자,
ㆍ WO2009/043803 및 WO2005/111202에 기술된 바와 같은, 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제를 코딩하며 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 thrA 또는 thrA 대립유전자,
ㆍ WO2007/077041에 기술된 바와 같은, B12-의존적 호모시스테인-N5-메틸테트라히드로폴레이트 트랜스메틸라제(transmethylase)를 코딩하는 metH,
- 및/또는 하기의 유전자들 중 하나 이상의 발현 억제:
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 피루베이트 키나제를 코딩하는 pykA,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 피루베이트 키나제를 코딩하는 pykF,
ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 포르밀테트라히드로폴레이트 데포르밀라제(deformylase)를 코딩하는 purU.
본 발명에 따른 미생물이 본원에 참고로 포함된 특허 출원 WO2004/076659에 기술된 바와 같은 O-숙시닐-호모세린으로부터의 호모시스테인의 생산을 위해 H2S를 우선적으로 또는 배타적으로 사용하는 변경된 metB 대립유전자를 사용함으로써 메티오닌 생산을 증가시키기 위해 추가로 변형될 수 있다.
당업자는 메티오닌 생산을 최적화하기 위해 기타 유전자들의 변형이 필요할 수 있음을 알 것이다. 이러한 유전자들이 WO2007/077041 및 WO2007/020295에서 확인되었다.
상기 언급된 메티오닌 생산에 관한 특허 및 특허 출원에 대한 모든 참고는 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 첫번째 측면에서, 트레오닌을 글리신으로 변환시키는 효소의 활성을 약화시킴으로써 트레오닌으로부터의 글리신 생산이 감소된다.
용어 "감소된", "약화된"은 본문에서 상호교환가능하게 사용되고, 의미가 유사하다. 본문에서, 이러한 용어들은 효소 활성 또는 유전자 발현의 부분적이거나 완전한 억제를 가리키고, 그러면 이를 '감소된' 또는 '약화된' 것으로 한다.
아미노산 서열에서 효소를 돌연변이시킴으로써, 상응하는 RNA로부터의 효소 번역을 감소시킴으로써 또는 상응하는 유전자의 발현을 감소시킴으로써 효소 활성을 감소시킬 수 있다. 번역을 감소시키기 위한 다수의 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 상응하는 메신저 RNA (문헌 [Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64]) 또는 단백질 (예를 들어 GST 태그(tag), 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))을 안정화 또는 탈안정화시키는 요소에 의해 효소 발현이 감소될 수 있다. 유전자 발현은 부분적으로 또는 완전히 감소될 수 있다. 이러한 유전자 발현 감소는 유전자 발현 억제, 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역 전체 또는 일부의 결실, 유전자의 코딩 영역에서의 결실, 또는 야생형 프로모터의 더 약한 천연 또는 합성 프로모터로의 교환일 수 있다. 우선적으로, 유전자 약화는 본질적으로 이러한 유전자의 완전한 결실이고, 이는 균주 확인, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선택 마커 유전자로 교체될 수 있다.
본 발명의 첫번째 측면에서, 변형된 미생물에서 트레오닌으로부터의 글리신 생산이 감소된다.
구체적인 측면에서, 트레오닌을 글리신으로 변환시키는 효소의 활성이 감소된다.
본 발명의 더욱 구체적인 실시양태에서, 변형된 미생물에서 하기의 유전자들 중 하나 이상의 발현이 약화된다: ltaE, kbl, glyA, tdh.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 변형된 미생물이 트레오닌 알돌라제 (TAL) 활성이 약화된 돌연변이체 GlyA 효소를 발현하는 한편, 상기 효소 GlyA의 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제 활성은 유지된다. 더욱 명확하게는, 본 발명에 따라, GlyA 효소의 폴리펩티드 서열 내에 하기의 아미노산 변화 중 하나 이상이 있을 수 있다: T128S, T224S, T225S, T226S, T227S, T230S, R235K. 가장 바람직한 아미노산 변화는 R235K이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 내인성 유전자 glyA가 미생물로부터 결실되었다.
본 발명의 두번째 측면에서, 트레오닌으로부터의 이소류신 생산이 감소되는 방식으로 미생물이 변형된다.
특히, 트레오닌의 알파-케토부티레이트로의 탈아미노화 및/또는 탈수를 감소시킴으로써 트레오닌으로부터의 이소류신 변환이 감소된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 하기 효소 활성 중 하나 이상이 약화된다: 트레오닌 데아미나제, 트레오닌 데히드라타제. 본 발명의 더욱 특정한 실시양태에서, 변형된 미생물에서 하기의 유전자 중 하나 이상이 약화된다: ilvA, tdcB, sdaA, sdaB, tdcG.
본 발명에 따라, 트레오닌으로부터의 글리신 및/또는 이소류신 생산의 감소에 더하여, 변형된 미생물 내의 세린 이용가능성이 증가될 수 있다.
'세린 이용가능성이 증가된다'라는 구절은 변형되지 않은 미생물과 비교하여 대사 경로에 이용가능한 내부 세린 풀(pool)이 증가된다는 사실을 의미한다. 여러 수단에 의해 상기 증가가 수득된다: 내부 생산 증가, 분해 감소, 외부로의 수송 감소, 및 당업자에게 공지된 모든 기타 경로.
특히, 유전자 serA, serB, serC 중 하나 이상의 발현을 증가시킴으로써 세린 생산이 미생물에서 증가될 수 있다. 또한, 세린 데아미나제 활성이 있는 효소를 코딩하는 유전자 sdaA 또는 sdaB 중 하나 이상의 활성을 약화시킴으로써 세린 분해가 감소될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, sdaA 유전자는 위치 158에 구아닌 대신 티미딘 뉴클레오티드를 갖는다.
본 발명의 더욱 특정한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은, 트레오닌 알돌라제 활성이 감소된 glyA 대립유전자의 발현이 증가될 수 있다.
본 발명의 설명에서, 이. 콜라이에서의 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 유전자 및 단백질이 확인된다. 그러나, 달리 명시되지 않는 한, 이러한 명칭의 사용은 본 발명에 따라 더욱 일반적인 의미를 지니고, 다른 생물, 더욱 특히 미생물에서의 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포괄한다.
공지된 유전자에 대해 진뱅크에서 제공되는 참조물을 사용하여, 당업자는 다른 생물, 박테리아 균주, 효모, 진균류, 포유동물, 식물 등 내의 등가의 유전자를 결정할 수 있다. 다른 미생물들로부터 유래된 유전자들과의 서열 정렬을 수행함으로써 결정될 수 있는 컨센서스(consensus) 서열을 사용하여, 그리고 또 다른 생물 내의 상응하는 유전자를 클로닝하기 위해 축퇴성 프로브를 디자인하여, 이러한 일상적인 작업이 유리하게 수행된다. 분자 생물학의 이러한 일상적인 방법이 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.]에서 언급되어 있다.
PFAM (정렬 및 은닉 마르코프(hidden Markov) 모델의 단백질 패밀리 데이터베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬의 대형 선집을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 가시화하는 것, 단백질 도메인을 확인하는 것, 생물들에서 분포를 평가하는 것, 다른 데이터베이스에 접근하는 것 및 공지된 단백질 구조를 가시화하는 것을 가능하게 한다.
주요 계통발생학적 계통을 나타내는 완전히 서열분석된 게놈들로부터의 단백질 서열들을 비교함으로써 COG (오르토로그성(orthologous) 단백질 군의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)가 수득된다. 각각의 COG는 3개 이상의 계통으로부터 정의되고, 이는 이전의 보존된 도메인의 확인을 허용한다.
상동성 서열 및 이들의 백분율 상동성을 확인하는 수단이 당업자에게 주지되어 있고, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 이러한 웹사이트에 지시된 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 BLAST 프로그램이 특히 이에 포함된다. 그 후, 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)을 이러한 웹사이트들에 지시된 디폴트 파라미터와 함께 사용하여, 수득된 서열을 활용 (예를 들어, 정렬)할 수 있다.
발효 공정에서의 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체의 생산 방법이 당업자에게 주지되어 있다. 공정 최적화, 예컨대 황 공급원 선택, 탄소 공급원 선택 및 질소 공급원 선택을 위해 발효 공정의 상이한 인자들을 조정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 배양 배지에 첨가된, L-메티오닌의 발효 생산에 사용된 황 공급원은 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸디술피드 및 기타 메틸-캡핑(capped) 술피드 또는 상이한 공급원들의 조합물이다.
더욱 우선적으로, 배양 배지 내의 황 공급원은 술페이트 또는 티오술페이트, 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명에 따른 용어 '탄소 공급원'은 미생물의 정상적인 성장을 지지하도록 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원을 나타내고, 이는 헥소스 (예컨대 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 모노사카라이드, 디사카라이드 (예컨대 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 올리고사카라이드, 당밀, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 이들의 조합물일 수 있다. 특히 바람직한 탄소 공급원은 글루코스이다. 또 다른 바람직한 탄소 공급원은 수크로스이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소 공급원은 재생가능한 공급 원료로부터 유래된다. 재생가능한 공급 원료는 원하는 생성물로의 변환을 허용하는 충분한 양으로 짧은 지체 시간 내에 재생될 수 있는 특정 산업 공정에 필요한 원료로 정의된다.
용어 질소 공급원은 암모늄 염 또는 암모니아 기체에 상응한다.
질소 공급원은 암모늄 또는 암모니아 형태로 공급된다.
일반적으로 발효는 하나 이상의 단순 탄소 공급원을 함유하고 필요하다면 대사산물의 생산을 위한 공동-기질을 함유하는, 사용될 미생물에 대해 개조된 적합한 배양 배지가 있는 발효기에서 수행된다.
당업자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 조건을 정의할 수 있다. 특히, 박테리아를 20℃ 내지 55℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 발효시키고, 더욱 구체적으로는 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)에 대해서는 약 30℃, 이. 콜라이에 대해서는 약 37℃에서 발효시킨다.
이. 콜라이에 대한 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 문헌 [Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270: 88-96]에서 정의된 바와 같은 배지와 조성이 동일하거나 유사할 수 있다.
씨. 글루타미쿰에 대한 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 BMCG 배지 (문헌 [Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210]) 또는 문헌 [Riedel et al., 2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583]에서 정의된 바와 같은 배지와 조성이 동일하거나 유사할 수 있다.
본 발명의 구체적인 측면에서, 무기 기질, 특히 포스페이트 및/또는 칼륨에 대해 미생물이 제한되거나 고갈되는 조건에서 배양이 수행된다.
유기체를 무기 기질 제한에 적용하는 것은 약한 성장을 여전히 허용하는 공급된 무기 화학물질의 양에 미생물 성장이 좌우되는 조건을 정의한다.
미생물을 무기 기질에 대해 고갈시키는 것은 무기 기질의 부재로 인해 미생물 성장이 완전히 정지되는 조건을 정의한다.
본 발명은 임의적으로 최종 생성물 내에 부분적으로 또는 총량으로 (0-100％) 잔존하는 발효 브로스 및/또는 바이오매스(biomass)로부터 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체를 단리하는 단계를 포함하는, 메티오닌 생산 방법에 또한 관련된다.
발효 후, L-메티오닌, 그의 전구체 또는 이로부터 유래된 화합물을 회수하고, 필요하다면 정제한다. 배양 배지 내의 메티오닌 및 N-아세틸-메티오닌과 같은 생산된 화합물의 회수 및 정제 방법이 당업자에게 주지되어 있다.
임의적으로, 바이오매스의 0 내지 100％, 우선적으로는 90％ 이상, 더욱 우선적으로는 95％, 더욱 더 우선적으로는 99％ 이상이 발효 생성물의 정제 동안 유지될 수 있다.
