JP5944323B2 - メチオニンの生産における誘導プロモーターの使用 - Google Patents
メチオニンの生産における誘導プロモーターの使用 Download PDFInfo
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Description
本発明は、発酵によるメチオニンの生産における誘導プロモーターの使用に関する。
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は、細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用されるべく工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような障害のための治療薬として直接用いられる。しかしながら、生産されるメチオニンの大部分は動物飼料に添加されている。
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程:
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび/またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該改変微生物において、メチオニン生産に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある方法に関する。
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程:
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび/またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該改変微生物において、メチオニン生産に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある方法に関する。
メチオニン生産を向上させるために改変されていること、および
メチオニン生産に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現が誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にあること
の双方の特徴を持つ。
遺伝子 受託番号 機能
cysK 1788754 システインシンターゼ
cysZ g1788753 cysK の上流のORF
cysN g1789108 ATPスルフリラーゼ
cysD g1789109 硫酸アデニリルトランスフェラーゼ
cysC g1789107 アデニリル硫酸キナーゼ
cysZ 1788753 硫酸輸送
sbp 1790351 周辺質硫酸結合タンパク質
b)補充反応は以下の遺伝子を発現させることにより増強することができる。
ppc 1790393 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
pps 1787994 ホスホエノールピルビン酸シンターゼ
pyc CAB13359 ピルビン酸カルボキシラーゼ
(例えば枯草菌(B. subtilis)由来)
c)酢酸消費反応は下記遺伝子を過剰発現させることにより増強することができる。
acs 1790505 アセチルCoAシンセターゼ
d)メチオニン生合成に直接関与する酵素:
metA 1790443 ホモセリンO-トランススクシニラーゼ
metB 1790375 シスタチオニンγ-シンターゼ
metC 1789383 シスタチオニンβ-リラーゼ
metE 2367304 5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸
-ホモシステインS-メチルトランスフェラーゼ
metF 1790377 5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ
metH 1790450 B12依存性ホモシステイン-N5-
メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼ
metK 1789311 メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ
metL 1790376 アスパルトキナーゼII/ホモセリンデヒドロゲナーゼII
e)アスパラギン酸代謝に関与する酵素:
asd 1789841 アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
aspC 1787159 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
lysC 1790455 アスパルトキナーゼIII
ackA 1788633 酢酸キナーゼ
pta 1788635 ホスホトランスアセチラーゼ
aceE 1786304 ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1
aceF 1786305 ピルビン酸デヒドロゲナーゼE2
lpd 1786307 ピルビン酸デヒドロゲナーゼE3
sucC 1786948 スクシニル-CoAシンセターゼ、βサブユニット
sucD 1786949 スクシニル-CoAシンセターゼ、αサブユニット
pck 1789807 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ
maeB
poxB 1787096 ピルビン酸オキシダーゼ
ilvB 1790104 アセトヒドロキシ酸シンターゼI、大サブユニット
ilvN 1790103 アセトヒドロキシ酸シンターゼI、小サブユニット
ilvG 1790202 アセトヒドロキシ酸シンターゼII、大サブユニット
1790203
ilvM 1790204 アセトヒドロキシ酸シンターゼII、小サブユニット
ilvI 1786265 アセトヒドロキシ酸シンターゼIII、大サブユニット
ilvH 1786266 アセトヒドロキシ酸シンターゼIII、小サブユニット
aroF 1788953 DAHPシンセターゼ
aroG 1786969 DAHPシンセターゼ
aroH 1787996 DAHPシンセターゼ
thrB 1786184 ホモセリンキナーゼ
thrC 1786185 トレオニンシンターゼ
sdaA 1788116 セリンデアミナーゼ
sdaB 1789161 セリンデアミナーゼ
speD 1786311 S-アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ
speC 1789337 オルニチンデカルボキシラーゼ
astA 1788043 アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ
dapA 1788823 ジヒドロ二ピコリン酸シンターゼ
mdh 1789632 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
mqo 1788539 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、FAD/NAD(P)-結合ドメイン
gltA 1786939 クエン酸シンターゼ
aceE 1786304 ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、E1
aceF 1786305 ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、E2
(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各PFAMにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。
