KR20120107992A

KR20120107992A - 메티오닌 생산에서의 유도성 프로모터의 용도

Info

Publication number: KR20120107992A
Application number: KR1020127018334A
Authority: KR
Inventors: 라이너 피게; 페린 바쉐르
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2012-10-04
Also published as: CN102762736A; EP2513322B1; JP2013513392A; WO2011073738A1; BR112012014454A2; CN104673852A; US9732364B2; PL2513322T3; JP2016165287A; CN102762736B; WO2011073122A1; ES2634469T3; EP2513322A1; US9988655B2; JP5944323B2; AR079459A1; KR101789215B1; MX2012006777A; US20170306366A1; MY172455A

Abstract

본 발명은 발효에 의한 메티오닌 생산에서의 유도성 프로모터의 용도에 관한 것이다. 본 발명은, - 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 변형된 미생물을 배양하는 단계; 및 - 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 변형된 미생물에서 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있는 것인, 발효 공정에서 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에서 사용되는 변형된 미생물에 관한 것이다.

Description

메티오닌 생산에서의 유도성 프로모터의 용도{USE OF INDUCIBLE PROMOTERS IN THE PRODUCTION OF METHIONINE}

본 발명은 발효에 의한 메티오닌 생산에서의 유도성 프로모터의 용도에 관한 것이다.

황-함유 화합물, 예를 들어, 시스테인, 호모시스테인, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌은 세포 대사에 중요하며, 산업적으로 식품 또는 사료 첨가제 및 제약으로서 생산된다. 특히, 동물에 의해 합성되지 못하는 필수 아미노산인 메티오닌은 많은 신체 기능에서 중요한 역할을 한다. 단백질 생합성에서의 그의 역할 이외에도, 메티오닌은 메틸 전달 반응 및 셀레늄 및 아연의 생체이용성에 관여한다. 메티오닌은 또한 알레르기 및 류마티스성 열과 같은 질병 치료법으로서 직접적으로 사용된다. 그럼에도 불구하고, 제조되는 메티오닌 대부분은 동물 사료에 첨가된다.

BSE 및 조류 독감의 결과로 동물 유래의 단백질 사용이 감소됨에 따라 순수한 메티오닌이 점점 더 요구되고 있다. 화학적으로 D,L-메티오닌은 통상 아크롤레인, 메틸 메르캅탄 및 시안화수소로부터 생산된다. 그럼에도 불구하고, 라세미 혼합물 뿐만 아니라, 순수한 L-메티오닌은 닭 사료 첨가제에서와 관련하여 기능 수행을 하지 못한다 (문헌 [Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633]). 순수한 L-메티오닌은 예를 들어, N-아세틸-D,L-메티오닌의 아실라제 처리를 통해 라세미 메티오닌으로부터 제조될 수 있는데, 이는 제조 비용을 현저히 증가시킨다. 환경상의 우려와 연계되는 순수한 L-메티오닌에 대한 요구가 증가함에 따라 미생물에 의한 메티오닌 생산이 관심의 대상이 되어 가고 있다.

생명공학적 공정에서 유도성 프로모터의 용도는 화학적 생합성 분야이다. 이러한 프로모터는 보통 각각 프로피오네이트 (WO2007005837), 아연 (WO2004020640) 및 아라비노스 (WO1998011231) 또는 온도 (문헌 ([Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli. Tang X, Tan Y, Zhu H, Zhao K, Shen W. Appl Environ Microbiol. 2009 Mar; 75(6): 1628-34.]) 및 광으로 예시되는 화학적 또는 물리적 자극에 대해 반응한다.

메티오닌 생산은 수개의 전구체를 제공하는 경로에 의존한다. 효율적인 메티오닌 생산을 위해서는 이러한 경로가 미세 조정되어야 한다. 메티오닌이 최대로 제조되도록 하기 위해서는 상기 공정 동안 특정 중요한 효소의 발현을 조정할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, (i) 특정 효소의 발현은 오직 제조 단계 동안에만 필요하고, 바이오매스 생성 동안에는 필요하지 않거나, 또는 그 반대의 경우가 있다. 다른 효소들은 오직 정지기에만 유익하다. 따라서, 산업 수준으로 총 메티오닌 생산 수율을 개선시키는 데 있어 유도성 프로모터를 사용하는 것이 관심의 대상이 될 수 있다.

그러나, 메티오닌 대사 경로가 복잡하고, 메티오닌 생산을 개선시키기 위해서는 상기 경로가 미세 조정되어야 하기 때문에, 메티오닌 생산에 관여하는 유전자의 발현을 제어하기 위해 유도성 프로모터를 사용하는 것에 관해서는 고려되거나 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 유도성 프로모터가 복잡한 대사 경로, 예를 들어, 메티오닌 생합성에 관여하는 유전자들의 유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 때 유익할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명은

- 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 변형된 미생물을 배양하는 단계; 및

- 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계

를 포함하며, 여기서, 상기 변형된 미생물에서 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있는 것인, 발효 공정에서 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있는 것인, 개선된 메티오닌 생산을 위해 변형된 미생물에 관한 것이다.

한 특정 실시양태에서, 유전자 thrA, cysE 및 metA는 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있다.

본 발명은

ㆍ 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 변형된 미생물을 배양하는 단계; 및

ㆍ 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계

본 발명에 따라, "발효 공정," "발효" 또는 "배양"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 이는 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지 상에서 박테리아를 성장시키는 것을 의미한다.

"적절한 배양 배지"는 미생물의 배양 및 성장에 적절한 배지이다. 그러한 배지는 배양되는 미생물에 따라 미생물 발효업계에 주지되어 있다.

"미생물"이라는 용어는 박테리아, 효모 또는 진균을 의미한다. 바람직하게, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게, 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 종이다. 더욱 더 바람직하게, 상기 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종이다.

"변형된 미생물"이라는 용어는 개선된 메티오닌 생산을 위해 변형된 미생물이며, 이는 메티오닌의 생산 수율 개선을 목적으로 유전적으로 변형된 미생물을 나타낸다. 본 발명에 따라, "개선된" 또는 "개선시키다"라는 것은 미생물에 의해 생산되는 메티오닌의 양, 특히 메티오닌 수율 (탄소 공급원당 생산되는 메티오닌의 비)을 상응하는 비변형 미생물에서와 비교하였을 때, 변형된 미생물에서 더 높은 것을 의미한다. 일반적 변형으로는 형질전환 및 재조합에 의해 유전자 결실을 미생물 내로 도입하는 것, 유전자 대체, 및 이종성 유전자 발현용의 벡터 도입이 포함된다.

본 발명의 방법에 사용되는 변형된 미생물은 하기 두 특징을 모두 갖는다:

- 개선된 메티오닌 생산을 위해 변형된 것이라는 점, 및

- 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현이 직접 또는 간접적으로 유도성 프로모터의 제어하에 있다는 점.

"배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수한다"라는 어구는 메티오닌, 및 가능하게는 S-아실 메티오닌 및 N-아실 메티오닌 화합물, 예를 들어 N-아세틸 메티오닌 및 N-프로피오닐 메티오닌, 및 수득된 모든 다른 유도체를 회수하는 행위를 말한다.

"유도성 프로모터"라는 용어는 그의 활성이 외부 자극이 존재할 경우, 증가 또는 감소될 수 있는 프로모터를 의미한다. 자극은 자연상의 물리적 또는 화학적 자극, 예를 들어, 온도, 광, 화학물질 등일 수 있다.

표적 유전자는 자극의 직접 또는 간접적 전달을 통해 유도될 수 있다.

한 표적 유전자의 발현이 유도성 프로모터의 제어하에 있을 때, 직접적인 전달이 이루어진다.

간접적인 전달은 유도성 프로모터의 제어하에 있으며, 메티오닌 생합성에 관여하는 표적 유전자의 발현을 구동시키는 특이적인 프로모터를 인식하는 이종성 RNA 폴리머라제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 경우, 유도성 프로모터가 표적 유전자의 프로모터에 직접 연결되어 있는 것이 아니라, 표적 유전자의 상기 프로모터를 전사시키는 RNA 폴리머라제의 발현을 구동시킨다.

이러한 이종성 RNA 폴리머라제는 예를 들어, T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, 또는 당업계의 숙련가에게 공지되어 있는 다른 폴리머라제일 수 있다.

'간접적 전달'이란 또한 한 특이 유전자의 유도성 발현이 그의 이웃 유전자의 발현에 대해 미치는 '극성 효과'를 의미한다. "극성 효과"란 유전자의 유전적 변형이, 상기 변형된 유전자의 하류에 존재하는 하나 이상의 유전자들의 발현에 형향을 준다는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 측면에서, 메티오닌 생산에 관여하는 특이 유전자가 유도되면 상기 특이 유전자 하류에 존재하는 유전자가 유도될 수 있다.

"이종성 유도성 프로모터의 제어하에 있다"라는 어구는 유도성 프로모터가 유전자의 천연 프로모터가 아니며, 그와 작동가능하게 연결된 유전자의 발현 수준을 적어도 부분적으로 제어할 수 있도록 하는 방식으로 도입된 것이라는 사실을 말한다. 유도성 프로모터의 활성은 생물적 또는 비생물적 요인의 존재 또는 부재에 의해 유도된다. 유전자의 발현은 당업자의 필요에 따라 작동되거나 작동이 중단될 수 있다. 이러한 프로모터는 (테트라시클린, 호르몬 등의 존재하에) 화학적으로 조절되거나, 또는 특히 열 또는 광에 의해 물리적으로 조절될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시양태에서, 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현은 유도성 프로모터의 직접적인 제어하에 있다.

본 발명의 제1 측면에서, 유도성 프로모터는 물리적 유도성 프로모터, 특히, 온도 유도성 프로모터 또는 광 유도성 프로모터의다. 이 프로모터는 파지 람다의 변형된 리프레서에 의해 우선적으로 조절되는 온도 유도성 프로모터, 프로모터 PR 또는 PR의 유도체, 프로모터 PL 또는 PL의 유도체 (문헌 ([A genetic switch. Ptashne M. Blackwell Scientific, Cambridge, MA. 1986]; [A genetic switch: Phage lambda revisited. Ptashne M. Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, NY. 2004]; [The bacteriophages, Part II: Life of phages, 8. Gene regulatory circuitry of phage λ. Little J. 2^nd edition 2004. Richard Calendar.ed. Oxford University Press])), 및 온도 감응성 Lac 리프레서에 의해 조절되는 변형된 lac 프로모터인 것이 이롭다.

리프레서는 프로모터 영역 중의 특이적인 결합 부위에 결합하여 RNA 폴리머라제가 프로모터에 접근하는 것을 제한하고, 전사의 개시 또는 신장을 감소시킴으로써 동족체 프로모터로부터의 발현을 억제한다. 상기 리프레서는 람다 리프레서 대립유전자 cI857 (문헌 [On a thermosensitive repression system in the Escherichia coli lambda bacteriophage. Sussman R, Jacob F. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1962, 254, p1517]) 또는 cI 람다 리프레서의 또 다른 온도-감응성 대립유전자인 것이 이롭다.

본 발명의 구체적인 측면에서, 메티오닌 생산을 위해 변형된 미생물에서, recA를 코딩하는 유전자가 결실되었다. 단백질 RecA는 cI 상에서 프로테아제로서의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, RecA를 코딩하는 유전자가 결실되면 람다 리프레서 cI의 단백질분해는 제외된다.

온도 유도성 프로모터는 이롭게는 프로모터 PR 또는 유도체, 및 프로모터 PL 또는 유도체 사이에서 선택될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 온도 유도성 프로모터는 온도 감응성 Lac 리프레서에 의해 조절되는 변형된 lac 프로모터다.

본 발명의 제2 측면에서, 유도성 프로모터는 화학적으로 조절된다. 특히, 프로모터의 활성의 유도는 탄소 이화대사산물의 억제에서의 변화와 연관이 있다. 탄소 이화대사산물 억제에 의해 활성화되는 프로모터는 저농도의 글루코스 또는 글루코스 부재하에서 활성인자 CRP를 통해 양성적으로 조절된다.

유도성 프로모터가 탄소 공급원 또는 당 알콜의 존재에 의해 유도되는 것이 이롭다. 탄소 공급원 또는 당 알콜에 의해 유도되는 프로모터의 예로는 각각 아라비노스 또는 라피노스 프로모터 및 만니톨 프로모터 또는 글루시톨 프로모터를 포함한다.