임의적으로, 메티오닌을 회수하기 전에, 메티오닌 유도체인 N-아세틸-메티오닌이 탈아실화에 의해 메티오닌으로 변환된다.
본 발명은
- MetJ 유전자의 결실,
- 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 대립유전자 MetA의 발현, 및
- 상기 기술된 것과 같은 변형 중 하나 이상
을 포함하는 변형된 미생물에 또한 관련된다.
본 발명은 하기 실시예에 기술된 것과 같은 변형된 미생물에 또한 관련된다.
도면
도 1은 피루베이트, 트레오닌, 이소류신 및 메티오닌을 수반하는 대사 경로를 나타낸다.
실시예
실시예 I: 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA ( pME101 - thrA *1- cysE - PgapA -metA*11)의 구축
본 출원에 참고로 포함된 특허 출원 WO2007/077041 및 WO2009/043372에 메티오닌 생산 균주가 기술되어 있다.
1. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA ( pME101 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11)의 구축
출원 WO2007/077041 및 PCT/FR2009/052520에 기술되어 있는 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11을 재조합 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF Δp y kA 내로 전기천공에 의해 도입하여, 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)을 제공하였다.
실시예 II : 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δlta E Δtdh ( pME101 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11)의 구축
본 출원에 참고로 포함된 특허 출원 WO2007077041 및 WO2009/043372에 메티오닌 생산 균주가 기술되어 있다.
1. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ ltaE :: Km 의 구축
ltaE 유전자를 불활성화시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관련 유전자 대부분을 결실시키면서 카나마이신 저항성 카세트의 삽입을 허용한다. 이러한 목적을 위해, 2개의 올리고뉴클레오티드 DltaEF 및 DltaER을 사용하였다 (웹사이트 http://ecogen.org/의 참조 서열(reference sequence)).
DltaEF (서열 1)
ggacatgccatgattgatttacgcagtgataccgttacccgaccaagccgcgccatgctcgaagcgatgatggccgccccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[서열에서
- 소문자는 ltaE 영역의 908446에서 908526까지의 서열에 대해 상동성인 영역이고,
- 대문자는 카나마이신 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역이다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]의 참조 서열)],
DltaER (서열 2)
gcgcaccagatgctgaccaatgtagccactggcaccgagaactaaaatgcgttgcggcacgtctctctccttaacgcgccCATATGAATATCCTCCTTAG
[서열에서
- 소문자는 ltaE 영역의 907446에서 907525까지의 서열에 대해 상동성인 영역이고,
- 대문자는 카나마이신 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역이다].
올리고뉴클레오티드 DltaEF 및 DltaER을 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 그 후, 수득된 PCR 생성물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA (pKD46) 내로 도입하였고, 이 균주 내에서, 발현된 레드(Red) 리콤비나제(recombinase) 효소는 상동 재조합을 허용하였다. 그 후, 카나마이신 저항성 형질전환체를 선택하고, 하기에 정의되는 올리고뉴클레오티드 ltaEF 및 ltaER로의 PCR 분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 유지된 균주를 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km으로 명명하였다.
ltaEF (서열 3)
GCCACCTGGCGCTCCTGAGCG (ltaE 영역의 907234에서 907254까지의 서열에 대해 상동성)
ltaER (서열 4)
GCTGCGCGCAATCATCAGCGG (ltaE 영역의 908603에서 908623까지의 서열에 대해 상동성).
2. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ ltaE :: Km Δtdh:: Cm 의 구축
tdh 유전자를 불활성화시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관련 유전자 대부분을 결실시키면서 클로람페니콜 저항성 카세트의 삽입을 허용한다. 이러한 목적을 위해, 2개의 올리고뉴클레오티드 DtdhF 및 DtdhR을 사용하였다 (웹사이트 http://ecogen.org/의 참조 서열).
DtdhF (서열 5)
gaaagcgttatccaaactgaaagcggaagagggcatctggatgaccgacgttcctgtaccggaactcgggcataacgatcCATATGAATATCCTCCTTAG
[서열에서
- 소문자는 tdh 영역의 3789287에서 3789366까지의 서열에 대해 상동성인 영역이고,
- 대문자는 클로람페니콜 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역이다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]의 참조 서열)],
DtdhR (서열 6)
cccagctcagaataactttcccggactggcccgaacgcatagcgtcaaagcccttctggaaatcatcgatagagaaacgatgggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[서열에서
- 소문자는 tdh 영역의 3788348에서 3788431까지의 서열에 대해 상동성인 영역이고,
- 대문자는 클로람페니콜 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역이다].
올리고뉴클레오티드 DtdhF 및 DtdhR을 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 그 후, 수득된 PCR 생성물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km (pKD46) 내로 도입하였고, 이 균주 내에서, 발현된 레드 리콤비나제 효소는 상동 재조합을 허용하였다. 그 후, 클로람페니콜 저항성 형질전환체를 선택하고, 하기에 정의되는 올리고뉴클레오티드 tdhF 및 tdhR로의 PCR 분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 유지된 균주를 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km Δtdh::Cm으로 명명하였다.
tdhF (서열 7)
GGGTAGAGAGATAATGAGAGCAGC (tdh 영역의 3788210에서 3788233까지의 서열에 대해 상동성).
tdhR (서열 8)
GCCCAGCCAAAACTGTACAG (tdh 영역의 3790719에서 3790738까지의 서열에 대해 상동성).
3. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ ltaE Δ tdh 의 구축
그 후, 카나마이신 및 클로람페니콜 저항성 카세트를 제거하였다. 카나마이신 또는 클로람페니콜 저항성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 리콤비나제 FLP를 보유하는 pCP20 플라스미드를 재조합 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA Δl t aE::Km Δtdh::Cm 내로 전기천공에 의해 도입하였다. 42℃에서의 일련의 배양 후, 카나마이신 및 클로람페니콜 저항성 카세트의 상실을 상기에서 사용된 것들과 동일한 올리고뉴클레오티드인 ltaEF / ltaER 및 tdhF / tdhR로의 PCR 분석에 의해 확인하였다. 유지된 균주를 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF -cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh로 명명하였다.
4. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ ltaE Δ tdh ( pME101 - thrA *1- cysE -PgapA-metA*11)의 구축
출원 WO2007/077041 및 PCT/FR2009/052520에 기술된 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11을 재조합 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA Δl t aE Δtdh 내로 전기천공에 의해 도입하여, 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF Δp y kA ΔltaE Δtdh (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)을 제공하였다.
실시예 III : 생산 균주의 평가
생산 균주를 소형 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 평가하였다. 5.5 ㎖ 예비배양물을 37℃에서 16시간 동안 혼합 배지 (10％ LB 배지 (시그마(Sigma) 25％) + 2.5 g/ℓ 글루코스 및 90％ 최소 배지 PC1)에서 성장시켰다. 이를 사용하여, 배지 PC1에서 OD600 0.2로 50 ㎖ 배양물에 접종하였다. 스펙티노마이신을 최종 농도 50 mg/ℓ으로 첨가하였다. 배양물의 온도는 37℃였다. 배양물이 OD600 5 내지 7에 도달했을 때, 세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였고, 기타 관련된 대사산물을 HPLC + 굴절측정 검출 (유기 산 및 글루코스) 및 실릴화 후의 GC-MS를 사용하여 분석하였다. 각각의 균주에 대해, 3회의 반복물을 제조하였다.
균주 1 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11).
균주 2 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11).
<표 1>
<표 2>
세포외 메티오닌 농도를 OPA/FMOC 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였다. 잔류 글루코스 농도를 HPLC + 굴절측정 검출을 사용하여 분석하였다. 메티오닌 수율은 하기와 같이 표현되었다:
표 2에서 볼 수 있듯이, 유전자 tdh 및 ltaE의 결실 시 메티오닌/글루코스 수율 (Ymet)이 증가된다.
실시예 IV : 하기의 실시예 V 및 VI 에서 시험된 메티오닌 생산 균주 3 내지 12의 구축
1. 프로토콜
몇몇 프로토콜이 메티오닌 생산 균주를 구축하는데 사용되었고, 하기의 예에서 기술된다.
프로토콜 1: 상동 재조합 및 재조합체의 선택에 의한 염색체 변형 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)])
특정 염색체 유전자좌에서의 대립유전자 교체 또는 유전자 파괴를 문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기술된 바와 같이 상동 재조합에 의해 수행하였다. Flp 인식 부위가 플랭킹(flanking)된, 클로람페니콜 (Cm) 저항성 cat 유전자, 카나마이신 (Km) 저항성 kan 유전자, 또는 겐타마이신 (Gt) 저항성 gm 유전자를 pKD3 또는 pKD4 또는 p34S-Gm (문헌 [Dennis & Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715]) 플라스미드를 각각 주형으로 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 사용하여, λ 레드 (γ,β,엑소) 리콤비나제를 발현하는 플라스미드 pKD46을 보유한 수용자 이. 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 항생제-저항성 형질전환제를 선택하였고, 돌연변이된 유전자좌에 대한 염색체 구조를 표 4에 열거된 적합한 프라이머로의 PCR 분석에 의해 확인하였다.
pCP20 플라스미드를 보유한 클론을 LB에서 37℃에서 배양한 후, 30℃에서 항생제 저항성의 상실에 대해 시험한 것을 제외하고는 문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기술된 바와 같이 플라스미드 pCP20을 사용하여 kan-저항성 유전자를 제거하였다. 그 후, 항생제 민감성 클론을 표 4에 열거된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다.
프로토콜 2: P1 파지 형질도입
P1 형질도입에 의해 소정의 이. 콜라이 수용자 균주에 염색체 변형을 전달하였다. 이 프로토콜은 2개의 단계로 구성된다: (i) 저항성 유전자와 관련된 염색체 변형을 함유하는 공여자 균주에 대한 파지 용해물의 제조 및 (ii) 생성된 파지 용해물에 의한 수용자 균주의 감염.
파지 용해물의 제조
- 관심 있는 염색체 변형이 있는 균주 MG1655를 밤새 배양한 배양물 100 ㎕를 10 ㎖의 LB + Km 50 ㎍/㎖ 또는 + 글루코스 0.2％ + CaCl2 5 mM에 접종한다.
- 진탕시키면서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 제조된 P1 파지 용해물 100 ㎕를 공여자 균주 MG1655 상에 첨가한다 (약 1 × 109개의 파지/㎖).
- 세포가 완전히 용해될 때까지 3시간 동안 37℃에서 진탕시킨다.
- 클로로포름 200 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱한다.
- 10분 동안 4500 g에서 원심분리하여 세포 잔해물을 제거한다.
- 상청액을 멸균 튜브로 옮긴다.
- 용해물을 4℃에서 보관한다.
형질도입
- LB 배지에 배양된 이. 콜라이 수용자 균주를 밤새 배양한 배양물 5 ㎖를 10분 동안 1500 g에서 원심분리한다.
- 세포 펠릿을 2.5 ㎖의 MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM에 현탁시킨다.
- 세포 100 ㎕를 염색체 변형 균주 MG1655의 P1 파지 용해물 100 ㎕로 감염시키고 (시험 튜브), 대조군 튜브는 P1 파지가 없는 세포 100 ㎕ 및 세포가 없는 P1 파지 100 ㎕이다.
- 진탕시키지 않으면서 30℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 각각의 튜브에 1 M 시트르산나트륨 100 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱한다.
- LB 1 ㎖를 첨가한다.
- 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 7000 rpm에서 3분 동안 원심분리한다.
- LB + Km 50 ㎍/㎖에 플레이팅한다
- 37℃에서 밤새 인큐베이션한다.
그 후, 항생제-저항성 형질전환체를 선택하고, 돌연변이된 유전자좌의 염색체 구조를 표 4에 열거된 적합한 프라이머로의 PCR 분석에 의해 확인하였다.