N−アセチルメチオニンの蓄積が低減されたメチオニン生産株は、特許出願WO2007077041およびWO2009043803(参照により本願の一部とされる)に記載されている。
ホスホセリンホスファターゼのレベルを高めるため、構成型人工trcプロモーターSerBを、MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA株のserB遺伝子の上流に付加した。
この配列は以下の領域を有する。
・遺伝子serBの領域の4622816〜4622878の配列と相同な領域(大文字)
・T7ファージ由来のT7Te転写ターミネーター配列に関する領域(下線の大文字)(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
この配列は以下の領域を有する。
・遺伝子serBの領域の4622939〜4622879の配列と相同な領域(大文字)
・trcプロモーター配列に関する領域(斜体の大文字)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(太字の大文字)(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)
次に、カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのFRT部位に作用するリコンビナーゼFLPを有するpCP20プラスミドを、エレクトロポレーションによって組換え株MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07−serB::Kmに導入した。42℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチドserBF(配列番号03)/serBR(配列番号04)を用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07−serBと呼称した。
pCC1BAC−serA−serCベクターの構築はWO2009043803に記載されている。
pCL1920−TTadc−CI857−PλR*(−35)−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11プラスミドは、プラスミドpCL1920(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)、pME101−thrA*1−cysEおよびpFC1(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)に由来する。
プラスミドpCL1920−TTadc−CI857−PλR*(−35)−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11の構築のため、TTadc−CI857−PλR*(−35)−thrA*1−cysE領域およびPgapA−metA*11領域をそれぞれオーバーラッピングPCRによって得た後、一緒にpCL1920ベクターにクローニングした。
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(小文字)
・ApaI部位を担持する領域(下線の大文字)
・TTadc転写ターミネーター配列(pSLO1メガプラスミドの179847〜179807と相同な、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)由来adc遺伝子の転写ターミネーター)に関する領域(大文字)
・λバクテリオファージ由来cI857遺伝子の3’末端と相同な領域(太字の大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・thrA遺伝子の5’末端(1塩基(太字斜体の大文字)を除く337〜348)と相同な領域(太字の大文字)
・*(−35)型PR(−35コンセンサスを得るために−35ボックスがTTGACTからTTGACAへ改変されている変異型)を得るための1塩基(斜体の大文字)を除き、λバクテリオファージPRプロモーターと相同な領域(大文字)
・PλR−thrA−F−3オリゴヌクレオチドとのオーバーラッピング領域(下線の大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・λバクテリオファージPRプロモーターと相同な領域(大文字)
・thrA遺伝子の5’末端(1塩基(太字斜体の大文字)を除く337〜377)と相同な領域(太字の大文字)
・PλR−thrA−R−2オリゴヌクレオチドとのオーバーラッピング領域(下線の大文字)
(pME101−thrA*1−cysEプラスミドのcysE下流領と相同)
これらのthrA*1遺伝子およびcysE遺伝子を低コピーベクターに導入するため、pSCB−TTadc−CI857−PλR*(−35)−thrA*1−cysEベクターをBsrBIおよびBamHIで制限酵素処理し、TTadc−CI857−PλR*(−35)−thrA*1−cysE断片をベクターpCL1920のSmaI/BamHI部位にクローニングし、ベクターpCL1920−TTadc−CI857−PλR*(−35)−thrA*1−cysEを得た。
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(小文字)
・SmaI部位を担持する領域(下線の大文字)
・大腸菌(Escherichia coli)のPgapAプロモーター配列の1860639〜1860661と相同な領域(大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・metA遺伝子の4212335〜4212303と相同な領域(太字の大文字)
・PgapAプロモーター配列の1860794〜1860761と相同な領域(大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・metA遺伝子の4212335〜4212303と相同な領域(太字の大文字)
・PgapAプロモーター配列の1860794〜1860761と相同な領域(大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(小文字)
・BamHI部位を担持する領域(下線の大文字)
・EcoRI部位を担持する領域(斜体の大文字)
・metA遺伝子配列の4213248〜4213218と相同な領域(太字の大文字)
株1:MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07−serB(pCC1BAC−serA−serC)(pCL1920−TTadc−CI857−PλR*(−35)−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11)
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。5.5mLの前培養物を混合培地(2.5g/Lグルコースおよび90%最小培地PC1を含む10%LB培地(Sigma25%))中で、30℃で21時間増殖させた。これを用いて、培地PC1においてOD600が0.2となるよう50mL培養物に植菌を行った。培養温度は30℃または37℃のいずれかとした。培養物のOD600が5〜7に達した際に、細胞外アミノ酸を、OPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたHPLC(有機酸およびグルコース)およびシリル化後のGC−MSを用いて分析した。各条件につき3反復を行った。