본 발명의 구체적인 측면에 따라, 관심의 대상이 되는 유전자의 발현은 "간접적 전달"을 통해 조절되며, 즉, 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자는, 그의 발현이 유도성 프로모터의 제어하에 있는 이종성 RNA 폴리머라제에 의해 전사된다.

본 발명의 구체적인 실시양태에서, 이종성 RNA 폴리머라제는 T7, T3 폴리머라제로부터 선택된다.

본 발명에 따라, 메티오닌 생산 또는 그의 전구체의 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자는 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있으며; 앞서 설명된 바와 같이, 유전자는 유도성 프로모터의 직접적인 제어하에 있거나, 또는 유전자는 유도성 RNA 폴리머라제에 의해 전사되거나, 또는 그 둘 모두의 조합이 이루어질 수 있다.

미생물에서 메티오닌 생산에 관여하는 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 메티오닌 특이 생합성 경로에 관여하는 유전자 뿐만 아니라, 전구체 제공 경로에 관여하는 유전자 및 메티오닌 소비 경로에 관여하는 유전자도 포함한다.

메티오닌을 효율적으로 제조하기 위해서는 메티오닌 특이 경로 및 수개의 전구체 제공 경로가 최적화되어야 한다. 메티오닌 생산 균주는 특허 출원 WO 2005/111202, WO 2007/077041, WO 2009/043803 및 WO 2009/043372에 기재되어 있고, 이들은 본 출원에 참고로 포함된다.

그의 억제제 SAM 및 메티오닌에의 피드백 감도가 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 대립유전자를 과다발현하는 메티오닌 생산 균주는 특허 출원 WO 2005/111202에 기재되어 있다. 상기 출원에는 또한, 특허 출원 JP 2000/157267에서 제안된 바와 같이, 메티오닌 레귤론의 하향 조절을 담당하는 메티오닌 리프레서 MetJ (진뱅크(GenBank) 1790373)가 결실된 상기 대립유전자의 조합이 기재되어 있다. 추가로, 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제의 과다발현을 동반하는 두 변형의 조합은 특허 출원 WO 2005/111202에 기재되어 있다.

유전자 cysE, metH 및 metF의 과다발현은 WO 2007/077041에 제안된 바 있다.

메티오닌 생산을 증가시키기 위해서 메티오닌 생산에 관여하는 하기 유전자들 중 적어도 하나가 유도성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.

a) 황 동화에 관여하는 유전자의 발현은 유도성 프로모터 또는 RNA 폴리머라제의 제어하에 있는 것이 이로울 수 있다:

b) 보충 반응은 하기 유전자 발현을 통해 증강될 수 있다:

c) 아세테이트 소비 반응은 하기 유전자의 과다발현을 통해 증강될 수 있다:

acs 1790505 아세틸-CoA 신테타제

d) 메티오닌 생합성에 직접적으로 관여하는 효소:

e) 아스파르테이트 대사에 관여하는 효소:

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유전자 thrA 및/또는 cysE 중 적어도 하나의 발현은 직접 또는 간접적으로 유도성 프로모터의 제어하에 있다.

효소 ThrA 또는 그의 동족체 (MetL, LysC) 중 임의의 것은 아스파르테이트의, 메티오닌의 전구체인 호모세린으로의 변환 반응을 촉매한다. 효소 CysE는 시스테인의 직접적인 전구체이며, 결국에는 메티오닌 생합성을 위한 황 공여자로서의 역할을 하는 O-아세틸-세린을 형성하는 세린의 O-아세틸화를 촉매한다.

메티오닌 생산은 추가로 특허 출원 WO 2004/076659 (본원에 참고로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 우선적으로 또는 배타적으로 H₂S를 사용함으로써, O-숙시닐-호모세린으로부터 호모시스테인을 생산하는 변경된 metB 대립유전자를 사용함으로써 추가로 증가시킬 수 있다.

메티오닌 생산의 추가 증가는 특허 출원 WO2009043803에 기재된 바와 같이, 유전자 pykA, pykF 및/또는 purU의 발현을 약화시킴으로써 이루어질 수 있다. 이는 또한 직접 또는 간접적으로 유도성 프로모터를 사용함으로써 달성될 수 있다.

본 출원은 또한 오페론 cysPUWAM, cysJIH 및 gcvTHP 및 유전자 serA, serB, serC, lpd 및 glyA가 과다발현되는 메티오닌 생산 균주를 기재한다. 유사하게, 이는 직접 또는 간접적으로 유도성 프로모터를 사용함으로써 달성될 수 있다.

메티오닌 분해 경로 (하기 목록 참조), 또는 메티오닌 생산 경로로부터의 이탈 경로에서의 유전자의 추가 발현은 직접 또는 간접적으로 유도성 프로모터를 사용함으로써 약화될 수 있다. 이와 관련하여 약화란 예를 들어, 효소의 발현을 감소시키거나, 효소의 안정성을 감소시키거나, 효소의 분해를 증가시키는 수단, 및/또는, 당업계의 숙련가에게 공지되어 있는 다른 해결 방법에 의해 효소의 세포내 활성을 감소시키는 것을 기술한다. 이는 유도성 프로모터의 발현을 감소시킴으로써, 즉, 유도성 프로모터를 유도하는 자극을 제거하거나, 또는 유도성 RNA 폴리머라제의 발현을 감소시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유전자: thrA, cysE, metA 중 적어도 하나의 발현은 직접 또는 간접적으로 유도성 프로모터의 제어하에 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 유전자 thrA, cysE 및 metA는 직접 또는 간접적으로 유도성 프로모터의 제어하에 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, thrA 유전자의 발현은 유도성 프로모터의 직접적인 제어하에 있고, cysE 유전자의 발현은 thrA 유전자의 유도성 발현의 '극성 효과'하에 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, thrA 유전자의 유도성 발현은 유도성 프로모터의 직접적인 제어하에 있고, cysE 및 metA 유전자의 발현은 thrA 유전자의 유도성 발현의 '극성 효과'하에 있다.

구체적인 실시양태에서, 3개의 유전자 thrA, cysE 및 metA는 동일한 유도성 프로모터, 예를 들어, 상기 및 실시예에 개시되어 있는 온도 유도성 프로모터의 제어하에 있다.

본 발명에서, "thrA 유전자"는 천연 thrA 유전자 또는 예를 들어, WO2005/108561에 기재되어 있는, 트레오닌에 대한 피드백 감응성이 감소된 thrA 대립유전자를 의미한다. 본 발명에 따라, "metA 유전자"는 천연 metA 유전자 또는 예를 들어, WO2005/108561에 기재되어 있는, 메티오닌 및 S-아데노실메티오닌에 대한 피드백 감응성이 감소된 효소를 코딩하는 metA 돌연변이체 대립유전자를 의미한다.

유도성 프로모터에 의해 제어되는 유전자는 염색체 상의 그의 천연 위치에 존재할 수 있거나, 비-천연 위치에 통합될 수 있다. 최적의 메티오닌 생산을 위해 유도성 프로모터에 의해 제어되는 유전자가 1회 또는 수회 통합되어야 할 수도 있다. 유사하게, 최적의 발현을 위해 하나 또는 수개의 조절인자 유전자 카피가 필요할 수도 있다. 발현을 미세 조정하기 위해 상이한 비의 리프레서 유전자 카피 및 프로모터가 사용될 수 있다.

유도성 프로모터의 제어하에 있는 유전자는 우선적으로, 그의 변형이 메티오닌 생산에 부정적 영향을 미치지 않는 것인 유전자좌 내로 통합된다. 유전자가 통합될 수 있는 유전자좌의 예는 하기와 같다:

본 발명의 상세한 설명에서, 유전자 및 단백질은 이. 콜라이(E. coli) 내의 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 확인한다. 그러나, 달리 명시되지 않는 한, 이러한 명칭을 사용하는 것은 본 발명에 따라 더욱 일반적인 의미를 가지고, 다른 유기체, 더욱 특히 미생물 내의 상응하는 유전자 및 단백질 모두를 포괄한다.

당업자들은 진뱅크에서 제공하는 공지의 유전자를 참조하여, 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등 내에 존재하는 등가의 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 통상의 작업은, 다른 유기체로부터 유래된 유전자와 함께 서열을 정렬하고, 축퇴성 프로브를 디자인하여 또 다른 유기체 내의 상응하는 유전자를 클로닝시킴으로써 결정될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 수행하는 것이 이롭다. 이러한 통상의 분자생물학적 방법은 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)]에서 주장된다.

PFAM (정렬 및 은닉 마르코프(hidden Markov) 모델의 단백질 패밀리 데이터베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 대규모 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬의 시각화, 단백질 도메인의 확인, 유기체간 분포의 평가, 다른 데이터베이스에의 접근 및 공지된 단백질 구조의 시각화를 가능하게 한다.

COG (단백질의 이종상동성 군의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 주요 계통발생학적 세포주를 나타내는 완전히 서열 분석된 게놈으로부터 단백질 서열을 비교하여 수득한 것이다. 각각의 COG는 적어도 3개의 세포주로부터 정의되며, 이전의 보존된 도메인의 확인을 가능하게 한다.

상동성 서열 및 그의 상동성 백분율(%)을 확인하는 수단은 당업자에게 주지되어 있고, 특히 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/와 상기 웹사이트에 표시된 디폴트 파라미터로부터 사용할 수 있는 BLAST 프로그램을 포함한다. 이어서, 수득된 서열을 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)과 이들 웹사이트에 표시된 디폴트 파라미터를 사용하여 활용 (예를 들어, 정렬)할 수 있다.

발효 공정에서 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체를 생산하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 공정을 최적화하기 위해서는 예를 들어, 황 공급원, 탄소 공급원, 및 질소 공급원 선택과 같이, 발효 공정의 상이한 요인들을 조정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 측면에서, L-메티오닌의 발효 생산을 위해 사용되는 것으로서, 배양 배지에 첨가되는 황 공급원은 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸디술피드 및 다른 메틸 캡핑된 술피드 또는 다른 공급원의 조합이다.

더욱 우선적으로, 배양 배지 중의 황 공급원은 술페이트 또는 티오술페이트, 또는 그의 혼합물이다.

본 발명에 따라 '탄소 공급원'이라는 용어는 당업자에 의해 미생물의 정상적인 성장을 지원하는 데 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원을 말하며, 헥소스 (예를 들어, 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 단당류, 이당류 (예를 들어, 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 올리고당, 당밀, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 그의 조합일 수 있다. 특히 바람직한 탄소 공급원은 글루코스이다. 또 다른 바람직한 탄소 공급원은 수크로스이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소 공급원은 재생가능한 공급 원료로부터 유래된다. 재생가능한 공급 원료는 잠깐 지체되는 동안 원하는 생성물로 변환될 수 있도록 허용되는데 충분한 양으로 재생될 수 있는 특정의 산업 공정상 요구되는 원료로 정의된다.

질소 공급원이라는 용어는 암모늄 염 또는 암모니아 기체에 상응한다.

질소 공급원은 암모늄 또는 암모니아 형태로 공급된다.

발효는 일반적으로 사용되는 미생물에 맞게 적합화된 것으로서, 적어도 하나의 단순 탄소 공급원, 및 필요에 따라 대사산물 생산을 위한 공동-기질을 함유하는 적절한 배양 배지와 함께 발효기 내에서 수행된다.

당업자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 조건을 규정할 수 있다. 특히, 박테리아는 20℃ 내지 55℃ 사이, 우선적으로는 25℃ 내지 40℃ 사이의 온도에서 발효시키고, 보다 구체적으로 씨. 글루타미쿰에 대해서는 약 30℃의 온도에서, 이. 콜라이에 대해서는 약 37℃의 온도에서 발효시킨다.

이. 콜라이에 대해 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 예를 들어, 문헌 [Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)]에서 정의된 배지와 동일하거나, 유사한 조성일 수 있다.

씨. 글루타미쿰에 대해 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 BMCG 배지 (문헌 [Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210]) 또는 예를 들어, 문헌 [Riedel et al. (2001 , J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)]에 기재된 배지와 동일하거나 유사한 조성일 수 있다.

본 발명은 또한 임의로 최종 생성물 내에서 일부분 또는 총량 (0 내지 100％)으로 잔존하는, 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스 중 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체를 단리시키는 단계를 포함하는, 메티오닌 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구체적인 측면에서, 배양은 미생물에 무기 기질, 특히, 포스페이트 및/또는 칼륨을 제한하거나 고갈시키는 조건하에서 수행된다.