이하의 실시예는 하기의 표 3에 열거된 모든 균주의 구축을 설명한다.
<표 3>
2. 균주 3의 설명
메티오닌 생산자 균주 3 (표 3)의 유전자 변형은 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술되어 있고, 이들은 참고로 본 출원에 포함된다. 균주 3의 DNA 서열분석 후, 미스센스(missense) 돌연변이가 sdaA 유전자에서 예기치 않게 확인되었다. 이 돌연변이는 구조 유전자의 위치 158에 위치하고 (T158G), 이는 상응하는 단백질에서의 아미노산 변화를 생성시킨다: 류신 53 → 아르기닌. 이러한 대립유전자를 sdaA *1로 칭하였다.
3. sdaA 유전자가 변형된 균주의 구축 - 세린 분해 경로의 변형
3.1. sdaA *( T158G )를 함유하는 균주 5의 구축
균주 3에서 yobD 유전자를 결실시키기 위해, 프라이머 Ome1983-DyobD-amplif-F (서열 09) 및 Ome 1986-DyobD-amplif-R (서열 10) (표 4)을 사용하여 균주 BW25113 Δ yobD :: Km (케이오(Keio) 선집, 문헌 [Baba. et al., Mol Syst Biol., 2, 2006-0])으로부터 Δ yobD :: Km 결실을 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1을 사용하였다.
카나마이신 저항성 재조합체를 선택하였다. 프라이머 Ome 1987-DyobD-verif-F (서열 11) 및 Ome 1988-DyobD-verif-R (서열 12) (표 4)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. sdaA 유전자의 sdaA *1 대립유전자를 DNA 서열분석에 의해 또한 확인하였다. 플라스미드 pKD46의 제거 후, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 Δ yobD :: Km을 균주 4 (표 3)로 칭하였다.
그 후, 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술된 pCL1920-PgapA -pycRe-TT07을 전기천공에 의해 균주 4 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA-pycre-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc -metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 Δ yobD :: Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07을 균주 5 (표 3)로 칭하였다.
3.2. 재구축된 sdaAwt 대립유전자 ( sdaArc )를 함유하는 균주 7의 구축
유전자 sdaA 및 yobD는 이. 콜라이 염색체 상에서 서로 근접하고 (각각 40.84 min 및 41.01 min), 파지 P1이 2 min의 이. 콜라이 염색체를 패키징(packaging)할 수 있기 때문에, 유전자 sdaA 및 yobD가 공동-형질도입될 수 있다. 이에 의해, 프로토콜 2에 따라 균주 BW25113 sdaA Δ yobD :: Km (케이오 선집, 문헌 [Baba. et al., Mol Syst Biol., 2, 2006-0])으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하여 sdaA 야생형 대립유전자 및 ΔyobD :: Km 결실을 균주 3 (표 3) 내로 공동-형질도입시켰다.
카나마이신 저항성 형질도입체를 선택하였다. 프라이머 Ome 1987-DyobD-verif-F (서열 11) 및 Ome 1988-DyobD-verif-R (서열 12) (표 4)로의 PCR에 이어서 DNA 서열분석에 의해 ΔyobD::Km 결실의 존재를 확인하였다. sdaA *1 대립유전자의 sdaA 야생형 대립유전자로의 교환을 DNA 서열분석에 의해 확인하였고, sdaArc (rc는 재구축됨을 가리킴)로 칭하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc -CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11 ΔuxaCA:: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA - metA *11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC sdaArc Δ yobD :: Km을 균주 6 (표 3)으로 칭하였다.
그 후, 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술된 플라스미드 pCL1920-PgapA-pycre-TT07을 전기천공에 의해 균주 6 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycre-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 -metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC sdaArc Δ yobD :: Km pCL1920-PgapA - pycre-TT07을 균주 7 (표 3)로 칭하였다.
4. 단백질 GlyA 또는 GlyA * ( R235K )를 과다생산 하는 균주의 구축 - 트레오닌/글리신 경로의 변형
4.1. glyA 유전자의 결실에 의한 균주 8의 구축
균주 3에서 glyA 유전자를 결실시키기 위해, 프라이머 Ome 0641-DglyA R (서열 13) 및 Ome 0642-DglyA F (서열 14) (하기 참조)를 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 저항성 카세트를 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1을 사용하였다.
카나마이신 저항성 재조합체를 선택하였다. 프라이머 Ome 0643-glyA R (서열 15) 및 Ome 0644-glyA F (서열 16) (표 4)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 Δ glyA :: Km pKD46으로 칭하였다.
Ome 0641-DglyA R (서열 13)
ATGTTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCGATTATGATGCCGAACTGTGGCAGGCTATGGAGCAGGAAAAAGTACGTCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[서열에서
- 대문자 서열은 glyA 유전자의 상류의 서열 (2683451-2683529, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이고,
- 밑줄친 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 2에 상응한다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])]
Ome 0642-DglyA F (서열 14)
GCGCAGATGTCGAGAACTTTACCTTTGATGCGCTCGATAACGGCTTCATCATTGATGCTGTCCAGCACGTCACACATCCCATATGAATATCCTCCTTAG
[서열에서
- 대문자 서열은 glyA 유전자의 상류의 서열 (2682298-2682376, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이고,
- 밑줄친 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 1에 상응한다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])].
그 후, 프로토콜 2에 따라 상기 기술된 균주 MG1655 metA *11 Δ glyA :: Km pKD46으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하여 ΔglyA :: Km 결실을 균주 3 (표 3) 내로 형질도입하였다.
카나마이신 저항성 형질도입체를 선택하였다. 프라이머 Ome 0643-glyA R (서열 15) 및 Ome 0644-glyA F (서열 16) (표 4)로의 PCR에 의해 ΔglyA::Km 결실의 존재를 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ Δp y kF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 Δg l yA:: Km을 균주 8 (표 3)로 칭하였다.
4.2. glyA 를 발현하는 균주 9의 구축
에스케리키아 콜라이의 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 유전자를 과다발현시키기 위해, 플라스미드 pCC1BAC (에피센터(EpiCentre)) 및 pSCB (스트라타진(Stratagene))로부터 유래한 플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA를 구축하였다.
플라스미드 pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA를 구축하기 위해, PglyA-glyA-TTglyA 삽입물을 MG1655 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 프라이머 Ome 1162-glyAR-EcoRI-HindIII (서열 17) 및 Ome 1165-PglyAF-HindIII (서열 18)으로의 PCR에 의해 증폭시키고, 플라스미드 pSCB (스트라타진)에 클로닝하였다. 생성된 벡터를 서열분석에 의해 확인하고, pSCB-PglyA-glyA-TTglyA로 칭하였다.
그 후, 플라스미드 pSCB-PglyA - glyA-TTglyA를 HindIII로 소화시키고, 생성된 단편 HindIII-PglyA - glyA - TTglyA - HindIII을 플라스미드 pCC1BAC의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 선택된 플라스미드는 플라스미드 pCC1BAC의 lacZ 프로모터와 반대되는 배향으로 PglyA - glyA - TTglyA 삽입물을 가지며, 이를 DNA 서열분석에 의해 확인하고 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA로 칭하였다.
Ome 1162-glyAR-EcoRI-HindIII (서열 17)
ATCTAGTAAGCTTAGTGAATTCGTTACGACAGATTTGATGGCGCG
[서열에서
- 밑줄친 대문자 서열은 HindIII 및 EcoRI 제한 부위 및 여분의 염기에 대한 것이고,
- 볼드체 대문자 서열은 glyA 프로모터 서열 (2682063-2682085, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이다].
Ome 1165-PglyAF-HindIII (서열 18)
TCATCGGATCCATCAAGCTTGAAAGAATGTGATGAAGTG
[서열에서
- 밑줄친 대문자 서열은 BamHI 및 HindIII 제한 부위 및 여분의 염기에 대한 것이고,
- 볼드체 대문자 서열은 glyA 유전자의 전사 종결자 (2683744-2683762, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이다].
그 후, 상기 기술된 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA를 전기천공에 의해 균주 8 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 ΔglyA :: Km pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA를 균주 9 (표 3)로 칭하였다.
4.3. glyA *를 발현하는 균주 10의 구축
pSCB - P glyA - glyA *( R235K )- TTglyA 의 구축
플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 구축하기 위해, 플라스미드 pSCB-PglyA - glyA - TTglyA를 프라이머 Ome 1483-glyA* R R235K (서열 19) 및 Ome 1482-glyA* F R235K (서열 20)로 증폭시켰다. 모 DNA 주형을 제거하기 위해 PCR 생성물을 DpnI로 소화시켰다. 남아 있는 점착성 돌출부를 인산화시키고, 이. 콜라이 균주 내로 도입하여, 플라스미드 pSCB-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 형성시켰다. PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA 삽입물, 특히 glyA 유전자 내의 R235K (703-AAA-705) 돌연변이의 존재를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
Ome 1483 glyA* R R235K (서열 19)
CCTTTCGCCAGGATCAGGCCTCCTTTCGGACCCGCCAGGGTTTTGTGAG
[서열에서
- 대문자 서열은 glyA 유전자 (2682802-2682850, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이고,
- 볼드체 대문자는 삽입된 코돈 돌연변이 CGC-708-TTT (R235K)에 상응하며,
- 밑줄친 대문자는 StuI 제한 부위가 나타나게 하는 침묵성 점 돌연변이 (G704T)에 상응한다].
Ome 1482 glyA* F R235K (서열 20)
CTCACAAAACCCTGGCGGGTCCGAAAGGAGGCCTGATCCTGGCGAAAGG
- 대문자 서열은 glyA 유전자 (2682802-2682850, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이고,
- 볼드체 대문자는 삽입된 코돈 돌연변이 CGC-708-TTT (R235K)에 상응하며,
- 밑줄친 대문자는 StuI 제한 부위가 나타나게 하는 침묵성 점 돌연변이 (G704T)에 상응한다].
pCC1BAC - P glyA - glyA *( R235K )- TTglyA 의 구축
pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 구축하기 위해, 하기 기술된 pSCB-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA로부터 정제된 HindIII 단편 PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 플라스미드 pCC1BAC의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 선택된 플라스미드는 플라스미드 pCC1BAC의 lacZ 프로모터 배향과 비교하여 반대되는 배향으로 PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA 삽입물을 가지며, 이를 DNA 서열분석에 의해 확인하고 pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA로 칭하였다.
그 후, 상기 기술된 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 전기천공에 의해 균주 8 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA -metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA - metA *11 ΔCP4-6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA - metA *11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 Δg l yA:: Km pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 균주 10 (표 3)으로 칭하였다.
4.4. glyA 를 과다발현하는 균주 11의 구축
pCL1920 - P glyA - glyA - TTglyA 의 구축
플라스미드 pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA는 플라스미드 pCL1920 (문헌 [Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631]) 및 상기 기술된 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA로부터 유래된다.
pCL1920-PglyA - glyA - TTglyA를 구축하기 위해, pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA로부터 정제된 HindIII 단편 PglyA - glyA - TTglyA를 플라스미드 pCL1920의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 선택된 플라스미드는 플라스미드 pCL1920의 lacZ 프로모터 배향과 비교하여 반대되는 배향으로 PglyA - glyA - TTglyA 삽입물을 가지며, 이를 DNA 서열분석에 의해 확인하고 pCL1920-PglyA - glyA - TTglyA로 칭하였다.
그 후, 상기 기술된 pCL1920-PglyA - glyA - TTglyA를 전기천공에 의해 균주 8 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PglyA - glyA - TTglyA의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 ΔglyA :: Km pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA를 균주 11 (표 3)로 칭하였다.
