CN111996206B

CN111996206B - 光控无细胞蛋白质合成方法、该方法使用的质粒以及使用该方法的产品

Info

Publication number: CN111996206B
Application number: CN202010566049.9A
Authority: CN
Inventors: 卢元; 杨俊祝
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2040-06-19
Also published as: CN111996206A

Abstract

本申请涉及一种质粒，其包括：光敏蛋白的基因；能够对所述光敏蛋白作出响应的启动子；与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因或与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路；本申请另外还涉及该质粒的用途，基于该用途的产品以及光控无细胞合成蛋白质的方法。

Description

光控无细胞蛋白质合成方法、该方法使用的质粒以及使用该方法的产品

技术领域

本申请属于生物反应系统领域，具体涉及光控无细胞蛋白质合成方法以及该方法使用的质粒以及使用该方法的产品。

背景技术

生物制造(Bio-Manufacturing)是以生物体机能进行大规模物质加工与物质转化，为社会发展提供新产品的产业。相比于传统制造产业，生物制造的对资源的需求量和消耗量低，同时对环境产生的的污染和破坏少，是推动传统制造业转型升级、优化产业结构的重要动力。

近年来，无细胞蛋白合成(cell-free protein synthesis，CFPS)作为一种新型的蛋白质合成方法，在生物制造领域受到了关注，展现出巨大的潜力和应用前景。该蛋白质合成系统的主要组分包括细胞粗提取物、DNA模板、能量再生物质、辅因子和无机盐等，其中，细胞提取物保留了天然的细胞转录和翻译机制，因此可以通过向提取物补充外源资源，包括氨基酸、核苷酸和次级能量底物等，在体外启动合成。特别地，与自然状态下活细胞合成蛋白质有所不同，无细胞蛋白合成消除了细胞膜的封闭性，将资源利用集中在一个独特的遗传网络中进行单一产品的生物合成，提供了一个良好的合成生物学设计操作平台，不仅使实验者能够直接操纵系统，还允许无细胞蛋白体系合成对细胞活性有害的蛋白质，极大地增加了蛋白质合成过程的灵活性。

另外，蛋白类产品在生产过程中有效活性和稳定性等方面的问题，一种有效解决思路是通过对蛋白质的生产过程进行“控制”，类似于开关的方式来实现“即需即产”，使得蛋白在目标部位更好地发挥生理作用。

传统的利用小分子化学物质来实现的控制主要利用结合膜受体或可溶性转录因子的小分子化学效应物实现了对基因表达的控制，从而进一步调节输出启动子的表达。但化学物质的调控速率会受到进出膜和体结合的过程速率的限制，以及化学物质本身的稳定性和其他副作用会对调控带来不利影响，传统的化学小分子配体和拮抗剂难以实现对靶向细胞的精准定位。而光遗传学技术是一种利用光来远程控制经改造后基因的技术，近年来在生命科学领域取得了飞速发展。光作为控制信号具备信号传输快速精确、无毒害副作用、响应迅速和成本低廉等优势，相比于化学物质是一种理想的控制开关。本专利提出的光控蛋白质合成方法用于蛋白质的无细胞可控合成，通过对蛋白质合成的无毒害副作用的控制手段来实现蛋白质的按需合成，具备灵活和高效的特点。这种光控的无细胞蛋白合成体系可以用于药物蛋白的光控合成、光遗传学教育试剂盒以及人工细胞内的光控合成。

发明内容

本申请开创性地将无细胞蛋白质合成系统与光控系统结合，具体地，提供了以下技术方案：

1.一种质粒，其包括：

编码光敏蛋白的基因；

能够对所述光敏蛋白作出响应的启动子；

与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因或与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路。

2.根据项1所述的质粒，其中，所述编码光敏蛋白的基因选自下述编码双组分转导系统(TCS)的基因构成的组：编码对蓝光响应的YF1/FixJ蛋白的基因、编码对紫外线响应的UirS/UirR蛋白的基因、编码对近红外线响应的BphP1/PpsR2蛋白的基因、编码对绿光响应的CcaS/CcaR蛋白的基因以及编码对红光响应的Cph8/OmpR蛋白的基因。

3.根据项2所述的质粒，其中，所述编码光敏蛋白的基因为编码YF1/FixJ蛋白的基因，所述启动子是FixK2启动子。

4.根据项2所述的质粒，其中，所述编码光敏蛋白的基因为编码YF1/FixJ蛋白的基因，所述启动子是FixK2启动子；而所述反转电路含有cI蛋白基因和pR启动子。

5.根据项1所述的质粒，其中，所述外源基因编码荧光蛋白、疫苗蛋白、抗体蛋白、生物催化酶、膜蛋白、多肽、细胞因子蛋白、激素蛋白或补体蛋白中的任意一种或两种以上。

6.根据项5所述的质粒，其中，所述荧光蛋白选自由下述构成的组：红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

7.根据项1至6的任一项所述的质粒在无细胞蛋白质合成系统中用于合成外源蛋白的用途。

8.一种光控教学用试剂盒，其包括：

根据项1至5的任一项所述的质粒，其中的外源基因编码荧光蛋白；

原核细胞或真核细胞的无细胞提取物；以及

光敏蛋白。

9.一种光控脂质体药物递送系统，其包括

根据项1至4的任一项所述的质粒，其中的外源基因编码药物蛋白；

原核细胞或真核细胞的无细胞提取物；以及

光敏蛋白。

10.一种光控无细胞合成蛋白质的方法，该方法包括下述步骤：

-由含有光敏蛋白的细胞培养物制得细胞提取物；

-使所述细胞提取物与下述质粒混合以形成无细胞反应体系，该质粒包括编码光敏蛋白的基因、能够对该光敏蛋白作出响应的启动子以及与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因或与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路；

-任选：向所述无细胞反应体系中添加能量源物质和氨基酸混合液，无机盐，转录翻译辅助物质；

-在黑暗或者特定波长的光线照射下在反应体系中表达所述外源蛋白。

11.根据项10所述的方法，其中，所述细胞提取物是来自于大肠杆菌的、古细菌的、麦芽细胞的、酵母细胞的、兔网织红细胞的、烟叶细胞的、昆虫细胞的、中国仓鼠卵巢细胞的细胞提取物。