유기체가 무기 기질의 제한을 받게 한다는 것은 여전히 약한 성장은 허용하도록 공급된 무기 화학 물질의 양으로 미생물의 성장이 지배되는 조건을 정의한다.

미생물에 무기 기질을 고갈시킨다는 것은 무기 기질의 부재로 인하여 미생물의 성장이 완전하게 멈추는 조건을 정의한다.

본 발명은 또한 예를 들어, 상기 기재된 변형 중 적어도 하나를 포함하는 미생물에 관한 것이다.

실시예

실시예 1:

N-아세틸 메티오닌 축적이 감소된 메티오닌 생산 균주는 특허 출원 WO2007077041 및 WO2009043803 (이는 본 출원에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다.

포스포세린 포스파타제, SerB의 수준을 증가시키기 위해, 구성적 인공 trc 프로모터를 serB 유전자 상류쪽에

내로 첨가하였다.

상기 인공 trc 프로모터를 첨가하기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기재된 상동성 재조합 전략법을 사용하였다. 이러한 전략법을 통해 구체적으로 염색체에 카나마이신 내성 카세트 뿐만 아니라, 추가의 DNA 영역을 삽입할 수 있다. 이러한 목적을 위해 2개의 올리고뉴클레오티드, Ptrc07-serBF (서열 01) 및 Ptrc07-serBR (서열 02)이 사용되었다 (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

Ptrc07-serBF (서열 01)

여기서,

- 영역 (대문자)는 유전자 serB의 영역 중 4622816부터 4622878까지인 서열에 상동성이고,

- 영역 (밑줄체 대문자)는 T7 파지로부터의 T7Te 전사 종결인자 서열에 대한 것이며 (문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24]),

- 영역 (굵은체 대문자)는 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 것이다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645] 중의 참조 서열).

Ptrc07-serBR (서열 02)

여기서,

- 영역 (대문자)은 유전자 serB의 영역 중 4622939부터 4622879까지인 서열에 상동성이고,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 trc 프로모터 서열에 대한 것이며,

- 영역 (굵은체 대문자)은 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 것이다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645] 중의 참조 서열).

올리고뉴클레오티드 Ptrc07-serBF (서열 01) 및 Ptrc07-serBR (서열 02)을 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다. 이어서, 수득된 PCR 생성물을 전기천공에 의해

내로 도입하였는데, 여기서, 발현된 Red 리콤비나제 효소가 상동성 재조합을 허용한다. 이어서, 카나마이신 내성 형질전환체를 선별하고, 하기 정의되는 올리고뉴클레오티드 serBF (서열 03) 및 serBR (서열 04)을 사용하여 PCR 분석을 수행함으로써 내성 카세트의 삽입을 확인하였다. 이어서, 선별된 형질전환체를 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.

보유 균주를

로 지정하였다.

serBF (서열 03)

(유전자 serB의 영역 중 4622747부터 4622765까지인 서열에 상동성이다).

serBR (서열 04)

(유전자 serB의 영역 중 4623006부터 4622988까지인 서열에 상동성이다).

이어서, 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다. 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 리콤비나제 FLP를 보유하는 pCP20 플라스미드를 전기천공에 의해

내로 도입하였다. 42℃에서 계속하여 일련의 배양을 수행한 후, 앞서 사용된 것과 동일한 올리고뉴클레오티드, serBF (서열 03)/serBR (서열 04)을 사용하여 PCR 분석을 수행함으로써 카나마이신 내성 카세트의 손실을 확인하였다. 보유 균주를

로 지정하였다.

pCC1BAC-serA-serC 벡터의 구축은 WO2009043803에 기재되어 있다.

pCC1BAC-serA-serC 벡터를 균주

내로 도입하여 균주

를 수득하였다.

플라스미드는 플라스미드 pCL1920 (문헌 [Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15p 4631]),

로부터 유도된 것이다 (문헌 [Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148]).

pME101-thrA*1-cysE의 구축은 WO2007077041에 기재되어 있다.

의 구축을 위해, 중복 PCR에 의해

및

영역을 개별적으로 수득한 후, pCL1920 벡터에 함께 클로닝시켰다.

먼저, 하기 올리고뉴클레오티드, ApaI-TTadc-CI857-F-1 (서열 05) 및 PlambdaR-thrA-R-2 (서열 06) (웹사이트 http://ecogene.org/ 및 http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind?C.acetobutylicum 상의 참조 서열)를 사용하여 pFC1 벡터로부터 TTadc-CI857-PlambdaR*(-35) 영역을 PCR 증폭시켰다. 이어서, 올리고뉴클레오티드 PlambdaR-thrA-F-3 (서열 07) 및 cysE-R-4 (서열 08) (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)를 사용하여

플라스미드로부터 thrA*1-cysE 영역을 PCR 증폭시켰다. 32 bp 길이의 중복 서열을 가지도록 PlambdaR-thrA-R-2 (서열 06) 및 PlambdaR-thrA-F-3 (서열 07) 올리고뉴클레오티드, 둘 모두를 디자인하였다. 이러한 중복 서열에 기인하여, 제3 단계에서는 TTadc-CI857-PlambdaR*(-35) 및 thrA*1-cysE PCR 생성물을 혼합하고, ApaI-TTadc-CI857-F-1 (서열 05) 및 cysE-R-4 (서열 08) 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써

영역을 PCR 증폭시켰다. 이어서, 상기 PCR 생성물을 pSCB (스트라타진(Stratagene))에 클로닝하고, 생성된 벡터를 서열 분석하여 확인하고,

라 명명하였다.

ApaI-TTadc-CI857-F-1 (서열 05)

여기서,

- 영역 (소문자)은 추가 염기를 포함하고,

- 영역 (밑줄체 대문자)은 ApaI 부위를 함유하며,

- 영역 (대문자)은 TTadc 전사 종결인자 서열 (pSLO1 메가플라스미드 중 179847부터 179807까지에 상동성인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터 유래된 adc 유전자의 전사 종결인자)에 대한 것이고,

- 영역 (굵은체 대문자)은 람다 박테리오파지로부터의 cI857 유전자의 3' 단부에 상동성이다.

PlambdaR-thrA-R-2 (서열 06)

여기서,

- 영역 (굵은체 대문자)은 thrA 유전자의 5' 단부에 상동성이고 (337부터 348까지, 단, 1개 염기 (굵은 이탤릭체 대문자) 제외),

- 영역 (대문자)은 -35 box의 변형을 통해 -35 컨센서스 (TTGACT → TTGACA)가 수득되는 것인 변이체 형태인 P_R의 *(-35) 버전의 수득을 위해 1개 염기 (이탤릭체 대문자)를 제외하고는 람다 박테리오파지 P_R 프로모터에 상동성이고,

- 중복 영역은 PlambdaR-thrA-F-3 올리고뉴클레오티드 (밑줄체 대문자)를 포함한다.

PlambdaR-thrA-F-3 (서열 07)

여기서,

- 영역 (대문자)은 람다 박테리오파지 P_R 프로모터에 상동성이고,

- 영역 (굵은체 대문자)은 thrA 유전자의 5' 단부에 상동성이며 (337부터 377까지, 단, 1개 염기 (굵은 이탤릭체 대문자) 제외),

- 중복 영역은 PlambdaR-thrA-R-2 올리고뉴클레오티드 (밑줄체 대문자)를 포함한다.

cysE-R-4 (서열 08)

(pME101-thrA*1-cysE 플라스미드의 하류 영역에 존재하는 cysE에 상동성이다).

카피수가 낮은 벡터에 thrA*1 및 cysE 유전자를 전이시키기 위해,

벡터를 BsrBI 및 BamHI에 의해 제한하고,

단편을 벡터 pCL1920의 SmaI/BamHI 부위로 클로닝하여 벡터

를 수득하였다.

이어서, PgapA-metA*11 영역을 중복 PCR에 의해 MG1655 metA*11 균주로부터 증폭시켰다. 먼저, 올리고뉴클레오티드 SmaI-PgapA-F (서열 09) 및 PgapA-metA*11-R (서열 10) (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)을 사용하여 PgapA 프로모터를 PCR 증폭시켰다. 이어서, 올리고뉴클레오티드 PgapA-metA*11-F (서열 11) 및 BamHI-metA*11-R (서열 12) (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)을 사용하여 metA*11 유전자를 PCR 증폭시켰다. 그의 전장의 서열에 대해 중복되도록 PgapA-metA*11-R (서열 10) 및 PgapA-metA*11-F (서열 11), 둘 모두를 디자인하였다. 이러한 특수성으로 인해 제3 단계에서는 metA*11 및 PgapA PCR 생성물을 혼합하고, SmaI-PgapA-F (서열 09) 및 BamHI-metA*11-R (서열 12) 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 PgapA-metA*11 영역을 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 SmaI 및 BamHI에 의해 제한한 후, 분해된 단편을 벡터

의 블런트화된 BamHI 부위 내로 클로닝하기 위해 상기 단편을 블런트화시켰다. 생성된 벡터를 서열 분석하여 확인하고,

로 명명하였다.

SmaI-PgapA-F (서열 09)

여기서,

- 영역 (소문자)은 추가 염기를 포함하고,

- 영역 (밑줄체 대문자)은 SmaI 부위를 함유하며,

- 영역 (대문자)은 에스케리키아 콜라이의 PgapA 프로모터 서열의 1860639부터 1860661까지에 상동성이다.

PgapA-metA*11-R (서열 10)

여기서,

- 영역 (굵은체 대문자)은 metA 유전자의 4212335부터 4212303까지에 상동성이고,

- 영역 (대문자)은 PgapA 프로모터 서열의 1860794부터 1860761까지에 상동성이다.

PgapA-metA*11-F (서열 11)

여기서,

BamHI-metA*11-R (서열 12)

여기서,

- 영역 (소문자)은 추가 염기를 포함하고,

- 영역 (밑줄체 대문자)은 BamHI 부위를 함유하며,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 EcoRI 부위를 함유하고,

- 영역 (굵은체 대문자)은 metA 유전자의 서열의 4213248부터 4213218까지에 상동성이다.

마지막으로, 벡터

을 전기천공에 의해 균주

내로 도입하여 균주

를 수득하였다.

5. 온도 의존성 메티오닌 생산 평가

작은 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 생산 균주를 평가하였다. 5.5 mL의 사전 배양물을 30℃에서 21시간 동안 혼합 배지 (2.5 g.L^-1 글루코스 및 90% 최소 배지 PC1을 포함하는 10% LB 배지 (시그마(Sigma) 25%)) 중에서 성장시켰다. 이를 사용하여 배지 PC1 중에 OD₆₀₀=0.2로 50 mL 배양물을 접종하였다. 스펙티노마이신을 50 mg.L^-1의 농도로, 클로람페니콜을 30 mg.L^-1의 농도로 첨가하였다. 배양 온도는 30℃ 또는 37℃였다. 배양물의 OD₆₀₀이 5 내지 7에 도달하였을 때, OPA/Fmoc 유도체화 후, HPLC에 의해 세포외 아미노산을 정량하고, 굴절 검출 (유기산 및 글루코스)을 이용한 HPLC, 및 실릴화 후 GC-MS를 통해 다른 관련 대사산물을 분석하였다. 각 조건마다 3회에 걸쳐 반복 수행하였다.

OPA/Fmoc 유도체화 후, HPLC에 의해 세포외 메티오닌 농도를 정량하였다. 굴절 검출을 이용한 HPLC를 통해 잔류 글루코스 농도를 분석하였다. 메티오닌 수율은 하기와 같이 표현하였다:

표 2에 제시된 바와 같이, 배양 공정 동안 유전자 thrA 및 cysE의 열 유도성 발현이 메티오닌의 생산량을 증가시켰다. 배양 공정 동안 내내 구성적 발현을 통해서는 낮은 메티오닌 수율을 얻었다.

하기 표 3에서는 유도시 HDH 및 SAT 활성이 증가하는 것을 제시한다. thrA 및 cysE의 구성적 발현시 HDH 및 SAT 활성 수준은 비유도성 조건과 유도성 조건 사이 정도였고, 이는 메티오닌 수율이 보다 낮은 것을 부분적으로 설명한다. 다른 세포 인자들 역시 구성적 발현시에 이들 활성에 영향을 주어, 상기 활성을 감소시킬 가능성이 매우 높다. 결론적으로, 이러한 결과를 통해 thrA 및 cysE의 유도가 실제로 메티오닌 수율을 증가시키는 데 유익하다는 것이 입증된다.