表3:ホモセリンデヒドロゲナーゼ(HDH)活性およびセリンアセチルトランスフェラーゼ(SAT)活性を上記培養において測定し、mUI/mg DWで示した。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて計算した(N=反復回数)。
N−アセチルメチオニン蓄積が低減されたメチオニン生産株は、特許出願WO2007077041およびWO2009043803(引用することにより本明細書の一部とされる)に記載されている。
プラスミドpBeloBAC11−PT7−RBST7−thrA*1−SMC−cysE−PgapA−metA*11−T7TΦは、プラスミドpBeloBAC11(New England BioLabs; Kim et al, 1996, Genomics, 34, 231-218)およびpCL1920−TTadc−CI857−PλR*(−35)−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11(上記)に由来する。
この配列は以下の領域を有する。
・thrA遺伝子の3’末端(2765〜2799)と相同であり(小文字)、SnaBI制限部位(斜体小文字)を担持する領域
・NheIおよびXhoI制限部位(斜体太字の文字)を担持するSMC領域に関する領域(太字の文字)
・cysE遺伝子の5’上流領域(3780796〜3780819)と相同な領域(大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・SfoI制限部位を担持する領域(斜体の大文字)
・T7バクテリオファージのT7p45(10A)遺伝子のプロモーター領域(22858〜22967)と相同な領域(小文字)
・thrA遺伝子(1塩基(太字下線の大文字)を除く337〜359)と相同な領域(太字の大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・SfoI制限部位を担持する領域(斜体の大文字)
・T7バクテリオファージのT7p45(10A)遺伝子の転写ターミネーター領域(24111〜24218)と相同な領域(小文字)
・metA遺伝子(4213208〜4213232)と相同な領域(太字の大文字)
malS領域を欠失させてTTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNAPol−TT07領域に置き換えるため、Datsenko & Wanner (2000)に記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する領域の大部分を欠失させるとともに、カナマイシン耐性カセットと付加的DNAを挿入することを可能とする。この目的で、下記のプラスミドpUC18−DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNAPol−TT07::Kmを構築した。
プラスミドpUC18−DmalS::SMC::Kmの構築のために、malSの上流領域(upmalS)、多重クローニング部位(SMC)およびカナマイシンカセット(Km)をオーバーラッピングPCRによって得、malSの下流領域(downmalS)を増幅した後にクローニングした。
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(小文字)
・HindIII制限部位を担持する領域(斜体の大文字)
・malS遺伝子の上流領域(3734620〜3734641)と相同な領域(大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(小文字)(Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645に参照配列)
・malS遺伝子の上流領域(3735836〜3735860)と相同な領域(大文字)
この配列は以下の領域を有する。
・malS遺伝子の上流領域(3735836〜3735860)と相同な領域(大文字)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(小文字)(Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645に参照配列)
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(大文字)
・BamHI、XhoI、SacII、BstZ17I、ApaI制限部位を担持するSMCに関する領域(斜体の大文字)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域(小文字)(Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645に参照配列)
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(大文字)
・EcoRI制限部位を担持する領域(斜体の大文字)
・malS遺伝子の下流領域(3737020〜3737044)と相同な領域(小文字)
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(大文字)
・EcoRI制限部位を担持する領域(斜体の大文字)
・malS遺伝子の下流領域(3738372〜3738398)と相同な領域(小文字)
プラスミドpUC18−DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNAPol−TT07::Kmの構築のために、pCR4BluntTOPO−TTadc−CI857*−PλR*(−35)−RBS01−SMC−TT07(Geneartにより合成)中に存在するTTadc−CI857*−PλR*(−35)−RBS01−SMC−TT07領域(下記)をApaIおよびBamHIにより制限酵素処理し、断片をプラスミドpUC18−DmalS::SMC::KmのApaIおよびBamHI制限部位にサブクローニングし、プラスミドpUC18−DmalS::TTadc−CI857*−PλR*(−35)−RBS01−SMC−TT07::Kmを得た。次に、このPλR03−RBS01−T7RNApol−TT07領域を、下記のオリゴヌクレオチドAvrII−PλR03−RBS01−T7RNApol−F(配列番号24)およびT7RNApol−BstZ17I−TT07−BamHI−XhoI−R(配列番号25)(ウェブサイトhttp://ecogene.org/およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553&begin=21516に参照配列)を用い、ベクターpAR1219(Sigma)から増幅した。次に、このPCR産物をAvrIIおよびBamHIにより制限酵素処理し、その断片を部分的にAvrIIおよびBamHIで制限酵素処理したpUC18−DmalS::TTadc−CI857*−PλR*(−35)−RBS01−SMC−TT07::Kmプラスミドにクローニングし、pUC18−DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Kmプラスミドを得、これをDNA配列決定法により確認した。
この配列は以下の領域を有する。
・制限部位ApaI、PacI、AvrIIおよびBamHIを担持する領域(斜体の小文字)
・TTadc転写ターミネーター配列(pSLO1メガプラスミドの179847〜179807と相同な、クロストリジウム・アセトブチリクム由来adc遺伝子の転写ターミネーター)(TTadc)と相同な領域
・いくつかの制限部位を作出するまたは欠失させる目的でコドン使用変化(斜体の大文字)を担持するcI857遺伝子(CI857*)と相同な領域(大文字)
・*(−35)型PR(−35コンセンサスを得るために−35ボックスがTTGACTからTTGACAへ改変されている変異型)(PλR*(−35))を得るための1塩基(斜体の大文字)を除き、λバクテリオファージPRプロモーターと相同な領域(大文字)