12.根据项10所述的方法，其中，所述编码光敏蛋白的基因选自下述双组分转导系统构成的组：编码YF1/FixJ蛋白的基因、编码UirS/UirR蛋白的基因、BphP1/PpsR2蛋白的基因、编码CcaS/CcaR蛋白的基因或编码Cph8/OmpR蛋白的基因。

13.根据项10所述的方法，其中，所述特定波长的光线选自近红外线、红光、绿光、蓝光或紫外线。

14.根据项10所述的方法，其中，所述能量源物质选自蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸、谷氨酸盐、多磷酸盐、磷酸烯醇式丙酮酸中的一种或两种以上。

15.根据项10所述的方法，其中，所述氨基酸混合液选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或两种以上。

16.根据项10所述的方法，其中，所述制备细胞提取物的方法是发酵液离心法，具体步骤为：

-对细胞进行培养，得到细胞培养物；

-对所述培养物进行破碎，破碎压力为15000-20000psi；

-在4℃的温度、10000g以上的条件下进行离心获得上清液。

17.根据项12所述的方法，其中所述编码光敏蛋白的基因为编码YF1/FixJ蛋白的基因，在将所述细胞提取物与所述质粒混合的步骤中控制YF1与FixJ的重量比在0.05至0.5范围。

18.根据项17所述的方法，其中混合步骤中所使用的质粒是包含与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因的质粒，控制无细胞系统中YF1与FixJ的重量比在0.2～0.3。

19.根据项17所述的方法，其中混合步骤中所使用的质粒是包含与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路的质粒，控制无细胞系统中YF1与FixJ的重量比在0.05～0.5。

本申请的技术方案取得的有益效果：

本申请开创性地将无细胞蛋白质合成系统与光控系统相结合；光作为控制信号具备信号传输快速精确、无毒害副作用、响应迅速和成本低廉等优势，相比于化学物质是一种理想的控制开关；同时，保留了无细胞蛋白质合成系统使实验者能够直接操纵系统、允许无细胞蛋白体系合成对细胞活性有害的蛋白质，极大增加蛋白质合成过程的灵活性的优点。

本申请使用工程质粒作为引入蛋白质复制模板(连同响应于光敏蛋白的启动子)和光敏蛋白的方式。将这些基因元件经由工程质粒一起带入反应系统被证明是成本低廉而有效的方法。

根据本申请，通过将光敏蛋白直接加入培养物或者通过提供含有表达该光敏蛋白的质粒的培养物来引入光敏蛋白，可以通过控制所使用的细胞提取物的量来控制光敏蛋白的量，由此可以精确地控制作为双组分转导系统的光敏蛋白的比例。通过使用根据本申请优化的光敏蛋白比例得到了最佳的蛋白质合成控制效果。具体对于红色荧光蛋白而言，有特定波长光线/黑暗下表达量的差异最大可达到3.5倍以上。

附图说明

图1为本发明实施例1中pDark质粒在不同光敏蛋白质量比下的荧光蛋白表达量比较；

图2为本发明实施例2中pLight质粒在不同光敏蛋白质量比下的荧光蛋白表达量比较；

图3为本发明实施例3中pLight质粒选用不同的作为药物的抗体蛋白作为报告蛋白时Western Blot结果；

图4为本发明实施例3中pLight质粒选用不同的作为药物的抗体蛋白作为报告蛋白时对Western Blot条带进行灰度分析的结果对比；

图5为本发明实施例4中光遗传学教育试剂盒的设计原理图；

图6为pDark质粒的构建结构图；

图7为pLight质粒的构建结构图。

具体实施方式

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本申请在第一方面涉及：质粒。

在一个具体实施方式中，提供了一种质粒，其包括光敏蛋白的基因；能够对所述光敏蛋白作出响应的启动子；与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因或与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路。

在本说明书的上下文中，“质粒”符合生物工程领域的一般定义，它是细菌、酵母菌和放线菌等生物中除染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质中(但酵母除外，酵母的2μm质粒存在于细胞核中)，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，有利于细菌在特定的环境条件下生存。与细菌基因组相同，质粒也属于环形双链DNA(共价闭环DNA，covalently closed circular DNA,cccDNA)。本申请使用工程质粒作为引入蛋白质复制模板(连同响应于光敏蛋白的启动子)和光敏蛋白的方式。将这些基因元件经由质粒一起带入反应系统被证明是成本低廉而有效的方法。

在本说明书的上下文中，“启动子”符合生物工程领域的一般定义，它是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。但有一些启动子(如tRNA启动子)位于转录起始点的下游,这些DNA序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。在本申请中，特别在工程质粒中构建了能够响应于光敏蛋白的启动子，特别地，当所述光敏蛋白为YF1/FixJ蛋白时，所采用的启动子是FixK2启动子；而所述反转电路含有pR启动子。

在本说明书的上下文中，“反转电路”符合生物工程领域的一般定义，即指将一般基因元件电路的正向调控实现一个反转或翻转调控；具体到本申请的具体实施方式，其构成方式为cI蛋白基因加上pR启动子，而其“响应”方式为:相对于FixK2启动子在黑暗条件下才发挥作用的情况，对于带有反转电路的质粒，黑暗条件下反转电路(具体就是对pR启动子有抑制作用的cI蛋白)被表达而致使目标外源基因被休眠，而在蓝光照射条件下，pR启动子后面的目标外源基因进行转录翻译行为。

图6示例性地示出了根据本申请的技术方案构建的第一质粒，其命名为pDark，以逆时针方向观察可以看到：它携带编码光敏蛋白的基因为YF1/FixJ基因，它使用FixK2启动子，其后携带荧光蛋白(FP)作为编码外源蛋白的基因。本申请的实施例示出了pDark质粒在黑暗环境下表达外源蛋白的实验结果。

图7示例性地示出了根据本申请的技术方案构建的第二质粒，其命名为pLight，以逆时针方向观察可以看到：它携带编码光敏蛋白的基因为YF1/FixJ基因，它使用FixK2启动子，其后携带的反转电路依次包括cI蛋白，pR启动子和荧光蛋白(FP)基因。