시험관내 효소 활성을 측정하기 위해, 상기 기재된 최소 배지 중에서 이. 콜라이 균주를 배양하였다.

SAT 활성 측정은 WO2007077041에 기재되어 있다.

시험관내 HDH 활성을 측정하기 위해, 20 mM의 저온 인산칼륨 완충제 (pH 7.2) 중에 이. 콜라이 세포를 재현탁시키고, 얼음 상에서 초음파처리하였다 (브랜슨(Branson) 초음파 처리기, 70 W). 원심분리 후, 상청액 중에 함유되어 있는 단백질을 정량하였다 (문헌 [Bradford, 1976]). 30℃에서 10분 동안 100 mM 트리스-HCl (pH 9), 150 mM KCl, 1 mM NADP⁺ 및 25 mM L-호모세린 중에서 10 ㎕의 추출물 (1,5 ㎍/mL 단백질)을 검정하였다. 340 nm에서 30분 동안 분광광도측정법에 따라 L-호모세린의 존재하의 NADP⁺ 환원을 측정하였다.

N-아세틸 메티오닌 축적이 감소된 메티오닌 생산 균주는 특허 출원 WO 2007077041 및 WO 2009043803 (이는 본 출원에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다.

플라스미드

는 플라스미드 pBeloBAC11 (문헌 [New England BioLabs; Kim et al, 1996, Genomics, 34, 231-218]) 및 (상기 기재된)

로부터 유도된 것이다.

먼저, 하기 올리고뉴클레오티드, SnaBI-thrA-SMC-cysE-F (서열 13) 및 cysE-R (서열 14) (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)을 사용하여

플라스미드로부터 thrA*1-SMC-cysE 영역 (SMC는 다중 클론화 부위(Multiple Clonage Site)를 위한 것이다)을 PCR 증폭시켰다.

SnaBI-thrA-SMC-cysE-F (서열 13)

여기서,

- 영역 (소문자)은 thrA 유전자의 3' 단부에 상동성이고 (2765부터 2799까지), SnaBI 제한 부위 (이탤릭체 소문자)를 함유하고,

- SMC 영역에 대한 영역 (굵은체)은 NheI 및 XhoI 제한 부위 (굵은 이탤릭체)를 함유하며,

- 영역 (대문자)은 cysE 유전자의 5' 상류 영역에 상동성이다 (3780796부터 3780819까지).

cysE-R (서열 14)

상기 서열은 3780226부터 3780243까지의 cysE 유전자에 상동성이다.

PCR 증폭된 단편 thrA*1-SMC-cysE를 SnaBI 및 StuI에 의해 제한하고, 분해된 단편을 플라스미드

의 SnaBI / StuI 부위 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 서열 분석에 의해 확인하고,

이라 명명하였다.

이어서, 하기 올리고뉴클레오티드, SfoI-PT7-RBST7-NdeI-thrA-F (서열 15) 및 metA-T7Tφ-SfoI-R (서열 16) (웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToS earch=10461&window=7553&begin=21516 상의 참조 서열)을 사용하여

플라스미드로부터

영역을 PCR 증폭시켰다. 상기 PCR 생성물을 pSCB 벡터 (스트라타진) 내로 클로닝하였다. 생성된 벡터를 서열 분석에 의해 확인하고,

이라 명명하였다.

영역을 단일 카피 벡터 pBeloBAC11 내로 전이시키기 위해,

를 SfoI에 의해 제한하고,

단편을 벡터 pBeloBAC11의 블런트화된 NotI 부위 내로 클로닝하여 플라스미드

를 수득하였다.

SfoI-PT7-RBST7-NdeI-thrA-F (서열 15)

여기서,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 SfoI 제한 부위를 함유하고,

- 영역 (소문자)은 T7 박테리오파지의 T7p45 (10A) 유전자의 프로모터 영역에 상동성이며 (22858부터 22967까지),

- 영역 (굵은체 대문자)은 thrA 유전자에 상동성이다 (337부터 359까지, 단, 1개 염기 (굵은 밑줄체 대문자) 제외).

metA-T7Tφ-SfoI-R (서열 16)

여기서,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 SfoI 제한 부위를 함유하고,

- 영역 (소문자)은 T7 박테리오파지의 T7p45 (10A) 유전자의 전사 종결인자 영역에 상동성이고 (24111부터 24218까지),

- 영역 (굵은체 대문자)은 metA 유전자에 상동성이다 (4213208부터 4213232까지).

마지막으로, 플라스미드

를 전기천공에 의해

내로 도입하여

를 수득하였다.

malS 영역을 결실시키고, 상기 영역을

영역으로 대체시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기재된 상동성 재조합 전략법을 사용하였다. 상기 전략법을 통해 관심 영역 대부분을 결실시키면서, 동시에 카나마이신 내성 카세트 및 추가의 DNA를 삽입할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 하기 플라스미드:

을 구축하였다.

플라스미드는 플라스미드 pUC18 (문헌 [Norrander et al, 1983, Gene 26,101-106]) 및 (상기 기재된) pUC18-DmalS::SMC::Km, pAR1219 (시그마), 및 (진아트(Geneart)에 의해 하기 기술된 바와 같이 합성된)

로부터 유도된 것이다.

2.1. 플라스미드 pUC18-DmalS::SMC::Km의 구축

플라스미드 pUC18-DmalS::SMC::Km을 구축하기 위해, malS의 상류 영역 (upmalS), 다중 클로닝 부위 (SMC), 및 카나마이신 카세트 (Km)를 중복 PCR에 의해 수득하고, malS의 하류 영역 (downmalS)을 순차적으로 증폭시키고, 클로닝시켰다.

먼저, 하기 올리고뉴클레오티드, HindIII-upmalS-F-1 (서열 17) 및 upmalS-Km-R-2 (서열 18) (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)를 사용하여 MG1655 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 upmalS 영역을 PCR 증폭시켰다. 이어서, 올리고뉴클레오티드 upmalS-Km-F-3 (서열 19) 및 Km-SMC-R-4 (서열 20)를 사용하여 pKD4 플라스미드 (문헌 [Datsenko & Wanner, 2000])로부터 Km-SMC 영역을 PCR 증폭시켰다. 45 bp 길이의 중복 서열을 가지도록 upmalS-Km-R-2 (서열 18) 및 upmalS-Km-F-3 (서열 19) 올리고뉴클레오티드, 둘 모두를 디자인하였다. 이러한 중복 서열에 기인하여, 제3 단계에서는 upmalS 및 Km-SMC PCR 생성물을 혼합하고, HindIII-upmalS-F-1 (서열 17) 및 Km-SMC-R-4 (서열 20) 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 upmalS-Km-SMC 영역을 PCR 증폭시켰다. 이어서, 상기 PCR 생성물을 pSCB (스트라타진)에 클로닝하고, 생성된 플라스미드를 서열 분석하여 확인하고, pSCB-upmalS-Km-SMC라 명명하였다.

HindIII-upmalS-F-1 (서열 17)

여기서,

- 영역 (소문자)은 추가 염기를 포함하고,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 HindIII 제한 부위를 함유하며,

- 영역 (대문자)은 malS 유전자의 상류 영역에 상동성이다 (3734620부터 3734641까지).

upmalS-Km-R-2 (서열 18)

여기서,

- 영역 (소문자)은 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 것이고 (문헌 [Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645] 중의 참조 서열),

- 영역 (대문자)은 malS 유전자의 상류 영역에 상동성이다 (3735836부터 3735860까지).

upmalS-Km-F-3 (서열 19)

여기서,

- 영역 (대문자)은 malS 유전자의 상류 영역에 상동성이고 (3735836부터 3735860까지),

- 영역 (소문자)은 카나마이신 내성 카세트의 증폭을 위한 것이다 (문헌 [Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645] 중의 참조 서열).

Km-SMC-R-4 (서열 20)

여기서,

- 영역 (대문자)은 추가 염기를 포함하고,

- SMC에 대한 영역 (이탤릭체 대문자)은 BamHI, XhoI, SacII, BstZ17I, ApaI 제한 부위를 함유하고,

이어서, pSCB-upmalS-Km-SMC 플라스미드를 BamHI 및 HindIII에 의해 제한하고, upmalS-Km-SMC 단편을 벡터 pUC18의 BamHI/HindIII 부위 내로 클로닝하여 벡터 pUC18-upmalS-Km-SMC를 수득하였다.

이어서, 하기 올리고뉴클레오티드, downmalS-F-1 (서열 21) 및 downmalS-R-2 (서열 22) (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)를 사용하여 MG1655 이. 콜라이 게놈 DNA로부터 downmalS 영역을 PCR 증폭시켰다. 이어서, 상기 PCR 생성물을 pSCB (스트라타진)에 클로닝하고, 생성된 플라스미드를 서열 분석하여 확인하고, pSCB-downmalS라 명명하였다.

downmalS-F-1 (서열 21)

여기서,

- 영역 (대문자)은 추가 염기를 포함하고,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 EcoRI 제한 부위를 함유하며,

- 영역 (소문자)은 malS 유전자의 하류 영역에 상동성이다 (3737020부터 3737044까지).

downmalS-R-2 (서열 22)

여기서,

- 영역 (대문자)은 추가 염기를 포함하고,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 EcoRI 제한 부위를 함유하며,

- 영역 (소문자)은 malS 유전자의 하류 영역에 상동성이다 (3738372부터 3738398까지).

이어서, pSCB-downmalS 플라스미드를 EcoRI에 의해 제한하고, downmalS 단편을 벡터 pUC18의 EcoRI 부위 내로 클로닝하여 벡터 pUC18-DmalS::SMC::Km을 수득하였다.

플라스미드

을 구축하기 위해, (진아트에 의해 합성된)

내 존재하는 (하기 기재된)

영역을 ApaI 및 BamHI에 의해 제한하고, 단편을 플라스미드 pUC18-DmalS::SMC::Km의 ApaI 및 BamHI 제한 부위 내로 서브클로닝하여 플라스미드

을 수득하였다. 이어서, 하기 올리고뉴클레오티드,

(서열 24) 및

(서열 25) (웹사이트 http://ecogene.org/ 및 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez? Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToS earch=10461&window=7553&begin=21516 상의 참조 서열)을 사용하여 벡터 pAR1219 (시그마)로부터

영역을 증폭시켰다. 이어서, PCR 생성물을 AvrII 및 BamHI에 의해 제한하고, 부분적으로 AvrII 및 BamHI에 의해 제한된

플라스미드 내로 클로닝하여

플라스미드를 수득하고, DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.

내 존재하는

영역 (서열 23):

여기서,

- 영역 (이탤릭체 소문자)은 제한 부위 ApaI, PacI, AvrII 및 BamHI를 함유하고,

- 영역 (밑줄체 대문자)은 TTadc 전사 종결인자 서열 (pSLO1 메가플라스미드 중 179847부터 179807까지에 상동성인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터 유래된 adc 유전자의 전사 종결인자)에 상동성이고 (TTadc),

- 영역 (대문자)은 일부 제한 부위 (이탤릭체 대문자) (CI857*)를 생성하거나, 또는 결실시키기 위한 목적으로 코돈 사용 빈도 변이를 포함하는 cI857 유전자에 상동성이며,

- 영역 (굵은체 대문자)은 -35 box의 변형을 통해 -35 컨센서스 (TTGACT → TTGACA)가 수득되는 것인 변이체 형태의 P_R의 *(-35) 버전 (PlambdaR*(-35))의 수득을 위해 1개 염기 (굵은 이탤릭체 대문자)를 제외하고는 람다 박테리오파지 P_R 프로모터에 상동성이고,

- 영역 (밑줄체 굵은체 대문자)은 리보솜 결합 부위 (RBS01)에 대한 것이며,

- 영역 (밑줄체 이탤릭체 대문자)은 BstZ17I 제한 부위 (SMC)를 함유하고,

- 영역 (밑줄체 소문자)은 T7Te 전사 종결인자 서열에 대한 것이다 (문헌 [Harrington et al., 2001 , PNAS, 98(9), 5019-24]) (TT07).