4.5. glyA *를 과다발현하는 균주 12의 구축
pCL1920 - P glyA - glyA *( R235K )- TTglyA 의 구축
플라스미드 pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA는 플라스미드 pCL1920 (문헌 [Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631]) 및 상기 기술된 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA로부터 유래된다.
pCL1920-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 구축하기 위해, pCC1BAC-PglyA -glyA*(R235K)-TTglyA로부터 정제된 HindIII 단편 PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 플라스미드 pCL1920의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. pCL1920 플라스미드의 lacZ 프로모터 배향과 비교하여 반대되는 배향으로 PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA 삽입물을 가진 선택된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고 pCL1920-PglyA -glyA*(R235K)-TTglyA로 칭하였다.
그 후, pCL1920-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 전기천공에 의해 균주 8 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 ΔglyA :: Km pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA를 균주 12 (표 3)로 칭하였다.
<표 4>
실시예 V: GLYA * 돌연변이체 단백질의 트레오닌 알돌라제 활성 약화가 메티오닌 생산에 미치는 효과
1. glyA 또는 glyA * 대립유전자를 갖는 생산 균주의 평가
생산 균주를 소형 에를렌마이어 플라스크에서 평가하였다. 5.5 ㎖ 예비배양물을 30℃에서 21시간 동안 혼합 배지 (10％ LB 배지 (시그마 25％) + 2.5 g/ℓ 글루코스 및 90％ 최소 배지 PC1)에서 성장시켰다. 이를 사용하여, 배지 PC1 (표 5의 조성)에서 OD600 0.2로 50 ㎖ 배양물에 접종하였다. 카나마이신 및 스펙티노마이신을 50 mg/ℓ의 농도로 첨가하였고, 필요한 경우 30 mg/ℓ의 클로람페니콜을 첨가하였다. 배양물의 온도는 37℃였다. 배양물이 OD600 5 내지 7에 도달했을 때, 세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였고, 기타 관련된 대사산물을 HPLC + 굴절측정 검출 (유기 산 및 글루코스) 및 실릴화 후의 GC-MS를 사용하여 분석하였다.
<표 5>
<표 6>
세린의 글리신으로의 변환을 촉매하는 것에 더하여, GlyA 효소는 또한 L-트레오닌을 절단할 수 있다. 이는 본 발명자들에 의해 glyA 결실을 보유하는 균주로써 입증되었다. 이러한 균주는 검출가능한 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT) 및 트레오닌 알돌라제 (TAL) 활성을 더 이상 지니지 않는다 (데이터는 제시되지 않음).
표 6에서 볼 수 있듯이, glyA * 대립유전자의 발현 (균주 10) 또는 과다발현 (균주 12) 시 glyAwt (각각 glyAwt의 발현 및 과다발현에 대한 균주 9 및 11)와 비교하여 메티오닌/글루코스 수율 (Ymet)이 증가된다.
GlyA의 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT)에 영향을 미치지 않으면서 트레오닌 알돌라제 활성을 약화시키는 것이 메티오닌 생산에 이롭다 (하기 표 7의 활성 참조).
세포외 메티오닌 농도를 OPA/FMOC 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였다. 잔류 글루코스 농도를 HPLC + 굴절측정 검출을 사용하여 분석하였다. 메티오닌 수율은 하기와 같이 표현되었다:
2. glyA wt 또는 glyA * 대립유전자를 과다발현하는 균주의 SHMT 및 TAL 활성의 결정
세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT), 트레오닌 알돌라제 (TAL) 및 알로트레오닌 알돌라제 (aTAL) 활성을 시험관 내에서 결정하기 위해, 이. 콜라이 균주를 상기 기술된 바와 같은 최소 배지에서 배양하였고, 최종 로그 단계에서 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하였다. 펠릿을 EDTA가 있는 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 저온 20 mM 인산칼륨 완충제 (pH 7.2) 내에 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 프리셀라이스(Precellys) (버틴 테크놀로지스(Bertin Technologies); 6500 rpm에서 2×10s)로의 비드 비팅(bead beating)에 의해 용해시키고, 이어서 4℃에서 30분 동안 12000g에서 원심분리하였다. 상청액을 탈염시키고, 효소 분석에 사용하였다. 브래드포드(Bradford) 검정 시약 (문헌 [Bradford, 1976])을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
SHMT 활성을 식 (1) 및 (2)에 기술된 바와 같이 메틸렌 테트라히드로폴레이트 데히드로게나제 (MTHFD) 커플링 효소 검정을 사용하여 37℃에서 분광광도법에 의해 모니터링하였다. 이러한 검정에서, SHMT 효소 반응에 의해 생산된 5,10-메틸렌-THF의 산화에 의해 산출되는 5,10-메테닐-THF의 형성을 350 nm에서 모니터링하였다.
(1) L-세린 + THF + 2H+ ← → 글리신 + 5,10-메틸렌-THF (SHMT 반응)
(2) 5,10-메틸렌-THF + NADP+ ← → 5,10-메테닐-THF + NADPH (MTHFD 반응)
SHMT 활성을 결정하기 위해, 2 ㎍의 조 세포 추출물을 50 mM 바이신(Bicine)-KOH 완충제 (pH 8.6), 10 mM L-세린, 0.4 mM THF, 10 mM 2-메르캅토에탄올, 및 1.5 mM NADP+에서 검정하였다. 37℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 조 세포 추출물 및 이. 콜라이로부터의 정제된 MTHFD 효소를 첨가하여 반응을 개시시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 10분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 2％ (v/v) 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 과염소산 첨가는 반응 (2)에서 형성된 환원된 피리딘 뉴클레오티드를 파괴한다. 실온에서 10분 후, 350 nm에서 흡광도를 판독하였다. 모든 실험에서, L-세린이 없는 대조군을 실행시켰고, 분광광도법 측정치에 대한 블랭크(blank)로서 사용하였다.
글리신 + 아세트알데히드를 생성시키는 TAL 활성을 4-히드라지노-7-니트로벤조푸라잔 (NBDH) 검출 시스템을 사용하여 37℃에서 형광측정법에 의해 검정하였다. 생산된 아세트알데히드를 NBDH로 유도체화시켜 형광성 히드라존 유도체를 산출시킴으로써 530 nm에서 아세트알데히드 형성 속도를 결정하였다. 200-250 ㎍의 조 세포 추출물을 20 mM HEPES-HCl 완충제 (pH 8.0), 0.01 mM 피리독살 포스페이트, 및 10 mM L-트레오닌에서 검정하였다. 조 세포 추출물을 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. 37℃에서 10분 및 40분 동안 인큐베이션한 후, 2.5％ (v/v) TCA를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 실온에서 5분 동안 10000g에서 원심분리한 후, 0.33 M 아세트산나트륨 (pH 5.2) 내의 0.001％ (w/v) NBDH를 상청액에 첨가하고, 생산된 형광성 히드라존을 실온에서의 10분 인큐베이션 후 FLx800 형광 마이크로플레이트 판독기 (λ 여기 = 485 nm; λ 방출 = 530 nm, 바이오텍(Biotek))로 정량하였다. 모든 실험에서, L-세린이 없는 대조군을 실행시켰고, 형광측정법 측정치에 대한 블랭크로서 사용하였다.
<표 7>
표 7에서 볼 수 있듯이, 균주 10 및 12 (glyA *가 있음)의 TAL 활성은 대조군 균주 3, 9 및 균주 11 (glyAwt가 있음)보다 각각 약 2배 및 6배 더 작았다. 또한, GlyA*를 초래하는, GlyA 효소에 도입된 R235K 돌연변이는 야생형 효소에 비하여 SHMT 활성에 대폭적인 영향을 미치지 않으면서 TAL 활성을 감소시켰다. GlyA의 주요한 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT) 활성에 영향을 미치지 않으면서 트레오닌 알돌라제 활성을 약화시키는 것이 메티오닌 생산에 이롭다 (상기 표 6의 메티오닌 수율 참조).
이는 균주 3 및 11과 비교하여 균주 10 및 12에서 세린에서 글리신으로의 탄소 유입을 강화시킬 수 있고, 메티오닌 생산 결과 (표 6)와 잘 일치한다.
실시예 VI : 세린 데아미나제 활성 ( SDA ) 약화가 메티오닌 생산에 미치는 효과
1. sdaArc (균주 7) 또는 sdaA * (균주 5)를 갖는 생산 균주의 평가
유가식(fedbatch) 전략을 사용하여 2.5 ℓ 발효기 (피에르 게랑(Pierre Guerin))에서의 생산 조건 하에 균주를 시험하였다.
카나마이신 및 스펙티노마이신을 각각의 배지에 50 mg/ℓ의 농도로 첨가하였다.
간략하게, 10 ㎖ LB 배지 + 2.5 g/ℓ 글루코스에서 성장된 24시간 배양물을 사용하여 최소 배지 (B1a) 내의 24시간 예비배양물에 접종하였다. 회전식 진탕기 (200 RPM) 내의 50 ㎖의 최소 배지 (B1a)를 함유하는 500 ㎖ 배플(baffled) 플라스크에서 이러한 인큐베이션을 수행하였다. 제1 예비배양물은 30℃의 온도에서, 제2 예비배양물은 34℃의 온도에서 성장시켰다.
5 ㎖의 농축 예비배양물이 1.2 g/ℓ의 바이오매스 농도로 접종된 200 ㎖의 최소 배지 (B1b)가 충전된 생물반응기 (식스포스(Sixfors))에서 제3 예비배양 단계를 수행하였다. 예비배양 온도를 34℃에서 일정하게 유지시켰고, pH를 10％ NH4OH 용액을 사용하여 6.8의 값으로 자동으로 조정하였다. 공기 공급 및/또는 교반으로 용존 산소 농도를 공기 분압 포화도 30％의 값으로 계속 조정하였다. 회분식 배지로부터의 글루코스 고갈 후, 0.7 ㎖/h의 초기 유속으로 유가식 배양을 개시시켰고, 약 18 g/ℓ의 최종 세포 농도를 수득하기 위해 0.13 /h의 성장 속도로 24시간 동안 지수적으로 증가시켰다.
<표 8>
<표 9>
<표 10>
<표 11>
이어서, 2.5 ℓ 발효기 (피에르 게랑)에 600 ㎖의 최소 배지 (B2)를 충전하였고, 55 내지 70 ㎖ 부피 범위의 예비배양물을 2.1 g/ℓ의 바이오매스 농도로 접종하였다.
배양 온도를 37℃에서 일정하게 유지시켰고, pH를 NH4OH 용액 (9시간 동안은 NH4OH 10％, 배양 종료까지는 28％)의 자동 첨가에 의해 작업값 (6.8)에서 유지시켰다. 초기 진탕 속도를 회분식 단계 동안은 200 RPM으로 설정하였고, 유가식 단계 동안 1000 RPM까지 증가시켰다. 초기 공기 유량을 회분식 단계 동안은 40 NL/h로 설정하였고, 유가식 단계를 시작할 때 100 NL/h로 증가시켰다. 진탕을 증가시킴으로써 용존 산소 농도를 20 내지 40％, 바람직하게는 30％ 포화도의 값에서 유지시켰다.
세포 덩어리가 5 g/ℓ에 근접하는 농도에 도달했을 때, 5 ㎖/h의 초기 유량으로 유가식 배양을 개시시켰다. 26시간 후에 24 ㎖/h에 도달하도록 유량을 증가시키면서 S자형 프로파일로 공급 용액을 주입하였다. 하기의 식으로 정확한 공급 조건을 계산하였다:
[식 중, Q(t)는 600 ㎖의 회분식 부피에 대한 ㎖/h 단위의 공급 유량이고, p1 = 1.80, p2 = 22.40, p3 = 0.270, p4 = 6.5이다].