本申请的实施例示出了pDark和pLight质粒在黑暗环境下以及特定波长的光线(蓝光)照射下表达外源蛋白的实验结果。

在此涉及到的基因序列为：

第一质粒(pDark质粒)的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

第二质粒(pLight质粒)的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

编码YF1的基因如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3:

atggcaagctttcaatcatttgggataccaggacagctggaagtcatcaaaaaagcacttgatcacgtgcgagtcggtgtggtaattacagatcccgcacttgaagataatcctattgtctacgtaaatcaaggctttgttcaaatgaccggctacgagaccgaggaaattttaggaaagaactgtcgcttcttacaggggaaacacacagatcctgcagaagtggacaacatcagaaccgctttacaaaataaagaaccggtcaccgttcagatccaaaactacaaaaaagacggaacgatgttctggaatgaattaaatattgatccaatggaaatagaggataaaacgtattttgtcggaattcagaatgatatcaccgagcaccagcagacccaggcgcgcctccaggaactgcaatccgagctcgtccacgtctccaggctgagcgccatgggcgaaatggcgtccgcgctcgcgcacgagctcaaccagccgctggcggcgatcagcaactacatgaagggctcgcggcggctgcttgccggcagcagtgatccgaacacaccgaaggtcgaaagcgccctggaccgcgccgccgagcaggcgctgcgcgccggccagatcatccggcgcctgcgcgacttcgttgcccgcggcgaatcggagaagcgggtcgagagtctctccaagctgatcgaggaggccggcgcgctcgggcttgccggcgcgcgcgagcagaacgtgcagctccgcttcagtctcgatccgggcgccgatctcgttctcgccgaccgggtgcagatccagcaggtcctggtcaacctgttccgcaacgcgctggaagcgatggctcagtcgcagcgacgcgagctcgtcgtcaccaacacccccgccgccgacgacatgatcgaggtcgaagtgtccgacaccggcagcggtttccaggacgacgtcattccgaacctgtttcagactttcttcaccaccaaggacaccggcatgggcgtgggactgtccatcagccgctcgatcatcgaagctcacggcgggcgcatgtgggccgagagcaacgcatcgggcggggcgaccttccgcttcaccctcccggcagccgacgagatgataggaggtctagcatga

YF1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

SEQ ID NO.13：

MASFQSFGIPGQLEVIKKALDHVRVGVVITDPALEDNPIVYVNQGFVQMTGYETEEILGKNCRFLQGKHTDPAEVDNIRTALQNKEPVTVQIQNYKKDGTMFWNELNIDPMEIEDKTYFVGIQNDITEHQQTQARLQELQSELVHVSRLSAMGEMASALAHELNQPLAAISNYMKGSRRLLAGSSDPNTPKVESALDRAAEQALRAGQIIRRLRDFVARGESEKRVESLSKLIEEAGALGLAGAREQNVQLRFSLDPGADLVLADRVQIQQVLVNLFRNALEAMAQSQRRELVVTNTPAADDMIEVEVSDTGSGFQDDVIPNLFQTFFTTKDTGMGVGLSISRSIIEAHGGRMWAESNASGGATFRFTLPAADEMIGGLA

编码FixJ的基因如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4:

atgacgaccaagggacatatctacgtcatcgacgacgacgcggcgatgcgggattcgctgaatttcctgctggattctgccggcttcggcgtcacgctgtttgacgacgcgcaagcctttctcgacgccctgccgggtctctccttcggctgcgtcgtctccgacgtgcgcatgccgggccttgacggcatcgagctgttgaagcggatgaaggcgcagcaaagcccctttccgatcctcatcatgaccggtcacggcgacgtgccgctcgcggtcgaggcgatgaagttaggggcggtggactttctggaaaagcctttcgaggacgaccgcctcaccgccatgatcgaatcggcgatccgccaggccgagccggccgccaagagcgaggccgtcgcgcaggatatcgccgcccgcgtcgcctcgttgagccccagggagcgccaggtcatggaagggctgatcgccggcctttccaacaagctgatcgcccgcgagtacgacatcagcccgcgcaccatcgaggtgtatcgggccaacgtcatgaccaagatgcaggccaacagcctttcggagctggttcgcctcgcgatgcgcgccggcatgctcaacgattga

FixJ蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

SEQ ID NO.14：

MTTKGHIYVIDDDAAMRDSLNFLLDSAGFGVTLFDDAQAFLDALPGLSFGCVVSDVRMPGLDGIELLKRMKAQQSPFPILIMTGHGDVPLAVEAMKLGAVDFLEKPFEDDRLTAMIESAIRQAEPAAKSEAVAQDIAARVASLSPRERQVMEGLIAGLSNKLIAREYDISPRTIEVYRANVMTKMQANSLSELVRLAMRAGMLND

启动子FixK2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5：

ctccgttgtgatgacgcattggtacgcggtatcgggaggttcgaaaatttcgagcgatatcttaaggggggtgccttacgtagaaccccgtaggtcatgcccgaggccggtcctggatggcgcggcggatacgcttgagcaggttttcgtcgagaagcggcttcaaaaccacgtcttttacgccggcctcggcggcccgggtcgagatgttttcgtccggatagccggtgatcaggatcacgggcgt

启动子pR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.6：

gcaaccattatcaccgccagaggtaaaatagtcaacacgcacggtgtta

编码红色荧光蛋白的基因如SEQ ID NO.7所示。

红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在图7中可以看到在反转电路中引入了cI蛋白；这样得到的pLight质粒可以实现相反的控制效果，即，cI蛋白表达后能够抑制启动子pR的表达，使其表现出与pDark质粒相反的控制效果，具体来说就是在黑暗下抑制目标蛋白的表达而在蓝光照射下启动目标蛋白的表达。