(서열 24)

여기서,

- 영역 (소문자)은 추가 염기를 포함하고,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 AvrII 제한 부위를 함유하며,

- 영역 (굵은체 대문자)은 P_R 프로모터의 PlambdaR03 돌연변이체 버전의 수득을 위해 2개 염기 (굵은 이탤릭체 대문자)를 제외하고는 람다 박테리오파지 P_R 프로모터에 상동성이고,

- 리보솜 결합 부위 (밑줄체 대문자)가 존재하며,

- 영역 (굵은체 소문자)은 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 유전자 (T7p07 유전자)의 5' 단부에 상동성이다 (3171부터 3198까지).

(서열 25)

여기서,

- 영역 (소문자)은 추가 염기를 포함하고,

- 영역 (이탤릭체 대문자)은 XhoI 및 BamHI 제한 부위를 함유하며,

- 영역 (굵은체 대문자)은 T7Te 전사 종결인자 서열에 대한 것이고 (문헌 [Harrington et al., 2001, PNAS, 98(9), 5019-24]),

- 영역 (밑줄체 이탤릭체 대문자)은 BstZ17I 제한 부위를 함유하며,

- 영역 (굵은체 소문자)은 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 유전자 (T7p07 유전자)의 3' 단부에 상동성이다 (5801부터 5822까지).

2.3.

영역에 의한 malS 영역의 대체

마지막으로, malS 영역을 결실시키고, 상기 영역을

영역으로 대체시키기 위해,

플라스미드를 ScaI 및 EcoRV에 의해 제한하고,

단편을 전기 천공에 의해 균주 MG1655 metA*11 (pKD46) 내로 도입하였는데, 여기서, 발현된 Red 리콤비나제 효소가 상동성 재조합을 허용한다. 이어서, 카나마이신 내성 형질전환체를 선별하고, 올리고뉴클레오티드 malS-F (서열 26), Km-R (서열 27), T7RNApol-F (서열 28) 및 malS-R (서열 29) (웹사이트 http://www.ecogene.org/ 및

및 문헌 [Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645] 상의 참조 서열)을 사용하여 PCR 분석을 수행함으로써

단편의 삽입을 확인하였다. 균주를

으로 지정하였다.

malS-F (서열 26):

(3734280부터 3734299까지의 malS 영역에 상동성이다).

Km-R (서열 27):

(pKD4 벡터의 카나마이신 내성 카세트에 상동성이다).

T7RNApol-F (서열 28):

(5274부터 5293까지의 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 유전자 (T7p07 유전자)에 상동성이다).

malS-R (서열 29):

(3738453부터 3738471까지의 malS 영역에 상동성이다).

중 malS 영역을 결실시키고, 상기 영역을

영역으로 대체시키기 위해,

구축물을 P1 파지 형질도입 (하기 참조)에 의해

균주로부터

균주로 전이시켰다. 카나마이신 및 클로람페니콜 내성 형질전환체를 선별하고, 앞서 기재된 올리고뉴클레오티드 malS-F (서열 26), Km-R (서열 27), T7RNApol-F (서열 28) 및 malS-R (서열 29)을 사용하여 PCR 분석을 수행함으로써

의 삽입을 확인하였다. 보유 균주를

로 지정하였다.

파지 용해물 P1의 제조:

- 밤새 배양된

배양물 100 ㎕를 카나마이신 (50 ㎍/mL), 글루코스 (0.2%) 및 CaCl₂ (5 mM)로 보충된 LB 10 mL 중에 접종하고,

- 진탕시키면서 30℃에서 1 h 동안 인큐베이션시키고,

- 균주 MG1655 상에서 제조된 파지 용해물 P1 (약 1.10⁹ 파지/mL) 100 ㎕를 첨가하고,

- 세포 모두가 용해될 때까지 30℃에서 3시간 동안 진탕시키고,

- 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고, 볼텍싱시키고,

- 4,500 g로 10 min 동안 원심분리시켜 세포 잔해물을 제거하고,

- 상청액을 멸균 튜브로 옮기고, 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고,

- 4℃에서 용해물을 보관하였다.

형질도입:

- LB 배지 중에서 밤새 배양된 균주

의 배양물 5 mL를 1,500 g로 10 min 동안 원심분리하고,

- 10 mM MgS0₄, 5 mM CaCl₂ 2.5 mL 중에 세포 펠릿을 현탁시키고,

- 대조군 튜브: 100 ㎕의 세포

의 파지 P1 100 ㎕

- 시험 튜브: 100 ㎕의 세포 +

의 파지 P1 100 ㎕,

- 진탕시키지 않고 30℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고,

- 각 튜브에 1 M 시트르산나트륨을 100 ㎕씩 첨가하고, 볼텍싱시키고,

- 1 mL의 LB를 첨가하고,

- 진탕시키면서 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고,

- 7,000 rpm으로 3 min 동안 튜브를 원심분리한 후, 카나마이신 (50 ㎍/mL)으로 보충된 LB 디쉬 상에 도말하고,

- 30℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.

4. 온도 의존성 메티오닌 생산 평가

사전 배양 및 배양 조건은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같다. 스펙티노마이신 대신 카나마이신을 사용하였다. 배양 온도는 30℃ 또는 34℃였다.

30 및 34℃에서 균주 2에 의해 생산된 메티오닌(g)/배치 배양물 중의 글루코스(g)의 백분율(%)인 메티오닌 수율 (Y_met). 메티오닌/글루코스의 수율에 대한 정확한 정의에 대해서는, 상기를 참조한다. SD는 3회 반복 수행하여 얻은 결과에 기초하여 계산된 수율에 대한 표준 편차를 나타낸다.
조건	Y _met	SD	N
균주 2 - 사전 배양 30℃ + 배양 30℃	6.7	0.1	3
균주 2 - 사전 배양 30℃ + 배양 34℃	9.9	0.4	3

thrA 및 cysE의 유도가 메티오닌의 생산량을 증가시켰다. HDH 및 SAT 두 활성을 분석함으로써 상기를 확인할 수 있었다. 34℃로의 이동시, 두 활성 모두 증가하였다.

실시예 III: 하기 실시예 IV 및 V에서 시험되는 열 유도성 균주의 구축

1. 프로토콜

메티오닌 생산 균주를 구축하는 데 수개의 프로토콜을 사용하였고, 이는 하기 실시예에 기재되어 있다.

프로토콜 1: 상동성 재조합에 의한 염색체 변형 및 재조합체 선별 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000])

문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기재된 바와 같이, 상동성 재조합에 의해 명시된 염색체 유전자좌에서 대립유전자 대체 또는 유전자 파괴를 수행하였다. Flp 인식 부위 측면에 위치하는 클로람페니콜 (Cm) 내성 cat, 카나마이신 (Km) 내성 kan, 겐타마이신 (Gt) 내성 gm 유전자 또는 테트라시클린 (Tc) 내성 tet는 주형으로서 각각 pKD3 또는 pKD4, p34S-Gm (문헌 [Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715]) 또는 pLOI2065 (문헌 [Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272]) 플라스미드를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 사용하여 λ Red (γ, β, 엑소) 리콤비나제를 발현하는 플라스미드 pKD46을 함유하는 수용자 이. 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 이어서, 항생제 내성 형질전환체를 선별하고, 표 2에 열거된 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수행함으로써 돌연변이화된 유전자좌의 염색체 구조를 확인하였다.

문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기재된 바와 같이, 플라스미드 pCP20을 사용하여 cat, kan, gm 및 tc-내성 유전자를 제거하되, 단, 예외적으로, pCP20 플라스미드를 함유하는 클론은 LB 상에서 37℃에서 배양한 후, 30℃에서의 항생제 내성 소실에 대해 시험하였다. 이어서, 표 2에 열거된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 항생제 감응성 클론을 확인하였다.

프로토콜 2: 파지 P1의 형질도입

P1 형질도입에 의해 주어진 이. 콜라이 수용자 균주에게 염색체 변형을 전달하였다. 본 프로토콜은 2 단계로 구성되었다: (i) 내성 관련 염색체 변형을 함유하는 공여자 균주 상에서 파지 용해물 제조, 및 (ii) 상기 파지 용해물에 의한 수용자 균주 감염.

파지 용해물 제조

- 밤새 배양된, 관심의 대상이 되는 염색체 변형을 포함하는 균주 MG1655의 배양물 100 ㎕를 Cm 30 ㎍/ml 또는 Km 50 ㎍/ml 또는 Gt 10 ㎍/mL 또는 Tet 10 ㎍/mL + 글루코스 0.2% + CaCl₂ 5 mM이 보충된 LB 10 mL 중에 접종하고,

- 진탕시키면서 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고,

- 공여자 균주 MG1655 상에서 제조된 P1 파지 용해물 (대략 1.10⁹ 파지/mL) 100 ㎕를 첨가하고,

- 세포 모두가 용해될 때까지 37℃에서 3시간 동안 진탕시키고,

- 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고, 볼텍싱시키고,

- 4,500 g로 10 min 동안 원심분리시켜 세포 잔해물을 제거하고,

- 상청액을 멸균 튜브로 옮기고,

- 4℃에서 용해물을 보관하였다.

형질도입

- LB 배지 중에서 밤새 배양된 이. 콜라이 수용자 균주의 배양물 5 mL를 1,500 g로 10 min 동안 원심분리하고,

- 10 mM MgS0₄, 5 mM CaCl₂ 2.5 mL 중에 세포 펠릿을 현탁시키고,

- 100 ㎕ 세포를, 염색체 상에 변형을 포함하는 균주 MG1655의 P1 파지 100 ㎕ (시험 튜브)로 감염시키고, 대조군 튜브로서 P1 파지를 포함하지 않는 100 ㎕ 세포, 및 세포를 포함하지 않는 100 ㎕ P1 파지를 두고,

- 진탕시키지 않으면서 30℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고,

- 1 mL의 LB를 첨가하고,

- 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고,

- 7,000 rpm으로 3 min 동안 원심분리하고,

- Cm 30 ㎍/ml 또는 Km 50 ㎍/ml 또는 Gt 10 ㎍/mL 또는 Tet 10 ㎍/mL가 보충된 LB 상에 플레이팅하고,

- 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.

이어서, 항생제 내성 형질도입체를 선별하고, 표 2에 열거된 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수행함으로써 돌연변이화된 유전자좌의 염색체 구조를 확인하였다.

메티오닌 생산 균주 3 (표 6)은 특허 출원 EP 10306164.4 및 US61/406249에 기재되어 있다. 상기 출원은 본 출원에 참고로 포함된다.

프로토콜 2에 따라, 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기재된

으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하여 균주 3 (표 6) 내로 특허 출원 EP10306164.4 및 US61/406249에 기재된

염색체 변형을 형질도입하였다.

클로람페니콜 내성 형질도입체를 선별하고,

(서열 30) 및

(서열 31) (표 7)을 사용하여 PCR에 의해

염색체 변형의 존재를 확인하였다. 생성된 균주

을 균주 4 (표 1)라고 명명하였다.

는 상기 기재된

및

, 하기 기재되는

및 pLOI2065 (문헌 [Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272])로부터 유도된 것이다.

는 상기 기재된

, pLOI2065 (문헌 [Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272]) 및 EP 10306164.4 및 US61/406249 특허 출원에 기재된

으로부터 유도된 것이다.

는 진아트 (http://www.geneart.com/)에 의해 합성된 플라스미드

및

로부터 유도된 것이다.

및

단편을 진아트로부터 입수한 플라스미드 pMA-RQ의 SfiI 부위로 클로닝하였고, 이는 각각 하기 서열을 함유하였다:

(서열 32)

- 밑줄체 소문자는 SfiI 및 AscI 제한 부위에 상응하고,

- 굵은체 소문자는 역 배향의 RBS01*2 서열 (TAAGGAGGTTATAA) 및 PsiI 제한 부위에 상응하며,

- 이탤릭체 대문자는 람다 박테리오파지 P_R 프로모터에 상동성이다 (PlambdaR*(-35), (문헌 [Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148])).

- 대문자는 뉴클레오티드 T67이 C67에 의해 변이됨으로써 1개의 아미노산 변이 Tyr23His를 생성한 것인 람다 박테리오파지의 리프레서 단백질 cI의 서열에 상응한다 (문헌 [Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148]). 상기 서열은 cI*1로 명명되었다.

- 굵은체 대문자는 역 배향의 TTadc 전사 종결인자 서열 (pSLO1 메가플라스미드 중 179847부터 179807까지에 상동성인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터 유래된 adc 유전자의 전사 종결인자)에 상동성이다.

- 밑줄체 대문자는 ApaI, PacI 및 SfiI에 상응한다.

