ES2634469T3 - Uso de promotores inducibles en la producción de metionina - Google Patents
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Abstract
Un método para la producción de metionina, sus precursores o derivados en un procedimiento fermentativo que comprende las siguientes etapas: - cultivar un microorganismo modificado en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno, y - recuperar metionina y/o sus derivados del medio de cultivo, en donde en dicho microorganismo modificado, la expresión de al menos los genes thrA y cysE implicados en la producción de metionina está bajo el control de un promotor heterólogo inducible por temperatura inducido por la temperatura.
Description
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DESCRIPCION
Uso de promotores inducibles en la produccion de metionina Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al uso de promotores inducibles en la produccion de metionina mediante fermentacion.
Antecedentes de la invencion
Compuestos que contienen azufre tales como cistema, homocistema, metionina o S-adenosilmetionina son cnticos para el metabolismo celular y se producen industrialmente para ser usados como aditivos de alimentos o piensos y productos farmaceuticos. En particular, la metionina, un aminoacido esencial, que no puede ser sintetizada por animales, representa un papel importante en muchas funciones corporales. Junto con su papel en la biosmtesis de protemas, la metionina esta implicada en la transmetilacion y en la biodisponibilidad de selenio y cinc. La metionina tambien se usa directamente como un tratamiento para trastornos como alergia y fiebre reumatica. No obstante, la mayona de la metionina que se produce se anade a piensos.
Con la reduccion del uso de protemas derivadas de animales como resultado de BSE y la gripe aviar, se ha incrementado la demanda de metionina pura. Qmmicamente, la D,L-metionina se produce comunmente a partir de acrolema, metilmercaptano y cianuro de hidrogeno. No obstante, la mezcla racemica no se comporta tan bien como la L-metionina pura, como por ejemplo en aditivos de pienso para pollos (Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633). La L-metionina pura se puede producir a partir de metionina racemica, p. ej. a traves del tratamiento con acilasa de N-acetil-D,L-metionina que incrementa drasticamente los costes de produccion. La demanda creciente de L-metionina pura asociada a los problemas medioambientales hace atractiva la produccion microbiana de metionina.
El uso de promotores inducibles en procedimientos biotecnologicos esta dentro de la tecnica de la biosmtesis qmmica. Estos promotores responden habitualmente a estfmulos qmmicos o ffsicos ejemplificados por propionato (documento WO2007005837), cinc (documento WO2004020640) y arabinosa (documento WO19980l1231) o temperatura (Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli. Tang X, Tan Y, Zhu H, Zhao K, Shen W. Appl Environ Microbiol. 2009 Mar; 75(6):1628-34.) y luz, respectivamente.
La produccion de metionina se basa en varias rutas que proporcionan precursores. La produccion eficaz de metionina requiere un ajuste fino de estas rutas. Para una produccion maxima de metionina, puede ser beneficioso ser capaz de modular la expresion de ciertas enzimas clave durante el proceso. Por ejemplo (i) la expresion de ciertas enzimas solo se requiere durante la fase de produccion y no durante la generacion de la biomasa o viceversa. Otras enzimas solo son beneficiosas en fase estacionaria. Por lo tanto, el uso de promotores inducibles puede ser de interes para mejorar el rendimiento global de la produccion de metionina a escala industrial.
Sin embargo, debido a la complejidad de la ruta metabolica de metionina y al ajuste fino de estas rutas para una produccion mejorada de metionina, nunca se ha considerado ni presentado el uso de promotores inducibles para controlar la expresion de genes implicados en la produccion de metionina.
Los inventores han encontrado ahora que los promotores inducibles pueden ser beneficiosos cuando se usan para regular la expresion genica de genes implicados en rutas metabolicas complejas tales como la biosmtesis de metionina.
Breve descripcion de la invencion
La presente invencion trata de un metodo para la produccion de metionina, sus precursores o derivados en un proceso fermentativo que comprende las siguientes etapas:
- cultivar un microorganismo modificado en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrogeno, y
- recuperar metionina y/o sus derivados del medio de cultivo,
en donde en dicho microorganismo modificado, la expresion de al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control, directo o indirecto, de un promotor inducible por temperatura heterologo inducido por la temperatura.
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La invencion tambien trata del microorganismo modificado para una produccion mejorada de metionina en la que la expresion de al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control, directo o indirecto, de un promotor inducible heterologo inducible por temperatura inducido por la temperatura.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de metionina, sus precursores o derivados en un proceso fermentativo que comprende las siguientes etapas:
- cultivar un microorganismo modificado en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrogeno, y
- recuperar metionina y/o sus derivados del medio de cultivo,
en donde en dicho microorganismo modificado, la expresion de al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control, directo o indirecto, de un promotor inducible por temperatura heterologo inducido por la temperatura.
Segun la invencion, los terminos "proceso fermentativo”, “fermentacion" o “cultivo” se usan intercambiablemente para indicar el crecimiento de bacterias en un medio de crecimiento apropiado que contiene una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrogeno.
Un "medio de cultivo apropiado" es un medio apropiado para el cultivo y el crecimiento del microorganismo. Estos medios son muy conocidos en la tecnica de la fermentacion de microorganismos, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar.
El termino "microorganismo" indica una bacteria, una levadura o un hongo. Preferentemente, el microorganismo se selecciona entre Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae. Mas preferentemente, el microorganismo es una especie de Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella o Corynebacterium. Aun mas preferentemente, el microorganismo es la especie bien Escherichia coli o bien Corynebacterium glutamicum.
El termino "microorganismo modificado" es un microorganismo modificado para una produccion mejorada de metionina e indica un microorganismo que se ha modificado geneticamente con el objetivo de mejorar el rendimiento de produccion de metionina. Segun la invencion, "mejorado" o "mejorar" significa que la cantidad de metionina producida por el microorganismo, y particularmente el rendimiento de metionina (relacion de metionina producida por fuente de carbono), es superior en el microorganismo modificado en comparacion con el correspondiente microorganismo no modificado. Modificaciones habituales incluyen introducir supresion de genes en microorganismos mediante transformacion y recombinacion, sustituciones de genes e introduccion de vectores para la expresion de genes heterologos.
El microorganismo modificado usado en el metodo de la invencion tiene ambas caractensticas:
- esta modificado para una produccion mejorada de metionina, y
- la expresion de al menos los genes implicados en la produccion de metionina esta bajo el control, directo o indirecto, de un promotor inducible por temperatura inducido por la temperatura.
La expresion "recuperar metionina y/o sus derivados del medio de cultivo" indica la accion de recuperar metionina, y posiblemente compuestos de S-acilmetionina y N-acilmetionina, tales como N-acetilmetionina y N-propionilmetionina, y todos los otros derivados obtenidos.
El termino "promotor inducible por temperatura" indica un promotor cuya actividad se puede incrementar o disminuir con una induccion por temperatura.
La induccion del gen diana se puede obtener a traves de la transmision directa o indirecta del estimulo.
La transmision directa se efectua cuando la expresion de los genes diana esta bajo el control del promotor inducible por temperatura.
La transmision indirecta se puede efectuar al usar ARN-polimerasas heterologas que estan bajo el control del promotor inducible por temperatura y que reconocen promotores espedficos que conducen la expresion de los genes diana implicados en la biosmtesis de metionina. En este caso, el promotor inducible por temperatura no esta
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directamente conectado al promotor de los genes diana, pero conduce la expresion de una ARN polimerasa que transcribe dicho promotor de los genes diana.
Estas ARN polimerasas heterologas pueden ser, p. ej. ARN polimerasa de T3, ARN polimerasa de T7 u otra polimerasa conocida por el experto en la especialidad.
Transmision indirecta' tambien se refiere al 'efecto polar' de la expresion inducible de un gen espedfico sobre la expresion de sus genes vecinos. Un "efecto polar" indica la influencia de una modificacion genetica en un gen sobre la expresion de uno o mas genes que estan aguas debajo de dicho gen modificado.
En un aspecto espedfico de la invencion, la induccion de genes espedficos implicados en la produccion de metionina puede conducir a una induccion de genes aguas debajo de dichos genes espedficos.
La expresion "bajo el control de un promotor inducible por temperatura heterologo" indica el hecho de que el promotor inducible por temperatura no es el promotor natural del gen y se introduda de un modo para controlar, al menos parcialmente, el nivel de expresion del gen que esta conectado operablemente al mismo. La expresion de genes se puede activar o desactivar, segun las necesidades del experto en la tecnica.
En una realizacion espedfica de la invencion, la expresion de al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control directo de un promotor inducible por temperatura.
El promotor inducible por temperatura se regula preferentemente mediante un represor modificado del fago lambda, el promotor PR o un derivado de PR, el promotor PL o un derivado de PL (A genetic switch. Ptashne M. Blackwell Scientific, Cambridge, MA. 1986; A genetic switch: Phage lambda revisited. Ptashne M. Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, NY. 2004; The bacteriophages, Part II: Life of phages, 8. Gene regulatory circuitry of phage A. Little J. 2a edicion 2004. Richard Calendar. ed. Oxford University Press) y un promotor lac modificado regulado por un represor Lac sensible a la temperatura.
El represor reprime la expresion desde el promotor cognado mediante la union a sitios de union espedficos en la region promotora, limitando de ese modo el acceso de ARN polimerasa al promotor y reduciendo el inicio o el alargamiento de la transcripcion. Ventajosamente, dicho represor es el alelo cI857 del represor lambda (On a thermosensitive repression system in the Escherichia coli lambda bacteriophage. Sussman R, Jacob F. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1962, 254, p1517) u otro alelo sensible a la temperatura del represor lambda cl.
En un aspecto espedfico de la invencion, en el microorganismo modificado para la produccion de metionina, se ha suprimido el gen que codifica recA. Se sabe que la protema RecA actua como una proteasa sobre cl. Por lo tanto, la supresion del gen que codifica RecA excluye la proteolisis del represor lambda cl.
El promotor inducible por temperatura se podna elegir ventajosamente entre el promotor PR o un derivado y el promotor PL o un derivado.
En otra realizacion, el promotor inducible por temperatura es un promotor lac modificado regulado por un represor Lac sensible a la temperatura.
Segun un aspecto espedfico de la invencion, la expresion de genes de interes esta regulada a traves de "transmision indirecta", es decir, al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina se transcribe mediante una ARN polimerasa heterologa cuya expresion esta bajo el control del promotor inducible por temperatura.
En una realizacion espedfica de la invencion, la ARN polimerasa heterologa se elige de polimerasa de T7, T3.
Segun la invencion, al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina o la produccion de sus precursores esta bajo el control, directo o indirecto, de un promotor inducible por temperatura heterologo; como se explica previamente, bien los genes estan bajo el control directo de dicho promotor inducible, o bien los genes son transcritos por una ARN polimerasa inducible o ambas combinaciones.
Genes implicados en la produccion de metionina en un microorganismo son conocidos en la tecnica, comprenden genes implicados en la ruta de biosmtesis espedfica de metionina asf como genes implicados en rutas que proporcionan precursores y genes implicados en rutas de consumo de metionina.
La produccion eficaz de metionina requiere la optimizacion de la ruta espedfica de metionina y varias rutas que proporcionan precursores. Cepas productoras de metionina se han descrito en las solicitudes de patente WO 2005/111202, WO 2007/077041, WO 2009/043803 y WO 2009/043372 y se incorporan como referencia en esta solicitud.
Una cepa productora de metionina que sobreexpresa alelos de homoserina succiniltransferasa con reduccion de la sensibilidad de retroalimentacion a sus inhibidores SAM y metionina se describe en la solicitud de patente WO 2005/111202. Esta solicitud tambien describe la combinacion de estos alelos con una supresion del represor de metionina MetJ (GenBank 1790373), responsable de la regulacion a la baja del regulon de metionina como se 5 sugena en la solicitud de patente JP 2000/157267. Ademas, combinaciones de las dos modificaciones con la
sobreexpresion de aspartocinasa/homoserina deshidrogenasa se describen en la solicitud de patente WO 2005/111202.
La sobreexpresion de los genes cysE, metH y metF se ha sugerido en el documento WO 2007/077041.
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Para incrementar la produccion de metionina, al menos uno de los siguientes genes implicados en la produccion de metionina tambien puede estar bajo el control de dicho promotor inducible.
a) La expresion de genes implicados en la asimilacion de azufre puede estar ventajosamente bajo el control de un 15 promotor inducible o de una ARN polimerasa:
- gen
- numero de registro funcion
- cysK
- 1788754 cistema sintasa
- cysZ
- g1788753 ORF aguas arriba de cysK
- cysN
- g1789108 ATP sulfurilasa
- cysD
- g1789109 sulfato adenililtransferasa
- cysC
- g1789107 adenililsulfato cinasa
- cysZ
- 1788753 transporte de sulfato
- sbp
- 1790351 Protema de union a sulfato periplasmica
- b) Las reacciones anapleroticas pueden ser impulsadas al expresar los siguientes genes:
- PPC
- 1790393 fosfoenolpiruvato carboxilasa
- PPS
- 1787994 fosfoenolpiruvato sintasa
- pyc
- CAB13359 piruvato carboxilasa (p. ej. de B. subtilis)
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c) Las reacciones de consumo de acetato pueden ser impulsadas al sobreexpresar el gen:
acs 1790505 acetil-CoA sintetasa
d) Enzimas directamente implicadas en la biosmtesis de metionina:
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- metA
- 1790443 homoserina O-transsuccinilasa
- metB
- 1790375 cistationina gamma-sintasa
- metC
- 1789383 cistationina beta-liasa
- metE
- 2367304 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocistema S-metiltransferasa
- metF
- 1790377 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa
- metH
- 1790450 homocistema-N5-metiltetrahidrofolato transmetilasa dependiente de B12;
- metK
- 1789311 metionina adenosiltransferasa
- metL
- 1790376 aspartocinasa II/homoserina deshidrogenasa II
- e) Enzimas implicadas en el metabolismo de aspartato:
- asd
- 1789841 aspartato-semialdetndo deshidrogenasa
- aspC
- 1787159 aspartato aminotransferasa
- lysC
- 1790455 aspartocinasa III
30 La enzima ThrA o cualquiera de sus homologos (MetL, LysC) cataliza reacciones en las transformacion de aspartato en homoserina, un precursor de metionina. La enzima CysE cataliza la O-acetilacion de serina para formar O-acetil- serina que es el precursor directo de cistema que a su vez sirve como donante de azufre para la biosmtesis de metionina.
La produccion de metionina se puede incrementar adicionalmente al usar un alelo de metB alterado que usa preferentemente o exclusivamente H2S y as^ produce homocistema a partir de O-succinil-homoserina segun se describe en la solicitud de patente WO 2004/076659 que se incorpora en la presente mediante referencia.
5 El incremento adicional en la produccion de metionina se puede obtener al atenuar la expresion de los genes pykA, pykF y/o purU segun se describe en la solicitud de patente WO2009043803. Esto tambien se puede efectuar al usar un promotor inducible, directamente o indirectamente.
Esta solicitud tambien describe cepas productoras de metionina en las que los operones cysPUWAM, cysJIH y 10 gcvTHP y los genes serA, serB, serC, Ipd y glyA se sobreexpresan. De forma similar, esto se puede efectuar al usar un promotor inducible, directamente o indirectamente.
Por otra parte, la expresion de genes en rutas que degradan metionina (vease la lista posterior) o que se desvfan de la ruta de produccion de metionina se pueden atenuar usando un promotor inducible, directamente o indirectamente. 15 La atenuacion, en este contexto, describe la reduccion de la actividad intracelular de una enzima mediante medidas tales como reducir su expresion, reducir la estabilidad de la enzima, incrementar su degradacion y/u otras soluciones conocidas por el experto en la especialidad. Esto se puede efectuar al reducir la expresion del promotor inducible, es decir eliminar el estfmulo que induce al promotor inducible o reducir la expresion de la ARN polimerasa inducible.
- Gen
- entrada del Genbank actividad
- ackA
- 1788633 acetato cinasa
- pta
- 1788635 fosfotransacetilasa
- aceE
- 1786304 piruvato deshidrogenasa E1
- aceF
- 1786305 piruvato deshidrogenasa E2
- lpd
- 1786307 piruvato deshidrogenasa E3
- sucC
- 1786948 succinil-CoA sintetasa, subunidad beta
- sucD
- 1786949 succinil-CoA sintetasa, subunidad alfa
- pck
- 1789807 fosfoenolpiruvato carboxicinasa
- maeB
- poxB
- 1787096 piruvato oxidasa
- ilvB
- 1790104 acetohidroxiacido sintasa \, subunidad grande
- ilvN
- 1790103 acetohidroxiacido sintasa \, subunidad pequena
- ilvG
- 1790202 acetohidroxiacido sintasa \\, subunidad grande
- 1790203
- ilvM
- 1790204 acetohidroxiacido sintasa \\, subunidad pequena
- ilv\
- 1786265 acetohidroxiacido sintasa \\\, subunidad grande
- ilvH
- 1786266 acetohidroxiacido sintasa \\\, subunidad pequena
- aroF
- 1788953 DAHP sintetasa
- aroG
- 1786969 DAHP sintetasa
- aroH
- 1787996 DAHP sintetasa
- thrB
- 1786184 homoserina cinasa
- thrC
- 1786185 treonina sintasa
- sdaA
- 1788116 serina desaminasa
- sdaB
- 1789161 serina desaminasa
- speD
- 1786311 S-adenosilmetionina descarboxilasa
- speC
- 1789337 ornitina descarboxilasa
- astA
- 1788043 arginina succiniltransferasa
- dapA
- 1788823 dihidrodipicolinato sintasa
- mdh
- 1789632 malato deshidrogenasa
- mqo
- 1788539 malato deshidrogenasa, dominio de union a FAD/NAD(P)
- gltA
- 1786939 citrato sintasa
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aceE 1786304 piruvato deshidrogenasa, E1
aceF 1786305 piruvato deshidrogenasa, E2
En una realizacion espedfica, los genes thrA, cysE y metA estan bajo el control de un promotor inducible por temperatura, directamente o indirectamente. En una realizacion preferida de la invencion, la expresion del gen thrA esta bajo el control directo del promotor inducible por temperatura, y la expresion del gen cysE esta bajo un 'efecto polar' de la expresion inducible del gen thrA. En otra realizacion preferida de la invencion, la expresion del gen thrA
esta bajo el control directo del promotor inducible por temperatura, y las expresiones de los genes cysE y metA estan
bajo el 'efecto polar' de la expresion inducible del gen thrA.
En una realizacion espedfica, los tres genes thrA, cysE y metA estan bajo el control del mismo promotor inducible por temperatura, tales como los divulgados anteriormente y en los ejemplos.