编码cI蛋白的基因如SEQ ID NO.11所示。

SEQ ID NO.11：

agctactaaagcgtagttttcgtcgtttgcagcgccaaacgtctcttcaggccactgactagcgataactttccccacaacggaacaactctcattgcatgggatcattgggtactgtgggtttagtggttgtaaaaacacctgaccgctatccctgatcagtttcttgaaggtaaactcatcacccccaagtctggctatgcagaaatcacctggctcaacagcctgctcagggtcaacgagaattaacattccgtcaggaaagctcggcttggagcctgttggtgcggtcatggaattaccttcaacctcaagccagaatgcagaatcactggcttttttggttgtgcttacccatctctccgcatcacctttggtaaaggttctaagctcaggtgagaacatccctgcctgaacatgagaaaaaacagggtactcatactcacttctaagtgacggctgcatactaaccgcttcatacatctcgtagatttctctggcgattgaagggctaaattcttcaacgctaactttgagaatttttgcaagcaatgcggcgttataagcatttaatgcattgatgccattaaataaagcaccaacgcctgactgccccatccccatcttgtctgcgacagattcctgggataagccaagttcatttttctttttttcataaattgctttaaggcgacgtgcgtcctcaagctgctcttgtgttaatggtttcttttttgtgctcat

cI蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

SEQ ID NO.12：

MSTKKKPLTQEQLEDARRLKAIYEKKKNELGLSQESVADKMGMGQSGVGALFNGINALNAYNAALLAKILKVSVEEFSPSIAREIYEMYEAVSMQPSLRSEYEYPVFSHVQAGMFSPELRTFTKGDAERWVSTTKKASDSAFWLEVEGNSMTAPTGSKPSFPDGMLILVDPEQAVEPGDFCIARLGGDEFTFKKLIRDSGQVFLQPLNPQYPMIPCNESCSVVGKVIASQWPEETFGAANDENYALVA

在另一具体实施方式中，所述编码光敏蛋白的基因选自编码下述双组分转导系统(TCS)的基因构成的组：对蓝光响应的YF1/FixJ蛋白、对紫光和绿光响应的UirS/UirR蛋白、对红光和近红外线响应的BphP1/PpsR2蛋白、对绿光响应的CcaS/CcaR蛋白以及对红光响应的Cph8/OmpR蛋白。

在现有技术中，响应光的双组分蛋白作用系统目前广泛地应用于研究中。按照对光的响应方式的区别，光调节光敏蛋白的方式大致有两种：(1)有些光敏蛋白受到特定波长的光刺激会发生同源二聚化或多聚化(homo-dimerization or homo-oligomerization)；(2)部分光敏蛋白接受特定波长的光刺激后，会与另一个蛋白发生异源二聚化(hetero-dimerization)；两类光调节的双组分蛋白的相互作用目前被广泛使用于光遗传技术，实现光控各种细胞和基因的表达行为。目前YF1/FixJ是一种有效地的基于蓝光传感的双组分可逆系统，YF1是一种人工构建的组氨酸激酶，其在黑暗条件下会对其同源调节蛋白FixJ进行磷酸化，FixJ～P能够驱动FixK2启动子进行转录反应。在蓝光照射下，YF1会转化为磷酸酶，将FixJ～P去磷酸化，从而停止转录反应。根据目前申请人掌握的知识，此类下述双组分转导系统(TCS)及其对应的启动子还没有与无细胞蛋白质合成系统结合使用过。

Cph8/OmpR是一种响应红光的双组分系统，Cph8是Cph1与EnvZ的组氨酸激酶结构域融合构成的重组转录因子，在黑暗条件下发生自磷酸化，随后将磷酸基团转移给响应调节因子OmpR，OmpR～P结合到ompC启动子，启动目的基因的转录与表达。红光照射下，Cph8的自磷酸化被抑制，OmpR不能被磷酸化，ompC启动子失去活性，目的基因的转录与表达被抑制。

CcaS/CcaR是一种响应红光/绿光信号的双组分系统，绿光照射使得CcaS从基态转变为激发态,激发态下CcaS自磷酸化并将一个磷酸基团转移给CcaR，CcaR～P激活启动子cpcG2的转录；在红光照射条件下CcaS转变为基态，CcaS将CcaR～P去磷酸化，不能结合启动子从而停止转录。

UirS/UirR是一种响应紫外线的双组分系统，紫外光照射下UirS自磷酸化后将UirR蛋白磷酸化，UirR～P能够驱动csiR1启动子进行转录。绿光照射下这种UirS不能发生自磷酸化，UirR～P也被去磷酸化，不能结合启动子，转录停止。

BphP1/PpsR2是一种可以响应近红外线的双组分系统，其中BphP1是一种胞质性的蛋白，光对它的调节一般通过二聚作用来实现，而不是通过磷酸信号。在近红外光照下，激活BphP1同源二聚化后可以与PpsR2结合，并在其抑制下结合启动子Br_crt1，从而激活转录翻译，红光照射下使得二聚体解聚，便不能激活启动子转录。

在又一具体实施方式中，所述外源基因可以编码荧光蛋白、疫苗蛋白、抗体蛋白、生物催化酶、膜蛋白、多肽、细胞因子蛋白、激素蛋白或补体蛋白中的任意一种或两种以上对于本申请中涉及的“外源基因编码的蛋白”，并无分子量、化学和物理属性上的特别限制。

在本说明书的上下文中，“疫苗蛋白”符合生物技术领域的一般定义，其涵盖了亚单位疫苗与多肽疫苗。目前，DNA重组技术使得获取大量纯抗原分子成为可能。这与以病原体为原料制备的疫苗相比在技术上发生了革命性变化，使得质量更易控制，价格也更高。从效果来看，有些亚单位疫苗，如非细胞百日咳、HBsAg等，在低剂量就具有高免疫原性；而另外一些疫苗的免疫力则较低，要求比铝盐更强的佐剂。肽疫苗通常由化学合成技术制造。其优点是成分更加简单，质量更易控制。但随着免疫原分子量和结构复杂性的降低，免疫原性也显著降低。因此，这些疫苗一般需要特殊的结构设计、特殊的递送系统或佐剂。

在本说明书的上下文中，“生物催化酶”符合生物技术领域的一般定义，也可以简称为“酶”。酶的化学本质是蛋白质(作为例外，也有少数为RNA)，因此它也具有一级、二级、三级，乃至四级结构。按其分子组成的不同，可分为单纯酶和结合酶。结合酶中的酶蛋白为蛋白质部分，辅助因子为非蛋白质部分，只有两者结合成全酶才具有催化活性。酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。很多酶也可以作为药物使用，例如门冬酰胺酶。