(서열 33)

- 밑줄체 소문자는 SfiI 및 AscI 제한 부위에 상응하고,

- 대문자는 뉴클레오티드 196-CTTGCG-201이 196-GCGACA-201에 의해 변이됨으로써 2개의 아미노산 변이 Leu66Ala 및 Ala67Thr을 생성한 것인 람다 박테리오파지의 리프레서 단백질 cI의 서열에 상응한다 (문헌 [Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148]). 상기 서열은 cI*3으로 명명되었다.

- 밑줄체 대문자는 ApaI, PacI 및 SfiI에 상응한다.

를 구축하기 위해, 상기 기재된

로부터 정제된 XmnI/NsiI 단편

를 상기 기재된 플라스미드

의 XmnI와 NsiI 부위 사이에 클로닝하여 cI 단백질 리프레서의 야생형 대립유전자를 생성하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열 분석에 의해 확인하고,

라 명명하였다.

는 EP10306164.4 및 US61/406249 특허 출원에 기재된

및 상기 기재된

로부터 유도된 것이다.

을 구축하기 위해, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 큰 (클레노우(Klenow)) 단편으로 처리되고,

로부터 정제된 ApaI/PsiI 단편 TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)를

의 SfoI 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 제한에 의해 확인하고,

이라 명명하였다.

마지막으로,

를 구축하기 위해, 프라이머인 Ome 1836-HindIII-K7-FRT-Tc-F (서열 34) 및 Ome 1837-SmaI-BstZ17I-K7-FRT-Tc-R (서열 35)과 함께 주형으로서 pLOI2065를 사용하여 PCR에 의해 FRT-Tc-FRT 내성 카세트를 증폭시켰다.

Ome 1836-HindIII-K7-FRT-Tc-F (서열 34)

여기서,

- 밑줄체 대문자는 HindIII 제한 부위 및 추가 염기에 상응하고,

- 굵은체 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 FRT 서열에 상응하며 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]),

- 대문자 서열은 pLOI2065에 위치하는 테트라시클린 내성 유전자의 서열에 상동성이다 (문헌 [Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263- 6272]).

Ome 1837-SmaI-BstZ17I-K7-FRT-Tc-R (서열 35)

여기서,

- 밑줄체 대문자는 SmaI 및 BstZ17I 제한 부위 및 추가 염기에 상응하고,

FRT-Tc-FRT PCR 생성물을 BstZ17I 및 HindIII에 의해 분해하고, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 큰 (클레노우) 단편으로 처리하였다. 이어서, 생성된 단편을, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 큰 (클레노우) 단편으로 처리된 BstZ17I 및 PacI 사이에 클로닝하였다. 선별된 플라스미드는 pUC18 플라스미드의 amp 내성 카세트와 동일한 배향의 tc 내성 카세트를 가지며, 이를 DNA 서열 분석에 의해 확인하고,

로 명명하였다.

단편을 구축하기 위해, yjbI의 상류 영역 (upyjbI), TT02 전사 종결인자, 다중 클로닝 부위 (MCS), 및 yjbI의 하류 영역 (downyjbI) 사이의 중복 PCR을 수행하였다.

먼저, 프라이머인

(서열 36) 및

(서열 37)을 사용하여 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 단편 upyjbI-TT02-MCS를 증폭시켰다. 이어서, 프라이머인

(서열 38) 및

(서열 39)을 사용하여 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 TT02-MCS-downyjbI 단편을 증폭시켰다. 프라이머

(서열 37) 및

(서열 38)은 36개 뉴클레오티드 길이의 영역이 중복되도록 디자인된 것이었다. 마지막으로, upyjbI-TT02-MCS 및 TT02-MCS-downyjbI 앰플리콘을 혼합하고, 프라이머인

(서열 36) 및

(서열 39)을 사용하여 upyjbI-TT02-MCS-downyjbI 단편을 증폭시켰다. 생성된 융합 PCR 생성물을 SfoI에 의해 분해하고, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 큰 (클레노우) 단편으로 처리된, 상기 기재된

의 EcoRI 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열 분석에 의해 확인하고,

라 명명하였다.

(서열 36)

여기서,

- 밑줄체 대문자는 SfoI 및 KpnI 제한 부위 및 추가 염기에 상응하고,

- 대문자 서열은 yjbI 유전자의 상류쪽 서열에 상동성이다 (4247987- 4248009, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

(서열 37)

여기서,

- 밑줄체 대문자 서열은 BstZ17I 제한 부위 및 다중 클로닝 부위의 시작점을 위한 것이고,

- 대문자 서열은 이. 콜라이 rrnB의 전사 종결인자 T₁에 상응하며 (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9]),

- 굵은체 대문자 서열은 yjbI 유전자의 하류쪽 서열에 상동성이다 (4248931-4248980, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

(서열 38)

여기서,

- 대문자 서열은 이. 콜라이 rrnB의 전사 종결인자 T1에 상응하고 (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9]),

- 굵은체 대문자 서열은 다중 클로닝 부위: BstZ17I, HindIII, AvrII, ApaI, PacI를 함유하며,

- 밑줄체 대문자 서열은 yjbI 유전자의 하류쪽 서열에 상동성이다 (4250286-4250335, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

(서열 39)

여기서,

- 대문자 서열은 yjbI 유전자의 상류쪽 서열에 상동성이다 (4251224- 4251249, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

를 구축하기 위해,

로부터 정제된 BstZ17I/SmaI 단편

를 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 큰 (클레노우) 단편으로 처리된

의 PacI/BstZ17I 부위 사이에 클로닝하였다. 선별된 플라스미드는 pUC18 플라스미드의 amp 내성 카세트와 동일한 배향의 tc 내성 카세트를 가지며, 이를 DNA 서열 분석에 의해 확인하고,

라 명명하였다.

yjbI 유전자를

영역으로 대체하기 위해,

를 AhdI 및 KpnI 제한 효소에 의해 분해하고, 프로토콜 1에 따라 남은 분해된 단편

를 균주 MG1655 metA*11 pKD46 내로 도입하였다.

테트라시클린 내성 재조합체를 선별하고, 프라이머인

(서열 40),

(서열 41),

(서열 42), 및

(서열 43) (표 7)를 사용한 PCR 및 DNA 서열 분석에 의해

염색체 변형의 존재를 확인하였다. 확인된 선별된 균주를

라 명명하였다.

3.3.

의 균주 4로의 형질도입

프로토콜 2에 따라, 상기 기재된

로부터의 P1 파지 용해물을 사용하여 상기 기재된 균주 4 (표 6) 내로

염색체 변형을 형질도입시켰다. 테트라시클린 내성 형질도입체를 선별하고,

(서열 40),

(서열 41),

(서열 42), 및

(서열 43) (표 2)를 사용하여 PCR에 의해

염색체 변형의 존재를 확인하였다.

를 균주 5라 명명하였다 (표 6).

는 하기 기재되는

및

로부터 유도된 것이다.

는 상기 기재된

및

으로부터 유도된 것이다.

플라스미드

를 구축하기 위해, 프라이머인 BstZ17I-FRT-Gt-F (서열 44) 및 HindIII-FRT-Gt-R (서열 45)과 함께 주형으로서의 p34S-Gm을 사용하여 FRT-Gt-FRT 내성 카세트를 PCR에 의해 증폭시켰다.

BstZ17I-FRT-Gt-F (서열 45)

여기서,

- 밑줄체 대문자 서열은 SmaI 및 BstZ17I 제한 부위 및 추가 염기를 위한 것이고,

- 굵은체 대문자 서열은 FRT 서열에 상응하며 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]),

- 대문자 서열은 p34S-Gm에 위치하는 겐타마이신 유전자의 서열에 상동성이다 (문헌 [Dennis et Zyltra, AEM July 1998, p 2710-2715]).

HindIII-FRT-Gt-R (서열 45)

여기서,

- 밑줄체 대문자 서열은 HindIII 제한 부위 및 추가 염기를 위한 것이고,

- 굵은체 대문자 서열은 FRT 서열에 상응하며 (문헌 [Datsenko, K.A. &

Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]),

FRT-Gt-FRT PCR 생성물을 BstZ17I 및 HindIII에 의해 분해하고, EP10306164.4 및 US61/406249 특허 출원에 기재된

의 BstZ17I 및 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열 분석에 의해 확인하고,

라 명명하였다.

를 구축하기 위해, 상기 기재된

로부터 정제된 StuI/BsrBI 단편

의 EcoRI 부위 사이로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 서열 분석에 의해 확인하고,

라 명명하였다.

마지막 플라스미드

를 구축하기 위해, 상기 기재된,

으로부터 정제된 ApaI/BamHI 단편

을

의 ApaI/BamHI 부위 사이로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 서열 분석에 의해 확인하고,

라 명명하였다.

단편을 구축하기 위해, melB의 상류 영역 (upmelB), TT02 전사 종결인자, 다중 클로닝 부위 (MCS) 및 melB의 하류 영역 (downmelB) 사이에서 중복 PCR을 수행하였다.

먼저, 프라이머인

(서열 46) 및

(서열 47)을 사용하여 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 단편 upmelB-TT02-MCS를 PCR에 의해 증폭시켰다. 이어서, 프라이머인

(서열 48) 및

(서열 49)을 사용하여 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 TT02-MCS-downmelB 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머

(서열 47) 및

(서열 48)는 36개 뉴클레오티드 길이의 영역이 중복되도록 디자인된 것이었다. 마지막으로, upmelB-TT02-MCS 및 TT02-MCS-downmelB 앰플리콘을 혼합하고, 프라이머인

(서열 46) 및

(서열 49)을 사용하여 upmelB-TT02-MCS-downmelB 단편을 증폭시켰다. 생성된 융합 PCR 생성물을 SfoI에 의해 분해하고, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 큰 (클레노우) 단편으로 처리된, 상기 기재된

라 명명하였다.

(서열 46)

여기서,

- 대문자 서열은 melB 유전자의 상류쪽 서열에 상동성이다 (4340489-4340513, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

Ome 1842 (SMC-TT02-DmelB amont-R) (서열 47)

여기서,

- 대문자 서열은 이. 콜라이 rrnB의 전사 종결인자 T1에 상응하며 (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9]),

- 굵은체 대문자 서열은 melB 유전자의 하류쪽 서열에 상동성이다 (4341377-4341406, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

Ome 1843 (TT02-SMC-DmelB aval-F) (서열 48)

여기서,

- 굵은체 대문자 서열은 다중 클로닝 부위: BstZ17I, HindIII, AvrII, ApaI, BamHI를 함유하며,

- 밑줄체 대문자 서열은 melB 유전자의 하류쪽 서열에 상동성이다 (4342793-4342818, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

Ome 1844 (SfoI-KpnI-DmelB aval-R) (서열 49)

- 대문자 서열은 melB 유전자의 상류쪽 서열에 상동성이다 (4343694-4343719, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

를 구축하기 위해, 상기 기재된,

로부터 정제된 BstZ17I/BamHI 단편

를 상기 기재된 플라스미드

의 BstZ17I/BamHI 부위 사이로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 서열 분석에 의해 확인하고,

라 명명하였다.

melB 유전자를

영역으로 대체하기 위해,

를 AhdI 및 SphI 제한 효소에 의해 분해하고, 프로토콜 1에 따라 남은 분해된 단편

를 균주 MG1655 metA*11 pKD46 내로 도입하였다.

겐타마이신 내성 재조합체를 선별하고, 프라이머인

(서열 50) 및

(서열 51) (표 7)을 사용하여 PCR에 의해 및 DNA 서열 분석에 의해

염색체 변형의 존재를 확인하였다. 확인된 선별된 균주를

라 명명하였다.

의 균주 5로의 형질도입

프로토콜 2에 따라, 상기 기재된

로부터의 P1 파지 용해물을 사용하여 상기 기재된 균주 5 (표 6) 내로

염색체 변형을 형질도입시켰다.

겐타마이신 내성 형질도입체를 선별하고,

(서열 50) 및

(서열 51) (표 7)을 사용하여 PCR에 의해

염색체 변형의 존재를 확인하였다. 생성된 균주

를 균주 6이라 명명하였다.

프로모터 염색체 변형

(WO2007/077041 및 WO2009/043803 특허 출원에 기재되어 있다), 및

유전자 결실 (WO2007/077041, WO2009/043803 및 WO2005/111202 특허 출원에 기재되어 있다)을 프로토콜 2에 따라, WO2005/111202에 기재되어 있는, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감응성이 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 metA*11 대립유전자를 함유하는 균주 내로 형질도입시켰다.