・リボソーム結合部位(RBS01)に関する領域(下線太字の大文字)
・BstZ17I制限部位を担持する領域(SMC)(下線斜体の大文字)
・T7Te転写ターミネーター配列(Harrington et al., 2001, PNAS, 98(9), 5019-24)(TT07)に関する領域
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(小文字)
・AvrII制限部位を担持する領域(斜体の大文字)
・PλR03変異型PRプロモーターを得るための2塩基(斜体の太字の大文字)を除き、λバクテリオファージPRプロモーターと相同な領域(太字の大文字)
・リボソーム結合部位(下線の大文字)
・バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ遺伝子(T7p07遺伝子)の5’末端(3171〜3198)と相同な領域(太字の小文字)
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域(小文字)
・XhoIおよびBamHI制限部位を担持する領域(斜体の大文字)
・T7Te転写ターミネーター配列(Harrington et al., 2001, PNAS, 98(9), 5019-24)に関する領域(太字の大文字)
・BstZ17I制限部位を担持する領域(下線斜体の大文字)
・バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ遺伝子(T7p07遺伝子)の3’末端(5801〜5822)と相同な領域(太字の小文字)
最後に、malS領域を欠失させてTTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNAPol−TT07領域に置き換えるために、pUC18−DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::KmプラスミドをScaIおよびEcoRVにより制限酵素処理し、DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km断片を、エレクトロポレーション(electroportation)によってMG1655 metA*11(pKD46)株に導入した(ここで、発現されるRedリコンビナーゼ酵素が相同組換えを可能とする)。次に、このカナマイシン耐性形質転換体を選択し、DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km断片の挿入を、オリゴヌクレオチドmalS−F(配列番号26)、Km−R(配列番号27)、T7RNApol−F(配列番号28)およびmalS−R(配列番号29)(ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553&begin=1#protmap;およびDatsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645に参照配列)を用いたPCR分析により確認した。この株をMG1655 metA*11 DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Kmと呼称した。
malS−F(配列番号26):
(malS領域の3734280〜3734299と相同)
(pKD4ベクターのカナマイシン耐性カセットと相同)
T7RNApol−F(配列番号28):
(バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ遺伝子(T7p07遺伝子)の5274〜5293と相同)
malS−R(配列番号29):
(malS領域の3738453〜3738471と相同)
MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA(pBeloBAC11−PT7−RBST7−thrA*1−SMC−cysE−PgapA−metA*11−T7TΦ)株において、malS領域を欠失させてTTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNAPol−TT07領域に置換するために、DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km構築物を、P1ファージ形質導入(下記参照)によってMG1655 metA*11 DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km株からMG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA(pBeloBAC11−PT7−RBST7−thrA*1−SMC−cysE−PgapA−metA*11−T7TΦ)株に移入した。カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km領域の挿入を、従前に記載されているオリゴヌクレオチドmalS−F(配列番号26)、Km−R(配列番号27)、T7RNApol−F(配列番号28)およびmalS−R(配列番号29)を用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km(pBeloBAC11−PT7−RBST7−thrA*1−SMC−cysE−PgapA−metA*11−T7TΦ)と呼称した。
・カナマイシン(50μg/mL)、グルコース(0.2%)およびCaCl2(5mM)を添加した10mLのLBの、MG1655 metA*11 DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Kmの一晩培養物100μlを植菌する。
・振盪しながら30℃で1時間インキュベートする。
・MG1655株で調製されたP1ファージ溶解液100μL(約1.109ファージ/mL)を添加する。
・総ての細胞が溶解するまで30℃で3時間振盪する。
・200μLのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・4500gで10分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移し、200μLのクロロホルムを加える。
・溶解液を4℃で保存する。
・LB培地中のMG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA(pBeloBAC11−PT7−RBST7−thrA*1−SMC−cysE−PgapA−metA*11−T7TΦ)株の一晩培養物5mLを1500gで10分間遠心分離する。
・2.5mLの10mM MgSO4、5mM CaCl2に細胞ペレットを懸濁させる。
・対照試験管:100μLの細胞
100μLのP1ファージMG1655 metA*11 DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km株
・供試試験管:100μLの細胞+100μLのP1ファージMG1655 metA*11 DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km株
・振盪せずに30℃で30分間インキュベートする。
・各試験管に100μLの1Mクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・1mLのLBを加える。
・振盪しながら30℃で1時間インキュベートする。
・試験管を7000rpmで3分間遠心分離した後、カナマイシン(50μg/mL)を添加したLBディッシュ上に拡げる。
・30℃で一晩インキュベートする。