En la invencion, "gen thrA" significa el gen thrA o alelos de thrA naturales con sensibilidad de retroalimentacion reducida a treonina, tales como los descritos en el documento WO2005/108561. Segun la invencion, "gen metA" significa genes metA naturales o alelos mutantes de metA que codifican enzima con sensibilidad de retroalimentacion reducida a metionina y S-adenosilmetionina, tales como los descritos en el documento WO2005/108561.
Los genes controlados por el promotor inducible bien pueden estar en su posicion natural en el cromosoma o bien integrados en una posicion no natural. Se pueden requerir una o varias integraciones del gen controlado por el promotor inducible para la produccion optima de metionina. De forma similar, se puede requerir una o varias copias del gen regulador para la expresion optima. Se pueden usar diferentes relaciones de copias y promotores del gen represor para la expresion de ajuste fino.
Los genes bajo el control del promotor inducible por temperatura preferentemente estan integrados en locus, cuya modificacion no tiene un impacto negativo sobre la produccion de metionina. Ejemplos para locus en los que se puede integrar el gen son:
- Locus
- Numero de Registro Funcion
- aaaD
- 87081759 Pseudogen, homologo de protema A de terminasa fagica, fragmento N-terminal
- aaaE
- 1787395 Pseudogen, homologo de protema A de terminasa fagica, fragmento C-terminal
- afuB
- 1786458 Pseudogen, permeasa transportadora de la familia de ABC ferrico; fragmento C- terminal
- afuC
- 87081709 subunidad transportadora de ABC ferrico predicha (componente que se une a ATP)
- agaA
- 48994927 Pseudogen, fragmento C-terminal, GalNAc-6-P desacetilasa
- agaW
- 1789522 Pseudogen, fragmento N-terminal, sistema de PTS EIICGalNAc
- alpA
- 1788977 proteasa
- appY
- 1786776 activador de la transcripcion que se une a ADN
- argF
- 1786469 ornitina carbamoiltransferasa
- argU
- ninguno ARNt de arginina
- argW
- ninguno ARNt(CCU) 5 de arginina
- arpB
- 87081959 reconstruccion del pseudogen, repeticiones de anquirina
- arrD
- 1786768 lisozima
- arrQ
- 1787836 homologo de protema R de lisozima del fago lambda
- arsB
- 87082277 transportador de arsenito
- arsC
- 1789918 arsenato reductasa
- arsR
- 1789916 represor de la transcripcion que se une a ADN
- beeE
- 1787397 Pseudogen, fragmento N-terminal, protema portal
- borD
- 1786770 homologo de protema Bor del bacteriofago lambda
- cohE
- 1787391 represor similar a CI
- croE
- 87081841 represor similar a Cro
- cspB
- 1787839 protema de choque por fno
- cspF
- 1787840 homologo de protema de choque por fno
- cspI
- 1787834 protema de choque por fno
- cybC
- 1790684 Pseudogen, fragmento N-terminal, citocromo b562
- dicA
- 1787853 Regulador para dicB
- dicB
- 1787857 Control de la division celular
- dicC
- 1787852 Regulador para dicB
- dicF
- ninguno ARNs antisentido de DicF
- eaeH
- 1786488 Pseudogen, homologo de intimina
- efeU
- 87081821 Reconstruccion de pseudogen, ion ferroso permeasa
- emrE
- 1786755 bomba de resistencia a multiples farmacos
- essD
- 1786767 protema de lisis del fago predicha
- essQ
- 87081934 homologo de protema de lisis del fago lambda S
- exoD
- 1786750 Pseudogen, fragmento de exonucleasa C-terminal
- eyeA
- ninguno nuevo ARNs, funcion desconocida
- flu
- 48994897 Antfgeno 43
- flxA
- 1787849 desconocida
- gapC
- 87081902 reconstruccion del pseudogen, GAP deshidrogenasa
- gatR
- 87082039 reconstruccion del pseudogen, represor para el operon gat
- glvC
- 1790116 reconstruccion del pseudogen
- givG
- 1790115 reconstruccion del pseudogen, 6-fosfo-beta-glucosidasa
- gnsB
- 87081932 supresor de multiples copias de secG(Cs) y fabA6(Ts)
- gtrA
- 1788691 glucosa translocasa conectada a bactoprenol
- gtrB
- 1788692 Bactoprenol glucosil transferasa
- gtrS
- 1788693 glucosil transferasa
- hokD
- 1787845 polipeptido membranario toxico pequeno
- icd
- 1787381 Isocitrato deshidrogenasa
- icdC
- 87081844 pseudogen
- ilvG
- 87082328 reconstruccion del pseudogen, acetohidroxiacido sintasa II
- insA
- 1786204 gen IS1, funcion de transposicion
- insA
- 1786204 gen IS1, funcion de transposicion
- insB
- 1786203 secuencia de insercion IS1 transposasa
- insB
- 1786203 secuencia de insercion IS1 transposasa
- insC
- 1786557 gen IS2, funcion de transposicion
- insD
- 1786558 gen IS2, funcion de transposicion
- insD
- 1786558 gen IS2, funcion de transposicion
- insE
- 1786489 gen IS3, funcion de transposicion
- insF
- 1786490 gen IS3, funcion de transposicion
- insH
- 1786453 gen IS5, funcion de transposicion
- insH
- 1786453 gen IS5, funcion de transposicion
- insH
- 1786453 gen IS5, funcion de transposicion
- insI
- 1786450 gen IS30, funcion de transposicion
- insI(-1)
- 1786450 IS30 gene, funcion de transposicion
- insM
- 87082409 Pseudogen, IS600 transposasa truncada
- insN
- 1786449 reconstruccion del pseudogen, IS911 transposasa ORFAB
- insO
- ninguno reconstruccion del pseudogen, IS911 transposasa ORFAB
- insX
- 87081710 Pseudogen, familia IS3 transposasa, fragmento N-terminal
- insZ
- 1787491 reconstruccion del pseudogen, familia IS4 transposasa, en ISZ'
- intA
- 1788974 gen de integrasa
- intB
- 1790722 reconstruccion del pseudogen, integrasa similar a P4
- intD
- 1786748 integrasa predicha
- intE
- 1787386 e14 integrasa
- intF
- 2367104 integrasa fagica predicha
- intG
- 1788246 Pseudogen, homologo de integrasa
- intK
- 1787850 Pseudogen, fragmento de integrasa
- intQ
- 1787861 Pseudogen, fragmento de integrasa
- intR
- 1787607 gen de integrasa
- intS
- 1788690 Integrasa
- intZ
- 1788783 gen de integrasa putativo
- isrC
- ninguno Nuevo ARNs, funcion desconocida
- jayE
- 87081842 Pseudogen, fragmento C-terminal, placa base
- kilR
- 87081884 funcion de destruccion del profago Rac
- lafU
- ninguno Pseudogen, fragmento de protema motriz flagelar lateral
- IfhA
- 87081703 Pseudogen, fragmento de protema de ensamblaje flagelar lateral
- lit
- 1787385 peptidasa de muerte celular
- lomR
- 1787632 reconstruccion del pseudogen, homologo de lom; protema de la membrana externa interrumpida por IS5Y, extremo N ausente
- malS
- 1789995 a-amilasa
- mcrA
- 1787406 protema de union a ADN espedfica de 5-metilcitosina
- mdtQ
- 87082057 reconstruccion del pseudogen, familia OMF de bomba de farmacos lipoprotemicos
- melB
- 1790561 melibiosa permeasa
- mmuM
- 1786456 homocistema metiltransferasa
- mmuP
- 870811708 S-metilmetionina permeasa
- mokA
- ninguno Pseudogen, peptido regulador solapado, permite hokB
- ninE
- 1786760 desconocida
- nmpC
- 1786765 reconstruccion del pseudogen, porina de OM, interrumpida por IS5B
- nohD
- 1786773 protema de empaquetamiento de ADN
- nohQ
- 1787830 Pseudogen, homologo Nu1 del fago lambda, familia de subunidad pequena de terminasa, protema de empaquetamiento de ADN putativa
- ogrK
- 1788398 regulador positivo del crecimiento de P2
- ompT
- 1786777 proteasa VII de la membrana externa
- oweE
- ninguno Pseudogen, homologo de protema O de replicacion de lambda
- oweS
- 1788700 Pseudogen, homologo de protema O de replicacion de lambda
- pauD
- ninguno pseudogen argU, sitio de ligacion al profago DLP12
- pawZ
- ninguno sitio de ligacion al profago CPS-53 attR, pseudogen argW
- pbl
- 87082169 reconstruccion del pseudogen, homologo de pilT
- peaD
- 87081754 Pseudogen, familia de protema P de replicacion del fago lambda; fragmento C-terminal
- perR
- 1786448 regulador de la transcripcion que se une a ADN predicho
- pgaA
- 1787261 porina de membrana externa de la ruta de poli-p-1,6-N-acetil-D-glucosamina (PGA)
- pgaB
- 1787260 PGA N-desacetilasa
- pgaC
- 1787259 UDP-N-acetil-D-glucosamina p-1,6-N-acetil-D-glucosaminil transferasa
- pgaD
- 1787258 protema de membrana interna predicha
- phnE
- 87082370 reconstruccion del pseudogen, fosfonato permeasa
- pinE
- 1787404 ADN invertasa
- pinH
- 1789002 Pseudogen, ADN invertasa, recombinacion espedfica del sitio
- pinQ
- 1787827 ADN invertasa
- pinR
- 1787638 ADN invertasa
- prfH
- 1786431 Pseudogen, homologo de factor de liberacion de protema
- psaA
- ninguno pseudogen ssrA, duplicacion del sitio de ligacion a CP4-57
- ptwF
- ninguno pseudogen thrW, sitio de ligacion al profago CP4-6
- quuD
- 1786763 protema antiterminacion predicha
- quuQ
- 87081935 homologo de protema antiterminacion de lambda Q
- racC
- 1787614 desconocida
- racR
- 1787619 represor del profago Rac, similar a cl
- ralR
- 1787610 gen de alivio de la restriccion
- rbsA
- 1790190 subunidad transportadora de ABC de D-ribosa (componente que se une a ATP)
- rbsD
- 87082327 D-ribosa piranasa
- recE
- 1787612 RecET recombinasa
- recT
- 1787611 RecET recombinasa
- relB
- 1787847 Antitoxina para RelE
- relE
- 1787846 ARNm endorribonucleasa espedfica de secuencia
- rem
- 1787844 desconocida
- renD
- 87081755 reconstruccion del pseudogen, homologo de lambda ren, interrumpido por IS3C; activador putativo de la transcripcion de lit
- rhsE
- 1787728 Pseudogen, familia rhs, codificado dentro de la repeticion RhsE
- rnlA
- 1788983 RNasa LS, endorribonucleasa
- rph
- 1790074 reconstruccion del pseudogen, RNasa PH
- rusA
- 1786762 Endonucleasa
- rzoD
- 87081757 Probable lipoprotema similar a Rz1
- rzoQ
- ninguno Probable lipoprotema similar a Rz1
- rzoR
- 87081890 Probable lipoprotema similar a Rz1
- rzpD
- 1786769 murema endopeptidasa predicha
- rzpQ
- 1787835 equivalente similar a Rz
- rzpR
- 87081889 Pseudogen, homologo de Rz
- sieB
- 87081885 protema de exclusion de superinfeccion
- sokA
- ninguno Pseudogen, ARNs antisentido que bloquea la traduccion de mokA/hokA
- stfE
- 87081843 casete variable Stf C-terminal, protema de especificidad virion-hospedador alterna; dominio del collar de la cola, pseudogen
- stfP
- 1787400 protema de fibra de la cola predicha
- stfR
- 87081892 protema de la fibra de la cola lateral
- tfaD
- 87081759 Pseudogen, gen de ensamblaje de la fibra de la cola, fragmento C-terminal
- tfaE
- 1787402 gen de ensamblaje de la fibra de la cola predicho
- tfaP
- 1787401 gen de ensamblaje de la fibra de la cola predicho
- tfaQ
- 2367120 homologo del gen de ensamblaje de la fibra de la cola del fago lambda
- tfaR
- 1787637 homologo del gen de ensamblaje de la fibra de la cola del fago lambda
- tfaS
- 87082088 Pseudogen, gen de ensamblaje de la fibra de la cola, fragmento C-terminal
- tfaX
- 2367110 reconstruccion del pseudogen, gen de ensamblaje de la fibra de la cola, fragmento C- terminal
- thrW
- ninguno ARNt de treonina (sitio de ligacion del profago CP4-6)
- tori
- 87082092 CPS-53/KpLE1 exisionasa
- treB
- 2367362 subunidad de trehalosa PTS permeasa (dominios IIB/IIC)
- treC
- 1790687 trehalosa-6-fosfato hidrolasa
- trkG
- 1787626 permeasa de captacion de K+ constitutiva principal
- ttcA
- 1787607 gen de integrasa
- ttcC
- ninguno Pseudogen, duplicacion de sitio ttcA de integracion del profago Rac
- uidB
- 1787902 Glucuronido permeasa, mutante puntual inactivo
- uxaA
- 1789475 altronato hidrolasa
- uxaC
- 2367192 uronato isomerasa
- wbbL
- 1788343 reconstruccion del pseudogen, ramnosil transferasa
- wcaM
- 1788356 protema de biosmtesis de acido colanico predicha
- xisD
- ninguno Pseudogen, fragmento de exisionasa en profago DLP12 defectuoso
- xisE
- 1787387 e14 excisionasa
- yabP
- 1786242 reconstruccion del pseudogen
- yafF
- 87081701 Pseudogen, fragmento C-terminal, protema asociada a la repeticion H
- yafU
- 1786411 Pseudogen, fragmento C-terminal
- yafW
- 1786440 antitoxina del sistema toxina-antitoxina Ykfi-YafW
- yafX
- 1786442 desconocida
- yafY
- 1786445 regulador de la transcripcion que se une a ADN predicho; lipoprotema de la membrana interna
- yafZ
- 87081705 desconocida
- yagA
- 1786462 regulador de la transcripcion que se une a ADN predicho
- yagB
- 87081711 Pseudogen, relacionado con antitoxina, fragmento N-terminal
- yagE
- 1786463 liasa/sintasa predicha
- yagF
- 1786464 deshidratasa predicha
- yagG
- 1786466 simportador sacarico putativo
- yagH
- 1786467 p-xilosidasa putativa
- yagi
- 1786468 regulador de la transcripcion que se une a ADN predicho
- yagJ
- 1786472 desconocida
- yagK
- 1786473 desconocida
- yagL
- 1786474 protema que se une a ADN
- yagM
- 2367101 desconocida
- yagN
- 2367102 desconocida
- yagP
- 1786476 Pseudogen, familia LysR, fragmento
- yaiT
- 1786569 reconstruccion del pseudogen, familia de autotransportadores
- yaiX
- 87082443 reconstruccion del pseudogen, interrumpida por IS2A
- ybbD
- 1786709 reconstruccion del pseudogen, nueva familia conservada
- ybcK
- 1786756 recombinasa predicha
- ybcL
- 1786757 inhibidor de cinasa predicho
- ybcM
- 1786758 regulador de la transcripcion que se une a ADN predicho
- ybcN
- 1786759 protema de volteo de bases de ADN
- ybcO
- 1786761 desconocida
- ybcV
- 87081758 desconocida
- ybcW
- 1786772 desconocida
- ybcY
- 48994878 reconstruccion del pseudogen, familia de metiltransferasas
- ybeM
- 1786843 reconstruccion del pseudogen, CN hidrolasa putativa
- ybfG
- 87081771 reconstruccion del pseudogen, nueva familia conservada
- ybfl
- ninguno reconstruccion del pseudogen, homologo de KdpE
- ybfL
- 87081775 reconstruccion del pseudogen, protema asociada a la repeticion H
- ybfO
- 1786921 Pseudogen, copia de nucleo Rhs con extension unica
- ycgH
- 87081847 reconstruccion del pseudogen
- ycgi
- 1787421 reconstruccion del pseudogen, homologo de autotransportador
- ycjv
- 1787577 reconstruccion del pseudogen, paralogo de malK
- ydaC
- 1787609 desconocida
- ydaE
- 87081883 metalotionema
- ydaF
- 87081886 desconocida
- ydaG
- 87081887 desconocida
- ydaQ
- 87081882 exisionasa putativa
- ydaS
- 1787620 desconocida
- ydaT
- 1787621 desconocida
- ydaU
- 1787622 desconocida
- ydaV
- 1787623 desconocida
- ydaW
- 87081888 Pseudogen, fragmento N-terminal
- ydaY
- 1787629 pseudogen
- ydbA
- 87081898 reconstruccion del pseudogen, homologo de autotransportador
- yddK
- 1787745 Pseudogen, fragmento C-terminal, rico en leucina
- yddL
- 1787746 Pseudogen, familia de porina de OmpCFN, fragmento N-terminal
- ydeT
- 1787782 Pseudogen, familia FimD, fragmento C-terminal
- ydfA
- 1787854 desconocida
- ydfB
- 87081937 desconocida
- ydfC
- 1787856 desconocida
- ydfD
- 1787858 desconocida
- ydfE
- 1787859 Pseudogen, fragmento N-terminal
- ydfJ
- 1787824 reconstruccion del pseudogen, familia MFS
- ydfK
- 1787826 gen de choque por fno
- ydfO
- 87081931 desconocida
- ydfR
- 1787837 desconocida
- ydfU
- 87081936 desconocida
- ydfV
- 1787848 desconocida
- ydfX
- 1787851 pseudogen
- yedN
- 87082002 reconstruccion del pseudogen, familia IpaH/YopM
- yedS
- 87082009 reconstruccion del pseudogen, homologo de protema de la membrana externa
- yeeH
- ninguno Pseudogen, fragmento interno
- yeeL
- 87082016 reconstruccion del pseudogen, familia de glicosiltransferasa
- yeeP
- 87082019 Pseudogen, protema que se une a GTP putativa
- yeeR
- 87082020 desconocida
- yeeS
- 1788312 desconocida
- yeeT
- 1788313 desconocida
- yeeU
- 1788314 componente de antitoxina del par de protemas de toxina-antitoxina YeeV-YeeU
- yeeV
- 1788315 componente de toxina del par de protemas de toxina-antitoxina YeeV-YeeU
- yeeW
- 1788316 pseudogen
- yegz
- ninguno Pseudogen, protema D similar al fago P2 de gpD; fragmento C-terminal
- yehH
- 87082046 reconstruccion del pseudogen
- yehQ
- 87082050 reconstruccion del pseudogen
- yejo
- 1788516 reconstruccion del pseudogen, homologo de autotransportador
- yfaH
- 1788571 reconstruccion del pseudogen, fragmento C-terminal, homologo de LysR
- yfaS
- 87082066 reconstruccion del pseudogen
- yfcU
- 1788678 reconstruccion del pseudogen, familia FimD
- yfdK
- 1788696 desconocida
- yfdL
- 1788697 Pseudogen, protema de fibra de la cola
- yfdM
- 87082089 Pseudogen, el gen intacto codifica una ADN adenina metiltransferasa predicha
- yfdN
- 1788699 desconocida
- yfdP
- 1788701 desconocida
- yfdQ
- 1788702 desconocida
- yfdR
- 87082090 desconocida
- yfdS
- 1788704 desconocida
- yfdT
- 1788705 desconocida
- yffL
- 1788784 desconocida
- yffM
- 1788785 desconocida
- yffN
- 1788786 desconocida
- yffO
- 1788787 desconocida
- yffP
- 1788788 desconocida
- yffQ
- 1788790 desconocida
- yffR
- 1788791 desconocida
- yffS
- 1788792 desconocida
- yfjH
- 1788976 desconocida
- yfjl
- 1788978 desconocida
- yfjJ
- 1788979 desconocida
- yfjK
- 1788980 desconocida
- yfjL
- 1788981 desconocida
- yfjM
- 1788982 desconocida
- yfjo
- 87082140 desconocida
- yfjP
- 48994902 desconocida
- yfjQ
- 1788987 desconocida
- yfjR
- 1788988 desconocida
- yfjs
- 87082142 desconocida
- yfjT
- 1788990 desconocida
- yfju
- 1788991 pseudogen
- yfjv
- 1788992 reconstruccion del pseudogen, fragmento similar a arsB C-terminal
- yfjW
- 2367146 desconocida
- yfjX
- 1788996 desconocida
- yfjY
- 1788997 desconocida
- yfjz
- 1788998 componente de antitoxina de toxina-antitoxina YpjF-YfjZ putativa
- ygaQ
- 1789007 reconstruccion del pseudogen, tiene dominio relacionado con alfa-amilasa
- ygaY
- 1789035 reconstruccion del pseudogen, familia MFS
- ygeF
- 2367169 reconstruccion del pseudogen, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
- ygeK
- 87082170 reconstruccion del pseudogen, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
- ygeN
- 1789221 reconstruccion del pseudogen, homologo de orgB
- ygeo
- 1789223 Pseudogen, homologo de orgA, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
- ygeQ
- 1789226 reconstruccion del pseudogen, parte de T3SS PAI ETT2 remanente
- yghE
- 1789340 reconstruccion del pseudogen, familia de protemas de secrecion general
- yghF