在本说明书的上下文中，“膜蛋白”符合生物技术领域的一般定义，即指生物膜所含的蛋白。膜蛋白基本可分为三大类：外在膜蛋白或称外周膜蛋白、内在膜蛋白或称整合膜蛋白和脂锚定蛋白。膜蛋白包括糖蛋白，载体蛋白和酶等。通常在膜蛋白外会连接着一些糖类，这些糖相当于会通过糖本身分子结构变化将信号传到细胞内。膜蛋白的功能是多方面的。膜蛋白可作为“载体”而将物质转运进出细胞。有些膜蛋白是激素或其他化学物质的专一受体，如甲状腺细胞上有接受来自脑垂体的促甲状腺素的受体。膜表面还有各种酶，使专一的化学反应能在膜上进行，如内质网膜上的能催化磷脂的合成等。细胞的识别功能也决定于膜表面的蛋白质。这些蛋白常常是表面抗原。表面抗原能和特异的抗体结合，如人细胞表面有一种蛋白质抗原HLA，是一种变化极多的二聚体。膜蛋白在生物体的许多生命活动中起着非常重要的作用，如细胞的增殖和分化、能量转换、信号转导及物质运输等。据估计有大约60％的药物作用靶点是膜蛋白。

本说明书的上下文中，“多肽”可以和“多肽药物”互换使用，其涵盖了内源性多肽和外源性多肽；前者即人体固有的内生性多肽，如脑啡肽、胸腺肽、胰脏多肽等；后者为诸如蛇毒、唾液酸、蜂毒、蛙毒、蝎毒、水蛭素、竽螺毒素衍生物和苍蝇分泌的杀菌肽等，其可以拥有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等方面的活性。

在本说明书的上下文中，“抗体”符合生物技术领域的一般定义，即指抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它(免疫球蛋白不仅仅只是抗体)是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。

在本说明书的上下文中，“细胞因子”符合生物技术领域的一般定义，即指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。细胞因子(cytokine，CK)是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。具体地，可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。

在本说明书的上下文中，“补体”符合生物技术领域的一般定义，即指一种存在于人和脊椎动物血清及组织液中的血清蛋白质，其不耐热，活化后具有酶活性、可介导免疫应答和炎症反应。它可被抗原-抗体复合物或微生物所激活，导致病原微生物裂解或被吞噬。

在再一具体实施方式中，所述荧光蛋白选自由下述构成的组：红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

在本说明书的上下文中，“荧光蛋白”符合生物技术领域的一般定义，它是生物学研究中经常用到的标记分子。最早出现的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现，之后又在海洋珊瑚虫中分离得到了第二种GFP。其中水母GFP是由238氨基酸组成的单体蛋白质，分子量约27KD，GFP荧光的产生主要是在氧气存在下，分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α-2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，这样GFP分子中就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。在搞清楚了这一原理后，GFP被广泛的应用到生物学研究中，各个厂家如Promega公司、Stratagene公司(包括来自香港中文大学的橙色蛋白制备技术)、Clontech公司(现属Takara公司)等都出产了相应的产品。在本申请的具体实施方式中特别地使用红色荧光蛋白mCherry，其序列在上文已经述及。

本申请在第二方面涉及：光控无细胞合成蛋白质的方法。

在一个具体实施方式中，提供了一种光控无细胞合成蛋白质的方法，该方法包括下述步骤：

-由含有光敏蛋白的细胞培养物制得细胞提取物；

-将如上制备的细胞提取物与下述质粒混合，该质粒包括能够对该光敏蛋白作出响应的启动子以及与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因或与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路，以形成无细胞反应体系；

-任选：向所述反应体系中添加能量源物质和氨基酸混合液，无机盐，转录辅助物质；

上述“细胞提取物”中“含有”光敏蛋白的含义是，光敏蛋白可以是以蛋白质形式直接加至培养物/提取物中的，也可以是以带有光敏蛋白的质粒的形式加入培养物，进而在细胞中表达的。

在又一具体实施方式中，所述细胞提取物是来自于大肠杆菌的、古细菌的、麦芽细胞的、酵母细胞的、兔网织红细胞的、烟叶细胞的、昆虫细胞的、中国仓鼠卵巢细胞的细胞提取物。

在再一具体实施方式中，所述编码光敏蛋白的基因选自由下述双组分转导系统构成的组：编码YF1/FixJ蛋白的基因、编码UirS/UirR蛋白的基因、编码BphP1/PpsR2蛋白的基因、编码CcaS/CcaR蛋白的基因或编码Cph8/OmpR蛋白的基因。

在一个具体实施方式中，所述光线可以是近红外线、红光、绿光、蓝光或紫外线。它们所对应的波长分别为：近红外760-2500nm，红640—780nm，绿505—525nm，蓝407—505nm，紫外10—400nm。

在又一具体实施方式中，所述能量源物质可以是蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸、谷氨酸盐、多磷酸盐和/或磷酸烯醇式丙酮酸。

在再一具体实施方式中，所述氨基酸混合液包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。而所述转录翻译辅助物质选自：谷氨酸钾、谷氨酸铵、草酸钾、谷氨酸镁、氧化性谷胱甘肽、还原性谷胱甘肽、碘乙酰胺、腐胺、亚精胺、NAD、NADH、ATP、CTP、GTP、UTP、AMP、CMP、GMP、UMP、CoA、tRNA、亚叶酸中的一种或两种以上。

在一个具体实施方式中，所述制备细胞提取物的方法是发酵液离心法，具体步骤为：-细胞培养；-使用高压破碎机对培养物进行破碎，破碎压力为15000-20000psi(可以为15000psi、16000psi、17000psi、18000psi、19000psi、20000psi)；在4℃低温、至少10000g(可以为10000g、11000g、12000g、13000g、14000g、15000g、16000g、17000g、18000g、19000g、20000g或者更多)下，离心至少10分钟(可以为10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、25分钟、30分钟或更多)，取上清液。

在一个具体实施方式中，所述编码光敏蛋白的基因为编码YF1/FixJ蛋白的基因，在将所述细胞提取物与所述质粒混合的步骤中需确保：YF1与FixJ的重量比在0.05至0.5范围内调整，该比值可以为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50。

在又一具体实施方式中，混合步骤中所使用的质粒是包含与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因的质粒，而无细胞系统中YF1与FixJ的重量比在0.2至0.3范围内调整，该比值可以为0.20、0.22、0.24、0.26、0.28、0.30。