株2:MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA DmalS::TTadc−CI857*−PλR03−RBS01−T7RNApol−TT07::Km(pBeloBAC11−PT7−RBST7−thrA*1−SMC−cysE−PgapA−metA*11−T7TΦ)株
前培養条件および培養条件は上記の実施例1に記載されている。スペクチノマイシンの代わりにカナマイシンを用いた。培養温度は30℃または34℃のいずれかとした。
表4:30℃および34℃で株2によりバッチ培養にて生産されたメチオニン収率(Ymet)(メチオニンg/グルコースgの%)。メチオニン/グルコース収率の厳密な定義については上記を参照。SDは、数回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す。
表5:ホモセリンデヒドロゲナーゼ(HDH、thrA*1)活性およびセリンアセチルトランスフェラーゼ(SAT、cysE)活性を上記培養において測定し、mUI/mgタンパク質で表した。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて計算した(N=反復回数)。
1.プロトコール
いくつかのプロトコールを用いてメチオニン生産株を構築したが、これらを下記の実施例に記載する。
特定の染色体遺伝子座における対立遺伝子置換または遺伝子破壊は、Datsenko. & Wanner (2000)により記載されているように相同組換えによって行った。Flp認識部位が隣接したクロラムフェニコール(Cm)耐性cat遺伝子、カナマイシン(Km)耐性kan遺伝子、ゲンタマイシン(Gt)耐性gm遺伝子またはテトラサイクリン(Tc)耐性tet遺伝子を、PCRにより、鋳型としてそれぞれpKD3またはpKD4、p34S−Gm(Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715)またはpLOI2065(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)プラスミドを用いることで増幅した。得られたPCR産物を用いて、λRed(γ、β、exo)リコンビナーゼを発現するプラスミドpKD46を担持するレシピエント大腸菌株を形質転換した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、突然変異遺伝子座の染色体構造を、表2に一覧化されている適当なプライマーを用いたPCR分析により確認した。
染色体改変をP1形質導入により、所与の大腸菌レシピエント株に移入した。このプロトコールは、(i)耐性関連の染色体改変を含むドナー株のファージ溶解液の調製と、(ii)このファージ溶解液によるレシピエント株の感染、の2工程から構成される。
・10mlのLB+Cm 30μg/mlまたはKm 50μg/mlまたはGt 10μg/mLまたはTet 10μg/mL+グルコース0.2%+CaCl2 5mM中、目的の染色体改変を有するMG1655株の一晩培養物100μlを植菌する。
・振盪しながら37℃で30分間インキュベートする。
・ドナーMG1655株で調製されたP1ファージ溶解液100μl(約1×109ファージ/mL)を添加する。
・37℃で3時間、細胞が完全に溶解するまで振盪する。
・200μLのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・4500gで10分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移す。
・溶解液を4℃で保存する。
・LB培地中で培養した大腸菌レシピエント株の一晩培養物5mlを1500gで10分間遠心分離する。
・2.5mlのMgSO4 10mM、CaCl2 5mMに細胞ペレットを懸濁させる。
・100mlの細胞に、染色体に改変を伴うMG1655株のP1ファージ100μl(供試試験管)および対照試験管としてP1ファージを含まない100μl細胞および細胞を含まない100μlのP1ファージを感染させる。
・振盪せずに30℃で30分間インキュベートする。
・各試験管に100μLの1Mクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・1mLのLBを加える。
・振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。
・7000rpmで3分間遠心分離する。
・LB+Cm 30μg/mlまたはKm 50μg/mlまたはGt 10μg/mLまたはTet 10μg/mLに播種する。
・37℃で一晩インキュベートする。
メチオニン生産株3(表6)は特許出願EP10306164.4およびUS61/406249に記載されている。これらの出願は引用することにより本願の一部とされる。
特許出願EP10306164.4およびUS61/406249に記載されているΔwcaM::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Cm染色体改変を、プロトコール2に従い、特許出願EP10306164.4およびUS61/406249に記載されているMG1655 metA*11 pKD46 ΔwcaM::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Cm株からのP1ファージ溶解液を用いて株3(表6)に形質導入した。
プラスミドpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔyjbI::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tcは、上記のプラスミドpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔpgaABCD::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::TcおよびpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔyjbI::TT02−SMC、下記のpMA−RQ−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−RBS01*2、およびpLOI2065(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)に由来する。
プラスミドpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔpgaABCD::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tcは、上記のpMA−RQ−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−RBS01*2、pLOI2065(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)、および特許出願EP10306164.4およびUS61/406249に記載されているpUC18−ΔpgaABCD::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Cmに由来する。
pMA−RQ−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−RBS01*2は、GeneArt(http://www.geneart.com/)により合成されたプラスミドpMA−RQ−TTadc−CI*1−PλR*(−35)−RBS01*2およびpMA−RQ−TTadc−CI*3−PλR*(−35)−RBS01*2に由来する。TTadc−CI*1−PλR*(−35)−RBS01*2断片およびTTadc−CI*3−PλR*(−35)−RBS01*2断片をGeneArtからのプラスミドpMA−RQのSfiI部位にクローニングした。これらは下記の配列を含む。