- 1789341 Pseudogen, protema de secrecion general
- ygho
- 1789354 Pseudogen, fragmento C-terminal
- yghx
- 1789373 reconstruccion del pseudogen, familia de S9 peptidasa
- yhcE
- 1789611 reconstruccion del pseudogen, interrumpida por IS5R
- yhdW
- 1789668 reconstruccion del pseudogen
- yhiL
- 87082275 reconstruccion del pseudogen, regulada por FliA
- yhiS
- 1789920 reconstruccion del pseudogen, interrumpida por IS5T
- yhjQ
- 1789955 reconstruccion del pseudogen
- yibJ
- 48994952 reconstruccion del pseudogen, familia Rhs
- yibS
- ninguno reconstruccion del pseudogen, familia Rhs, fragmento C-terminal
- yibU
- ninguno reconstruccion del pseudogen, protema asociada a la repeticion H
- yibW
- ninguno reconstruccion del pseudogen, conectada a rhsA
- yicT
- ninguno Pseudogen, fragmento N-terminal
- yifN
- 2367279 reconstruccion del pseudogen
- yjbi
- 1790471 reconstruccion del pseudogen
- yjdQ
- ninguno reconstruccion del pseudogen, integrasa similar a P4 remanente
- yjgx
- 1790726 reconstruccion del pseudogen, familia EptAB
- yjhD
- 87082406 Pseudogen, fragmento C-terminal
- yjhE
- 87082407 Pseudogen, transportador putativo remanente
- yjhR
- 1790762 reconstruccion del pseudogen, familia de helicasa, fragmento C-terminal
- yjhv
- 1790738 Pseudogen, fragmento C-terminal
- yjhY
- ninguno reconstruccion del pseudogen, nueva familia de dedo de cinc
- yjhz
- ninguno reconstruccion del pseudogen, paralogo de rimK, fragmento C-terminal
- yjiP
- 1790795 reconstruccion del pseudogen, familia de transposasa
- yjiT
- 87082428 Pseudogen, fragmento N-terminal
- yjiv
- ninguno reconstruccion del pseudogen, similar a helicasa, fragmento C-terminal
- yjjN
- 87082432 oxidorreductasa predicha
- ykfA
- 87081706 protema que se une a GTP putativa
- ykfB
- 1786444 desconocida
- ykfC
- 87081707 Pseudogen, familia de transcriptasa inversa tipo retron, fragmento N-terminal
- ykfF
- 1786443 desconocida
- ykfG
- 2367100 desconocida
- ykfH
- 87081704 desconocida
- ykfl
- 1786439 toxina del sistema toxina-antitoxina Ykfl-YafW
- ykfJ
- 1786430 Pseudogen, fragmento N-terminal
- ykfK
- 1786445 Pseudogen, fragmento N-terminal
- ykfL
- ninguno Pseudogen, fragmento C-terminal
- ykfN
- ninguno Pseudogen, N-terminal remanente, familia YdiA
- ykgA
- 87081714 Pseudogen, fragmento N-terminal, familia AraC
- ykgP
- ninguno Pseudogen, fragmento de oxidorreductasa
- ykgQ
- ninguno Pseudogen, fragmento C-terminal de una deshidrogenasa putativa
- ykgS
- ninguno fragmento interno de pseudogen
- ykiA
- 1786591 reconstruccion del pseudogen, fragmento C-terminal
- ylbE
- 1786730 reconstruccion del pseudogen, paralogo de yahG
- ylbG
- 87081748 reconstruccion del pseudogen, fragmento N-terminal discontinuo
- ylbH
- 1786708 Pseudogen, copia de nucleo de Rhs con extension unica
- ylbl
- ninguno Pseudogen, fragmento interno, familia Rhs
- ylcG
- 87081756 desconocida
- ylcH
- ninguno desconocida
- ylcI
- ninguno desconocida
- ymdE
- 87081823 Pseudogen, fragmento C-terminal
- ymfD
- 1787383 metiltransferasa dependiente de SAM putativa
- ymfE
- 1787384 desconocida
- ymfl
- 87081839 desconocida
- ymfJ
- 87081840 desconocida
- ymfL
- 1787393 desconocida
- ymfM
- 1787394 desconocida
- ymfQ
- 1787399 protema tt de placa base o fibra de cola putativa
- ymfR
- 1787396 desconocida
- ymjC
- ninguno Pseudogen, fragmento N-terminal
- ymjD
- ninguno protema remanente de fusion de pseudogen de supresion expresado
- ynaA
- 1787631 Pseudogen, fragmento N-terminal
- ynaE
- 1787639 gen de choque por fno
- ynaK
- 1787628 desconocida
- yncI
- 1787731 reconstruccion del pseudogen, asociado a la repeticion H, conectado a RhsE
- yncK
- ninguno reconstruccion del pseudogen, homologo de transposasa
- yneL
- 1787784 reconstruccion del pseudogen, fragmento C-terminal, familia AraC
- yneO
- 1787788 reconstruccion del pseudogen, adhesina autotrasportadora de OM putativa
- ynfN
- 87081933 gen de choque por fno
- ynfO
- ninguno desconocida
- yoeA
- 87082018 reconstruccion del pseudogen, interrumpido por IS2F
- yoeD
- ninguno Pseudogen, fragmento C-terminal de una transposasa putativa
- yoeF
- 87082021 Pseudogen, fragmento C-terminal
- yoeG
- ninguno pseudogen, fragmento N-terminal
- yoeH
- ninguno pseudogen, fragmento C-terminal
- ypdJ
- 87082091 Pseudogen, fragmento de exisonasa
- ypjc
- 1789003 reconstruccion del pseudogen
- ypjF
- 1788999 componente de toxina del par toxina-antitoxina YpjF-YfjZ putativo
- ypji
- ninguno reconstruccion del pseudogen
- ypjJ
- 87082144 desconocida
- ypjK
- 87082141 desconocida
- yqfE
- 1789281 reconstruccion del pseudogen, fragmento C-terminal, familia LysR
- yqiG
- 48994919 reconstruccion del pseudogen, familia FimD, interrumpida por IS2I
- yrdE
- ninguno reconstruccion del pseudogen, fragmento C-terminal, paralogo de yedZ
- yrdF
- ninguno Pseudogen, fragmento N-terminal
- yrhA
- 87082266 reconstruccion del pseudogen, interrumpida por IS1E
- yrhC
- 87082273 reconstruccion del pseudogen, fragmento N-terminal
- ysaC
- ninguno Pseudogen, C-terminal remanente
- ysaD
- ninguno Pseudogen, secuencia interna remanente
- ytfA
- 1790650 Pseudogen, fragmento C-terminal
- yzgL
- 87082264 Pseudogen, protema que se une a soluto periplasmico putativa
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En la descripcion de la presente invencion, los genes y las protemas se identifican usando las denominaciones de los genes correspondientes en E. coli. Sin embargo, y a menos que se especifique otra cosa, el uso de estas denominaciones tiene un significado mas general segun la invencion y cubre todos los genes y las protemas correspondientes en otros organismos, mas particularmente microorganismos.
Usando las referencias dadas en GenBank para genes conocidos, los expertos en la tecnica son capaces de determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mairnferos, plantas, etc. Este trabajo habitual se realiza ventajosamente usando secuencias de consenso que se pueden determinar al llevar a cabo alineamientos de secuencias con genes derivados de otros microorganismos, y disenando sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo. Estos metodos habituales de biologfa molecular son muy conocidos por los expertos en la tecnica y se reivindican, por ejemplo, en Sambrook y cols. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nueva York.)
PFAM (base de datos de alineamientos por familias de protemas y modelos de Markov ocultos;
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa una gran coleccion de alineamientos de secuencias protemicas. Cada PFAM hace posible visualizar multiples alineamientos, observar dominios protemicos, evaluar la distribucion entre organismos, obtener acceso a otras bases de datos y visualizar estructuras protemicas conocidas.
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) representa una gran coleccion de alineamientos de secuencias protemicas. Cada PFAM hace posible visualizar multiples alineamientos, observar dominios protemicos, evaluar la distribucion entre organismos, obtener acceso a otras bases de datos y visualizar estructuras protemicas conocidas.
COGs (agregados de grupos ortologos de protemas;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ se obtienen al comparar secuencias protemicas procedentes de genomas completamente secuenciados que representan lmeas filogenicas principales. Cada COG se define a partir de al menos tres lmeas, lo que permite la identificacion de dominios conservados previos.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ se obtienen al comparar secuencias protemicas procedentes de genomas completamente secuenciados que representan lmeas filogenicas principales. Cada COG se define a partir de al menos tres lmeas, lo que permite la identificacion de dominios conservados previos.
Los medios para identificar secuencias homologas y su porcentaje de homologfa son muy conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen en particular los programas BLAST, que se pueden usar del cibersitio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parametros por defecto indicados en ese cibersitio. A continuacion, las secuencias obtenidas se pueden explotar (p. ej, alinear) usando, por ejemplo, los programas CLUSTALW (
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) o MULTALIN (
http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html), con los parametros por defecto indicados en esos cibersitios.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parametros por defecto indicados en ese cibersitio. A continuacion, las secuencias obtenidas se pueden explotar (p. ej, alinear) usando, por ejemplo, los programas CLUSTALW (
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) o MULTALIN (
http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html), con los parametros por defecto indicados en esos cibersitios.
El metodo para la produccion de metionina, sus precursores o derivados en un proceso fermentativo, es muy conocido por el experto en la tecnica. Diferentes factores del proceso fermentativo se pueden modular para la optimizacion del proceso, tales como la eleccion de la fuente de azufre, de la fuente de carbono y de la fuente de nitrogeno.
En un aspecto preferido de la invencion, la fuente de azufre usada para la produccion fermentativa de L-metionina, anadida al medio de cultivo, es sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrogeno, ditionato, ditionito, sulfito, metilmercaptano, disulfuro de dimetilo y otros sulfuros terminados en metilo o una combinacion de las diferentes fuentes.
Mas preferentemente, la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato o tiosulfato, o una mezcla de los mismos.
El termino 'fuente de carbono', segun la presente invencion, indica cualquier fuente de carbono que pueda ser usada por los expertos en la tecnica para apoyar el crecimiento normal de un microorganismo, que puede ser hexosas (tales como glucosa, galactosa o lactosa), pentosas, monosacaridos, disacaridos (tales como sacarosa, celobiosa o maltosa), oligosacaridos, melazas, almidon o sus derivados, hemicelulosas, glicerol y combinaciones de los mismos. Una fuente de carbono especialmente preferida es la glucosa. Otra fuente de carbono preferida es la sacarosa.
En una realizacion particular de la invencion, la fuente de carbono se deriva de una materia prima renovable. Una materia prima renovable se define como un material de partida requerido para ciertos procedimientos industriales que se puede regenerar en poco tiempo y en una cantidad suficiente para permitir su transformacion en el producto deseado.
El termino fuente de nitrogeno corresponde bien a una sal amonica o bien a amomaco gaseoso.
La fuente de nitrogeno se suministra en la forma de amonio o amomaco.
La fermentacion se efectua generalmente en fermentadores con un medio de cultivo apropiado adaptado al microorganismo que se use, que contiene al menos una fuente de carbono simple, y si es necesario cosustratos para la produccion de metabolitos.
Los expertos en la tecnica son capaces de definir las condiciones de cultivo para los microorganismos segun la invencion. En particular, las bacterias se fermentan a una temperatura entre 20°C y 55°C, preferentemente entre 25°C y 40°C, y mas espedficamente aproximadamente 30°C para C. glutamicum y aproximadamente 37°C para E. coli.
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Como un ejemplo de un medio de cultivo conocido para E. coli, el medio de cultivo puede ser de composicion identica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128), un medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) o un medio tal como el definido por Schaefer y cols. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).
Como un ejemplo de un medio de cultivo conocido para C. glutamicum, el medio de cultivo puede ser de composicion identica o similar a medio BMCG (Liebl y cols., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) o a un medio tal como el descrito por Riedel y cols. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583).
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para la produccion de metionina, que comprende la etapa de aislamiento de metionina, sus precursores o derivados, del caldo de fermentacion y/o la biomasa, opcionalmente en porciones o en la cantidad total (0-100%) en el producto final.
En un aspecto espedfico de la invencion, el cultivo se realiza en tales condiciones que el microorganismo este limitado o en ayunas con respecto a un sustrato inorganico, en particular fosfato y/o potasio.
Someter a un organismo a una limitacion de un sustrato inorganico define una condicion bajo la cual el crecimiento de los microorganismos esta gobernado por la cantidad de un producto qmmico inorganico suministrado que permita todavia un crecimiento debil.
Someter a ayuno a un microorganismo con respecto a un sustrato inorganico define la condicion bajo la cual el crecimiento del microorganismo se detiene completamente debido a la ausencia del sustrato inorganico.
La presente invencion tambien se refiere a un microorganismo que comprende al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control, directo o indirecto, de un promotor inducible por temperatura heterologo inducido por la temperatura.
Ejemplos
Ejemplo I: Construccion de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB (pCC1BAC-serA-serC) (pCL1920-TTadc- CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1 -cysE-PgapA-metA*11)
Cepas productoras de metionina con acumulacion reducida de N-acetilmetionina se han descrito en las solicitudes de patente WO2007077041 y WO2009043803 que se incorporan como referencia en esta solicitud.
1. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB::Km.
Para incrementar el nivel de fosfoserina fosfatasa, SerB, un promotor tcr artificial constitutivo, se anadio aguas arriba del gen serB en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA.
Para anadir este promotor trc artificial, se uso la estrategia de recombinacion homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la insercion de un casete de resistencia a kanamicina, pero tambien una region de AdN adicional, espedficamente en cromosoma. Con este proposito, se usaron dos oligonucleotidos, Ptrc07-serBF (SEQ ID N°01) y Ptrc07-serBR (SEQ ID N°02) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/).
http://ecogene.org/).
Ptrc07-serBF (SEQ ID N°01)
CCACCCTTTGAAAATTTGAGACTTAATGTTGCCAGAAGCAATGGATACAAGGT
AGCCTCATGCTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCCATATGAAT
ATCCTCCTTAG
con
- una region (mayusculas) homologa a la secuencia de 4622816 a 4622878 de la region del gen serB,
- una region (mayusculas subrayado) para la secuencia terminadora de la transcription T7Te procedente del fago T7 (Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Natl Acad Sci USA. 24 abr. 2001;98(9):5019-24.),
- una region (mayusculas negrita) para la amplification del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 20O0, PNAS, 97: 6640-6645).
5 Ptrc07-serBR (SEQ ID N°02)
CGCACCAGGTAATGTTAGGCATTAAGGCTCCTGTAAAATCGTTCGAAGCAGGG AAAATAAC TTCCA CA CA TTA TA CGA GCCGGA TGA TTAA TCGCCAA CA GC7TGTAGG CTGGAGCTGCTTCG
con
- una region (mayusculas) homologa a la secuencia de 4622939 a 4622879 de la region del gen serB,
- una region (mayusculas cursiva) para la secuencia del promotor trc,
10 - una region (mayusculas negrita) para la amplificacion del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de
referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 20O0, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleotidos Ptrc07-serBF (SEQ ID N°01) y Ptrc07-serBR (SEQ ID N°02) se usaron para amplificar el casete de resistencia a kanamicina procedente del plasmido pKD4. A continuation, el producto de pCr obtenido se introdujo mediante electroporation en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09- 15 gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA (pKD46), en la que la enzima Red recombinasa
expresada permite la recombination homologa. A continuacion, se seleccionaron los transformantes resistentes a kanamicina, y la insertion del casete de resistencia se verifico mediante un analisis por PCR con los oligonucleotidos serBF (SEQ ID N°03) y serBR (SEQ ID N°04) definidos posteriormente. A continuacion, los transformantes seleccionados se verificaron mediante secuenciacion de ADN.
20
La cepa retenida se denomino MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB::Km.
serBF (SEQ ID N°03)
CAAGGCAAGACAGAACAGG (homologa a la secuencia de 4622747 a 4622765 de la region del gen serB).
25 serBR (SEQ ID N°04)
GGCATCACTTCATCACCAC (homologa a la secuencia de 4623006 a 4622988 de la region del gen serB).
2. Construction de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB
Posteriormente, se elimino el casete de resistencia a kanamicina. El plasmido pCP20, que soporta recombinasa FLP 30 que actua en los sitios FRT del casete de resistencia a kanamicina, se introdujo en la cepa recombinante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB::Km mediante electroporacion. Despues de una serie de cultivos a 42°C, la perdida del casete de resistencia a kanamicina se verifico mediante analisis por PCR con los mismos oligonucleotidos que los usados previamente, serBF (SEQ ID N°03) / serBR (SEQ ID N°04). La cepa retenida se denomino MG1655 metA*11 35 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU
DyncA Ptrc07-serB.
3. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB (pCC1BAC-serA-serC)
La construccion del vector pCC1BAC-serA-serC se ha descrito en el documento WO2009043803.
5 El vector pCC1BAC-serA-serC se introdujo mediante electroporation en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-
cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB dando la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB (pCCIBAC-serA-serC).
4. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- 10 ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB (pCC1BAC-serA-serC) (pCL1920-TTadc-CI857-
PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)
El plasmido pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 se deriva de los plasmidos pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631), pME101-thrA*1-cysE y pFC1 (Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148).
15
La construccion de pME101-thrA*1-cysE se describio en el documento WO2007077041.
Para la construccion del plasmido pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11, TTadc- CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE y las regiones PgapA-metA*11 se obtuvieron individualmente mediante PCR de 20 solapamiento y a continuation se clonaron conjuntamente en el vector pCL1920.
En primer lugar, la region TTadc-CI857-PlambdaR*(-35) se amplifico por PCR a partir del vector pFC1 al usan los siguientes oligonucleotidos, ApaI-TTadc-CI857-F-1 (SeQ ID N°05) y PlambdaR-thrA-R-2 (SEQ ID N°06) (secuencia de referencia en el cibersitio http://ecogene.org/ y
http://www.genomejp/dbget-bin/www_bfind?C.acetobutilicum). En 25 segundo lugar, la region thrA*1-cysE se amplifico por PCR a partir del plasmido pME101-thrA*1-cysE usando los oligonucleotidos PlambdaR-thrA-F-3 (SEQ ID N°07) y cysE-R-4 (SEQ ID N°08) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/). Ambos oligonucleotidos PlambdaR-thrA-R-2 (SEQ ID N°06) y PlambdaR-thrA-F-3 (SEQ ID N°07) estaban disenados para poseer una secuencia solapada de 32 pb de longitud. Debido a esta secuencia solapada, en una tercera etapa, la region TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE se amplificaba por 30 PCR al mezclar los productos de PCR TTadc-CI857-PlambdaR*(-35) y thrA*1-cysE y al usar los oligonucleotidos ApaI-TTadc-CI857-F-1 (SEQ ID N°05) y cysE-R-4 (SEQ ID N°08). A continuacion, este producto de PCR se clono en el pSCB (Stratagene) y el vector resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pSCB-TTadc-CI857- PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE.
http://www.genomejp/dbget-bin/www_bfind?C.acetobutilicum). En 25 segundo lugar, la region thrA*1-cysE se amplifico por PCR a partir del plasmido pME101-thrA*1-cysE usando los oligonucleotidos PlambdaR-thrA-F-3 (SEQ ID N°07) y cysE-R-4 (SEQ ID N°08) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/). Ambos oligonucleotidos PlambdaR-thrA-R-2 (SEQ ID N°06) y PlambdaR-thrA-F-3 (SEQ ID N°07) estaban disenados para poseer una secuencia solapada de 32 pb de longitud. Debido a esta secuencia solapada, en una tercera etapa, la region TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE se amplificaba por 30 PCR al mezclar los productos de PCR TTadc-CI857-PlambdaR*(-35) y thrA*1-cysE y al usar los oligonucleotidos ApaI-TTadc-CI857-F-1 (SEQ ID N°05) y cysE-R-4 (SEQ ID N°08). A continuacion, este producto de PCR se clono en el pSCB (Stratagene) y el vector resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pSCB-TTadc-CI857- PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE.
ApaI-TTadc-CI857-F-1 (SEQ ID N°05)
accttgccgaGGGCCCT AAAAAT AAGAGTT ACCTT AAAT GGT AACT CTTATTTTTTTT 35 ATCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCC
con
- una region (minusculas) con bases adicionales,
- una region (mayusculas subrayado) que aloja el sitio ApaI,
- una region (mayusculas) para la secuencia del terminador de la transcription TTadc (terminador de la
40 transcripcion del gen adc procedente de Clostridium acetobutilicum, homologo de 179847 a 179807 del
megaplasmido pSLO1),
- una region (mayusculas negrita) homologa al extremo 3' del gen cI857 procedente del bacteriofago lambda. PlambdaR-thrA-R-2 (SEQ ID N°06)
C AAC ACTC TC AT AT GACCTCCTT AGT AC AT GC AACC ATT ATC ACCGCC AGAGG TAAAAT 7GTC AAC ACGC ACGGT GTTAGAT ATTT ATCCCTTGC
45 con
- una region (mayusculas negrita) homologa al extremo 5' del gen thrA (de 337 a 348, excepto para 1 base (mayusculas negrita cursiva))
- una region (mayusculas) homologa al promotor Pr del bacteriofago lambda, excepto 1 base (mayusculas cursiva) para obtener la version *(-35) del Pr, forma variante en la que la caja -35 esta modificada para obtener
5 el consenso -35 (de TTGACT a TTGACA)
- una region solapada con el oligonucleotido PlambdaR-thrA-F-3 (mayusculas subrayado).
PlambdaR-thrA-F-3 (SEQ ID N°07)
GCATGTACTAAGGAGGTCATATGAGAGTGTTGAAGTTCGGCGGTACATCAG
TGGCAAATGC
con
10 - una region (mayusculas) homologa al promotor PR del bacteriofago lambda,
- una region (mayusculas negrita) homologa al extremo 5' del gen thrA (de 337 a 377, excepto para 1 base
(mayusculas negrita cursiva))
- una region solapada con el oligonucleotido PlambdaR-thrA-R-2 (mayusculas subrayado) cysE-R-4 (SEQ ID N°08)
15 AGCTTGCATGCCTGCAGGTCG (homologa a la region aguas abajo cysE del plasmido pME101-thrA*1-cysE)
Para transferir los genes thrA*1 y cysE en un vector de bajo numero de copias, el vector pSCB-TTadc-C857-
PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE se restringio mediante BsrBI y BamHI y el fragmento TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)- thrA*1-cysE se clono en los sitios SmaI / BamHI del vector pCL1920, dando como resultado el vector pCL1920- TTadc-C/857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE.
20
Posteriormente, la region PgapA-metA*11 se amplifico a partir de la cepa MG1655 metA*11 mediante una PCR de solapamiento. En primer lugar, el promotor PgapA se amplifico por PCR usando los oligonucleotidos SmaI-PgapA-F (SeQ ID N°09) y PgapA-metA*11-R (SEQ ID N°10) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/). En segundo lugar, el gen metA*11 se amplifico por PCR al usar los oligonucleotidos PgapA-metA*11-F (SEQ ID N°11) y 25 BamHI-metA*11-R (SEQ ID N°12) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/). Tanto PgapA- metA*11-R (SEQ ID N°10) como PgapA-metA*11-F (SEQ ID N°11) estaban disenados para solaparse en toda su secuencia. Debido a esta particularidad, en una tercera etapa, la region PgapA-metA*11 se amplifico por PCR al mezclar los productos de PCR metA*11 y PgapA y al usar los oligonucleotidos SmaI-PgapA-F (SEQ ID N°09) y BamHI-metA*11-R (SEQ ID N°12). El producto de PCR se restringio mediante SmaI y BamHI, a continuation el 30 fragmento digerido se hizo romo a fin de clonarlo en el sitio BamHI romo del vector pCL1920-TTadc-C857- PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE. El vector resultante se verifico al secuenciar y se denomino pCL1920-TTadc-C857- PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11.
http://ecogene.org/). En segundo lugar, el gen metA*11 se amplifico por PCR al usar los oligonucleotidos PgapA-metA*11-F (SEQ ID N°11) y 25 BamHI-metA*11-R (SEQ ID N°12) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/). Tanto PgapA- metA*11-R (SEQ ID N°10) como PgapA-metA*11-F (SEQ ID N°11) estaban disenados para solaparse en toda su secuencia. Debido a esta particularidad, en una tercera etapa, la region PgapA-metA*11 se amplifico por PCR al mezclar los productos de PCR metA*11 y PgapA y al usar los oligonucleotidos SmaI-PgapA-F (SEQ ID N°09) y BamHI-metA*11-R (SEQ ID N°12). El producto de PCR se restringio mediante SmaI y BamHI, a continuation el 30 fragmento digerido se hizo romo a fin de clonarlo en el sitio BamHI romo del vector pCL1920-TTadc-C857- PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE. El vector resultante se verifico al secuenciar y se denomino pCL1920-TTadc-C857- PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11.
SmaI-PgapA-F (SEQ ID N°09)
acgtCCCGGGCAAGCCCAAAGGAAGAGTGAGGC
35 con
- una region (minusculas) con bases adicionales,
- una region (mayusculas subrayado) que aloja el sitio SmaI,
- una region (mayusculas) homologa de 1860639 a 1860661 de la secuencia del promotor PgapA de Escherichia coli).
40 PgapA-metA*11-R (SEQ ID N°10)
5
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15
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25
30
35
GGCGGGTAGCTCGTCCGGCACACGAATCGGCATATATTCCACCAGCTATTT
GTTAGTGAATAAAAGG
con
- una region (mayusculas negrita) homologa de 4212335 a 4212303 del gen metA
- una region (mayusculas) homologa de 1860794 a 1860761 de la secuencia del promotor PgapA PgapA-metA*11-F (SEQ ID N°11)
CCTTTT ATTC ACT A AC AAAT AGCTGGT GG AAT AT ATGC C G ATTC GTGTGCCG GACGAGCTACCCGCC
con
- una region (mayusculas negrita) homologa de 4212335 a 4212303 del gen metA
- una region (mayusculas) homologa de 1860794 a 1860761 de la secuencia del promotor PgapA BamHI-metA*11-R (SEQ ID N°12)
acgtGGATCCGAATTCCGACTATCACAGAAGATTAATCCAGCGTTGG
con
- una region (minusculas) con bases adicionales,
- una region (mayusculas subrayado) que aloja el sitio BamHI,
- una region (mayusculas cursiva) que aloja el sitio EcoRI,
- una region (mayusculas negrita) homologa de 4213248 a 4213218 de la secuencia del gen metA.
Finalmente, el vector pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 se introdujo mediante electroporation en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB (pCC1BAC-serA-serC) dando como resultado la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB (pCC1BAC-serA-serC) (pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1- cysE-PgapA-metA*11).
5. Evaluation de la production de metionina dependiente de la temperatura
Cepa 1: MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA Ptrc07-serB (pCC1BAC-serA-serC) (pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)
Las cepas de produccion se evaluaron en matraces Erlenmeyer pequenos. Un precultivo de 5,5 ml se hizo crecer a 30°C durante 21 horas en un medio mixto (10 % de medio LB (Sigma 25 %) con 2,5 g.l-1 de glucosa y 90% de medio mmimo PC1). Se uso para inocular un cultivo de 50 ml hasta una OD60o de 0,2 en medio PC1. Se anadio espectinomicina a una concentration de 50 mg.l-1, cloranfenicol a 30 mg.l-1. La temperatura del cultivo era bien 30°C o bien 37°C. Cuando el cultivo hubo alcanzado una OD600 de 5 a 7, los aminoacidos extracelulares se cuantificaron mediante HPLC despues de la derivation por OPA/Fmoc y otros metabolitos pertinentes se analizaron usando HPLC con detection refractometrica (acidos organicos y glucosa) y GC-MS despues de la sililacion. Para cada condition, se realizaron tres repeticiones.
Tabla 1: Composition del medio mmimo (PC1)
- Compuesto
- Concentracion (g.l-1)
- ZnSO4.7H2O
- 0,0040
- CuCl2.2H2O
- 0,0020
- MnSO4.H2O
- 0,0200
- CoCl2.6H2O
- 0,0080
- H3BO3
- 0,0010
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0004
- MgSO4.7H2O
- 1,00
- Acido citrico
- 6,00
- CaCl2.2H2O
- 0,04
- K2HPO4.3H2O
- 10,50
- Na2HPO4
- 2,00
- (NH4)2HPO4
- 8,00
- NH4Cl
- 0,13
- NaOH 4M
- Ajustado hasta pH 6,8
- FeSO4.7H2O
- 0,04
- Tiamina
- 0,01
- Glucosa
- 10,00
- Tiosulfato amonico
- 5,60
- Vitamina B12
- 0,01
- MOPS
- 10,00
- IPTG
- 0,0024
Tabla 2: Rendimiento de metionina (Rmet) en % g de metionina /g de glucosa producido en cultivo discontinuo por la cepa 1 bajo diferentes condiciones de cultivo. Para la definicion del rendimiento de metionina/glucosa, vease posteriormente. DE indica la desviacion estandar para los rendimientos que se calculaba sobre la base de varias 5 repeticiones (N = numero de repeticiones)
- Condicion
- Rmet DE N
- Cepa 1 -Precultivo 30°C + Cultivo 30°C
- 10,6 0,4 3
- Cepa 1 -Precultivo 30°C + Cultivo 37°C
- 12,9 0,8 9
- Cepa 1 -Precultivo 37°C + Cultivo 37°C
- 7,4 0,9 6|
La concentracion de metionina extracelular se cuantifico mediante HPLC despues de la derivacion con OPA/FMOC. La concentracion de glucosa residual se analizo usando HPLC con deteccion refractometrica. El rendimiento de 10 metionina se expreso como sigue:
metionina (a)
R = * 100
met glucosa consumida (g)
Como se muestra en la tabla 2 la termoinduccion de la expresion de los genes thrA y cysE durante el procedimiento de cultivo incrementa la cantidad de metionina producida. La expresion constitutiva a lo largo del procedimiento de cultivo da como resultado un rendimiento de metionina bajo.
15 La Tabla 3 muestra que durante la induccion, las actividades de HDH y SAT se incrementan. La expresion constitutiva de thrA y cysE da como resultado niveles de actividad de HDH y SAT que estan entre las condiciones no inducidas e inducidas, explicando en parte el rendimiento de metionina inferior. Otros factores celulares afectan lo mas probablemente a estas actividades durante la expresion constitutiva y disminuyen las actividades. En conclusion, estos resultados demuestran que la induccion de thrA y cysE es ciertamente beneficiosa para 20 incrementar el rendimiento de metionina.
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 3: Las actividades de homoserina deshidrogenasa (HDH) y serina acetiltransferasa (SAT) se determinaron en los cultivos descritos anteriormente y se dan en mUI/mg DW. Las desviaciones estandar se calcularon sobre la base de varios cultivos independientes (N = numero de repeticiones).
- condition
- HDH SAT N
- Cepa 1 - Precultivo 30°C + Cultivo 30°C
- 33 ± 0 40 ± 12 3
- Cepa 1 - Precultivo 30°C + Cultivo 37°C
- 94 ± 15 CM -H CD CM 3
- Cepa 1 - Precultivo 37°C + Cultivo 37°C
- 51 ± 1 148 ± 28 3
Para la determination de actividades enzimaticas in vitro, se cultivaron cepas de E. coli en medio mmimo segun se describe anteriormente.
La determinacion de la actividad de SAT se ha descrito en el documento WO 2007077041.
Para la determinacion de la actividad de HDH in vitro, celulas de E. coli se resuspendieron en tampon de fosfato potasico 20 mM (pH 7,2) frfo y se trataron por ultrasonidos sobre hielo (sonificador Branson, 70 W). Despues de la centrifugation, se cuantifico la protema contenida en los sobrenadantes (Bradford, 1976). Se ensayaron 10 ^l de extracto (1,5 ^g/ml de protema) en 100 mM de Tris-HCl pH 9, 150 mM de KCl, 1 mM de NADP+ y 25 mM de L- homoserina durante 10 minutos a 30°C. La reduction de NADP+ en presencia de L-homoserina es seguida espectrofotometricamente durante 30 minutos a 340 nm.
Ejemplo II: Construction de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA DmaIS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol- TT07::Km (pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO)
Cepas productoras de metionina con acumulacion reducida de N-acetilmetionina se han descrito en las solicitudes de patente WO 2007077041 y WO 2009043803 que se incorporan como referencia en esta solicitud.
1. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA (pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11- T7T0)
El plasmido pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO se deriva de los plasmidos pBeloBAC11 (New England BioLabs; Kim y cols., 1996, Genomics, 34, 231-218) y pCL1920-TTadc-CI857- PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 (descrito anteriormente).
En primer lugar, la region thrA*1-SMC-cysE (SMC para el sitio de donation multiple) se amplifico por PCR a partir del plasmido pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 al usar los siguientes oligonucleotidos, SnaBI-thrA-SMC-cysE-F (SEQ ID N°13) y cysE-R (SEQ ID N°14) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/).
http://ecogene.org/).
SnaBI-thrA-SMC-cysE-F (SEQ ID N°13)
tgctaegtaccctctcatggaagttaggagtctgaG'CY/lG'CrAGTCCGCrCG'/lG'ATACGAAAGAAG
TCCGCGAACTGG
con
- una region (minusculas) homologa al extremo 3' del gen thrA (de 2765 a 2799) y que aloja el sitio de restriction SnaBI (minusculas cursiva)
- una region (negrita) para la region SMC que aloja los sitios de restriccion NheI y XhoI (negrita cursiva)
- una region (mayusculas) homologa a la region aguas arriba 5' del gen cysE (de 3780796 a 3780819)
5
10
15
20
25
30
35
cysE-R (SEQ ID N°14)
CAACCAGTGACCGATGCG
homologa al gen cysE de 3780226 a 3780243
El fragmento amplificado por PCR thrA*1-SMC-cysE se restringio mediante SnaBI y StuI y el fragmento digerido se clono en los sitios SnaBI / StuI del plasmido pCL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11. El plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pcL1920-TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)- thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11.
Posteriormente, la region PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO se amplifico por PCR a partir del plasmido pCL1920-TTadc-C/857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-SMC-PgapA-metA*11 al usar los siguientes oligonucleotidos, SfoI-PT7-RBST7-NdeI-thrA-F (SEQ ID N°15) y metA-T7TO-SfoI-R (SEQ ID N°16) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToS earch=10461&window=7553&begin=21516). Este producto de PCR se clono en el vector pSCB (Stratagene). El vector resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pSCB-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA- metA*11-T7TO. Para transferir la region PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO al vector de una sola copia pBeloBAC11, el pSCB-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*l1-T7TO se restringio mediante SfoI y el fragmento PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO se clono en el sitio NotI romo del vector pBeloBAC11, dando como resultado el plasmido pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11- T7TO.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToS earch=10461&window=7553&begin=21516). Este producto de PCR se clono en el vector pSCB (Stratagene). El vector resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pSCB-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA- metA*11-T7TO. Para transferir la region PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO al vector de una sola copia pBeloBAC11, el pSCB-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*l1-T7TO se restringio mediante SfoI y el fragmento PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO se clono en el sitio NotI romo del vector pBeloBAC11, dando como resultado el plasmido pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11- T7TO.