균주를 구축하는 동안 각각의 염색체 변형 또는 결실과 관련이 있는 내성 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거하였다.

프로토콜 2에 따라, EP10306164.4 및 US61/406249 특허 출원에 기재된 균주

으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하여 균주

내로

염색체 변형을 형질도입시켰다.

카나마이신 내성 형질도입체를 선별하고, 프라이머인 Ome 0826-malS-F (서열 52) 및 Ome 0827-malS-R (서열 53) (표 7)을 사용하여 PCR에 의해

염색체 변형의 존재를 확인하였다. 생성된 균주는 유전자형

을 가졌다.

마지막으로, 프로토콜 1에 따라 상기 균주의 카나마이신 내성을 제거하였다. 프라이머인 Ome 0826-malS-F (서열 52) 및 Ome 0827-malS-R (서열 53)을 사용하여 PCR에 의해 카나마이신 내성 카세트의 소실을 확인하였다. 생성된 균주

를 균주 7로 명명하였다.

플라스미드

플라스미드는 본 특허 출원 실시예 2에 기재된 플라스미드

로부터 유도된 것이다.

플라스미드

를 구축하기 위해, 프라이머인

(서열 54) 및

(서열 55)를 사용하여 플라스미드

를 증폭시켰다. HpaI/NheI 분해된

단편을 본 특허 출원 실시예 2에 기재된 플라스미드

의 HpaI 및 NheI 부위 사이로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열 분석에 의해 확인하고,

라 명명하였다.

(서열 54)

여기서,

- 밑줄체 대문자 서열은 SfoI, HpaI 및 AvrII 제한 부위 및 추가 염기에 상응하고,

- 굵은체 대문자 서열은 짧은 형태의 람다 박테리오파지 P_L 프로모터 (P_L1 문헌 [Giladi et al, FEMS Microbiol Rev. 1995 Aug; 17(1-2): 135-40])에 상응하고, -10 박스에 돌연변이를 함유한다 (문헌 [Kincade & deHaseth, Gene. 1991 Jan 2;97(1):7-12]에 기재된 G-12T). 상기 프로모터를 PL1*1이라 명명한다.

- 소문자는 PL1*1의 전사 출발 부위와 리보솜 결합 부위 RBS01*2를 이격화시키는 5개의 염기이며,

-이탤릭체 대문자는 RBS01*2 서열에 상응하고,

- 밑줄체 대문자 서열은 thrA*1 유전자에 상동성이다 (337-354, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

(서열 55)

이는 cysE 유전자에 상동성이다 (3780360-3780378, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열).

상기 기재된

를 전기천공에 의해 균주 7 (표 6) 내로 도입하였다. 플라스미드

의 존재를 확인하고,

을 균주 8로 명명하였다.

실시예 IV: 균주 3, 4, 5 및 6의 온도 의존성 메티오닌 생산 평가

작은 엘렌마이어 플라스크에서 생산 균주를 평가하였다. 5.5 mL의 사전 배양물을 21시간 동안 혼합 배지 (2.5 g.L^-1 글루코스 및 90% 최소 배지 PC1을 함유하는 10% LB 배지 (시그마 25%)) 중에서 성장시켰다. 이를 사용하여 배지 PC1 중에 OD₆₀₀=0.2로 50 mL 배양물을 접종하였다. 필요할 경우, 겐타마이신을 10 mg.L^-1의 농도로, 클로람페니콜을 30 mg.L^-1의 농도로, 및 테트라시클린을 5 mg.L^-1의 농도로 첨가하였다. 배양물의 OD₆₀₀이 5 내지 7에 도달하였을 때, OPA/Fmoc 유도체화 후, HPLC에 의해 세포외 아미노산을 정량하고, 굴절 검출 (유기산 및 글루코스)을 이용한 HPLC, 및 실릴화 후 GC-MS를 통해 다른 관련 대사산물을 분석하였다.

배양 및 사전 배양 조건은 하기 표에 제시되어 있다. 사전 배양물은 30℃ 또는 37℃에서 성장시켰다. 배양물은 30℃ 또는 37℃, 또는 37℃에서 2시간 동안 성장시킨 후, 42℃에서 2시간 동안 성장시키고, 마지막으로 배양물의 휴지를 위해 37℃에서 성장시켰다.

표 9에 제시된 바와 같이, 배양 공정 동안 유전자 thrA*1 및 cysE의 열 유도성 발현이 메티오닌의 생산량을 증가시켰다. 배양 공정 동안 내내 구성적 발현을 통해서는 낮은 메티오닌 수율을 얻었다.

최적의 메티오닌 생산을 위해, 최상의 배양 조건은 사전 배양을 30℃에서 수행한 후, 배양을 37℃ (2h), 42℃ (2h), 37℃에서 수행하는 것이었다. 상기와 같은 조건하에 균주 3은 메티오닌을 9.2%의 수율로 생산하였다.

균주 4, 5 및 6 모두를 최적의 메티오닌 생산 조건하에서 배양하였다.

표 10에 제시된 바와 같이, 배양 공정 동안 유전자 thrA*1 및 cysE의 열 유도성 발현은 유도성 프로모터에 의해 제어되는 유전자의 카피수에 비례하여 생산을 증가시켰다. 실제로, Plambda 프로모터의 제어하의, 7 카피의 thrA*1을 가지는 균주 6 (표 6 참조)은 균주 5 (6 카피의 thrA*1) 및 4 (5 카피)보다 더 높은 수율로 메티오닌을 생산하였다.

정확하게 말하면, 균주 5 및 6은 37℃의 일정한 온도에서는 성장할 수 없다는 점이 주목할 만하다. 결론적으로, 이러한 결과를 통해 열 유도는 생산에 유익할 뿐만 아니라, 상기와 같은 사례에서도 필수적이다는 것이 입증된다.

thrA*1 및 cysE 유전자의 열 유도성 발현을 확인하기 위해, 조 추출물 중에서 상응하는 효소의 활성을 측정하였다.

시험관내 효소 활성을 측정하기 위해, 상기 기재된 최소 배지 중에서 이. 콜라이 균주를 배양하고, 대수 성장기 종결시 원심분리에 의해 수거하였다. EDTA와 함께 프로테아제 억제제 칵테일 정제를 함유하는 20 mM의 저온 인산칼륨 완충제 (pH 7.2) 중에 펠릿을 재현탁시켰다. 이어서, 프리셀리스(Precellys) 시스템 (베르탱 테크놀로지스(Bertin Technologies))을 사용하여 비드 비팅시켜 세포를 1x30 s 동안 6,500 rpm으로 용해시킨 후, 30분 동안 12,000 g (4℃)로 원심분리시켰다. 상청액을 탈염시키고, 분석을 위해 사용하였다. 브래드포드(Bradford) 검정용 시약 (문헌 [Bradford, 1976])을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.

시험관내 HDH 활성 (호모세린 데히드로게나제, thrA*1에 의해 코딩)을 측정하기 위해, 100 mM 트리스-HCl(pH 9), 150 mM KCl, 1 mM NADP+ 및 25 mM L-호모세린 중에서 15 ㎍의 세포 조 추출물을 검정하였다. 340 nm에서 30분 동안 분광광도측정법에 따라 L-호모세린의 존재하의 NADP+ 환원을 모니터링하였다.

CoA와 DTNB의 반응에 기인하여 408 nm에서 10분 동안 TNB의 흡광도를 측정함으로써 25℃에서 분광광도측정법에 따라 SAT 활성 (세린 아세틸 트랜스퍼라제, cysE에 의해 코딩)을 검정하였다. 반응은 80 mM 인산칼륨 (pH 7.5), 2 mM 아세틸-coA, 30 mM 세린 및 0,1 mM DTNB 중 2 ㎍의 조 추출물을 통해 수행되었다.

표 11에서는 유도시 HDH 및 SAT 활성이 증가하는 것으로 나타났다. thrA*1 및 cysE의 구성적 발현시 HDH 및 SAT 활성 수준은 비유도성 조건과 유도성 조건 사이 정도였고, 이는 메티오닌 수율이 보다 낮은 것을 부분적으로 설명한다. 결론적으로, 이러한 결과를 통해 thrA*1 및 cysE의 유도가 실제로 메티오닌 수율을 증가시키는 데 유익하다는 것이 입증된다.

균주 4, 5 및 6에 대해서도 동일한 방식으로, HDH 및 SAT 활성은 유도시 증가하였다. 활성은 염색체 상에 통합된 유전자 thrA*1 및 cysE의 카피수에 비례하여 증가하였다 (데이터는 나타내지 않음).

실시예 V: 균주 8의 온도 의존성 메티오닌 생산 평가

실시예 IV에 기재된 바와 같이 작은 엘렌마이어 플라스크에서 균주 8을 평가하였다. 이를 균주 3과 비교하였다.

표 12에 제시된 바와 같이, 구축물

를 수반하는 균주 8의 경우, 유도시 메티오닌 생산은 4 카피의 구축물

를 수반하는 균주 3 정도로 양호하였다.

OPA/Fmoc 유도체화 후, HPLC에 의해 세포외 메티오닌 농도를 정량하였다. 굴절 검출을 이용한 HPLC를 통해 잔류 글루코스 농도를 분석하였다. 메티오닌 수율은 하기와 같이 표현하였다.

PL1*1 유도성 프로모터에 의해 제어되는 thrA*1 및 cysE 유전자의 열 유도성 발현을 확인하기 위해, 실시예 IV에 기재된 바와 같은 조 추출물 중에서 상응하는 효소의 활성을 측정하였다.

표 13에서 알 수 있는 바와 같이, 균주 8의 HDH 및 SAT 활성은 균주 3의 것과 유사하였다. 그 결과,

로부터의 유도는 4 카피의

로부터의 유도와 적어도 등가인 정도였다.