在再一具体实施方式中，混合步骤中所使用的质粒是包含与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路的质粒，而无细胞系统中YF1与FixJ的重量比在0.05至0.5范围内调整。关于不同情况下最佳的YF1与FixJ的重量比选择，可以参见图1和图2。

本申请在第三方面涉及：上述质粒在无细胞蛋白质合成系统中的应用。

在一个具体实施方式中，提供了上述质粒在无细胞蛋白质合成系统中用于合成外源蛋白的用途，其中，在无细胞蛋白质合成系统中还添加有作为辅因子的光敏蛋白。

在一个更具体的实施方式中，提供了上述质粒在基于大肠杆菌提取物的无细胞蛋白质合成系统中用于合成外源蛋白质的用途，其中，在无细胞蛋白质合成系统中还添加有作为辅因子的YF1/FixJ蛋白。

在此，通过将光敏蛋白直接加入培养物或者提供含有表达该光敏蛋白的质粒的培养物来引入光敏蛋白，可以通过控制所使用的细胞提取物的量来控制光敏蛋白的量；可以精确控制作为双组分转导系统的光敏蛋白比例。

本申请在第四方面涉及：基于上述应用的各类产品。

在一个具体实施方式中，提供了一种光控教学用试剂盒，其包括：上述质粒；作为反应基质的、基于原核细胞或真核细胞的无细胞提取物；以及额外添加的、作为辅因子的光敏蛋白。

在又一具体实施方式中，提供了一种光控脂质体药物递送系统，其包括上述质粒；作为反应基质的、基于原核细胞或真核细胞的无细胞提取物；以及额外添加的、作为辅因子的光敏蛋白；并且该药物递送系统在给药至人体之前，需在低温下保存，以防止污染。

下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1:制成pDark质粒、将其在E.coli BL21的无细胞提取物中培养，并在黑暗以及蓝光照射条件下表达红色荧光蛋白

-制成pDark质粒

使用PCR方法将红色荧光蛋白基因mCherry从质粒pET23a-mCherry(该质粒由金唯智公司合成)上克隆下来，然后使用PCR技术将质粒pDusk(该质粒的产品货号为：Addgene#43795)从启动子FixK2处打开，保证mCherry基因和线性载体两端有25个碱基的相同序列。使用吉布森自组装的方法将mCherry基因与载体连接起来，构成pDark质粒。

-制成E.coli BL21细胞提取物并与pDark混合以形成无细胞反应体系

对细胞进行培养分别制备含有两种光控蛋白的细胞提取物E.coli BL21(DE3)，配制无细胞体系时按照0，0.01，0.04，0.1，0.25，0.5，1，1.5(无细胞系统中YF1蛋白的质量：无细胞系统中FixJ蛋白的质量)混合两种细胞提取物，剩余体积用E.coli BL21(DE3)补充。具体地：针对含有YF1或FixJ蛋白的细胞提取物：将编码YF1或FixJ蛋白的质粒体化转到E.coli BL21(DE3)菌株中。从平板上挑取单克隆，接种至10mL 2×YT+P培养基中，37℃，220rpm过夜培养。第二天早上，将过夜菌液分别转接至200mL 2×YT+P培养基中，37℃，220rpm培养3h。将培养的菌液以5％的接种量分别转移至800mL 2×YT+P培养基，37℃，220rpm培养至OD600＝0.3～0.4时，加入1mM IPTG，16℃，220rpm过夜培养。S30A溶液清洗重悬后在15000～20000psi压力下破碎2次后在13000×g离心30min得到上清液，孵育和透析后在4℃，13000×g离心30min，得到上清液为含有YF1或者FixJ蛋白细胞提取物，得到混合无细胞提取物。

向所述混合无细胞提取物中添加构建好的质粒pDark，报告蛋白选取红色荧光蛋白mCherry,质粒添加量为300ng，将无细胞体系分装。

-在黑暗以及蓝光照射条件下表达红色荧光蛋白

将分装好的无细胞体系同时在黑暗和波长为480nm的蓝光照射下表达12h，体系表达的温度为30℃。

将表达后的无细胞体系使用酶标仪测量荧光强度，分析相同质粒在黑暗和蓝光照射条件下的表达情况来观察质粒合成蛋白质的光控效果，表达结果如图1所示。图1中所示的“倍数”为黑暗条件下的表达量：蓝光照射条件下的表达量。可以看到，该“倍数”可以高达3.5。

实施例2:制成pLight质粒、将其在E.coli BL21的无细胞提取物中培养，并在黑暗以及蓝光照射条件下表达红色荧光蛋白

-在pDark质粒结构的基础上进一步构建出pLight质粒，pLight是在pDark的基础之上，将cI-pR基因电路组装到启动子FixK2之后。使用PCR技术将空载体pDawn(该质粒的产品货号为：Addgene#43796)从启动子pR处打开，保证mCherry基因和线性载体两端有25个碱基的相同序列。使用吉布森自组装的方法将mCherry基因与载体连接起来，构成pLight质粒。-制成E.coli BL21细胞提取物并与pLight混合以形成无细胞反应体系

分别制备含有两种光控蛋白的细胞提取物E.coli BL21(DE3)，配制无细胞体系时按照0，0.01，0.04，0.1，0.25，0.5，1，1.5混合两种细胞提取物，剩余体积用E.coli BL21(DE3)补充。具体操作同实施例1的描述。

向无细胞体系中添加构建好的质粒pLight，报告蛋白选取红色荧光蛋白mCherry,质粒添加量为300ng，将无细胞体系分装；

-在黑暗以及蓝光照射条件下表达红色荧光蛋白

将表达后的无细胞体系使用酶标仪测量荧光强度，分析相同质粒在黑暗和蓝光照射条件下的表达情况来观察质粒合成蛋白质的光控效果，表达结果如图2所示。图2中所示的“倍数”为蓝光照射条件下的表达量：黑暗条件下的表达量。可以看到，该“倍数”可以高达3.5。

实施例3:选用新的pLight质粒(用NbmCherry，NbRota3B2和NbCEA5三种药物蛋白替换红色荧光蛋白)，研究它们在E.coli BL21的无细胞提取物中的表达。