この配列において
・下線の小文字は、SfiIおよびAscI制限部位に相当する。
・太字の小文字は、逆配向のRBS01*2配列(TAAGGAGGTTATAA)およびPsiI制限部位に相当する。
・斜体の大文字は、λバクテリオファージPRプロモーター(PλR*(−35)(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148))と相同である。
・大文字は、ヌクレオチドT67がC67に変化して1アミノ酸変異Tyr23Hisを生じている(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)、λバクテリオファージのレプレッサータンパク質cIの配列に相当する。この配列をcI*1と呼称した。
・太字の大文字は、逆配向のTTadc転写ターミネーター配列(pSLO1メガプラスミドの179847〜179807と相同なクロストリジウム・アセトブチリクム由来adc遺伝子の転写ターミネーター)と相同である。
・下線の大文字は、ApaI、PacIおよびSfiIに相当する。
この配列において
・下線の小文字は、SfiIおよびAscI制限部位に相当する。
・太字の小文字は、逆配向のRBS01*2配列(TAAGGAGGTTATAA)およびPsiI制限部位に相当する。
・斜体の大文字は、λバクテリオファージPRプロモーター(PλR*(−35)、(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148))と相同である。
・大文字は、ヌクレオチド196−CTTGCG−201が196−GCGACA−201に変化して2アミノ酸変異Leu66AlaおよびAla67Thrを生じている(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)、λバクテリオファージのレプレッサータンパク質cIの配列に相当する。この配列をcI*3と呼称した。
・太字の大文字は、逆配向のTTadc転写ターミネーター配列(pSLO1メガプラスミドの179847〜179807と相同なクロストリジウム・アセトブチリクム由来adc遺伝子の転写ターミネーター)と相同である。
・下線の大文字は、ApaI、PacIおよびSfiIに相当する。
pMA−RQ−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−RBS01*2を構築するために、上記のpMA−RQ−TTadc−CI*3−PλR*(−35)−RBS01*2から精製したXmnI/NsiI断片NsiI−CI*3−PλR*(−35)−RBS01*2−XmnIを、上記のプラスミドpMA−RQ−TTadc−CI*1−PλR*(−35)−RBS01*2のXmnI部位とNsiI部位の間にクローニングし、cIタンパク質レプレッサーの野生型対立遺伝子を作出した。得られたプラスミドをDNA配列決定法により確認し、pMA−RQ−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−RBS01*2と呼称した。
pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔpgaABCD::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Cmプラスミドは、特許出願EP10306164.4およびUS61/406249に記載されているpUC18−ΔpgaABCD::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Cm、および上記のpMA−RQ−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−RBS01*2に由来する。
この配列において
・下線の大文字は、HindIII制限部位および余分な塩基に相当する。
・太字の大文字の配列は、プラスミドpKD4のFRT配列(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する。
・大文字の配列は、pLOI2065に位置するテトラサイクリン耐性遺伝子の配列(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)と相同である。
この配列において
・下線の大文字は、SmaIおよびBstZ17I制限部位および余分な塩基に相当する。
・太字の大文字の配列は、プラスミドpKD4のFRT配列(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する。
・大文字の配列は、pLOI2065に位置するテトラサイクリン耐性遺伝子の配列(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)と相同である。
ΔyjbI::TT02−MCS断片を構築するために、yjbIの上流領域(upyjbI)、TT02転写ターミネーター、多重クローニング部位(MCS)およびyjbIの下流領域(downyjbI)の間でオーバーラッピングPCRを行った。
この配列において
・下線の大文字は、SfoIおよびKpnI制限部位および余分な塩基に相当する。
・大文字の配列は、yjbI遺伝子の上流配列(4247987〜4248009、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
この配列において
・下線の大文字の配列は、BstZ17I制限部位および多重クローニング部位の開始部に関するものである。
・大文字の配列は、大腸菌rrnBの転写ターミネーターT1(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当する。
・太字の大文字の配列は、yjbI遺伝子の下流配列(4248931〜4248980、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
この配列において
・大文字の配列は、大腸菌rrnBの転写ターミネーターT1(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当する。
・太字の大文字の配列は、多重クローニング部位:BstZ17I、HindIII、AvrII、ApaI、PacIを含む。
・下線の大文字の配列は、yjbI遺伝子の下流配列(4250286〜4250335、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
この配列において
・下線の大文字は、SfoIおよびKpnI制限部位および余分な塩基に相当する。
・大文字の配列は、yjbI遺伝子の上流配列(4251224〜4251249http://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−DyjbI::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tcを構築するために、pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔpgaABCD::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tcから精製したBstZ17I/SmaI断片PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tcを、大腸菌DNAポリメラーゼIのラージ(クレノウ)断片により処理したプラスミドpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔyjbI::TT02−SMCのPacI/BstZ17I部位間にクローニングした。選択されたプラスミドはpUC18プラスミドのamp耐性カセットと同配向でtc耐性カセットを有し、これをDNA配列決定法により確認し、pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−DyjbI::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tcと呼称した。