26시간의 유가식 배양 후, 공급 용액 펌프를 정지시켰고, 글루코스 고갈 후 배양이 정지되었다.
세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였고, 기타 관련된 대사산물을 HPLC + 굴절측정 검출 (유기 산 및 글루코스) 및 실릴화 후의 GC-MS를 사용하여 분석하였다.
<표 12>
표 12에서 볼 수 있듯이, sdaAwt 발현과 비교하여 sdaA * 대립유전자 발현 시 메티오닌/글루코스 수율 (Ymet)이 증가된다. SdaA 효소의 세린 데아미나제 활성 약화는 메티오닌 생산을 위한 세린 이용가능성을 증가시킨다.
pH를 조정하기 위해, 그리고 배양물에 공급하기 위해 첨가된 용액의 양을 초기 부피에 더하고, 샘플링에 사용되고 증발에 의해 손실된 부피를 차감하여, 발효기 부피를 계산하였다.
공급 모액을 칭량함으로써 유가식 부피를 계속 추적하였다. 그 후, 주입된 글루코스의 양을 주입된 중량, 용액 밀도 및 브릭스(Brix) 방법으로 결정된 글루코스 농도 ([글루코스])를 기초로 계산하였다.
메티오닌 수율은 하기와 같이 표현되었다:
배양 동안 수득된 최대 수율이 여기에서 각각의 균주에 대해 제시되었다.
상기 식에서 메티오닌0 및 메티오닌t는 각각 초기 및 최종 메티오닌 농도이고, V0 및 Vt는 초기 및 t 시점의 부피이다.
소비된 글루코스를 하기와 같이 계산하였다:
주입된 글루코스t = 공급된 부피t * [글루코스]
소비된 글루코스t = [글로코스]0 * V0 + 주입된 글루코스 - [글루코스]잔류 * Vt
상기 식에서, [글루코스]0, [글루코스], [글루코스]잔류는 각각 초기 글루코스 농도, 공급된 글루코스 농도 및 잔류 글루코스 농도이다.
2. 균주 5 및 7에서의 세린 데아미나제 활성 ( SDA )의 결정
SDA 활성을 시험관 내에서 결정하기 위해, 이. 콜라이 균주를 상기 기술된 바와 같은 최소 배지에서 배양하였고, 원심분리에 의해 수확하였다. 펠릿을 저온 50 mM 글리실글리신 완충제 (pH 8) + 3 mM FeSO4, 30 mM DTT 및 EDTA가 없는 프로테아제 억제제 칵테일 내에 현탁시켰다. 그 후, 세포를 프리셀라이스 (버틴 테크놀로지스; 6500 rpm에서 2×10s)로의 비드 비팅에 의해 용해시키고, 이어서 30분 동안 12000g (4℃)에서 원심분리하였다. 상청액을 탈염시키지 않고, 효소 분석에 사용하였다. 브래드포드 검정 시약 (문헌 [Bradford, 1976])을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
SDA 활성을 결정하기 위해, 100 ㎍의 조 세포 추출물을 50 mM 글리실글리신 완충제 (pH 8) + 3 mM FeSO4, 30 mM DTT 및 50 mM L-세린에서 검정하였다. 조 세포 추출물을 첨가하여 반응을 개시시켰다. 37℃에서 5분 및 20분 동안 인큐베이션한 후, 0.4 ㎖의 톨루엔을 첨가하였고, HCl 내의 2-4-디니트로페닐히드라진으로 반응을 정지시켰다. 균질화 후, 제제 혼합물을 실온에서 5분 동안 3500 rpm에서 원심분리하였고, 상부 상을 10％ (w/v) 탄산나트륨으로 처리하였다. 균질화 후, 제제 혼합물을 실온에서 1분 동안 3500 rpm에서 원심분리하였고, 하부 상을 1.5 M NaOH로 처리하였다. 10분 인큐베이션 후, 알칼리성 용액 내의 케토-산 히드라존의 색을 측정함으로써 생산된 피루베이트의 양을 540 nm에서 분광광도법으로 결정하였다. 15분 기간 이내에 색 강도가 변하지 않았다. 모든 실험에서, L-세린이 없는 대조군을 실행시켰고, 분광광도법 측정치에 대한 블랭크로서 사용하였다.
<표 13>
표 13에서 볼 수 있듯이, 균주 5의 SDA 활성은 야생형 균주 7의 활성보다 100배 초과로 더 낮다. SDA 활성의 이러한 유의한 감소는 메티오닌 생산의 개선과 상관되었다 (표 12 참조).
SdaA*의 경우 잔류 세린 데아미나제 활성이 있다는 것을 인지하는 것이 중요하고, 이는 세포의 생리학에 중요한 것일 수 있다.
참고문헌
도 1은 피루베이트, 트레오닌, 이소류신 및 메티오닌을 수반하는 대사 경로를 나타낸다.
실시예
실시예 I: 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA ( pME101 - thrA *1- cysE - PgapA -metA*11)의 구축
본 출원에 참고로 포함된 특허 출원 WO2007/077041 및 WO2009/043372에 메티오닌 생산 균주가 기술되어 있다.
1. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA ( pME101 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11)의 구축
출원 WO2007/077041 및 PCT/FR2009/052520에 기술되어 있는 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11을 재조합 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF Δp y kA 내로 전기천공에 의해 도입하여, 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)을 제공하였다.
실시예 II : 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δlta E Δtdh ( pME101 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11)의 구축
본 출원에 참고로 포함된 특허 출원 WO2007077041 및 WO2009/043372에 메티오닌 생산 균주가 기술되어 있다.
1. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ ltaE :: Km 의 구축
ltaE 유전자를 불활성화시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관련 유전자 대부분을 결실시키면서 카나마이신 저항성 카세트의 삽입을 허용한다. 이러한 목적을 위해, 2개의 올리고뉴클레오티드 DltaEF 및 DltaER을 사용하였다 (웹사이트 http://ecogen.org/의 참조 서열(reference sequence)).
DltaEF (서열 1)
ggacatgccatgattgatttacgcagtgataccgttacccgaccaagccgcgccatgctcgaagcgatgatggccgccccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[서열에서
- 소문자는 ltaE 영역의 908446에서 908526까지의 서열에 대해 상동성인 영역이고,
- 대문자는 카나마이신 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역이다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]의 참조 서열)],
DltaER (서열 2)
gcgcaccagatgctgaccaatgtagccactggcaccgagaactaaaatgcgttgcggcacgtctctctccttaacgcgccCATATGAATATCCTCCTTAG
[서열에서
- 소문자는 ltaE 영역의 907446에서 907525까지의 서열에 대해 상동성인 영역이고,
- 대문자는 카나마이신 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역이다].
올리고뉴클레오티드 DltaEF 및 DltaER을 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 그 후, 수득된 PCR 생성물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA (pKD46) 내로 도입하였고, 이 균주 내에서, 발현된 레드(Red) 리콤비나제(recombinase) 효소는 상동 재조합을 허용하였다. 그 후, 카나마이신 저항성 형질전환체를 선택하고, 하기에 정의되는 올리고뉴클레오티드 ltaEF 및 ltaER로의 PCR 분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 유지된 균주를 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km으로 명명하였다.
ltaEF (서열 3)
GCCACCTGGCGCTCCTGAGCG (ltaE 영역의 907234에서 907254까지의 서열에 대해 상동성)
ltaER (서열 4)
GCTGCGCGCAATCATCAGCGG (ltaE 영역의 908603에서 908623까지의 서열에 대해 상동성).
2. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ ltaE :: Km Δtdh:: Cm 의 구축
tdh 유전자를 불활성화시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 관련 유전자 대부분을 결실시키면서 클로람페니콜 저항성 카세트의 삽입을 허용한다. 이러한 목적을 위해, 2개의 올리고뉴클레오티드 DtdhF 및 DtdhR을 사용하였다 (웹사이트 http://ecogen.org/의 참조 서열).
DtdhF (서열 5)
gaaagcgttatccaaactgaaagcggaagagggcatctggatgaccgacgttcctgtaccggaactcgggcataacgatcCATATGAATATCCTCCTTAG
[서열에서
- 소문자는 tdh 영역의 3789287에서 3789366까지의 서열에 대해 상동성인 영역이고,
- 대문자는 클로람페니콜 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역이다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]의 참조 서열)],
DtdhR (서열 6)
cccagctcagaataactttcccggactggcccgaacgcatagcgtcaaagcccttctggaaatcatcgatagagaaacgatgggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[서열에서
- 소문자는 tdh 영역의 3788348에서 3788431까지의 서열에 대해 상동성인 영역이고,
- 대문자는 클로람페니콜 저항성 카세트의 증폭을 위한 영역이다].
올리고뉴클레오티드 DtdhF 및 DtdhR을 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 저항성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 그 후, 수득된 PCR 생성물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km (pKD46) 내로 도입하였고, 이 균주 내에서, 발현된 레드 리콤비나제 효소는 상동 재조합을 허용하였다. 그 후, 클로람페니콜 저항성 형질전환체를 선택하고, 하기에 정의되는 올리고뉴클레오티드 tdhF 및 tdhR로의 PCR 분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 유지된 균주를 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE::Km Δtdh::Cm으로 명명하였다.
tdhF (서열 7)
GGGTAGAGAGATAATGAGAGCAGC (tdh 영역의 3788210에서 3788233까지의 서열에 대해 상동성).
tdhR (서열 8)
GCCCAGCCAAAACTGTACAG (tdh 영역의 3790719에서 3790738까지의 서열에 대해 상동성).
3. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ ltaE Δ tdh 의 구축
그 후, 카나마이신 및 클로람페니콜 저항성 카세트를 제거하였다. 카나마이신 또는 클로람페니콜 저항성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 리콤비나제 FLP를 보유하는 pCP20 플라스미드를 재조합 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA Δl t aE::Km Δtdh::Cm 내로 전기천공에 의해 도입하였다. 42℃에서의 일련의 배양 후, 카나마이신 및 클로람페니콜 저항성 카세트의 상실을 상기에서 사용된 것들과 동일한 올리고뉴클레오티드인 ltaEF / ltaER 및 tdhF / tdhR로의 PCR 분석에 의해 확인하였다. 유지된 균주를 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF -cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh로 명명하였다.
4. 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ ltaE Δ tdh ( pME101 - thrA *1- cysE -PgapA-metA*11)의 구축
출원 WO2007/077041 및 PCT/FR2009/052520에 기술된 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11을 재조합 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA Δl t aE Δtdh 내로 전기천공에 의해 도입하여, 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF ΔmetJ ΔpykF Δp y kA ΔltaE Δtdh (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)을 제공하였다.
실시예 III : 생산 균주의 평가
생산 균주를 소형 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 평가하였다. 5.5 ㎖ 예비배양물을 37℃에서 16시간 동안 혼합 배지 (10％ LB 배지 (시그마(Sigma) 25％) + 2.5 g/ℓ 글루코스 및 90％ 최소 배지 PC1)에서 성장시켰다. 이를 사용하여, 배지 PC1에서 OD600 0.2로 50 ㎖ 배양물에 접종하였다. 스펙티노마이신을 최종 농도 50 mg/ℓ으로 첨가하였다. 배양물의 온도는 37℃였다. 배양물이 OD600 5 내지 7에 도달했을 때, 세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였고, 기타 관련된 대사산물을 HPLC + 굴절측정 검출 (유기 산 및 글루코스) 및 실릴화 후의 GC-MS를 사용하여 분석하였다. 각각의 균주에 대해, 3회의 반복물을 제조하였다.
균주 1 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11).
균주 2 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔltaE Δtdh (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11).