-在实施例2的pLight质粒结构的基础上进一步构建出三种药物蛋白的pLight质粒，即pLight-NbmCherry，pLight-NbRota3B2和pLight-NbCEA5。使用PCR技术将NbmCherry，NbRota3B2和NbCEA5三种药物蛋白的基因从各自的质粒(关于NbmCherry可以参考下述文献：Fridy,P.C.,Li,Y.,Keegan,S.,Thompson,M.K.,Nudelman,I.,Scheid,J.F.,Oeffinger,M.,Nussenzweig,M.C.,

D.,and Chait,B.T.(2014)A robust pipelinefor rapid production of versatile nanobody repertoires,Nature methods 11,1253.关于NbRota3B2可以参考下述文献：Vega,C.G.,Bok,M.,Vlasova,A.N.,Chattha,K.S.,Gómez-Sebastián,S.,

C.,Alvarado,C.,Lasa,R.,Escribano,J.M.,andGaraicoechea,L.L.(2013)Recombinant monovalent llama-derived antibodyfragments(VHH)to rotavirus VP6 protect neonatal gnotobiotic piglets againsthuman rotavirus-induced diarrhea,PLoS pathogens 9.关于NbCEA5可以参考下述文献：Vaneycken,I.,Govaert,J.,Vincke,C.,Caveliers,V.,Lahoutte,T.,De Baetselier,P.,Raes,G.,Bossuyt,A.,Muyldermans,S.,and Devoogdt,N.(2010)In vitro analysis andin vivo tumor targeting ofa humanized,grafted nanobody in mice using pinholeSPECT/micro-CT,Journal of Nuclear Medicine 51,1099-1106.)上克隆下来，同时，使用PCR技术将pLight质粒除mCherry基因的部分克隆下来，保证载体与目的基因有25个碱基的相同序列。最后使用吉布森自组装的手段将载体与目的基因连接起，构成这三种质粒。

此处涉及的药物蛋白的基因序列如下所示：

编码NbmCherry的基因如SEQ ID NO.8所示。

SEQ ID NO.8：

atggcacaagttcagctggttgaaagcggtggtagtctggttcagccgggcggtagtctgcgtctgagttgtgccgcgagcggtcgctttgcggaaagcagcagcatgggttggttccgccaagccccgggcaaagaacgcgaattcgtggccgccattagctggagcggtggtgcgaccaattacgccgatagcgccaaaggtcgcttcacgctgagccgcgacaacaccaagaacaccgtgtatctgcagatgaacagtctgaagccggatgataccgcggtgtactattgcgcggcgaatctgggcaactacatcagcagcaaccagcgtctgtacggctattggggccaaggcacccaagttaccgttagcagtccgttcaccaccagccatcatcatcatcaccattaa

NbmCherry蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

SEQ ID NO.16：

MAQVQLVESGGSLVQPGGSLRLSCAASGRFAESSSMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGATNYADSAKGRFTLSRDNTKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCAANLGNYISSNQRLYGYWGQGTQVTVSSPFTTSHHHHHH

编码NbRota3B2的基因如SEQ ID NO.9所示。

SEQ ID NO.9：

atggccgacgtacagctacaagccagtggtggtggtctggcccaagccggtgatagtctgacgctgagttgcgccgccagtggtcgcacctttagcggctacgtggttggctggttccgtcaagccccgggcgccgaacgcgaatttgttggcgcgatccgctggagtgaagacagcacgtggtatggcgatagcatgaaaggccgcattctgatcagccgcaacaacatcaagaacaccgtgaatctgcagatgttcaatctgaagccggaggataccgccgtttatgtttgcgccgcgggtgccggtgatatcgtgaccacggagacgagctacaactactggggccgcggcacgcaagttaccgttagcagccgcggccgtacgagccatcatcatcatcaccattaa

NbRota3B2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

SEQ ID NO.17：

MADVQLQASGGGLAQAGDSLTLSCAASGRTFSGYVVGWFRQAPGAEREFVGAIRWSEDSTWYGDSMKGRILISRNNIKNTVNLQMFNLKPEDTAVYVCAAGAGDIVTTETSYNYWGRGTQVTVSSRGRTSHHHHHH

编码NbCEA5的基因如SEQ ID NO.10所示。

SEQ ID NO.10：

atgcaagttcagctggttgaaagcggtggtggtagcgttcaagccggtggcagtctgcgtctgagctgtgccgcgagcggtgatacctatggcagctactggatgggttggtttcgccaagccccgggtaaagaacgcgaaggcgttgcggccatcaatcgcggtggtggctacaccgtttacgcggatagcgtgaaaggccgctttaccatcagtcgcgataccgcgaagaacacggtgtatctgcagatgaacagcctccgtccggatgataccgccgactactactgcgccgccagtggtgttctgggtggtctgcacgaagactggttcaattactggggtcaaggcacccaagttaccgtgagcagcacgagccatcatcatcatcaccattaa

NbCEA5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

SEQ ID NO.18：

MQVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGDTYGSYWMGWFRQAPGKEREGVAAINRGGGYTVYADSVKGRFTISRDTAKNTVYLQMNSLRPDDTADYYCAASGVLGGLHEDWFNYWGQGTQVTVSSTSHHHHHH

-制成E.coli BL21细胞提取物并与上述三种新的pLight质粒混合以形成无细胞反应体系

分别制备含有两种光控蛋白的细胞提取物E.coli BL21(DE3)，配制无细胞体系时按照YF1与FixJ的质量比为0.25来混合两种细胞提取物，剩余体积用E.coli BL21(DE3)补充。具体操作同实施例1的描述。向无细胞体系中添加构建好的质粒pLight，报告蛋白选取三种药物抗体蛋白NbmCherry，NbRota3B2和NbCEA5,质粒添加量为300ng，将无细胞体系分装；

-在黑暗以及蓝光照射条件下表达三种药物蛋白

将表达后的无细胞体系使用Western Blot进行分析，并对结果进行灰度分析，观察相同质粒在黑暗和蓝光照射条件下的表达情况来观察质粒合成蛋白质的光控效果，Western Blot的分析结果如图3所示，灰度分析如图4所示。图3中抗体蛋白的表达都可以实现光照条件表达量高于条件，除了NbRota3B2之外，其它两种抗体蛋白表达量在黑暗和光照下的差距都能够达到2倍。