참조 문헌

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Sequence <220> <223> ApaI-TTadc-CI857-F-1 oligonucleotide <400> 5 accttgccga gggccctaaa aataagagtt accttaaatg gtaactctta ttttttttat 60 cagccaaacg tctcttcagg cc 82 <210> 6 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlambdaR-thrA-R-2 oligonucleotide <400> 6 caacactctc atatgacctc cttagtacat gcaaccatta tcaccgccag aggtaaaatt 60 gtcaacacgc acggtgttag atatttatcc cttgc 95 <210> 7 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlambdaR-thrA-F-3 oligonucleotide <400> 7 gcatgtacta aggaggtcat atgagagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg 60 c 61 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cysE-R-4 oligonucleotide <400> 8 agcttgcatg cctgcaggtc g 21 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SmaI-PgapA-F oligonucleotide <400> 9 acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33 <210> 10 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgapA-metA*11-R oligonucleotide <400> 10 ggcgggtagc tcgtccggca cacgaatcgg catatattcc accagctatt tgttagtgaa 60 taaaagg 67 <210> 11 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgapA-metA*11-F oligonucleotide <400> 11 ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgccg attcgtgtgc cggacgagct 60 acccgcc 67 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI-metA*11-R oligonucleotide <400> 12 acgtggatcc gaattccgac tatcacagaa gattaatcca gcgttgg 47 <210> 13 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SnaBI-thrA-SMC-cysE-F oligonucleotide <400> 13 tgctacgtac cctctcatgg aagttaggag tctgagctag ctagtccgct cgagatacga 60 aagaagtccg cgaactgg 78 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cysE-R oligonucleotide <400> 14 caaccagtga ccgatgcg 18 <210> 15 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SfoI-PT7-RBST7-NdeI-thrA-F oligonucleotide <400> 15 ggcgcctcga ttcgaacttc tgatagactt cgaaattaat acgactcact atagggagac 60 cacaacggtt tccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatga 120 gagtgttgaa gttcggcgg 139 <210> 16 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> metA-T7T?-SfoI-R oligonucleotide <400> 16 ggcgcccttt cagcaaaaaa cccctcaaga cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta 60 gttattgctc agcggtggca gcagccaact cagcttcctt tcgggctttg ttagttaatc 120 cagcgttgga ttcatgtgc 139 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIII-upmalS-F-1 oligonucleotide <400> 17 atcgtaaagc ttttcacttt acctggcgca ttgg 34 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> upmalS-Km-R-2 oligonucleotide <400> 18 ctaaggagga tattcatatg accggttcgg cggcgttctg gatgg 45 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> upmalS-Km-F-3 oligonucleotide <400> 19 ccatccagaa cgccgccgaa ccggtcatat gaatatcctc cttag 45 <210> 20 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Km-SMC-R-4 oligonucleotide <400> 20 gatcgatgga tccatctcga gatccgcgga tgtatacatg ggccctgtag gctggagctg 60 cttcg 65 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> downmalS-F-1 oligonucleotide <400> 21 atgctgaatt caccggtgaa gcctggggcc acggcg 36 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> downmalS-R-2 oligonucleotide <400> 22 tacgatgaat tcgggacgcc ataagcgtta tcaatcacc 39 <210> 23 <211> 925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01-SMC-TT07 <400> 23 gggccctaaa aataagagtt accttaaatg gtaactctta ttttttttat taattaacct 60 aggtcagcca aacgtctctt caggccactg actagcgata actttcccca caacggaaca 120 actctcattg catgggatca ttgggtactg tgggtttagt ggttgtaaaa acacctgacc 180 gctatccctg atcagtttct tgaaggtaaa ctcatcaccc ccaagtctgg ctatgcagaa 240 atcacctggc tcaacagcct gctcagggtc aacgagaatt aacattccgt caggaaagct 300 tggcttggag cctgttggtg cggtcatgga attaccttca acctcaagcc agaatgcaga 360 atcactggct tttttggttg tgcttaccca tctctccgca tcacctttgg taaaggttct 420 aagcttaggt gagaacatcc ctgcctgaac atgagaaaaa acagggtact catactcact 480 tctaagtgac ggctgcatgc taaccgcttc atacatctcg tagatttctc tggcgattga 540 agggctaaat tcttcaacgc taactttgag aatttttgta agcaatgcgg cgttgtaagc 600 atttaatgca ttgatgccat taaataaagc accaacgcct gactgcccca tccccatctt 660 gtctgcgaca gattcctggg ataagccaag ttcatttttc tttttttcat aaattgcctt 720 aaggcgacgt gcgtcctcaa gctgctcttg tgttaatggt ttcttttttg tgctcatcct 780 aggaatctat caccgcaagg gataaatatc taacaccgtg cgtgttgaca attttacctc 840 tggcggtgat aatggttgca tgtactaagg aggttataag tatactcaca ctggctcacc 900 ttcgggtggg cctttctgcg gatcc 925 <210> 24 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvrII-PlambdaR03-RBS01-T7RNApol-F oligonucleotide <400> 24 ctcatcctag gaatctatca ccgcaaggga taaatatcta acaccgtgcg tgttgatcat 60 tttacctctg gcggtgataa tggttgcatg tactaaggag gttataaatg aacacgatta 120 acatcgctaa gaacg 135 <210> 25 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7RNApol-BstZ17I-TT07-BamHI-XhoI-R oligonucleotide <400> 25 cggccagctc gagcgcggat ccgcagaaag gcccacccga aggtgagcca gtgtgagtat 60 acttacgcga acgcgaagtc cgac 84 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> malS-F oligonucleotide <400> 26 gcaccaacaa cgcttcaggc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Km-R oligonucleotide <400> 27 tgtaggctgg agctgcttcg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7RNApol-F oligonucleotide <400> 28 gctgctaagc tgctggctgc 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> malS-R oligonucleotide <400> 29 ggaaagactc atgcacagc 19 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ome1707-DwcaM-verif-F <400> 30 gccgttcaac actggctgga cg 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 31 tgccattgca ggtgcatcgc 20 <210> 32 <211> 914 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pMA-RQ-TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)-RBS01*2 <400> 32 ggccgtcaag gccgcatggc gcgccttata acctccttag tacatgcaac cattatcacc 60 gccagaggta aaattgtcaa cacgcacggt gttagatatt tatcccttgc ggtgatagat 120 ttaacgtatg agcacaaaaa agaaaccatt aacacaagag cagcttgagg acgcacgtcg 180 ccttaaggca attcatgaaa aaaagaaaaa tgaacttggc ttatcccagg aatctgtcgc 240 agacaagatg gggatggggc agtcaggcgt tggtgcttta tttaatggca tcaatgcatt 300 aaatgcttac aacgccgcat tgcttgcgaa aattctcaaa gttagcgttg aagaatttag 360 cccttcaatc gccagagaaa tctacgagat gtatgaagcg gttagcatgc agccgtcact 420 tagaagtgag tatgagtacc ctgttttttc tcatgttcag gcagggatgt tctcacctga 480 acttagaacc tttaccaaag gtgatgcgga gagatgggta agcacaacca aaaaagccag 540 tgattctgca ttctggcttg aggttgaagg taattccatg accgcaccaa caggctccaa 600 gccaagcttt cctgacggaa tgttaattct cgttgaccct gagcaggctg ttgagccagg 660 tgatttctgc atagccagac ttgggggtga tgagtttacc ttcaagaaac tgatcaggga 720 tagcggtcag gtgtttttac aaccactaaa cccacagtac ccaatgatcc catgcaatga 780 gagttgttcc gttgtgggga aagttatcgc tagtcagtgg cctgaagaga cgtttggctg 840 ataaaaaaaa taagagttac catttaaggt aactcttatt tttagggccc ttaattaact 900 gggcctcatg ggcc 914 <210> 33 <211> 914 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pMA-RQ-TTadc-CI*3-PlambdaR*(-35)-RBS01*2 <400> 33 ggccgtcaag gccgcatggc gcgccttata acctccttag tacatgcaac cattatcacc 60 gccagaggta aaattgtcaa cacgcacggt gttagatatt tatcccttgc ggtgatagat 120 ttaacgtatg agcacaaaaa agaaaccatt aacacaagag cagcttgagg acgcacgtcg 180 ccttaaggca atttatgaaa aaaagaaaaa tgaacttggc ttatcccagg aatctgtcgc 240 agacaagatg gggatggggc agtcaggcgt tggtgcttta tttaatggca tcaatgcatt 300 aaatgcttac aacgccgcat tggcgacaaa aattctcaaa gttagcgttg aagaatttag 360 cccttcaatc gccagagaaa tctacgagat gtatgaagcg gttagcatgc agccgtcact 420 tagaagtgag tatgagtacc ctgttttttc tcatgttcag gcagggatgt tctcacctaa 480 gcttagaacc tttaccaaag gtgatgcgga gagatgggta agcacaacca aaaaagccag 540 tgattctgca ttctggcttg aggttgaagg taattccatg accgcaccaa caggctccaa 600 gccaagcttt cctgacggaa tgttaattct cgttgaccct gagcaggctg ttgagccagg 660 tgatttctgc atagccagac ttgggggtga tgagtttacc ttcaagaaac tgatcaggga 720 tagcggtcag gtgtttttac aaccactaaa cccacagtac ccaatgatcc catgcaatga 780 gagttgttcc gttgtgggga aagttatcgc tagtcagtgg cctgaagaga cgtttggctg 840 ataaaaaaaa taagagttac catttaaggt aactcttatt tttagggccc ttaattaact 900 gggcctcatg ggcc 914 <210> 34 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 34 gcccaagctt tgtaggctgg agctgcttcg aagttcctat actttctaga gaataggaac 60 ttcggaatag gaaccggatc aattcatcgc gcgtc 95 <210> 35 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 35 tcccccgggg tataccatat gaatatcctc cttagttcct attccgaagt tcctattctc 60 tagaaagtat aggaacttcg aattgtcgac aagctagctt gc 102 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 36 cgtaggcgcc ggtaccgagt gcagatcggc tggaaggcg 39 <210> 37 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 37 gcttgtatac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt tcgttttatt 60 tgatgcattt ctgtagaatt ttacacttat agtatcatta ctgattgaga cttca 115 <210> 38 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 38 agactgggcc tttcgtttta tctgttgtat acaagcttta cctagggccc ttaattaaat 60 aatgaataag ggtgtttaag taaaggaaaa catcaccgtt cctggcat 108 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 39 cgtaggcgcc ggtacccagc ataatcattc accacacatc cg 42 <210> 40 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 40 tcccccgggg tatactgtag gctggagctg cttcgaagtt cctatacttt ctagagaata 60 ggaacttcgg aataggaact tcatttagat gggtaccgag ctcgaattg 109 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 41 cagaccaccc aactggcgac c 21 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 42 gccattggaa tcgaccagcc 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 43 ggttgctggc gcctatatcg c 21 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 44 gcctggtgga gtttaatgat gtcgc 25 <210> 45 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 45 cccaagcttc atatgaatat cctccttagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa 60 gtataggaac ttcggcgcgg atgggtaccg agctcgaatt g 101 <210> 46 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 46 cgtaggcgcc ggtaccgacc tcaatatcga cccagctacg c 41 <210> 47 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 47 gcttgtatac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt tcgttttatt 60 tgatgcattg aaatgctcat agggtatcgg gtcgc 95 <210> 48 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 48 agactgggcc tttcgtttta tctgttgtat acaagcttaa ttaacctagg gcccgggcgg 60 atccgtgagt gatgtgaaag cctgacgtgg 90 <210> 49 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 49 cgtaggcgcc ggtacccgaa ctgcactaag taacctcttc gg 42 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 50 gccgattttg tcgtggtggc 20 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 51 gccggttatc catcaggttc ac 22 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 52 ggtattccac gggatttttc gcg 23 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 53 cgtcagtaat cacattgcct gttgg 25 <210> 54 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 54 tgccggcacg gcgccaagtt aaccctaggt tatctctggc ggtgttgaca taaataccac 60 tggcggttat actgagcaca tcaactaagg aggttataaa tgagagtgtt gaagttcg 118 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 55 ccgggtcagc ggcgtaggc 19

Claims

- 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 변형된 미생물을 배양하는 단계; 및
- 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계
를 포함하며, 여기서, 상기 변형된 미생물에서 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있는 것인, 발효 공정에서 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 직접적인 제어하에 있는 것인 방법.
제2항에 있어서, 유도성 프로모터가 물리적 또는 화학적 자극에 의해 유도되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 유도성 프로모터가 물리적 자극에 의해 유도되고, 상기 유도성 프로모터는 온도 유도성 프로모터 또는 광 유도성 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
제4항에 있어서, 온도 유도성 프로모터가 파지 람다의 변형된 리프레서에 의해 조절되는 프로모터, 프로모터 PR 또는 PR의 유도체, 프로모터 PL 또는 PL의 유도체 및 온도 감응성 Lac 리프레서에 의해 조절되는 변형된 lac 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 파지 람다의 변형된 리프레서가 람다 리프레서 대립유전자 cI857 또는 람다 리프레서 cI의 임의의 다른 온도 불안정성 대립유전자인 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 변형된 미생물에서 유전자 recA가 결실된 것인 방법.
제3항에 있어서, 유도성 프로모터가 화학적 자극에 의해 유도되고, 상기 자극은
- 탄소 이화대사산물 억제 변화;
- 특정 탄소 공급원의 존재, 또는
- 당 알콜의 존재로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자가 이종성 유도성 프로모터의 간접적인 제어하에 있고, 상기 유전자는 이종성 RNA 폴리머라제에 의해 전사되고, 그의 발현은 유도성 프로모터의 제어하에 있는 것인 방법.
제9항에 있어서, 이종성 RNA 폴리머라제가 T7 및 T3 폴리머라제로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 발현이 이종성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있는 것인 적어도 하나의 유전자가 cysK, cysZ, cysN, cysD, cysC, cysZ, sbp, ppc, pps, pyc, acs, metA, metB, metC, metE, metF, metH, metK, metL, asd, aspC, lysC, pykA, pykF, purU, 오페론 cysPUWAM, cysJIH 및 gcvTHP, serA, serB, serC, lpd, glyA, ackA, pta, aceE, aceF, lpd, sucC, sucD, pck, maeB, poxB, ilvB, ilvN, ilvG, ilvM, ilvI, ilvH, aroF, aroG, aroH, thrB, thrC, sdaA, sdaB, sped, speC, astA, dapA, mdh, mqo, gltA, aceE, aceF로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자: thrA, cysE, metA 중 적어도 하나의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있는 것인 방법.
제12항에 있어서, 유전자 thrA, cysE 및 metA가 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있는 것인 방법.
변형된 미생물에서 메티오닌 생산에 관여하는 적어도 하나의 유전자의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 직접 또는 간접적인 제어하에 있는 것인, 개선된 메티오닌 생산을 위해 변형된 미생물.
제14항에 있어서, 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 변형 중 적어도 하나를 포함하는 미생물.