<표 1>
<표 2>
세포외 메티오닌 농도를 OPA/FMOC 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였다. 잔류 글루코스 농도를 HPLC + 굴절측정 검출을 사용하여 분석하였다. 메티오닌 수율은 하기와 같이 표현되었다:
표 2에서 볼 수 있듯이, 유전자 tdh 및 ltaE의 결실 시 메티오닌/글루코스 수율 (Ymet)이 증가된다.
실시예 IV : 하기의 실시예 V 및 VI 에서 시험된 메티오닌 생산 균주 3 내지 12의 구축
1. 프로토콜
몇몇 프로토콜이 메티오닌 생산 균주를 구축하는데 사용되었고, 하기의 예에서 기술된다.
프로토콜 1: 상동 재조합 및 재조합체의 선택에 의한 염색체 변형 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)])
특정 염색체 유전자좌에서의 대립유전자 교체 또는 유전자 파괴를 문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기술된 바와 같이 상동 재조합에 의해 수행하였다. Flp 인식 부위가 플랭킹(flanking)된, 클로람페니콜 (Cm) 저항성 cat 유전자, 카나마이신 (Km) 저항성 kan 유전자, 또는 겐타마이신 (Gt) 저항성 gm 유전자를 pKD3 또는 pKD4 또는 p34S-Gm (문헌 [Dennis & Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715]) 플라스미드를 각각 주형으로 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 사용하여, λ 레드 (γ,β,엑소) 리콤비나제를 발현하는 플라스미드 pKD46을 보유한 수용자 이. 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 항생제-저항성 형질전환제를 선택하였고, 돌연변이된 유전자좌에 대한 염색체 구조를 표 4에 열거된 적합한 프라이머로의 PCR 분석에 의해 확인하였다.
pCP20 플라스미드를 보유한 클론을 LB에서 37℃에서 배양한 후, 30℃에서 항생제 저항성의 상실에 대해 시험한 것을 제외하고는 문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기술된 바와 같이 플라스미드 pCP20을 사용하여 kan-저항성 유전자를 제거하였다. 그 후, 항생제 민감성 클론을 표 4에 열거된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다.
프로토콜 2: P1 파지 형질도입
P1 형질도입에 의해 소정의 이. 콜라이 수용자 균주에 염색체 변형을 전달하였다. 이 프로토콜은 2개의 단계로 구성된다: (i) 저항성 유전자와 관련된 염색체 변형을 함유하는 공여자 균주에 대한 파지 용해물의 제조 및 (ii) 생성된 파지 용해물에 의한 수용자 균주의 감염.
파지 용해물의 제조
- 관심 있는 염색체 변형이 있는 균주 MG1655를 밤새 배양한 배양물 100 ㎕를 10 ㎖의 LB + Km 50 ㎍/㎖ 또는 + 글루코스 0.2％ + CaCl2 5 mM에 접종한다.
- 진탕시키면서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 제조된 P1 파지 용해물 100 ㎕를 공여자 균주 MG1655 상에 첨가한다 (약 1 × 109개의 파지/㎖).
- 세포가 완전히 용해될 때까지 3시간 동안 37℃에서 진탕시킨다.
- 클로로포름 200 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱한다.
- 10분 동안 4500 g에서 원심분리하여 세포 잔해물을 제거한다.
- 상청액을 멸균 튜브로 옮긴다.
- 용해물을 4℃에서 보관한다.
형질도입
- LB 배지에 배양된 이. 콜라이 수용자 균주를 밤새 배양한 배양물 5 ㎖를 10분 동안 1500 g에서 원심분리한다.
- 세포 펠릿을 2.5 ㎖의 MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM에 현탁시킨다.
- 세포 100 ㎕를 염색체 변형 균주 MG1655의 P1 파지 용해물 100 ㎕로 감염시키고 (시험 튜브), 대조군 튜브는 P1 파지가 없는 세포 100 ㎕ 및 세포가 없는 P1 파지 100 ㎕이다.
- 진탕시키지 않으면서 30℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 각각의 튜브에 1 M 시트르산나트륨 100 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱한다.
- LB 1 ㎖를 첨가한다.
- 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 7000 rpm에서 3분 동안 원심분리한다.
- LB + Km 50 ㎍/㎖에 플레이팅한다
- 37℃에서 밤새 인큐베이션한다.
그 후, 항생제-저항성 형질전환체를 선택하고, 돌연변이된 유전자좌의 염색체 구조를 표 4에 열거된 적합한 프라이머로의 PCR 분석에 의해 확인하였다.
이하의 실시예는 하기의 표 3에 열거된 모든 균주의 구축을 설명한다.
<표 3>
2. 균주 3의 설명
메티오닌 생산자 균주 3 (표 3)의 유전자 변형은 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술되어 있고, 이들은 참고로 본 출원에 포함된다. 균주 3의 DNA 서열분석 후, 미스센스(missense) 돌연변이가 sdaA 유전자에서 예기치 않게 확인되었다. 이 돌연변이는 구조 유전자의 위치 158에 위치하고 (T158G), 이는 상응하는 단백질에서의 아미노산 변화를 생성시킨다: 류신 53 → 아르기닌. 이러한 대립유전자를 sdaA *1로 칭하였다.
3. sdaA 유전자가 변형된 균주의 구축 - 세린 분해 경로의 변형
3.1. sdaA *( T158G )를 함유하는 균주 5의 구축
균주 3에서 yobD 유전자를 결실시키기 위해, 프라이머 Ome1983-DyobD-amplif-F (서열 09) 및 Ome 1986-DyobD-amplif-R (서열 10) (표 4)을 사용하여 균주 BW25113 Δ yobD :: Km (케이오(Keio) 선집, 문헌 [Baba. et al., Mol Syst Biol., 2, 2006-0])으로부터 Δ yobD :: Km 결실을 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1을 사용하였다.
카나마이신 저항성 재조합체를 선택하였다. 프라이머 Ome 1987-DyobD-verif-F (서열 11) 및 Ome 1988-DyobD-verif-R (서열 12) (표 4)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. sdaA 유전자의 sdaA *1 대립유전자를 DNA 서열분석에 의해 또한 확인하였다. 플라스미드 pKD46의 제거 후, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 Δ yobD :: Km을 균주 4 (표 3)로 칭하였다.
그 후, 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술된 pCL1920-PgapA -pycRe-TT07을 전기천공에 의해 균주 4 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA-pycre-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc -metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 Δ yobD :: Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07을 균주 5 (표 3)로 칭하였다.
3.2. 재구축된 sdaAwt 대립유전자 ( sdaArc )를 함유하는 균주 7의 구축
유전자 sdaA 및 yobD는 이. 콜라이 염색체 상에서 서로 근접하고 (각각 40.84 min 및 41.01 min), 파지 P1이 2 min의 이. 콜라이 염색체를 패키징(packaging)할 수 있기 때문에, 유전자 sdaA 및 yobD가 공동-형질도입될 수 있다. 이에 의해, 프로토콜 2에 따라 균주 BW25113 sdaA Δ yobD :: Km (케이오 선집, 문헌 [Baba. et al., Mol Syst Biol., 2, 2006-0])으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하여 sdaA 야생형 대립유전자 및 ΔyobD :: Km 결실을 균주 3 (표 3) 내로 공동-형질도입시켰다.
카나마이신 저항성 형질도입체를 선택하였다. 프라이머 Ome 1987-DyobD-verif-F (서열 11) 및 Ome 1988-DyobD-verif-R (서열 12) (표 4)로의 PCR에 이어서 DNA 서열분석에 의해 ΔyobD::Km 결실의 존재를 확인하였다. sdaA *1 대립유전자의 sdaA 야생형 대립유전자로의 교환을 DNA 서열분석에 의해 확인하였고, sdaArc (rc는 재구축됨을 가리킴)로 칭하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc -CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11 ΔuxaCA:: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA - metA *11 ΔCP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC sdaArc Δ yobD :: Km을 균주 6 (표 3)으로 칭하였다.
그 후, 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기술된 플라스미드 pCL1920-PgapA-pycre-TT07을 전기천공에 의해 균주 6 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycre-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 -metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC sdaArc Δ yobD :: Km pCL1920-PgapA - pycre-TT07을 균주 7 (표 3)로 칭하였다.
4. 단백질 GlyA 또는 GlyA * ( R235K )를 과다생산 하는 균주의 구축 - 트레오닌/글리신 경로의 변형
4.1. glyA 유전자의 결실에 의한 균주 8의 구축
균주 3에서 glyA 유전자를 결실시키기 위해, 프라이머 Ome 0641-DglyA R (서열 13) 및 Ome 0642-DglyA F (서열 14) (하기 참조)를 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 저항성 카세트를 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1을 사용하였다.
카나마이신 저항성 재조합체를 선택하였다. 프라이머 Ome 0643-glyA R (서열 15) 및 Ome 0644-glyA F (서열 16) (표 4)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 저항성 카세트의 삽입을 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 Δ glyA :: Km pKD46으로 칭하였다.
Ome 0641-DglyA R (서열 13)
ATGTTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCGATTATGATGCCGAACTGTGGCAGGCTATGGAGCAGGAAAAAGTACGTCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
[서열에서
- 대문자 서열은 glyA 유전자의 상류의 서열 (2683451-2683529, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이고,
- 밑줄친 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 2에 상응한다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])]
Ome 0642-DglyA F (서열 14)
GCGCAGATGTCGAGAACTTTACCTTTGATGCGCTCGATAACGGCTTCATCATTGATGCTGTCCAGCACGTCACACATCCCATATGAATATCCTCCTTAG
[서열에서
- 대문자 서열은 glyA 유전자의 상류의 서열 (2682298-2682376, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이고,
- 밑줄친 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 1에 상응한다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])].
그 후, 프로토콜 2에 따라 상기 기술된 균주 MG1655 metA *11 Δ glyA :: Km pKD46으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하여 ΔglyA :: Km 결실을 균주 3 (표 3) 내로 형질도입하였다.
카나마이신 저항성 형질도입체를 선택하였다. 프라이머 Ome 0643-glyA R (서열 15) 및 Ome 0644-glyA F (서열 16) (표 4)로의 PCR에 의해 ΔglyA::Km 결실의 존재를 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ Δp y kF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 Δg l yA:: Km을 균주 8 (표 3)로 칭하였다.
4.2. glyA 를 발현하는 균주 9의 구축
에스케리키아 콜라이의 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 유전자를 과다발현시키기 위해, 플라스미드 pCC1BAC (에피센터(EpiCentre)) 및 pSCB (스트라타진(Stratagene))로부터 유래한 플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA를 구축하였다.
플라스미드 pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA를 구축하기 위해, PglyA-glyA-TTglyA 삽입물을 MG1655 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 프라이머 Ome 1162-glyAR-EcoRI-HindIII (서열 17) 및 Ome 1165-PglyAF-HindIII (서열 18)으로의 PCR에 의해 증폭시키고, 플라스미드 pSCB (스트라타진)에 클로닝하였다. 생성된 벡터를 서열분석에 의해 확인하고, pSCB-PglyA-glyA-TTglyA로 칭하였다.
그 후, 플라스미드 pSCB-PglyA - glyA-TTglyA를 HindIII로 소화시키고, 생성된 단편 HindIII-PglyA - glyA - TTglyA - HindIII을 플라스미드 pCC1BAC의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 선택된 플라스미드는 플라스미드 pCC1BAC의 lacZ 프로모터와 반대되는 배향으로 PglyA - glyA - TTglyA 삽입물을 가지며, 이를 DNA 서열분석에 의해 확인하고 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA로 칭하였다.