SfoI-PT7-RBST7-NdeI-thrA-F (SEQ ID N°15)
GGCGCCtcgattcgaacttctgatagacttcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataa ttttgtttaactttaagaaggagatatacat AT G AG AGT GTT G AAGTT C GGC GG
con
- una region (mayusculas cursivas) que aloja el sitio de restriction SfoI
- una region (minusculas) homologa a la region promotora del gen T7p45 (10A) del bacteriofago T7 (de 22858 a 22967)
- una region (mayusculas negrita) homologa al gen thrA (de 337 a 359, excepto para 1 base (mayusculas negrita subrayado))
metA-T7TO-SfoI-R (SEQ ID N°16)
GGCGCCctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagca gccaactcagcttcctttcgggctttgttagTT AAT C C AGC GTT GG ATT CAT GTGC
con
- una region (mayusculas cursiva) que aloja el sitio de restriccion SfoI
- una region (minusculas) homologa a la region terminadora de la transcription del gen T7p45 (10A) del bacteriofago T7 (de 24111 a 24218)
- una region (mayusculas negrita) homologa al gen metA (de 4213208 a 4213232)
Finalmente, el plasmido pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO se introdujo mediante electroporation en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA dando como resultado la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA (pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO).
2. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km (pKD46)
Para suprimir la region malS y reemplazarla por la region TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07, se uso la estrategia de recombinacion homologa descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la 5 insercion de un casete de resistencia a kanamicina y ADN adicional, mientras se suprime la mayona de la region relacionada. Con este proposito, se construyo el siguiente plasmido, pUC18-DmalS::TTadc-CI857* PlambdaR03- RBS01- T7RNAPol-TT07::Km.
El plasmido pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km se derivo de los plasmidos 10 puCl8 (Norrander y cols., 1983, Gene 26,101-106) y pUC18-DmalS::SMC::Km (descrito anteriormente), pAR1219 (Sigma) y pCR4BluntTOPO-TTadc-C1857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07 (sintetizado por Geneart y descrito posteriormente).
2.1. Construccion del plasmido pUC18-DmalS::SMC::Km
Para la construccion del plasmido pUC18-DmalS::SMC::Km, se obtuvieron la region aguas arriba de malS (upmalS), 15 el sitio de clonacion multiple (SMC) y el casete de kanamicina (Km) mediante PCR de solapamiento, y la region aguas abajo de malS (downmalS) se amplifico y se clono posteriormente.
En primer lugar, la region upmalS se amplifico por PCR a partir del ADN genomico de E. coli MG1655 usando los siguientes oligonucleotidos, HindIII-upmalS-F-1 (SEQ ID N°17) y upmalS-Km-R-2 (SEQ ID N°18) (secuencia de 20 referencia del cibersitio
http://ecogene.org/). En segundo lugar, la region Km-SMC se amplifico por PCR a partir del plasmido pKD4 (Datsenko & Wanner, 2000) usando los oligonucleotidos upmalS-Km-F-3 (SEQ ID N°19) y Km-SMC- R-4 (SEQ ID N°20). Ambos oligonucleotidos upmalS-Km-R-2 (SEQ ID N°18) y upmalS-Km-F-3 (SEQ ID N°19) estaban disenados para poseer una secuencia solapada de 45 pb. Debido a esta secuencia solapada, en una tercera etapa, la region upmalS-Km-SMC se amplifico por PCR al mezclar los productos de PCR upmalS y Km-SMC 25 y al usar los oligonucleotidos HindIII-upmalS-F-1 (SEQ ID N°17) y Km-SMC-R-4 (SEQ ID N°20). A continuacion, este producto de PCR se clono en el pSCB (Stratagene) y el plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pSCB-upmalS-Km-SMC.
http://ecogene.org/). En segundo lugar, la region Km-SMC se amplifico por PCR a partir del plasmido pKD4 (Datsenko & Wanner, 2000) usando los oligonucleotidos upmalS-Km-F-3 (SEQ ID N°19) y Km-SMC- R-4 (SEQ ID N°20). Ambos oligonucleotidos upmalS-Km-R-2 (SEQ ID N°18) y upmalS-Km-F-3 (SEQ ID N°19) estaban disenados para poseer una secuencia solapada de 45 pb. Debido a esta secuencia solapada, en una tercera etapa, la region upmalS-Km-SMC se amplifico por PCR al mezclar los productos de PCR upmalS y Km-SMC 25 y al usar los oligonucleotidos HindIII-upmalS-F-1 (SEQ ID N°17) y Km-SMC-R-4 (SEQ ID N°20). A continuacion, este producto de PCR se clono en el pSCB (Stratagene) y el plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pSCB-upmalS-Km-SMC.
HindIII-upmalS-F-1 (SEQ ID N°17)
atcgtaAAGCTTTTCACTTTACCTGGCGCATTGG
30 con
- una region (minusculas) con bases adicionales
- una region (mayusculas cursiva) que aloja el sitio de restriccion HindIII
- una region (mayusculas) homologa a la region aguas arriba del gen malS (de 3734620 a 3734641) upmalS-Km-R-2 (SEQ ID N°18)
35 ctaaggaggatattcatatgACCGGTTCGGCGGCGTTCTGGATGG con
- una region (minusculas) para la amplificacion del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645)
- una region (mayusculas) homologa a la region aguas arriba del gen malS (de 3735836 a 3735860)
40 upmalS-Km-F-3 (SEQ ID N°19)
CCATCCAGAACGCCGCCGAACCGGTcatatgaatatcctccttag
- una region (mayusculas) homologa a la region aguas arriba del gen malS (de 3735836 a 3735860)
- una region (minusculas) para la amplificacion del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko & Wanner, 2000, PNaS, 97, 6640-6645)
Km-SMC-R-4 (SEQ ID N°20)
GATCGATGGA TCCATCTCGA G AX CCGCGGATGTA MCATGGGCCCtgtaggctggagctg 5 cttcg con
- una region (mayusculas) con bases adicionales
- una region (mayusculas cursiva) para el SMC que aloja sitios de restriction BamHI, XhoI, SacII, BstZ17I, Apal
- una region (minusculas) para la amplificacion del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia
10 en Datsenko & Wanner, 2000, PNaS, 97, 6640-6645).
A continuation, el plasmido pSCB-upmalS-Km-SMC se restringio mediante BamHI e HindIII y el fragmento upmalS- Km-SMC se clono en los sitios BamHI / HindIII del vector pUC18, dando como resultado el vector pUCIB-upmalS- Km-SMC.
15 Posteriormente, la region downmalS se amplifico por PCR as partir del ADN genomico de E. coli MG1655 usando los siguientes oligonucleotidos, downmalS-F-1 (SEQ ID N°21) y downmalS-R-2 (SEQ ID NO 22) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/). A continuacion, este producto de PCR se clono en el pSCB (Stratagene) y el plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pSCB-downmalS.
http://ecogene.org/). A continuacion, este producto de PCR se clono en el pSCB (Stratagene) y el plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pSCB-downmalS.
downmalS-F-1 (SEQ ID N°21)
20 ATGCTGAATTCaccggtgaagcctggggccacggcg
con
- una region (mayusculas) con bases adicionales
- una region (mayusculas cursiva) que aloja el sitito de restriccion EcoRI
- una region (minusculas) homologa a la region aguas abajo del gen malS (de 3737020 a 3737044) 25 downmalS-R-2 (SEQ ID NO 22)
TACGATGAATTCgggacgccataagcgttatcaatcacc
con
- una region (mayusculas) con bases adicionales
- una region (mayusculas cursiva) que aloja el sitio de restriccion EcoRI
30 - una region (minusculas) homologa a la region aguas abajo del gen malS (de 3738372 a 3738398).
A continuacion, el plasmido pSCB-downmalS se restringio mediante EcoRI y el fragmento downmalS se clono en el sitio EcoRI del vector pUC18, dando como resultado el vector pUC18-DmalS::SMC::Km.
Para la construccion del plasmido pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07::Km, la region TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07 (descrita posteriormente) presente en el pCR4BluntTOPO- TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07 (sintetizado por Geneart) se restringio mediante ApaI y BamHI y 5 el fragmento se subclono en los sitios de restriction ApaI y BamHI del plasmido pUC18-DmalS::SMC::Km, dando el plasmido pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07::Km. A continuation, la region PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07 se amplifico a partir del vector pAR1219 (Sigma) usando los siguientes oligonucleotidos, AvrII-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-F (SEQ ID N°24) y T7RNApol-BstZ17I-TT07-BamHI-XhoI- R(SEQ ID N°25) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/ y
http://ecogene.org/ y
10
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553 &begin=21516). A continuacion, el producto de PCR se restringio mediante AvrII y BamHI y el fragmento se clono en el plasmido pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07::Km parcialmente restringido por AvrII y BamHI, dando el plasmido pUC18-DmalS::TTadc-Cl857*-PlambdaR03-RBs0l-T7RNApol-TT07::Km que se verifico mediante secuenciacion de ADN.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553 &begin=21516). A continuacion, el producto de PCR se restringio mediante AvrII y BamHI y el fragmento se clono en el plasmido pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07::Km parcialmente restringido por AvrII y BamHI, dando el plasmido pUC18-DmalS::TTadc-Cl857*-PlambdaR03-RBs0l-T7RNApol-TT07::Km que se verifico mediante secuenciacion de ADN.
15
Region TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07 presente en el pCR4BluntTOPO-TTadc-CI857*- PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07 (SEQ ID N°23) :
gggcccTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTTA//aa/taaccta ggT C AGCC AAACGT CT CTTC AGGCC ACTGACTAGCGAT AACTTTCCCC AC AACG G AAC AACTCTC ATTGC ATGGG ATC ATT GGGT ACTGT GGGTTT AGT GGTT GT AAA
AACACCTGACCGCTATCCCTGATCAGTTTCTTGAAGGTAAACTCATCACCCCCA AGTCTGGCTATGC AGAAATC ACCT GGCT C AAC AGCCT GCT C AGGGT C AAC GAG AATTAAC ATTCCGTC AGG AAAGCTTGGCTT GGAGCCTGTTGGT GCGGT CAT GG AATT AC CTTC AACCTC AAGCC AG AAT GC AG AAT C ACT GGCTTTTTT GGTT GT GC TTACCCATCTCTCCGCATCACCTTTGGTAAAGGTTCTAAGCTTAGGTGAGAACA TCCCT GCCTGAAC ATGAGAAAAAAC AGGGT ACT CAT ACT C ACTTCTAAGT GAC GGCTGCATGC7AACCGCTTCATACATCTCGTAGATTTCTCTGGCGATTGAAGGG CTAAATTCTTCAACGCTAACTTTGAGAATTTTTGTAAGCAATGCGGCGTTGZTA GCATTTAATGCATTGATGCCATTAAATAAAGCACCAACGCCTGACTGCCCCAT CCCCATCTTGTCTGCGACAGATTCCTGGGATAAGCCAAGTTCATTTTTCTTTTTT TCATAAATTGCC7TAAGGCGACGTGCGTCCTCAAGCTGCTCTTGTGTTAATGGT TTCTTTTTT GT GCT CAT cctaggAAT C T AT C AC C GC AAGGG AT A AAT AT C T AAC A CCGTGCGTGTTGACAATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACT AAGGAGGTTATAAG7.J TA Ctcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcggafcc
20 con
- regiones (minusculas cursiva) que alojan los sitios de restriccion ApaI, PacI, AvrII y BamHI
- una region (mayusculas subrayado) homologa a la secuencia del terminador de la transcription TTadc (terminador de la transcripcion del gen adc de Clostridium acetobutilicum, homologo de 179847 a 179807 del megaplasmido pSLO1) (TTadc)
25 - una region (mayusculas) homologa al gen cI857 que aloja cambios de utilization de codones con el objeto de
crear o suprimir algunos sitios de restriccion (mayusculas cursiva) (CI857*)
- una region (mayusculas negrita) homologa al promotor PR del bacteriofago lambda, excepto 1 base (mayusculas negrita cursiva) para obtener la version *(-35) del PR, forma variante en la que la caja -35 se modifica para obtener el consenso -35 (de TTGACT a TTGACA) (PlambdaR*(-35))
30 - una region (mayusculas negrita subrayado) para el sitio de union al ribosoma (RBS01)
5
10
15
20
25
30
35
- una region (mayusculas cursiva subrayado) que aloja el sitio de restriction BstZ17I (SMC)
- una region (minusculas subrayado) para la secuencia del terminador de la transcription T7Te (Harrington y cols., 2001, PNAS, 98(9), 5019-24) (TT07)
AvrII-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-F (SEQ ID N°24)
ctcatCCZ^GGAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGT TGArCATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTA T AAatgaacacgattaacatcgctaagaacg
con
- una region (minusculas) con bases adicionales
- una region (mayusculas cursiva) que aloja el sitio de restriccion AvrII
- una region (mayusculas negrita) homologa al promotor PR del bacteriofago lambda, excepto 2 bases (mayusculas negrita cursiva) para obtener la version mutante PlambdaR03 del promotor PR
- un sitio de union al ribosoma (mayusculas subrayadas)
- una region (minusculas negrita) homologa al extremo 5' del gen de ARN polimerasa del bacteriofago T7 (gen T7p07) (de 3171 a 3198)
T7RNApol-BstZ17I-TT07-BamHI-XhoI-R (SEQ ID N°25)
cggccagCTCGA GCGCGGA 7TCGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGTG TGAGTA TA Cttacgcgaacgcgaagtccgac
con
una region (minusculas) con bases adicionales
una region (mayusculas cursiva) que aloja los sitios de restriccion XhoI y BamHI
una region (mayusculas negrita) para la secuencia del terminador de la transcripcion T7Te (Harrington y cols., 2001, PNAS, 98(9), 5019-24)
una region (mayusculas cursiva subrayado) que aloja el sitio de restriccion BstZ17I
una region (minusculas negrita) homologa al extremo 3' del gen de ARN polimerasa del bacteriofago T7 (gen T7p07) (de 5801 a 5822).
2.3. Sustitucion de la region malS por la region TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07
Finalmente. a fin de suprimir la region malS y reemplazarla por la region TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01- T7RNAPol-TT07, el plasmido pUC18-DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km se restringio mediante Seal y EcoRVy el fragmento DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km se introdujo mediante electroporation en la cepa MG1655 metA*11 (pKD46), en la que la enzima Red recombinasa permite la recombination homologa. A continuation, se seleccionaron los transformantes resistentes a kanamicina, y la insertion del fragmento DmalS::TTadc-Cl857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km se verifico mediante analisis por PCR con los oligonucleotidos malS-F (SEQ ID N°26), Km-R (SEQ ID N°27), T7RNApol-F (SEQ ID N°28) y malS-R (SEQ ID N°29) (secuencia de referencia en el cibersitio
http://www.ecogene.org/ y
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetaiView&TermToSearch=10461&window=7553 &begin=1#protmap; y Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645). La cepa se denomina MG1655 metA*11 DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km.
http://www.ecogene.org/ y
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetaiView&TermToSearch=10461&window=7553 &begin=1#protmap; y Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645). La cepa se denomina MG1655 metA*11 DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km.
malS-F (SEQ ID N°26): GCACCAACAACGCTTCAGGC (homologa a la region malS de 3734280 a 3734299)
Km-R (SEQ ID N°27): TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG (homologa al casete de resistencia a kanamicina del vector pKD4)
T7RNApol-F (SEQ ID N°28): GCTGCTAAGCTGCTGGCTGC (homologa al gen de ARN polimerasa del bacteriofago 5 T7 gene (gen T7p07) de 5274 a 5293)
malS-R (SEQ ID NO 29): GGAAAGACTCATGCACAGC (homologa a la region malS de 3738453 a 3738471.
3. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol- TT07::Km (pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA *11-T7T0)
10 Para suprimir la region malS y reemplazarla por la region TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNAPol-TT07 en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA (pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO), la construccion DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km se transfirio mediante la transduccion del fago P1 (vease posteriormente) desde la cepa MG1655 metA*11 DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol- 15 TT07::Km hasta la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA (pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11- T7TO). Se seleccionaron transformantes resistentes a kanamicina y cloranfenicol y la insercion de la region DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km se verifico mediante un analisis por PCR con los oligonucleotidos malS-F (SEQ ID N°26), Km-R (SEQ ID N°27), T7RNApol-F (SEQ ID N°28) y malS-R (SEQ ID N°29) 20 descritos previamente. La cepa retenida se denomina MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA DmalS::TTadc-CI857*-PlambdaR03- RBS01-T7RNApol-TT07::Km (pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO).
Preparacion del lisado del fago P1:
- Inoculacion con 100 pl de un cultivo nocturno de la cepa MG1655 metA*11 DmalS::TTadc-CI857*-
25 PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km de 10 ml de LB complementado con kanamicina (50 pg/ml),
glucosa (0,2%) y CaCl2 (5 mM)
- Incubacion durante 1 h a 30°C con agitacion
- Adicion de 100 pl de lisado de fago P1 preparado en la cepa MG1655 (aproximadamente 1,109 fagos/ml)
- Agitacion a 30°C durante 3 horas hasta que todas las celulas sufnan lisis
30 - Adicion de 200 pl de cloroformo y turbulencia
- Centrifugacion durante 10 min a 4500 g para eliminar el residuo celular
- Transferencia del sobrenadante a un tubo esteril y adicion de 200 pl de cloroformo
- Almacenamiento del lisado a 4°C
Transduccion:
35 - Centrifugacion durante 10 min a 1500 g para 5 ml de un cultivo nocturno de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-
metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA (pBeloBAC11-PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO) en medio LB
- Suspension de la pella celular en 2,5 ml de 10 mM de MgSO4,5 mM de CaCl2
- Tubos de control: 100 pl de celulas
5
10
15
20
25
30
- Tubos de ensayo: 100 jl de celulas + 100 jl de fagos P1 de la cepa MG1655 metA*11 DmalS::TTadc- C/857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km
- Incubacion durante 30 min a 30°C sin agitacion
- Adicion de 100 jl de 1 M de citrato sodico en cada tubo y turbulencia
- Adicion de 1 ml de LB
- Incubacion durante 1 hora a 30°C con agitacion
- Extension sobre placas LB complementado con kanamicina (50 jg/ml) despues de la centrifugacion de los tubos durante 3 min a 7000 rpm
- Incubacion a 30°C durante la noche
4. Evaluacion de la produccion de metionina dependiente de la temperature
Cepa 2: MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF DmetJ DpykF DpykA DpurU DyncA DmalS::TTadc-C/857*-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-TT07::Km (pBeloBAC11- PT7-RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO
Las condiciones de precultivo y cultivo se describen anteriormente en el ejemplo 1. Se uso kanamicina en lugar de espectinomicina. La temperatura de cultivo era bien 30°C o bien 34°C.