3.2.MG1655 metA*11 DyjbI::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tc pKD46株の構築
ΔyjbI::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tc染色体改変を、プロトコール2に従い、上記のMG1655 metA*11 pKD46 ΔyjbI::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Tc株からのP1ファージ溶解液を用い、上記の株4(表6)に形質導入した。
プラスミドpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔmelB::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gtは、下記のpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔCP4−6::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::GtおよびpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔmelB::TT02−MCS::Gtに由来する。
プラスミドpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔCP4−6::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gtは、上記のpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔCP4−6::TT02−SMC::GtおよびpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔpgaABCD::TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Cmに由来する。
プラスミドpMA−ΔCP4−6::TT02−MCS::Gtを構築するために、FRT−Gt−FRT耐性カセットを、鋳型としてp34S−Gmを用い、プライマーBstZ17I−FRT−Gt−F(配列番号44)およびHindIII−FRT−Gt−R(配列番号45)を用いたPCRにより増幅した。
この配列において
・下線の大文字の配列は、SmaIおよびBstZ17I制限部位および余分な塩基に関するものである。
・太字の大文字の配列は、FRT配列(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する。
・大文字の配列は、p34S−Gmに位置するゲンタマイシン遺伝子の配列(Dennis et Zyltra, AEM July 1998, p 2710-2715)と相同である。
この配列において
・下線の大文字の配列は、HindIII制限部位および余分な塩基に関するものである。
・太字の大文字の配列は、FRT配列(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する。
・大文字の配列は、p34S−Gmに位置するゲンタマイシン遺伝子の配列(Dennis et Zyltra, AEM July 1998, p 2710-2715)と相同である。
pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔCP4−6::TT02−SMC::Gtを構築するために、上記のpMA−ΔCP4−6::TT02−MCS::Gtから精製したStuI/BsrBI断片ΔCP4−6::TT02−SMC::Gtを、大腸菌DNAポリメラーゼIのラージ(クレノウ)断片により処理したプラスミドpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔpgaABCD::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::CmのEcoRI部位間にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定により確認し、pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔCP4−6::TT02−SMC::Gtと呼称した。
ΔmelB::TT02−MCS断片を構築するために、melBの上流領域(upmelB)、TT02転写ターミネーター、多重クローニング部位(MCS)およびmelBの下流領域(downmelB)の間でオーバーラッピングPCRを行った。
この配列において
・下線の大文字は、SfoIおよびKpnI制限部位および余分な塩基に相当する。
・大文字の配列は、melB遺伝子の上流配列(4340489〜4340513、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
この配列において
・下線の大文字の配列は、BstZ17I制限部位および多重クローニング部位の開始部に関するものである。
・大文字の配列は、大腸菌rrnBの転写ターミネーターT1(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当する。
・太字の大文字の配列は、melB遺伝子の下流配列(4341377〜4341406、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
この配列において
・大文字の配列は、大腸菌rrnBの転写ターミネーターT1(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当する。
・太字の大文字の配列は、多重クローニング部位:BstZ17I、HindIII、AvrII、ApaI、BamHIを含む。
・下線の大文字の配列は、melB遺伝子の下流配列(4342793〜4342818、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
この配列において
・下線の大文字は、SfoIおよびKpnI制限部位および余分な塩基に相当する。
・大文字の配列は、melB遺伝子の上流配列(4343694〜4343719、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔmelB::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gtを構築するために、上記のpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔCP4−6::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gtから精製したBstZ17I/BamHI断片PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gtを、上記のプラスミドpUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔmelB::TT02−SMCのBstZ17I/BamHI部位間にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定により確認し、pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−DmelB::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gtと呼称した。