Ome 1162-glyAR-EcoRI-HindIII (서열 17)
ATCTAGTAAGCTTAGTGAATTCGTTACGACAGATTTGATGGCGCG
[서열에서
- 밑줄친 대문자 서열은 HindIII 및 EcoRI 제한 부위 및 여분의 염기에 대한 것이고,
- 볼드체 대문자 서열은 glyA 프로모터 서열 (2682063-2682085, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이다].
Ome 1165-PglyAF-HindIII (서열 18)
TCATCGGATCCATCAAGCTTGAAAGAATGTGATGAAGTG
[서열에서
- 밑줄친 대문자 서열은 BamHI 및 HindIII 제한 부위 및 여분의 염기에 대한 것이고,
- 볼드체 대문자 서열은 glyA 유전자의 전사 종결자 (2683744-2683762, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이다].
그 후, 상기 기술된 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA를 전기천공에 의해 균주 8 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 ΔglyA :: Km pCC1BAC-PglyA-glyA-TTglyA를 균주 9 (표 3)로 칭하였다.
4.3. glyA *를 발현하는 균주 10의 구축
pSCB - P glyA - glyA *( R235K )- TTglyA 의 구축
플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 구축하기 위해, 플라스미드 pSCB-PglyA - glyA - TTglyA를 프라이머 Ome 1483-glyA* R R235K (서열 19) 및 Ome 1482-glyA* F R235K (서열 20)로 증폭시켰다. 모 DNA 주형을 제거하기 위해 PCR 생성물을 DpnI로 소화시켰다. 남아 있는 점착성 돌출부를 인산화시키고, 이. 콜라이 균주 내로 도입하여, 플라스미드 pSCB-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 형성시켰다. PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA 삽입물, 특히 glyA 유전자 내의 R235K (703-AAA-705) 돌연변이의 존재를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
Ome 1483 glyA* R R235K (서열 19)
CCTTTCGCCAGGATCAGGCCTCCTTTCGGACCCGCCAGGGTTTTGTGAG
[서열에서
- 대문자 서열은 glyA 유전자 (2682802-2682850, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이고,
- 볼드체 대문자는 삽입된 코돈 돌연변이 CGC-708-TTT (R235K)에 상응하며,
- 밑줄친 대문자는 StuI 제한 부위가 나타나게 하는 침묵성 점 돌연변이 (G704T)에 상응한다].
Ome 1482 glyA* F R235K (서열 20)
CTCACAAAACCCTGGCGGGTCCGAAAGGAGGCCTGATCCTGGCGAAAGG
- 대문자 서열은 glyA 유전자 (2682802-2682850, 웹사이트 http://ecogene.org/의 참조 서열)에 대해 상동성이고,
- 볼드체 대문자는 삽입된 코돈 돌연변이 CGC-708-TTT (R235K)에 상응하며,
- 밑줄친 대문자는 StuI 제한 부위가 나타나게 하는 침묵성 점 돌연변이 (G704T)에 상응한다].
pCC1BAC - P glyA - glyA *( R235K )- TTglyA 의 구축
pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 구축하기 위해, 하기 기술된 pSCB-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA로부터 정제된 HindIII 단편 PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 플라스미드 pCC1BAC의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 선택된 플라스미드는 플라스미드 pCC1BAC의 lacZ 프로모터 배향과 비교하여 반대되는 배향으로 PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA 삽입물을 가지며, 이를 DNA 서열분석에 의해 확인하고 pCC1BAC-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA로 칭하였다.
그 후, 상기 기술된 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 전기천공에 의해 균주 8 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA -metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA - metA *11 ΔCP4-6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA - metA *11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 Δg l yA:: Km pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 균주 10 (표 3)으로 칭하였다.
4.4. glyA 를 과다발현하는 균주 11의 구축
pCL1920 - P glyA - glyA - TTglyA 의 구축
플라스미드 pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA는 플라스미드 pCL1920 (문헌 [Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631]) 및 상기 기술된 pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA로부터 유래된다.
pCL1920-PglyA - glyA - TTglyA를 구축하기 위해, pCC1BAC-PglyA - glyA - TTglyA로부터 정제된 HindIII 단편 PglyA - glyA - TTglyA를 플라스미드 pCL1920의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 선택된 플라스미드는 플라스미드 pCL1920의 lacZ 프로모터 배향과 비교하여 반대되는 배향으로 PglyA - glyA - TTglyA 삽입물을 가지며, 이를 DNA 서열분석에 의해 확인하고 pCL1920-PglyA - glyA - TTglyA로 칭하였다.
그 후, 상기 기술된 pCL1920-PglyA - glyA - TTglyA를 전기천공에 의해 균주 8 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PglyA - glyA - TTglyA의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 -gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 ΔglyA :: Km pCL1920-PglyA-glyA-TTglyA를 균주 11 (표 3)로 칭하였다.
4.5. glyA *를 과다발현하는 균주 12의 구축
pCL1920 - P glyA - glyA *( R235K )- TTglyA 의 구축
플라스미드 pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA는 플라스미드 pCL1920 (문헌 [Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631]) 및 상기 기술된 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA로부터 유래된다.
pCL1920-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 구축하기 위해, pCC1BAC-PglyA -glyA*(R235K)-TTglyA로부터 정제된 HindIII 단편 PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 플라스미드 pCL1920의 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. pCL1920 플라스미드의 lacZ 프로모터 배향과 비교하여 반대되는 배향으로 PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA 삽입물을 가진 선택된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고 pCL1920-PglyA -glyA*(R235K)-TTglyA로 칭하였다.
그 후, pCL1920-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA를 전기천공에 의해 균주 8 (표 3) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCC1BAC-PglyA - glyA *( R235K )- TTglyA의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4 -6:: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC sdaA *1 ΔglyA :: Km pCL1920-PglyA-glyA*(R235K)-TTglyA를 균주 12 (표 3)로 칭하였다.
<표 4>
실시예 V: GLYA * 돌연변이체 단백질의 트레오닌 알돌라제 활성 약화가 메티오닌 생산에 미치는 효과
1. glyA 또는 glyA * 대립유전자를 갖는 생산 균주의 평가
생산 균주를 소형 에를렌마이어 플라스크에서 평가하였다. 5.5 ㎖ 예비배양물을 30℃에서 21시간 동안 혼합 배지 (10％ LB 배지 (시그마 25％) + 2.5 g/ℓ 글루코스 및 90％ 최소 배지 PC1)에서 성장시켰다. 이를 사용하여, 배지 PC1 (표 5의 조성)에서 OD600 0.2로 50 ㎖ 배양물에 접종하였다. 카나마이신 및 스펙티노마이신을 50 mg/ℓ의 농도로 첨가하였고, 필요한 경우 30 mg/ℓ의 클로람페니콜을 첨가하였다. 배양물의 온도는 37℃였다. 배양물이 OD600 5 내지 7에 도달했을 때, 세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였고, 기타 관련된 대사산물을 HPLC + 굴절측정 검출 (유기 산 및 글루코스) 및 실릴화 후의 GC-MS를 사용하여 분석하였다.
<표 5>
<표 6>
세린의 글리신으로의 변환을 촉매하는 것에 더하여, GlyA 효소는 또한 L-트레오닌을 절단할 수 있다. 이는 본 발명자들에 의해 glyA 결실을 보유하는 균주로써 입증되었다. 이러한 균주는 검출가능한 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT) 및 트레오닌 알돌라제 (TAL) 활성을 더 이상 지니지 않는다 (데이터는 제시되지 않음).
표 6에서 볼 수 있듯이, glyA * 대립유전자의 발현 (균주 10) 또는 과다발현 (균주 12) 시 glyAwt (각각 glyAwt의 발현 및 과다발현에 대한 균주 9 및 11)와 비교하여 메티오닌/글루코스 수율 (Ymet)이 증가된다.
GlyA의 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT)에 영향을 미치지 않으면서 트레오닌 알돌라제 활성을 약화시키는 것이 메티오닌 생산에 이롭다 (하기 표 7의 활성 참조).
세포외 메티오닌 농도를 OPA/FMOC 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였다. 잔류 글루코스 농도를 HPLC + 굴절측정 검출을 사용하여 분석하였다. 메티오닌 수율은 하기와 같이 표현되었다:
2. glyA wt 또는 glyA * 대립유전자를 과다발현하는 균주의 SHMT 및 TAL 활성의 결정
세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT), 트레오닌 알돌라제 (TAL) 및 알로트레오닌 알돌라제 (aTAL) 활성을 시험관 내에서 결정하기 위해, 이. 콜라이 균주를 상기 기술된 바와 같은 최소 배지에서 배양하였고, 최종 로그 단계에서 바이오매스를 원심분리에 의해 수확하였다. 펠릿을 EDTA가 있는 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 저온 20 mM 인산칼륨 완충제 (pH 7.2) 내에 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 프리셀라이스(Precellys) (버틴 테크놀로지스(Bertin Technologies); 6500 rpm에서 2×10s)로의 비드 비팅(bead beating)에 의해 용해시키고, 이어서 4℃에서 30분 동안 12000g에서 원심분리하였다. 상청액을 탈염시키고, 효소 분석에 사용하였다. 브래드포드(Bradford) 검정 시약 (문헌 [Bradford, 1976])을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
SHMT 활성을 식 (1) 및 (2)에 기술된 바와 같이 메틸렌 테트라히드로폴레이트 데히드로게나제 (MTHFD) 커플링 효소 검정을 사용하여 37℃에서 분광광도법에 의해 모니터링하였다. 이러한 검정에서, SHMT 효소 반응에 의해 생산된 5,10-메틸렌-THF의 산화에 의해 산출되는 5,10-메테닐-THF의 형성을 350 nm에서 모니터링하였다.
(1) L-세린 + THF + 2H+ ← → 글리신 + 5,10-메틸렌-THF (SHMT 반응)
(2) 5,10-메틸렌-THF + NADP+ ← → 5,10-메테닐-THF + NADPH (MTHFD 반응)
SHMT 활성을 결정하기 위해, 2 ㎍의 조 세포 추출물을 50 mM 바이신(Bicine)-KOH 완충제 (pH 8.6), 10 mM L-세린, 0.4 mM THF, 10 mM 2-메르캅토에탄올, 및 1.5 mM NADP+에서 검정하였다. 37℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 조 세포 추출물 및 이. 콜라이로부터의 정제된 MTHFD 효소를 첨가하여 반응을 개시시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 10분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 2％ (v/v) 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 과염소산 첨가는 반응 (2)에서 형성된 환원된 피리딘 뉴클레오티드를 파괴한다. 실온에서 10분 후, 350 nm에서 흡광도를 판독하였다. 모든 실험에서, L-세린이 없는 대조군을 실행시켰고, 분광광도법 측정치에 대한 블랭크(blank)로서 사용하였다.
글리신 + 아세트알데히드를 생성시키는 TAL 활성을 4-히드라지노-7-니트로벤조푸라잔 (NBDH) 검출 시스템을 사용하여 37℃에서 형광측정법에 의해 검정하였다. 생산된 아세트알데히드를 NBDH로 유도체화시켜 형광성 히드라존 유도체를 산출시킴으로써 530 nm에서 아세트알데히드 형성 속도를 결정하였다. 200-250 ㎍의 조 세포 추출물을 20 mM HEPES-HCl 완충제 (pH 8.0), 0.01 mM 피리독살 포스페이트, 및 10 mM L-트레오닌에서 검정하였다. 조 세포 추출물을 첨가함으로써 반응을 개시시켰다. 37℃에서 10분 및 40분 동안 인큐베이션한 후, 2.5％ (v/v) TCA를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 실온에서 5분 동안 10000g에서 원심분리한 후, 0.33 M 아세트산나트륨 (pH 5.2) 내의 0.001％ (w/v) NBDH를 상청액에 첨가하고, 생산된 형광성 히드라존을 실온에서의 10분 인큐베이션 후 FLx800 형광 마이크로플레이트 판독기 (λ 여기 = 485 nm; λ 방출 = 530 nm, 바이오텍(Biotek))로 정량하였다. 모든 실험에서, L-세린이 없는 대조군을 실행시켰고, 형광측정법 측정치에 대한 블랭크로서 사용하였다.