Tabla 4: Rendimiento de metionina (Rmet) en % g de metionina /g de glucosa producido en cultivo discontinuo por la cepa 2 a 30 y 34°C. Para la definicion precisa del rendimiento de metionina/glucosa, vease anteriormente. DE indica la desviacion estandar para los rendimientos que se calculaba sobre la base de tres repeticiones.
- Condicion
- Rmet DE N
- Cepa 2 - Precultivo 30°C + Cultivo 30°C
- 6,7 0,1 3
- Cepa 2 - Precultivo 30°C + Cultivo 34°C
- 9,9 0,4 3
La induccion de thrA y cysE incrementa la cantidad de metionina producida. Esto se confirma por un analisis de las dos actividades HDH y SAT. Ambas actividades se incrementan con el cambio hasta 34 °C.
Tabla 5: Las actividades de homoserina deshidrogenasa (HDH, thrA*1) y serina acetiltransferasa (SAT, cysE) se determinaron en los cultivos descritos anteriormente y se dieron en mUI/mg de protemas. Las desviaciones estandar se calcularon sobre la base de varios cultivos independientes (N = numero de repeticiones).
- condicion
- HDH SAT N
- Cepa 2 - Precultivo 30°C + Cultivo 30°C
- 58,9 ± 2,8 77,0 ± 8,3 3
- Cepa 2 - Precultivo 30°C + Cultivo 34°C
- 91,7 ± 4,4 131,0 ± 9,7 3|
Ejemplo III: Construcciones de las cepas termoinducibles probadas en los ejemplos IV y V posteriores
1. Protocolos
Se han usado varios protocolos para construir cepas productoras de metionina y se describen en los siguientes ejemplos.
5 Protocolo 1: Modificaciones cromosomicas mediante recombinacion homologa y seleccion de recombinantes (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000)
Se llevo a cabo sustitucion alelica o la alteracion genica en locus cromosomicos especificados mediante recombinacion homologa segun se describe por Datsenko. & Wanner (2000). La resistencia a cloranfenicol (Cm) cat, la resistencia a kanamicina (Km) kan, los genes de resistencia a gentamicina (Gt) gm o la resistencia a tetraciclina 10 (Tc) tet, flanqueados por sitios de reconocimiento de Flp, se amplificaron mediante PCR al usar los plasmidos pKD3 o pKD4, p34S-Gm (Dennis et Ziltra, AEM julio 1998, p 2710-2715) o pLOI2065 (Underwood y cols., Appl Environ Microbiol. diciembre 2002; 68(12): 6263-6272) como plantilla, respectivamente. Los productos de PCR resultantes se usaron para transformar la cepa de E. coli receptora que aloja el plasmido pKD46 que expresa la A Red (y, p,.exo) recombinasa. A continuacion, se seleccionaron transformantes resistentes a antibioticos y la estructura cromosomica 15 de los locus mutados se verifico mediante analisis por PCR con los cebadores apropiados listados en la Tabla 2.
Los genes de resistencia cat, kan, gm y tc se retiraron al usar el plasmido pCP20 segun se describe por Datsenko. & Wanner (2000), excepto que los clones que alojaban el plasmido pCP20 se cultivaron a 37°C sobre LB y a continuacion se probaron con respecto a la perdida de resistencia a antibioticos a 30°C. A continuacion, los clones 20 sensibles a antibioticos se verificaron mediante PCR usando los cebadores listados en la Tabla 2.
Protocolo 2: Transduccion del fago P1
Se transfirieron modificaciones cromosomicas a una cepa receptora de E. coli dada mediante transduccion de P1. El protocolo esta compuesto por 2 etapas: (i) preparacion del lisado fagico sobre una cepa donante que contiene la modificacion cromosomica asociada con la resistencia y (ii) infeccion de la cepa receptora mediante este lisado 25 fagico.
Preparacion del lisado fagico
- Inoculense 100 pl de un cultivo nocturno de la cepa MG1655 con la modificacion cromosomica de interes en 10 ml de LB + Cm 30 pg/ml o Km 50 pg/ml o Gt 10 pg/ml o Tet 10 pg/ml + glucosa 0,2% + CaCl2 5 mM.
- Incubense 30 min a 37°C con agitacion.
30 - Anadanse 100 pl de lisado de fago P1 preparado sobre la cepa donante MG1655 (aprox. 1 x 109 fagos/ml).
- Agttese a 37°C durante 3 horas hasta la lisis completa de las celulas.
- Anadanse 200 pl de cloroformo, y sometase a turbulencia
- Centrifuguese 10 min a 4500 g para eliminar el residuo celular.
- Transfierase el sobrenadante a un tubo esteril.
35 - Almacenese el lisado a 4°C.
Transduccion
- Centrifuguense 10 min a 1500 g 5 ml de un cultivo nocturno de la cepa receptora de E. coli cultivada en medio
LB.
- Suspendase la pella celular en 2,5 ml de MgSO410 mM, CaCl2 5 mM.
- Infectense 100 |jl de celulas con 100 |jl de fago P1 de la cepa MG1655 con la modificacion en el cromosoma (tubo de ensayo) y como tubos de control 100 jl de celulas sin fago P1 y 100 jl de fago P1 sin celulas.
- Incubese 30 min a 30°C sin agitacion.
5 - Anadanse 100 jl de citrato sodico 1 M en cada tubo, y sometase a turbulencia.
- Anadase 1 ml de LB.
- Incubese 1 hora a 37°C con agitacion
- Centrifuguese 3 min a 7000 rpm.
- Siembrese en placa sobre LB + Cm 30 jg/ml o Km 50 jg/ml o Gt 10 jg/ml o Tet 10 jg/ml
10 - Incubese a 37°C durante la noche.
A continuacion, se seleccionaron los transductantes resistentes a antibioticos y la estructura cromosomica del locus mutado se verifico mediante analisis por PCR con los cebadores apropiados listados en la Tabla 2.
Tabla 6: Lista de genotipos y numeros correspondientes de cepas intermedias y cepas productoras que aparecen en 15 los siguientes ejemplos.
- Cepa Numero
- Genotipo
- 3
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS:: TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ApgaABCD:: TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1*-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc- PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11
- 4
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1*-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc- PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:: Cm
- 5
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1*-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc- PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11::Cm Ayjbl:: TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc
- 6
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF cysPUWAM PtrcF cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncK AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1*-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc- PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1*-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1*-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1*-cysE-PgapA- metA*11::Cm AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1*-cysE-PgapA-metA*11::Tc AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1*-cysE-PgapA-metA*11::Gt
- 7
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR *(-35)-thrA*1-cysE
- 8
- MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcP-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE pBeloBAC11- PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7m
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1. Construccion de la cepa 3: MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-
ARNmst-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857 PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA ::TT07-TTadc-
PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE- PgapA-metA*11
La cepa productora de metionina 3 (Tabla 6) se ha descrito en las solicitudes de patente EP10306164.4 y US61/406249. Estas solicitudes se incorporan como referencia en esta solicitud.
2. Construccion de la cepa 4: MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-
ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc-
PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE- PgapA-metA*11 AwcaM:: TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:: Cm
La modificacion cromosomica AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm descrita en la solicitudes de patente EP10306164.4 y US61/406249 se transdujo en la cepa 3 (Tabla 6) con un lisado de fago P1 procedente de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1- cysE-PgapA-metA*11::Cm descrita en las solicitudes de patente EP10306164.4 y US61/406249, segun el Protocolo 2.
Se seleccionaron transductantes resistentes a cloranfenicol y la presencia de la modificacion cromosomica AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm se verifico mediante PCR con Ome1707-DwcaM_verif_F (SEQ ID N°30) y Ome1708-DwcaM_verif_R (SEQ ID N°31) (Tabla 7). La cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc- PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE- PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02- TTadc- PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm resultante se denomino cepa 4 (Tabla 1).
3. Construccion de la cepa 5: MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-
ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(- 35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-
metA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm AyjbI::TT02-TTadc- PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc
3.1. Construccion del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc
El plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11::Tc se deriva de los plasmidos pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ApgaABCD::TT02-TTadc- PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc y pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-AyjbI::TT02-SMC descritos anteriormente, pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-RBS01*2 descrito posteriormente y pLOI2065 (Underwood y cols., Appl Environ Microbiol. diciembre 2002; 68(12): 6263-6272).
3.1.1. Construccion de pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1- cysE-PgapA-metA*11::Tc
El plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*11-cysE- PgapA-metA*11::Tc se deriva de pMA-RQ-TTadc-Cl*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2 descrito anteriormente, pLOl2065 (Underwood y cols., Appl Environ Microbiol. diciembre 2002; 68(12): 6263-6272) y pUC18-ApgaABCD::TT02-TTadc- PlamhdaR*(-35)-RBs0l-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm descrito en las solicitudes de patente EP10306164.4 y US61/406249.
Construccion del plasmido pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2
pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-RBS01*2 se deriva de los plasmidos pMA-RQ-TTadc-CI*1-PlambdaR*(-35)- RBS01*2 y pMA-RQ-TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)-RBS01*2 que han sido sintetizados por GeneArt (
http://www.geneart.com/). Los fragmentos TTadc-Cl*1-PlambdaR*(-35)-RBS01*2 y TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)- RBS01*2 se clonaron en los sitios Sfil del plasmido pMA-RQ de GeneArt y contienen las siguientes secuencias, respectivamente:
http://www.geneart.com/). Los fragmentos TTadc-Cl*1-PlambdaR*(-35)-RBS01*2 y TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)- RBS01*2 se clonaron en los sitios Sfil del plasmido pMA-RQ de GeneArt y contienen las siguientes secuencias, respectivamente:
ggccgtcaaggccgcatggcgcgccttataacctccttaGA4 CATGCAACCA TTA TCA CCGCCA GA GGT AAAA TTGTCAA CA CGCA CGGTGTTA GA TA TTTA TCCCTTGCGGTGA TA GA TTTAA CGT ATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTC GCCTT AAGGC AATT CAT G AAAAAAAG AA AAAT G AACTT GGCTT AT C CC AGG AA TCTGTCGC AGAC AAGAT GGGGAT GGGGC AGTC AGGCGTT GGT GCTTT ATTT AA T GGC AT C AAT GC ATTAAAT GCTTAC AACGCCGC ATT GCTT GCGAAAATT CT C AA AGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCTTCAATCGCCAGAGAAATCTACGAGATGT ATGAAGCGGTTAGC ATGC AGCCGTC ACTT AGAAGTGAGT AT GAGT ACCCT GTT TTTTCTCATGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTGAACTTAGAACCTTTACCAAA GGT G ATGC GG AG AG AT GGGT AAGC AC AAC C AAA AAAGCC AGT GATT CT GC AT TCTGGCTTGAGGTTGAAGGTAATTCCATGACCGCACCAACAGGCTCCAAGCCA AGCTTTCCTGACGGAATGTTAATTCTCGTTGACCCTGAGCAGGCTGTTGAGCCA
GGTGATTTCTGCATAGCCAGACTTGGGGGTGATGAGTTTACCTTCAAGAAACT GATCAGGGATAGCGGTCAGGTGTTTTTACAACCACTAAACCCACAGTACCCAA TGATCCC ATGC AAT GAGAGTTGTTCCGTTGT GGGGAAAGTT ATCGCT AGTC AGT GGC CTG AAG AG AC GTTT GGCT G AT AA AAAAAAT AAG AGTT AC C ATTT AAGGT AACTCTTATTTTTAGGGCCCTTAATTAACTGGGCCTCATGGGCC
- minusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriction Sfil y Ascl
5 - minusculas negrita correspondientes a las secuencias de RBS01*2 (TAAGGAGGTTATAA) en orientation
inversa y el sitio de restriccion Psil,
- mayusculas cursiva homologas al promotor PR del bacteriofago lambda (PlambdaR*(-35), (Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)).
- mayusculas correspondientes a la secuencia de la protema represora cl del bacteriofago lambda donde el
10 nucleotido T67 se cambiaba por C67 generando un cambio de aminoacido Tyr23His (Mermet-Bouvier &
Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148). Esta secuencia de denomino cl*1.
- mayusculas negrita homologas a la secuencia del terminador de la transcription TTadc en orientacion inversa (terminador de la transcripcion del gen adc procedente de Clostridium acetobutilicum, homologa de 179847 a 179807 del megaplasmido pSLO1).
15 - mayusculas subrayadas correspondientes a Apal, Pacl y Sfil
5
10
15
20
25
ggccgtcaaggccgcatggcgcgccttataacctccttaGZT CATGCAACCA TTA TCA CCGCCA GA GGT AAAATTGTCAACACGCACGGTGTTA GA TA TTTA TCCCTTGCGGTGATA GA TTTAACGT ATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTC GCCTT AAGGC A ATTT AT G AAAAAAAG AAAAAT G AACTT GGCTT AT CCC AGG AA TCTGTCGC AGAC AAGAT GGGGAT GGGGC AGTC AGGCGTT GGT GCTTT ATTT AA T GGC AT C AAT GC ATTAAATGCTTAC AACGCCGC ATTGGCG AC AAAAATT CT C A AAGTTAGCGTTGAAG AATTT AGCCCTT C AATCGCC AGAGAAAT CT ACGAGAT G TATGAAGCGGTTAGCATGCAGCCGTCACTTAGAAGTGAGTATGAGTACCCTGT TTTTTCTCATGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTAAGCTTAGAACCTTTACCAA AGGTGATGCGGAGAGATGGGTAAGCACAACCAAAAAAGCCAGTGATTCTGCA TTCTGGCTTGAGGTTGAAGGTAATTCCATGACCGCACCAACAGGCTCCAAGCC AAGCTTTCCTGACGGAAT GTT AATT CTCGTTGAC CCT GAGC AGGCTGTTG AGCC AGGTGATTTCTGCATAGCCAGACTTGGGGGTGATGAGTTTACCTTCAAGAAAC TGATCAGGGATAGCGGTCAGGTGTTTTTACAACCACTAAACCCACAGTACCCA AT G ATC CC AT GC AAT G AG AGTT GTT CCGTT GT GGGG AAAGTT AT CGCT AGT C A GTGGCCTGAAGAGACGTTTGGCTGATAAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAG GTAACTCTTATTTTTAGGGCCCTTAATTAACTGGGCCTCATGGGCC
- minusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriction Sfil y Ascl
- minusculas negrita correspondientes a secuencias de RBS01*2 (TAAGGAGGTTATAA) en orientation inversa y el sitio de restriccion Psil,
- mayusculas cursiva homologas al promotor PR del bacteriofago lambda (PlambdaR*(35), (Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)).
- mayusculas correspondientes a la secuencia de la protema represora cl del bacteriofago lambda donde los nucleotidos 196-CTTGCG-201 se cambiaban por 196-GCGACA-201 generando dos cambios de aminoacido Leu66Ala y Ala67Thr (Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148). Esta secuencia se denomino cl*3.
- mayusculas negrita homologas a la secuencia terminadora de la transcription TTadc en orientacion inversa (terminador de la transcripcion del gen adc procedente de Clostridium acetobutilicum, homologo de 179847 a 179807 del megaplasmido pSLO1).
- mayusculas subrayadas correspondientes a Apal, Pacl y Sfil
Para construir pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-RBS01*2, el fragmento de XmnllNsil Nsil-CI*3-PlambdaR*(35)- RBS01*2-XmnI purificado de pMA-RQ-TTadc-CI*3-PlambdaR*(35)-RBS01*2 descrito anteriormente se clono entre los sitios Xmnl y Nsil del plasmido pMA-RQ-TTadc-CI*1-PlambdaR*(35)-RBS01*2 descrito anteriormente creando el alelo silvestre del represor protemico cl. El plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion de ADN y se denomino pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-RBS01*2.
Construction del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01- thrA*1-csyE-PgapA-metA*11::Cm
El plasmido pUC18-TTadc-Cl*0-PlambdaR*(-35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE- PgapA-metA*11::Cm se deriva de pUC18-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11::Cm descrito en las solicitudes de patente EP10306164.4 y US61/406249 y pMA-RQ-TTadc-CI*0- PlambdaR*(-35)-RBS01*2 descrito anteriormente.
Para construir pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE- PgapA-metA*11::Cm, el fragmento de Apall/Psil TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35), tratado mediante fragmento (de Klenow) grande de AdN polimerasa I de E. coli, y purificado de pMA-RQ-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-RBS01*2, se clono entre los sitios Sfol del plasmido pUC18-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlanlbdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE- 5 PgapA-metA*11::Cm. El plasmido resultante se verifico mediante restriction y se denomino pUC18-TTadc-CI*0- PlambdaR*(-35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm.
Finalmente, para construir pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01- thrA*0-cysE-PgapA-metA*11::Tc, el casete de resistencia FRT-Tc-FRT se amplifico mediante PCR con los 10 cebadores Ome 1836-Hindlll-K7-FRT-Tc-F (SEQ ID N°34) y Ome 1837-SmaI-BstZ17I-K7-FRT-Tc-R (SEQ ID N°35) usando pLOI2065 como plantilla.
Ome1836-HindIII-K7-FRT-Tc-F (SEQ ID N°34)
GCCCAAGCTTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAG
AATAGGAACTTCGGAATAGGAACCGGATCAATTCATCGCGCGTC
con
15 - mayusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriccion HindIII y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas y negrita correspondiente a la secuencia FRT del plasmido pKD4 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
- secuencia en mayusculas homologa a la secuencia del gen de resistencia a tetraciclina situado sobre pLOI2065 (Underwood y cols., Appl Environ Microbiol. diciembre 2002; 68(12): 6263-6272).
20 Ome1837-SmaI-BstZ17I-K7-FRT-Tc-R (SEQ ID N°35)
TCCCCCGGGGTATACCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTC
CTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAATTGTCGACAAGCTAGCTTGC
con
- mayusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriccion SmaI y BstZ17I y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas y negrita correspondiente a la secuencia FRT del plasmido pKD4 (Datsenko, K.A. &
25 Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
- secuencia en mayusculas homologa a la secuencia del gen de resistencia a tetraciclina situado sobre pLOI2065 (Underwood y cols., Appl Environ Microbiol. diciembre 2002; 68(12): 6263-6272).
El producto de PCR FRT-Tc-FRT se digirio mediante BstZ17I e HindIN y se trato mediante el fragmento (de Klenow) grande de ADN polimerasa I de E. coli. A continuation, el fragmento resultante se clono entre los BstZ17I y PacI que 30 se ha tratado mediante fragmento (de Klenow) grande de ADN polimerasa I de E. coli. El plasmido seleccionado tiene el casete de resistencia a tc en la misma orientation que el casete de resistencia a amp del plasmido pUC18 y se verifico mediante secuenciacion de ADN y se denomino pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-ApgaABCD::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01*2-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:: Tc.