melB遺伝子をTT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gt領域で置換するために、pUC18−TTadc−CI*0−PλR*(−35)−ΔmelB::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11:GtをAhdIおよびSphI制限酵素で消化し、残存する消化断片ΔmelB::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gtを、プロトコール1に従ってMG1655 metA*11 pKD46株に導入した。
ΔmelB::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gt染色体改変を、プロトコール2に従い、上記のMG1655 metA*11 pKD46 ΔmelB::TT02−TTadc−PλR*(−35)−RBS01−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11::Gt株からのP1ファージ溶解液を用い、上記の株5(表6)に形質導入した。
プラスミドpBeloBAC11−PL1*1/RBS01*2−thrA*1−SMC−cysE−PgapA−metA*11−T7TΦプラスミドは、本特許出願の実施例2に記載されているプラスミドpBeloBAC11−PT7/RBST7−thrA*1−SMC−cysE−PgapA−metA*11−T7TΦに由来する。
この配列において
・下線の大文字は、SfoI、HpaIおよびAvrII制限部位および余分な塩基に相当する。
・太字の大文字の配列は、λバクテリオファージPLプロモーター(PL1 Giladi et al, FEMS Microbiol Rev. 1995 Aug;17(1-2):135-40)の短鎖型に相当し、−10ボックスにおける突然変異(Kincade & deHaseth, Gene. 1991 Jan 2;97(1):7-12に記載されているG−12T)を担持する。このプロモーターはPL1*1と呼ばれる。
・小文字:5つの塩基がPL1*1の転写開始部位とリボソーム結合部位RBS01*2の間に挿入されている。
・斜体の大文字は、RBS01*2配列に相当する。
・下線の大文字の配列は、thrA*1遺伝子(337〜354、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列)と相同である。
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。5.5mLの前培養物を混合培地(2.5g/Lグルコースおよび90%最小培地PC1を含む10%LB培地(Sigma25%))中で21時間増殖させた。これを用いて、培地PC1においてOD600が0.2となるよう50mL培養物に植菌を行った。必要であれば、ゲンタマイシンを10mg/L濃度、クロラムフェニコールを30mg/L濃度およびテトラサイクリンを5mg/L濃度で加えた。培養物のOD600が5〜7に達した際に、細胞外アミノ酸を、OPA/Fmoc誘導体化後にHPLCにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたHPLC(有機酸およびグルコース)およびシリル化後のGC−MSを用いて分析した。
表11:ホモセリンデヒドロゲナーゼ(HDH、thrA*1)およびセリンアセチルトランスフェラーゼ(SAT、cysE)活性を、種々の条件で増殖させた株3の培養物の粗抽出液で測定した。活性はmUI/mgタンパク質で示す。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて計算した(N=反復回数)。
株8を、実施例IVに記載されているように小エルレンマイヤーフラスコで評価した。これを株3と比較した。
Claims (11)
- 発酵プロセスにおいてメチオニンを生産するための方法であって、下記工程:
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中でエシェリキア属の種からの改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンを回収する工程
を含んでなり、
該改変微生物において、メチオニン生産に関与する遺伝子thrAおよびcysEの発現が、物理的刺激により誘導される異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にあり、該誘導プロモーターが温度誘導プロモーターであり、
該培養工程が温度誘導を行うことを含む、方法。 - メチオニン生産に関与する遺伝子thrAおよびcysEの発現が、異種誘導プロモーターの直接的制御下にある、請求項1に記載の方法。
- 温度誘導プロモーターが、λファージの改変レプレッサーにより調節されるプロモーター、プロモーターPRまたはPRの誘導体、プロモーターPLまたはPLの誘導体、および温度感受性Lacレプレッサーにより調節される改変lacプロモーターからなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記λファージの改変レプレッサーが、λレプレッサー対立遺伝子cI857またはcI λレプレッサーの別の温度感受性対立遺伝子である、請求項3に記載の方法。
- 改変微生物において遺伝子recAが欠失している、請求項3または4に記載の方法。
- メチオニン生産に関与する少なくとも1つの遺伝子が、異種誘導プロモーターの間接的制御下にあり、該遺伝子が、その発現が誘導プロモーターの制御下にある異種RNAポリメラーゼにより転写される、請求項1に記載の方法。
- 異種RNAポリメラーゼが、T7およびT3ポリメラーゼからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記微生物が、その発現が異種プロモーターの直接的または間接的制御下にある少なくとも1つの遺伝子をさらに含んでなり、該遺伝子が、cysK、cysZ、cysN、cysD、cysC、sbp、ppc、pps、pyc、acs、metA、metB、metC、metE、metF、metH、metK、metL、asd、aspC、lysC、pykA、pykF、purU、オペロンcysPUWAM、cysJIHおよびgcvTHP、serA、serB、serC、lpd、glyA、ackA、pta、aceE、aceF、sucC、sucD、pck、maeB、poxB、ilvB、ilvN、ilvG、ilvM、ilvI、ilvH、aroF、aroG、aroH、thrB、thrC、sdaA、sdaB、speD、speC、astA、dapA、mdh、mqoおよびgltAからなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子thrAが、トレオニンに対するフィードバック感受性が低減されたthrA対立遺伝子である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、遺伝子metAが異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子metAが、メチオニンおよびS−アデノシルメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするmetA変異型対立遺伝子である、請求項10に記載の方法。
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