<표 7>
표 7에서 볼 수 있듯이, 균주 10 및 12 (glyA *가 있음)의 TAL 활성은 대조군 균주 3, 9 및 균주 11 (glyAwt가 있음)보다 각각 약 2배 및 6배 더 작았다. 또한, GlyA*를 초래하는, GlyA 효소에 도입된 R235K 돌연변이는 야생형 효소에 비하여 SHMT 활성에 대폭적인 영향을 미치지 않으면서 TAL 활성을 감소시켰다. GlyA의 주요한 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 (SHMT) 활성에 영향을 미치지 않으면서 트레오닌 알돌라제 활성을 약화시키는 것이 메티오닌 생산에 이롭다 (상기 표 6의 메티오닌 수율 참조).
이는 균주 3 및 11과 비교하여 균주 10 및 12에서 세린에서 글리신으로의 탄소 유입을 강화시킬 수 있고, 메티오닌 생산 결과 (표 6)와 잘 일치한다.
실시예 VI : 세린 데아미나제 활성 ( SDA ) 약화가 메티오닌 생산에 미치는 효과
1. sdaArc (균주 7) 또는 sdaA * (균주 5)를 갖는 생산 균주의 평가
유가식(fedbatch) 전략을 사용하여 2.5 ℓ 발효기 (피에르 게랑(Pierre Guerin))에서의 생산 조건 하에 균주를 시험하였다.
카나마이신 및 스펙티노마이신을 각각의 배지에 50 mg/ℓ의 농도로 첨가하였다.
간략하게, 10 ㎖ LB 배지 + 2.5 g/ℓ 글루코스에서 성장된 24시간 배양물을 사용하여 최소 배지 (B1a) 내의 24시간 예비배양물에 접종하였다. 회전식 진탕기 (200 RPM) 내의 50 ㎖의 최소 배지 (B1a)를 함유하는 500 ㎖ 배플(baffled) 플라스크에서 이러한 인큐베이션을 수행하였다. 제1 예비배양물은 30℃의 온도에서, 제2 예비배양물은 34℃의 온도에서 성장시켰다.
5 ㎖의 농축 예비배양물이 1.2 g/ℓ의 바이오매스 농도로 접종된 200 ㎖의 최소 배지 (B1b)가 충전된 생물반응기 (식스포스(Sixfors))에서 제3 예비배양 단계를 수행하였다. 예비배양 온도를 34℃에서 일정하게 유지시켰고, pH를 10％ NH4OH 용액을 사용하여 6.8의 값으로 자동으로 조정하였다. 공기 공급 및/또는 교반으로 용존 산소 농도를 공기 분압 포화도 30％의 값으로 계속 조정하였다. 회분식 배지로부터의 글루코스 고갈 후, 0.7 ㎖/h의 초기 유속으로 유가식 배양을 개시시켰고, 약 18 g/ℓ의 최종 세포 농도를 수득하기 위해 0.13 /h의 성장 속도로 24시간 동안 지수적으로 증가시켰다.
<표 8>
<표 9>
<표 10>
<표 11>
이어서, 2.5 ℓ 발효기 (피에르 게랑)에 600 ㎖의 최소 배지 (B2)를 충전하였고, 55 내지 70 ㎖ 부피 범위의 예비배양물을 2.1 g/ℓ의 바이오매스 농도로 접종하였다.
배양 온도를 37℃에서 일정하게 유지시켰고, pH를 NH4OH 용액 (9시간 동안은 NH4OH 10％, 배양 종료까지는 28％)의 자동 첨가에 의해 작업값 (6.8)에서 유지시켰다. 초기 진탕 속도를 회분식 단계 동안은 200 RPM으로 설정하였고, 유가식 단계 동안 1000 RPM까지 증가시켰다. 초기 공기 유량을 회분식 단계 동안은 40 NL/h로 설정하였고, 유가식 단계를 시작할 때 100 NL/h로 증가시켰다. 진탕을 증가시킴으로써 용존 산소 농도를 20 내지 40％, 바람직하게는 30％ 포화도의 값에서 유지시켰다.
세포 덩어리가 5 g/ℓ에 근접하는 농도에 도달했을 때, 5 ㎖/h의 초기 유량으로 유가식 배양을 개시시켰다. 26시간 후에 24 ㎖/h에 도달하도록 유량을 증가시키면서 S자형 프로파일로 공급 용액을 주입하였다. 하기의 식으로 정확한 공급 조건을 계산하였다:
26시간의 유가식 배양 후, 공급 용액 펌프를 정지시켰고, 글루코스 고갈 후 배양이 정지되었다.
세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였고, 기타 관련된 대사산물을 HPLC + 굴절측정 검출 (유기 산 및 글루코스) 및 실릴화 후의 GC-MS를 사용하여 분석하였다.
<표 12>
표 12에서 볼 수 있듯이, sdaAwt 발현과 비교하여 sdaA * 대립유전자 발현 시 메티오닌/글루코스 수율 (Ymet)이 증가된다. SdaA 효소의 세린 데아미나제 활성 약화는 메티오닌 생산을 위한 세린 이용가능성을 증가시킨다.
pH를 조정하기 위해, 그리고 배양물에 공급하기 위해 첨가된 용액의 양을 초기 부피에 더하고, 샘플링에 사용되고 증발에 의해 손실된 부피를 차감하여, 발효기 부피를 계산하였다.
공급 모액을 칭량함으로써 유가식 부피를 계속 추적하였다. 그 후, 주입된 글루코스의 양을 주입된 중량, 용액 밀도 및 브릭스(Brix) 방법으로 결정된 글루코스 농도 ([글루코스])를 기초로 계산하였다.
메티오닌 수율은 하기와 같이 표현되었다:
배양 동안 수득된 최대 수율이 여기에서 각각의 균주에 대해 제시되었다.
상기 식에서 메티오닌0 및 메티오닌t는 각각 초기 및 최종 메티오닌 농도이고, V0 및 Vt는 초기 및 t 시점의 부피이다.
소비된 글루코스를 하기와 같이 계산하였다:
주입된 글루코스t = 공급된 부피t * [글루코스]
소비된 글루코스t = [글로코스]0 * V0 + 주입된 글루코스 - [글루코스]잔류 * Vt
상기 식에서, [글루코스]0, [글루코스], [글루코스]잔류는 각각 초기 글루코스 농도, 공급된 글루코스 농도 및 잔류 글루코스 농도이다.
2. 균주 5 및 7에서의 세린 데아미나제 활성 ( SDA )의 결정
SDA 활성을 시험관 내에서 결정하기 위해, 이. 콜라이 균주를 상기 기술된 바와 같은 최소 배지에서 배양하였고, 원심분리에 의해 수확하였다. 펠릿을 저온 50 mM 글리실글리신 완충제 (pH 8) + 3 mM FeSO4, 30 mM DTT 및 EDTA가 없는 프로테아제 억제제 칵테일 내에 현탁시켰다. 그 후, 세포를 프리셀라이스 (버틴 테크놀로지스; 6500 rpm에서 2×10s)로의 비드 비팅에 의해 용해시키고, 이어서 30분 동안 12000g (4℃)에서 원심분리하였다. 상청액을 탈염시키지 않고, 효소 분석에 사용하였다. 브래드포드 검정 시약 (문헌 [Bradford, 1976])을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
SDA 활성을 결정하기 위해, 100 ㎍의 조 세포 추출물을 50 mM 글리실글리신 완충제 (pH 8) + 3 mM FeSO4, 30 mM DTT 및 50 mM L-세린에서 검정하였다. 조 세포 추출물을 첨가하여 반응을 개시시켰다. 37℃에서 5분 및 20분 동안 인큐베이션한 후, 0.4 ㎖의 톨루엔을 첨가하였고, HCl 내의 2-4-디니트로페닐히드라진으로 반응을 정지시켰다. 균질화 후, 제제 혼합물을 실온에서 5분 동안 3500 rpm에서 원심분리하였고, 상부 상을 10％ (w/v) 탄산나트륨으로 처리하였다. 균질화 후, 제제 혼합물을 실온에서 1분 동안 3500 rpm에서 원심분리하였고, 하부 상을 1.5 M NaOH로 처리하였다. 10분 인큐베이션 후, 알칼리성 용액 내의 케토-산 히드라존의 색을 측정함으로써 생산된 피루베이트의 양을 540 nm에서 분광광도법으로 결정하였다. 15분 기간 이내에 색 강도가 변하지 않았다. 모든 실험에서, L-세린이 없는 대조군을 실행시켰고, 분광광도법 측정치에 대한 블랭크로서 사용하였다.
<표 13>
표 13에서 볼 수 있듯이, 균주 5의 SDA 활성은 야생형 균주 7의 활성보다 100배 초과로 더 낮다. SDA 활성의 이러한 유의한 감소는 메티오닌 생산의 개선과 상관되었다 (표 12 참조).
SdaA*의 경우 잔류 세린 데아미나제 활성이 있다는 것을 인지하는 것이 중요하고, 이는 세포의 생리학에 중요한 것일 수 있다.
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ctcacaaaac cctggcgggt ccgaaaggag gcctgatcct ggcgaaagg 49
Claims (16)
- - 변형된 미생물을 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계, 및
- 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계
를 포함하고, 이때 미생물이 트레오닌의 메티오닌 이외의 화합물로의 변환을 감소시키는 방식으로 변형된 것인, 발효 공정에서의 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체의 생산 방법. - 제1항에 있어서, 트레오닌으로부터의 글리신 생산이 감소되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 트레오닌을 글리신으로 변환시키는 효소의 활성이 감소되는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 하기의 유전자, 즉, ltaE, kbl, glyA, tdh 중 하나 이상의 발현이 약화되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 트레오닌 알돌라제(aldolase) 활성이 약화된 돌연변이체 GlyA 효소가 발현되는 한편, 상기 효소 GlyA의 세린 히드록시메틸 트랜스퍼라제(transferase) 활성은 유지되는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 GlyA 효소가 그의 폴리펩티드 서열 내에 하기의 아미노산 변화, 즉, T128S, T224S, T225S, T226S, T227S, T230S, R235K 중 하나 이상을 갖는 것인 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 유전자 glyA가 미생물로부터 결실된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 트레오닌으로부터의 이소류신 생산이 감소되는 방식으로 미생물이 변형되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 트레오닌의 알파-케토부티레이트로의 탈아미노화 및/또는 탈수가 감소되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 하기의 효소 활성, 즉, 트레오닌 데아미나제(deaminase), 트레오닌 데히드라타제(dehydratase) 중 하나 이상이 약화되는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 하기 유전자, 즉, ilvA, tdcB, sdaA, sdaB, tdcG 중 하나 이상의 발현이 약화되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 내의 세린 이용가능성이 증가되는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 유전자 serA, serB, serC 중 하나 이상의 발현을 증가시킴으로써 미생물에서 세린 생산이 증가되는 것인 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 세린 데아미나제 활성이 있는 효소를 코딩하는 유전자 sdaA 또는 sdaB 중 하나 이상의 활성을 약화시킴으로써 세린 분해가 감소되는 것인 방법.
- 제11항 또는 제14항에 있어서, sdaA 유전자가 그의 핵산 서열 내에 T158G 뉴클레오티드 변화를 갖는 것인 방법.
- - metJ 유전자의 결실,
- 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 대립유전자 metA의 발현, 및
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기술된 것과 같은 변형 중 하나 이상
을 포함하는 변형된 미생물.
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