3.1.2. Construction del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-AyjbI::TT02-SMC
35 Para construir el fragmento AyjbI::TT02-MCS, se realizo PCR de solapamiento entre la region aguas arriba de yjbI (upyjbl), el terminador de la transcription TT02, el sitio de donation multiple (MCS) y la region aguas abajo de yjbI (downyjbI).
En primer lugar, el fragmento upyjbI-TT02-MCS se amplifico a partir de ADN genomico de E. coli MG1655 usando 40 los cebadores Ome 1852- SfoI-KpnI-DyjbI amont-F (SEQ ID N°36) y Ome 1853- SMC-TT02- DyjbI amont-R (SEQ ID N°37) mediante PCR. A continuacion, el fragmento TT02-MCS-downyjbI se amplifico a partir de ADN genomico de E. coli MG1655 usando los cebadores Ome 1854-TT02-SMC-DyjbI aval-F (SeQ ID N°38) y Ome 1855- SfoI-KpnI-
5
10
15
20
25
30
Dyjbl aval-R (SEQ ID N°39) mediante PCR. Los cebadores Ome 1853- SMC-TT02- Dyjbl amont-R (SEQ ID N°37) y Ome 1854-TT02-SMC- DyjbI aval-F (SEQ ID N°38) se han disenado para solaparse a traves de una region de 36 nucleotidos de longitud. Finalmente, el fragmento upyjbI-TT02-MCS-downyjbI se amplifico al mezclar los amplicones upyjbI-TT02-MCS y TT02-MCS-downyjbI y usar los cebadores Ome 1852- Sfol-KpnI-Dyjbl amont-F (SEQ ID N°36) y Ome 1855- SfoI-KpnI-DyjbI aval-R (SEQ ID N°39). El producto de PCR de fusion resultante se digirio mediante SfoI y se clono entre los sitios EcoRI del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-ApgaABCD::TT02-TTadc- PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, descrito anteriormente, que se ha tratado mediante fragmento (de Klenow) grande de AdN polimerasa I de E. coli. El plasmido resultante se verifico mediante Secuenciacion de ADN y se denomino pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-AyjbI::TT02-MCS.
Ome 1852-SfoI-KpnI-DyjbI amont-F (SEQ ID N°36)
CGTAGGCGCCGGTACCGAGTGCAGATCGGCTGGAAGGCG
con
- mayusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriccion SfoI y KpnI y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas homologa a la secuencia aguas arriba del gen yjbI (4247987-4248009, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene,org/
http://ecogene,org/
Ome 1853-SMC-TT02- DyjbI amont-R (SEQ ID N°37)
GCTTGTATACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCG
TTTT ATTTG ATGC ATTTC TGT AGA ATTTT AC AC TT AT AGT AT C ATT AC T GATT
GAGACTTCA
con
- secuencia en mayusculas subrayadas para el sitio de restriccion BstZ17I y el principio de un sitio de donation multiple,
- secuencia en mayusculas correspondiente al terminador de la transcription Ti de rrnB de E. coli (Orosz A, Boros Iy Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
- secuencia en mayusculas y negrita homologa a la secuencia aguas abajo del gen yjbI (4248931-4248980, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/).
http://ecogene.org/).
Ome 1854-TT02-SMC- DyjbI aval-F (SEQ ID N°38)
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTTACCTAGGGCCCTTA
ATTAAATAATGAATAAGGGTGTTTAAGTAAAGGAAAACATCACCGTTCCTGGC
Al
con
secuencia en mayusculas correspondiente al terminador de la transcripcion T1 de rrnB de E. coli (Orosz A, Boros Iy Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
secuencia en mayusculas y negrita que contiene un sitio de clonacion multiple: BstZ17I, HindIII, AvrII, ApaI, PacI,
secuencia en mayusculas subrayadas homologa a la secuencia aguas abajo del gen yjbI (4250286-4250335, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/).
http://ecogene.org/).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ome 1855-SfoI-KpnI- Dyjbl aval-R (SEQ ID N°39) CGTAGGCGCCGGTACCCAGCATAATCATTCACCACACATCCG
con
- mayusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriccion SfoI y Kpnl y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas homologa a la secuencia aguas arriba del gen yjbI (4251224-4251249, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/)
http://ecogene.org/)
3.1.3. Construccion del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc
Para construir pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11::Tc, el fragmento de BstZ17I/SmaI PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc purificado de pUC18-TTadc-CI*0-P\ambdaR*(-35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11::Tc, se clono entre los sitios PacI/BstZ17I del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-Ay/bI:.TT02- SMC que se habfa tratado mediante fragmento (de Klenow) grande de ADN polimerasa I de E. coli. El plasmido seleccionado tiene el casete de resistencia a tc en la misma orientacion que el casete de resistencia a amp del plasmido pUC18 y se verifico mediante secuenciacion de ADN y se denomino pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)- DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc
3.2. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11::Tc pKD46
Para reemplazar el gen yjbI por la region TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc, pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-DyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc se digirio mediante las enzimas de restriccion Ahdl y Kpnl y el fragmento digerido restante AyjbI:TT02-TTadc- PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 segun el Protocolo 1.
Se seleccionaron recombinantes resistentes a tetraciclina y la presencia de la modificacion cromosomica AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc se verifico mediante PCR con los cebadores Ome1856-DyjbI-verif1-F (SEQ ID N°40), Ome1857-DyjbI-verif2-R (SEQ ID N°41), Ome 1838-K7-FRT-Tc- seq-F (SEQ ID N°42) y Ome1815-metA*11-seq-F (SEQ ID N°43) (Tabla 7) y mediante secuenciacion de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denomino MG1655 metA*11 AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1 - cysE-PgapA-metA*11::Tc (pKD46).
3.3. Transduccion de AyjbI:TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc en la cepa 4
La modificacion cromosomica AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc se transdujo en la cepa 4 (Tabla 6), descrita anteriormente, con un lisado de fago P1 procedente de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc descrita
anteriormente, segun el Protocolo 2. Se seleccionaron transductantes resistentes a tetraciclina y la presencia de la modificacion cromosomica AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc se verifico mediante PCR con Ome1856-DyjbI- verif1-F (SEQ ID N°40), Ome1857-DyjbI -verif2-R (SEQ ID N°41), Ome 1838- K7-FRT-Tc-seq-F (SEQ ID N°42), y Ome1815-metA*11-seq-F (SEQ ID N°43) (Tabla 2). La cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4- 6::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm Dyjbl:: TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:: Tc resultante se denomino cepa 5 (Tabla 6).
4. Construccion de la cepa 6: MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD:: TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(- 35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)- RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Tc AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-
metA*11::Gt
5
10
15
20
25
30
35
4.1. Construccion del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1 -cysE-PgapA-metA*11::Gt
El plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(35)-AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11::Gt se deriva de pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1- cysE-PgapA-metA*11::Gt y pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::TT02-MCS::Gt descritos posteriormente.
4.1.1. Construccion del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01 -thrA*1 -cysE-PgapA -metA*11::Gt
El plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA- metA*11:: Gt se deriva de pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-SMC::Gt y pUC18-TTadc-CI*0- PlambdaR*(-35)-ApgaABCD::TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm descritos
anteriormente.
Construccion de pMA-ACP4-6::TT02-MCS::Gt
Para construirel plasmido pMA-ACP4-6::TT02-MCS ::Gt, el casete de resistencia FRT-Gt-FRT se amplifico mediante PCR con los cebadores BstZ17I-FRT-Gt-F (SEQ ID N°44) e Hindlll-FRT-Gt-R (SEQ ID N°45) usando p34S-Gm como plantilla.
BstZ17I-FRT-Gt-F (SEQ ID N°45)
TCCCCCGGGGTATACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTC T AG AG AAT AGGAAC TTC GG AAT AGG AAC TTC ATTT AG AT GGGT AC CG AGCT CGAATTG
con
- secuencia en mayusculas subrayadas para los sitios de restriction Smal y BstZ17I y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas y negrita correspondiente a la secuencia FRT (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
- secuencia en mayusculas homologa a la secuencia del gen de gentamicina situado sobre p34S-Gm (Dennis et Ziltra, AEM julio 1998, p 2710-2715).
Hindlll-FRT-Gt-R (SEQ ID N°45)
CCCAAGCTTCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTC
TCTAGAAAGTATAGGAACTTCGGCGCGGATGGGTACCGAGCTCGAATTG
con
- secuencia en mayusculas subrayadas para el sitio de restriccion HindIN y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas y negrita correspondiente a la secuencia FRT (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)
- secuencia en mayusculas homologa a la secuencia del gen de gentamicina situado sobre p34S-Gm (Dennis y Ziltra, AEM julio 1998, p 2710-2715).
El producto de PCR FRT-Gt-FRT se digirio mediante BstZ17I e HindIII y se clono entre los sitios BstZ17I e HindIII de pMA-ACP4-6::TT02-MCS descrito en las solicitudes de patente EP10306164.4 y US61/406249. El plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion de ADN y se denomino pMA-ACP4-6::TT02-MCS-Gt.
Construccion de pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-SMC::Gt
Para construir pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6:: TT02-SMC::Gt, el fragmento de StuI/BsrBI ACP4- 6::TT02-SMC::Gt purificado de pMA-ACP4-6::TW2-MCS::Gt, descrito anteriormente, se clono entre los sitios EcoRI del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE- PgapA-metA*11::Cm que se ha tratado mediante fragmento (de Klenow) grande de ADN polimerasa I de E. coli. El 5 plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4- 6::TT02-SMC:: Gt
Para construir el plasmido final pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:: Gt, el fragmento de Apal/BamHI TW2-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE- 10 PgapA-metA*11 purificado de pUC 18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ApgaABCD:: TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)- RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, descrito anteriormente, se clono entre los sitios ApaI/BamHI del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-SMC::Gt. El plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt
15 4.1.2. Construction del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::TT02-SMC
Para construir el fragmento AmelB::TT02-MCS, se realizo PCR de solapamiento entre la region aguas arriba de melB (upmelB), el terminador de la transcription TT02, el sitio de donation multiple (MCS) y la region aguas abajo de melB (downmelB).
20 En primer lugar, el fragmento upmelB-TT02-MCS se amplifico a partir de ADN genomico de E. coli MG1655 usando los cebadores Ome 1841-SfoI-KpnI-DmelB amont-F (SEQ ID N°46) y Ome 1842-SMC-TT02-DmelB amont-R (SEQ ID N°47) mediante PCR. A continuation, el fragmento TT02-MCS-downmelB se amplifico a partir de ADN genomico de E. coli MG1655 usando los cebadores Ome 1843-TT02-SMC-DmelB aval-F (SEQ ID N°48) y Ome 1844-SfoI- KpnI-DmelB aval-R (SEQ ID N°49) mediante PCR. Los cebadores Ome 1842-SMC-TT02-DmelB amont-R (SEQ ID 25 N°47) y Ome 1843-TT02-SMC-DmelB aval-F (SEQ ID N°48) se han disenado para solaparse a traves de una region
de 36 nucleotidos de longitud. Finalmente, el fragmento upmelB-TT02-MCS-downmelB se amplifico al mezclar los amplicones upmelB-TT02-MCS y TT02-MCS-downmelB y usar los cebadores Ome 1841-SfoI-KpnI-DmelB amont-F (SEQ ID N°46) y Ome 1844-SfoI-KpnI-DmelB aval-R (SEQ ID N°49). El producto de PCR de fusion resultante se digirio mediante SfoI y se clono entre los sitios EcoRI del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)- 30 ApgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm, descrito anteriormente, que se
ha tratado mediante fragmento (de Klenow) grande de ADN polimerasa I de E. coli. El plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion de AdN y se denomino pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::TT02-MCS.
Ome 1841-SfoI-KpnI-DmelB amont-F (SEQ ID N°46)
CGTAGGCGCCGGTACCGACCTCAATATCGACCCAGCTACGC
35 con
- mayusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriction SfoI y KpnI y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas homologa a la secuencia aguas arriba del gen melB (4340489-4340513, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/)
http://ecogene.org/)
Ome 1842 (SMC-TT02-DmelB amont-R) (SEQ ID N°47)
GCTTGTATACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCG 40 TTTTATTTGATGCATTGAAATGCTCATAGGGTATCGGGTCGC
con
- secuencia en mayusculas subrayadas para el sitio de restriccion BstZ17I y el principio de un sitio de clonacion multiple,
- secuencia en mayusculas correspondiente al terminador de la transcripcion T1 de rrnB de E. coli (Orosz A,
45 Boros Iy Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
- secuencia en mayusculas y negrita homologa a la secuencia aguas abajo del gen melB (4341377-4341406, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/).
http://ecogene.org/).
5
10
15
20
25
30
35
40
Ome 1843 (TT02-SMC-DmelB aval-F) (SEQ ID N°48)
AGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTATACAAGCTTAATTAACCTAGGGCC
CGGGCGGATCCGTGAGTGATGTGAAAGCCTGACGTGG
con
- secuencia en mayusculas correspondiente al terminador de la transcription T1 de rrnB de E. coli (Orosz A, Boros ly Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)
- secuencia en mayusculas y negrita que contiene un sitio de donation multiple: BstZ17I, Hindlll, Avrll, Apal, BamHI,
- secuencia en mayusculas subrayadas homologa a la secuencia aguas abajo del gen melB (4342793-4342818, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/).
http://ecogene.org/).
Ome 1844 (Sfol-Kpnl-DmelB aval-R) (SEQ ID N°49)
CGTAGGCGCCGGTACCCGAACTGCACTAAGTAACCTCTTCGG
- mayusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriction Sfol y KpnI y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas homologa a la secuencia aguas arriba del gen melB (4343694-4343719, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/)
http://ecogene.org/)
4.1.3. Construction del plasmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1 -cysE-PgapA-metA*11::Gt
Para construir pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-
PgapA-metA*11::Gt, el fragmento de BstZ17I/BamHI PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt purificado de pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-
PgapA-metA*11::Gt, descrito anteriormente, se clono entre los sitios BstZ17I/BamHI del plasmido pUC18-TTadc- CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB:: TT02-SMC, descrito anteriormente. El plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion y se denomino pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-DmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01- thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt.
4.2. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 DmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA *1-cysE-PgapA- metA*11::Gt pKD46
Para reemplazar el gen melB por la region TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*I-cysE-PgapA-metA*11::Gt, pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11:Gt se digirio mediante las enzimas de restriccion Ahdl y Sphl y el fragmento digerido AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(- 35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt restante se introdujo en la cepa MG1655 metA*11 pKD46 segun el Protocolo 1.
Se seleccionaron recombinantes resistentes a gentamicina y la presencia de la modification cromosomica AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt se verifico mediante PCR con los cebadores Ome 1845-DmelB-verif1-F (SEQ ID N°50) y Ome 1846-DmelB-verif2-R (SEQ ID N°51) (Tabla 7) y mediante secuenciacion de ADN. La cepa verificada y seleccionada se denomino MG1655 metA*11 AmelB::TT02- TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt (pKD46).
4.3. Transduction de AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt en la cepa 5
La modificacion cromosomica AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt se transdujo en la cepa 5 (Tabla 6), descrita anteriormente, con un lisado de fago P1 procedente de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt descrita
anteriormente, segun el Protocolo 2.
Se seleccionaron transductantes resistentes a gentamicina y la presencia de la modificacion cromosomica AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Gt se verifico mediante PCR con Ome
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
1845-DmelB-verifl-F (SEQ ID N°50) y Ome 1846-DmelB-verif2-R (SEQ ID N°51) (Tabla 7). La cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB AmetJ ApykF ApykA ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ApgaABCD::TT02-TTadc- PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE- PgapA-metA*11 ACP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 AwcaM::TTadc-
PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm AyjbI::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE- PgapA-metA*11::Tc AmelB::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBs01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ::Gt resultante se denomino cepa 6.
5. Construccion de la cepa 8: MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE pBeloBAC11- PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO
5.1. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE
Las modificaciones cromosomicas del promotor Ptrc-metH, PtrcF-cysPUWAM, PtrcF-cysJIH, Ptrc09-gcvTHP y Ptrc36-ARNmst17-metF, que se han descrito en la solicitudes de patente WO2007/077041 y WO2009/043803, y las supresiones de los genes AmetJ, ApykF, ApurU y AyncA, que se han descrito en las solicitudes de patente WO2007/077041, WO2009/043803 y Wo20o5/111202, se transdujeron en una cepa que contema alelos metA*11 que codifica una homoserina succiniltransferasa con sensibilidad de retroalimentacion reducida a S- adenosilmetionina y/o metionina segun se describe en el documento WO2005/111202, segun el Protocolo 2.
El casete de resistencia, asociado cada modificacion cromosomica o supresion durante la construccion de la cepa, se ha retirado segun el Protocolo 1.
La modificacion cromosomica AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km se transdujo en la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA con un lisado de fago P1 procedente de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 AmalS::TTadc-CI857- PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km descrita en las solicitudes de patente EP10306164.4 y US61/406249, segun el Protocolo 2.
Se seleccionaron transductantes resistentes a kanamicina y la presencia de la modificacion cromosomica AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*-1-cysE::Km se verifico mediante PCR con los cebadores Ome 0826- malS-F (SEQ ID N°52) y Ome 0827-malS-R (SEQ ID N°53) (Tabla 7). La cepa resultante tiene el genotipo MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km
Finalmente, la resistencia a kanamicina de la cepa anterior se retiro segun el Protocolo 1. La perdida del casete resistente a kanamicina se verifico mediante PCR al usar los cebadores Ome 0826-malS-F (SEQ ID N°52) y Ome 0827-malS-R (SEQ ID N°53). La cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE resultante se denomino cepa 7.
5.1.1. Construccion de la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36- ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE pBeloBAC11- PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11 -T7TO
Construccion del plasmido pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO
El plasmido pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO se deriva del plasmido pBeloBAC11-PT7/RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO descrito en el ejemplo 2 de esta solicitud de patente.
Para construir el plasmido pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*a11-T7TO, el plasmido pBeloBAC11-PT7/RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO se amplifico con los cebadores Ome 2012-SfoI- HpaI-AvrII-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-F (SEQ ID N°54) y Ome 0625-Ptrc-cysE*rec (SEQ ID N°55). El fragmento PL1*1/RBS01*2-thrA*1 digerido con HpaI/NheI se clono entre los sitios HpaI y NheI del plasmido pBeloBAC11- PT7/RBST7-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO descrito en el ejemplo 2 de esta solicitud de patente. El plasmido resultante se verifico mediante secuenciacion de ADN y se denomino pBeloBAC11-PL1 *1/RBS01*2-thrA*1- SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO.
Ome 2012 SfoI-HpaI-AvrII-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-F (SEQ ID N°54)
TGCCGGCACGGCGCCAAGTTAACCCTAGGTTATCTCTGGCGGTGTTGACATA
AATACCACTGGCGGTTATACTGAGCACAtcaac7>L4GG4GG7T,47>L4ATGAGAGT
GTTGAAGTTCG
con
- mayusculas subrayadas correspondientes a los sitios de restriction Sfol, Hpal y AvrM y bases adicionales,
- secuencia en mayusculas y negrita correspondiente a una forma corta de promotor PL de bacteriofago lambda
5 (PLi Giladi y cols, FEMS Microbiol Rev. agosto 1995; 17(1-2):135-40) y que aloja una mutation en las cajas -10
(G-12T descrita en Kincade & deHaseth, Gene. 2 de enero de 1991 ;97(1):7-12). Este promotor se denomina PL1*1).
- minusculas: cinco bases que separan el sitio de inicio de la transcription de PL1*1 y el sitio de union al ribosoma RBS01*2
10 - mayusculas cursivas correspondientes a la secuencia RBS01*2
- secuencia en mayusculas subrayadas homologa al gen thrA*1 (337-354, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/).
http://ecogene.org/).
Ome 0625 Ptrc-cysE*rec (SEQ ID N°55)
CCGGGTCAGCGGCGTAGGC
15 homologa al gen cysE (3780360-3780378, secuencia de referencia en el cibersitio
http://ecogene.org/)
http://ecogene.org/)
El pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO, descrito anteriormente, se introdujo mediante electroporation en la cepa 7 (Tabla 6). La presencia del plasmido pBeloBAC11-PL1*1/RBS01*2-thrA*1- SMC-cysE-PgapA-metA*11-T7TO se verifico y la cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF AmetJ ApykF ApurU AyncA AmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1- 20 cysE pBeloBAC11-PL1 *1 /RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE-PgapA-metA* 11-TT01 resultante se denomino cepa 8.
Tabla 7: Cebadores usados para verificaciones por PCR de las modificaciones cromosomicas descritas anteriormente
- Nombre de los genes
- Nombre de los cebadores SEQ ID N° Localization de la homologla con la region cromosomica Secuencias
- wcaM
- Ome1707- DwcaM_verif_F 30 2115741-2115762 GCCGTTCAACACTGGCTGGAC G
- Ome1708- DwcaM_verif_R
- 31 2110888-2110907 TGCCATTGCAGGTGCATCGC
- yjbl
- Ome1856-DyjbI- verif1-F 40 4247754-4247774 CAGACCACCCAACTGGCGACC
- Ome1857-DyjbI - verif2-R
- 41 4251489-4251508 GCCATTGGAATCGACCAGCC
- Ome 1838-K7-FRT- Tc-seq-F
- 42 GGTTGCTGGCGCCTATATCGC
- Ome 1815-metA*11- seq-F
- 43 4212634-4212658 GCCT GGT GGAGTTT AAT GAT G TCGC
- melB
- Ome 1845-DmelB- verifl-F 50 4340168-4340187 GCCGATTTTGTCGTGGTGGC
- Ome 1846-DmelB- verif2-R
- 51 4344044-4344065 GCCGGTTATCCATCAGGTTCA C
- malS
- Ome0826-malS-F 52 3734778-3734800 G
- Ome0827-malS-R
- 53 3738298-3738322 CGT C AGT AAT C AC ATT GCCT G TTGG
5 Ejemplo IV: Evaluation de la production de metionina dependiente de la temperatura de las cepas 3, 4, 5 y 6
Las cepas de produccion se evaluaron en matraces Erlenmeyer pequenos. Un precultivo de 5,5 ml se hizo crecer durante 21 horas en un medio mixto (10 % de medio LB (Sigma 25 %) con 2,5 g.l-1 de glucosa y 90% de medio mmimo PC1). Se uso para inocular un cultivo de 50 ml hasta una OD600 de 0,2 en medio PC1. Cuando era necesario, se anadia gentamicina a una concentration de 10 mg.l-1, cloranfenicol a 30 mg.l-1 y tetraciclina a 5 mg.l-1. 10 Cuando el cultivo hubo alcanzado una OD600 de 5 a 7, los aminoacidos extracelulares se cuantificaron mediante HPLC despues de la derivation por OPA/Fmoc y otros metabolitos pertinentes se analizaron usando HPLC con detection refractometrica (acidos organicos y glucosa) y GC-MS despues de la sililacion.
Las condiciones de cultivo y precultivo se muestran en las tablas posteriores. Los precultivos se hicieron crecer bien a 30°C o bien a 37°C. Los cultivos se hicieron crecer bien a 30°C o 37°C o bien a 37°C durante 2 horas, a 15 continuation a 42°C durante 2 horas y finalmente 37°C durante el resto del cultivo.
Tabla 8: Composicion del medio mmimo (PC1).
- Compuesto
- Concentracion (g.l-1)
- ZnSO4.7H2O
- 0,0040
- CuCl2.2H2O
- 0,0020
- MnSO4.H2O
- 0,0200
- CoCl2.6H2O
- 0,0080
- H3BO3
- 0,0010
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0004
- MgSO4.7H2O
- 1,00
- Acido citrico
- 6,00
- CaCl2.2H2O
- 0,04
- K2HPO4
- 8,00
- Na2HPO4
- 2,00
- (NH4)2HPO4
- 8,00
- NH4Cl
- 0,13
- NaOH 4M
- Ajustado hasta pH 6,8
- FeSO4.7H2O
- 0,04
- Tiamina
- 0,01
- Glucosa
- 15,00
- Tiosulfato amonico
- 5,60
- Vitamina B 12
- 0,01
- MOPS
- 15,00
Tabla 9: Rendimiento de metionina (Rmet) en % g de metionina /g de glucosa producido en cultivo discontinuo por la 5 cepa 3. Para la definicion precisa del rendimiento de metionina/glucosa, vease posteriormente. DE indica la desviacion estandar para los rendimientos que se calculaba sobre la base de varias repeticiones (n = numero de repeticiones). Se probaron diferentes condiciones de cultivo. Se indican en la tabla; Pc significa precultivo y C significa cultivo.
- Condiciones de crecimiento de precultivos y cultivos de la cepa 3
- Rmet DE
- Cepa 3 - PC 30°C/ C 30°C
- 7.9 0.5
- (n=4)
- Cepa 3 - PC 30°C/C 37°C
- 9.0 1.0
- (n=34)
- Cepa 3 - PC 30°C /C 37-42-37°C
- 9.2 1.2
- (n=86)
- Cepa 3 - PC 37°/C37°C
- 7.9 0.1
- (n=3)
10
Como se muestra en la tabla 9, la termoinduccion de la expresion de los genes thrA*1 y cysE durante el procedimiento de cultivo incrementa la cantidad de metionina producida. La expresion constitutiva a lo largo del procedimiento de cultivo da como resultado un rendimiento de metionina bajo.
Para una produccion optima de metionina, las mejores condiciones de cultivo son 30°C para el precultivo seguido por un cultivo a 37°C (2 h), 42°C (2 h), 37°C. En estas condiciones, la cepa 3 produda metionina con un rendimiento de 9,2%.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tabla 10: Rendimiento de metionina (Rmet) en % g de metionina /g de glucosa producido en cultivo discontinuo por las cepas 4, 6 y 6. Para la definicion precisa del rendimiento de metionina/glucosa, vease posteriormente. DE indica la desviacion estandar para los rendimientos que se calculaba sobre la base de varias repeticiones (n = numero de repeticiones). Los precultivos se cultivaron a 30°C y el cultivo a 37°C durante 2 horas, 42°C durante 2 horas y 37°C hasta el final del cultivo.
- Cepa y condicion de crecimiento
- Rmet DE
- Cepa 4 - PC 30°C /C 37-42-37°C (n=11)
- 9,7 1,7
- Cepa 5 - PC 30°C /C 37-42-37°C (n=9)
- 10,6 1,3
- Cepa 6 - PC 30°C /C 37-42-37°C (n=3)
- 11,7 0,1
Las cepas 4, 5 y 6 se cultivaron todas en condiciones para la produccion optima de metionina.
Como se muestra en la tabla 10, la termoinduccion de la expresion de los genes thrA*1 y cysE durante el procedimiento de cultivo incrementa la produccion proporcionalmente al numero de copias de los genes controlados por el promotor inducible. En efecto, la cepa 6 que posee siete copias de thrA*1 bajo el control del promotor Plambda (vease la tabla 6) produda metionina con un rendimiento superior que las cepas 5 (6 copias de thr*1) y 4 (5 copias).
Es notable precisar que las cepas 5 y 6 no pueden crecer a una temperatura constante de 37°C. En conclusion, estos resultados demuestran que la termoinduccion no solo es mejor para la produccion sino tambien esencial en este caso.
La concentracion de metionina extracelular se cuantifico mediante HPLC despues de la derivacion con OPA/FMOC. La concentracion de glucosa residual se analizo usando HPLC con deteccion refractometrica. El rendimiento de metionina se expreso como sigue:
metionina (g)
R = * 100
met glucosa consumida (g)
Para validar la termoinduccion de la expresion de los genes thrA*1 y cysE, las actividades de las enzimas correspondientes se determinaron en extractos brutos.
Para la determinacion de las actividades enzimaticas in vitro, cepas de E. coli se cultivaron en medio mmimo segun se describe anteriormente y se recogieron al final de la fase de crecimiento exponencial mediante centrifugacion. Las pellas se resuspendieron en tampon de fosfato potasico 20 mM (pH 7,2) frio que contema un comprimido de coctel inhibidor de proteasa con EDTA. A continuacion, las celulas se sometieron a lisis 1x30 s a 6500 rpm al batir con cuentas con un sistema Precellys (Bertin Technologies) seguido por centrifugacion a 12000 g (4°C) durante 30 minutos. Los sobrenadantes se desalaron y se usaron para el analisis. Las concentraciones de protema se determinaron usando reactivo de ensayo de Bradford (Bradford, 1976).
Para la determinacion de la actividad de HDH (homoserina deshidrogenasa, codificada por thrA*1) in vitro, 15 pg de extracto celular bruto se ensayaron en 100 mM de Tris-HCl pH 9, 150 mM de KCl, 1 mM de NADP+ y 25 mM de L- homoserina. La reduccion de NADP+ en presencia de L-homoserina se comprobo espectrofotometricamente durante 30 minutos a 340 nm.
La actividad de SAT (serina acetiltransferasa, codificada por cysE) se ensayo espectrofotometricamente a 25°C al medir la absorbancia de TNB a 408 nm durante 10 minutos, debido a la reaccion de CoA con DTNB. La reaccion se realizo con 2 pg de extractos brutos en 80 mM de fosfato potasico pH 7,5, 2 mM de acetil-coA, 30 mM de serina y 0,1 mM de DTNB.
Tabla 11: Las actividades de homoserina deshidrogenasa (HDH, thrA*1) y serina acetiltransferasa (SAT, cysE) se determinaron sobre los extractos brutos de cultivos de la cepa 3 desarrollada en diferentes condiciones. Las actividades se dan en mUI/mg de protemas. Las desviaciones estandar se calcularon sobre la base de varios cultivos independientes (N = numero de repeticiones).
5
- Condiciones de crecimiento de precultivos y cultivos de la cepa 3
- HDH SAT N
- Precultivo 30°C + Cultivo 30°C
- 78 ± 28 99 ± 10 6
- Precultivo 30°C + Cultivo 37°C
- 104 ± 21 153 ± 28 18
- Precultivo 30°C + Cultivo 37/42/37°C
- 195 ± 33 324 ± 32 16
- Precultivo 37°C + Cultivo 37°C
- 94 ± 25 181 ± 20 6
La tabla 11 muestra que durante la induccion, se incrementan las actividades de HDH y SAT. La expresion constitutiva de thrA*1 y cysE da como resultado niveles de actividades de HDH y SAT que estan entre las 10 condiciones no inducidas e inducidas, explicando en parte el rendimiento inferior de metionina. En conclusion, estos resultados demuestran que la induccion de thrA*1 y cysE es ciertamente beneficiosa para incrementar el rendimiento de metionina.
Del mismo modo para las cepas 4, 5 y 6, las actividades de HDH y SAT se incrementaban durante la induccion. Las 15 actividades se incrementan proporcionalmente con el numero de copias de los genes thrA*1 y cysE integrados en el cromosoma (datos no mostrados).
Ejemplo V: Evaluacion de la produccion dependiente de la temperatura de la cepa 8
La cepa 8 se evaluo en matraces Erlenmeyer pequenos como se describe en el ejemplo IV. Se comparo con la cepa 3.
20
Tabla 12: Rendimiento de metionina (Rmet) en % g de metionina /g de glucosa producido en cultivo discontinuo por las cepas 8 y 3. Para la definicion precisa del rendimiento de metionina/glucosa, vease posteriormente. DE indica la desviacion estandar para los rendimientos que se calculaba sobre la base de varias repeticiones (n = numero de repeticiones). Los precultivos se cultivaron a 30°C y el cultivo a 37°C durante 2 horas, 42°C durante 2 horas y a 25 continuacion 37°C hasta el final del cultivo.
- Condiciones de crecimiento de las cepas 3 y 8
- Rmet DE
- Cepa 8 - PC 30°C /C 37-42-37°C (n =3)
- 9,5 0,1
- Cepa 3 - PC 30°C /C 37-42-37°C (n=3)
- 8,6 0,5
Segun se muestra en la tabla 12, la produccion de metionina durante la induccion es tan buena para la cepa 8 que 30 soporta la construccion PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE como para la cepa 3 que soporta 4 copias de la construccion PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE.
La concentracion de metionina extracelular se cuantifico mediante HPLC despues de la derivacion con OPA/FMOC. La concentracion de glucosa residual se analizo usando HPLC con deteccion refractometrica. El rendimiento de 35 metionina se expreso como sigue:
metionina (g)
R = * 100
met glucosa consumida (g)
Para validar la termoinduccion de la expresion de los genes thrA*1 y cysE controlados por el promotor PL1*1, las actividades de las enzimas correspondientes se determinaron en extractos brutos segun se describe en el ejemplo IV.
Tabla 13: Las actividades de homoserina deshidrogenasa (HDH, thrA*1) y serina acetiltransferasa (SAT, cysE) se determinaron en los cultivos descritos anteriormente y se dieron en mUI/mg de protemas. Las desviaciones estandar se calcularon sobre la base de varios cultivos independientes (N = numero de repeticiones).
- Condiciones de crecimiento de la cepa 3 y 8
- HDH SAT N
- Cepa 8- Precultivo 30°C + Cultivo 37/42/37°C
- 91 ± 8 140 ± 2 3
- Cepa 3 - Precultivo 30°C + Cultivo 37/42/37°C
- 100 ± 3 140 ± 10 2
5
Como se puede observar en la tabla 13, las actividades de HDH y SAT de la cepa 8 eran similares a las de la cepa 3. Como resultado, la induccion a partir de PL1*1/RBS01*2-thrA*1-SMC-cysE es al menos equivalente a la induccion a partir de 4 copias de PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE
REFERENCIAS
10 Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633.
"Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli." Tang X, Tan Y, Zhu H, Zhao K, Shen W. Appl Environ Microbiol. 2009 Mar; 75(6):1628-34.
"A genetic switch". Ptashne M. Blackwell Scientific, Cambridge, MA. 1986.
"A genetic switch: Phage lambda revisited". Ptashne M. Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, NY. 15 2004.
"The bacteriophages, Part II: Life of phages, 8". Gene regulatory circuitry of phage A. Little J. 2a edicion 2004. Richard Calendar.ed. Oxford University Press.
"On a thermosensitive repression system in the Escherichia coli lambda bacteriophage". Sussman R, Jacob F. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1962, 254, p1517.
20
Claims (14)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un metodo para la produccion de metionina, sus precursores o derivados en un procedimiento fermentativo que comprende las siguientes etapas:- cultivar un microorganismo modificado en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrogeno, y- recuperar metionina y/o sus derivados del medio de cultivo,en donde en dicho microorganismo modificado, la expresion de al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control de un promotor heterologo inducible por temperatura inducido por la temperatura.
- 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la expresion de los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control directo del promotor inducible heterologo.
- 3. El metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, en el que el promotor inducible por temperatura se selecciona del grupo que consiste en promotores regulados por un represor modificado del fago lambda, el promotor PR o un derivado de PR, el promotor PL o un derivado de PL y un promotor lac modificado regulado por un represor Lac sensible a la temperatura.
- 4. El metodo segun la reivindicacion 3, en el que dicho represor modificado del fago lambda es el alelo del represor lambda cI857 o cualquier otro alelo labil a la temperatura del represor lambda cl.
- 5. El metodo segun las reivindicaciones 3 o 4, en el que en la cepa productora se suprime el gen recA.
- 6. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la expresion de los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control indirecto del promotor inducible heterologo, siendo transcritos dichos genes por una ARN polimerasa heterologa cuya expresion esta bajo el control de un promotor inducible.
- 7. El metodo segun la reivindicacion 6, en el que la ARN polimerasa heterologa se selecciona entre el grupo que consiste en polimerasa de T7 y T3.
- 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el gen thrA es un alelo de thrA que tiene una sensibilidad de retroalimentacion reducida a treonina.
- 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la expresion del gen metA esta ademas bajo el control de un promotor inducible heterologo.
- 10. El metodo segun la reivindicacion 9, en el que el gen metA es un alelo mutante de metA que codifica con sensibilidad de retroalimentacion reducida a metionina y S-adenosilmetionina.
- 11. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho microorganismo modificado es una Enterobacteriaceae, y preferiblemente Escherichia coli.
- 12. Un microorganismo modificado para una produccion mejorada de metionina, en donde en dicho microorganismo modificado, la expresion de al menos los genes thrA y cysE implicados en la produccion de metionina esta bajo el control de un promotor inducible por temperatura heterologo inducido por la temperatura.
- 13. El microorganismo segun la reivindicacion 12, que comprende al menos una de las modificaciones descritas en las reivindicaciones 2 a 11.
- 14. El microorganismo segun las reivindicaciones 12 o 13, que es una Enterobacteriaceae, y preferiblemente Escherichia coli.
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| CN111996206B (zh) * | 2020-06-19 | 2023-01-31 | 清华大学 | 光控无细胞蛋白质合成方法、该方法使用的质粒以及使用该方法的产品 |
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Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE10239073A1 (de) * | 2002-08-26 | 2004-03-11 | Basf Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien |
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| DE10359668A1 (de) * | 2003-12-18 | 2005-07-14 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von Methionin |
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| CA2615419A1 (en) * | 2005-07-18 | 2007-01-25 | Basf Aktiengesellschaft | Use of a bacillus meti gene to improve methionine production in microorganisms |
| US8389250B2 (en) * | 2006-01-04 | 2013-03-05 | Metabolic Explorer | Methods for producing methionine by culturing a microorganism modified to enhance production of cysteine |
| WO2009043372A1 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-09 | Metabolic Explorer | Increasing methionine yield |
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