实施例4:选用实施例2的pLight质粒，将其在E.coli BL21的无细胞提取物中培养，并在蓝光照射条件下使用教育试剂盒进行展示

利用无细胞蓝光控制蛋白合成体系进行教育试剂盒的设计。

-制成E.coli BL21细胞提取物并与pLight混合以形成无细胞反应体系

分别制备含有两种光控蛋白的细胞提取物E.coli BL21(DE3)，配制无细胞体系时按照YF1与FixJ的质量比为0.25来混合两种细胞提取物，剩余体积用E.coli BL21(DE3)补充。向无细胞体系中添加构建好的质粒pLight，报告蛋白选取红色荧光蛋白mCherry,质粒添加量为300ng，将无细胞体系分装到96孔板(每孔60μL)或384孔板(每孔20μL)；

-在黑暗以及蓝光照射条件下表达红色荧光蛋白

按照孔板形状设计呈现的图案，按照设计对铝箔进行打孔，按照对应位置用打好孔的铝箔包裹孔板，呈现出成像区域的小孔可以被蓝光照射，其余小孔不能被照射，处于黑暗条件。

将铝箔包裹好的装有无细胞体系的孔板同时在波长为480nm的蓝光照射下表达12h，体系表达的温度为30℃。

观察表达后的无细胞反应体系的成像情况。教育试剂盒的设计原理如图5所示。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

序列表

<110> 清华大学

<120> 光控无细胞蛋白质合成方法、该方法使用的质粒以及使用该方法的产品

<130> PD01021

<141> 2020-06-19

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6220

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgacccat ttgctgtcca ccagtcatgc tagccatatg 240

gctgccgcgc ggcaccaggc cgctgctgtg atgatgatga tgatggctgc tgcccatggt 300

atatctcctt cttaaagtta aacaaaatta tttctagact ccgttgtgat gacgcattgg 360

tacgcggtat cgggaggttc gaaaatttcg agcgatatct taaggggggt gccttacgta 420

gaaccccgta ggtcatgccc gaggccggtc ctggatggcg cggcggatac gcttgagcag 480

gttttcgtcg agaagcggct tcaaaaccac gtcttttacg ccggcctcgg cggcccgggt 540

cgagatgttt tcgtccggat agccggtgat caggatcacg ggcgtagatc tcgatcctct 600

acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata 660

tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt 720

tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc 780

atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc 840

taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gagatcccgg acaccatcga atggtgcaaa 900

acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattgagggt ggtgaatgtg 960

gctagttttc aatcatttgg gataccagga cagctggaag tcatcaaaaa agcacttgat 1020

cacgtgcgag tcggtgtggt aattacagat cccgcacttg aagataatcc tattgtctac 1080

gtaaatcaag gctttgttca aatgaccggc tacgagaccg aggaaatttt aggaaagaac 1140

tgtcgcttct tacaggggaa acacacagat cctgcagaag tggacaacat cagaaccgct 1200

ttacaaaata aagaaccggt caccgttcag atccaaaact acaaaaaaga cggaacgatg 1260

ttctggaatg aattaaatat tgatccaatg gaaatagagg ataaaacgta ttttgtcggt 1320

attcagaatg atatcaccga gcaccagcag acccaggcgc gcctccagga actgcaatcc 1380

gagctcgtcc acgtctccag gctgagcgcc atgggcgaaa tggcgtccgc gctcgcgcac 1440

gagctcaacc agccgctggc ggcgatcagc aactacatga agggctcgcg gcggctgctt 1500

gccggcagca gtgatccgaa cacaccgaag gtcgaaagcg ccctggaccg cgccgccgag 1560

caggcgctgc gcgccggcca gatcatccgg cgcctgcgcg acttcgttgc ccgcggcgaa 1620

tcggagaagc gggtcgagag tctctccaag ctgatcgagg aggccggcgc gctcgggctt 1680

gccggcgcgc gcgagcagaa cgtgcagctc cgcttcagtc tcgatccggg cgccgatctc 1740

gttctcgccg accgggtgca gatccagcag gtcctggtca acctgttccg caacgcgctg 1800

gaagcgatgg ctcagtcgca gcgacgcgag ctcgtcgtca ccaacacccc cgccgccgac 1860

gacatgatcg aggtcgaagt gtccgacacc ggcagcggtt tccaggacga cgtcattccg 1920

aacctgtttc agactttctt caccaccaag gacaccggca tgggcgtggg actgtccatc 1980

agccgctcga tcatcgaagc tcacggcggg cgcatgtggg ccgagagcaa cgcatcgggc 2040

ggggcgacct tccgcttcac cctcccggca gccgacgaga tgataggagg tctagcatga 2100

cgaccaaggg acatatctac gtcatcgacg acgacgcggc gatgcgggat tcgctgaatt 2160

tcctgctgga ttctgccggc ttcggcgtca cgctgtttga cgacgcgcaa gcctttctcg 2220

acgccctgcc gggtctctcc ttcggctgcg tcgtctccga cgtgcgcatg ccgggccttg 2280

acggcatcga gctgttgaag cggatgaagg cgcagcaaag cccctttccg atcctcatca 2340

tgaccggtca cggcgacgtg ccgctcgcgg tcgaggcgat gaagttaggg gcggtggact 2400

ttctggaaaa gcctttcgag gacgaccgcc tcaccgccat gatcgaatcg gcgatccgcc 2460

aggccgagcc ggccgccaag agcgaggccg tcgcgcagga tatcgccgcc cgcgtcgcct 2520

cgttgagccc cagggagcgc caggtcatgg aagggctgat cgccggcctt tccaacaagc 2580

tgatcgcccg cgagtacgac atcagcccgc gcaccatcga ggtgtatcgg gccaacgtca 2640

tgaccaagat gcaggccaac agcctttcgg agctggttcg cctcgcgatg cgcgccggca 2700

tgctcaacga ttgacaattg atgtaagtta gctcactcat taggcaccgg gatctcgacc 2760

gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 2820

cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 2880

gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 2940

gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 3000

caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccccac gggtgcgcat 3060

gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg ggttgcctta ctggttagca 3120

gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc tgctgcaaaa cgtctgcgac 3180

ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg taaagtctgg aaacgcggaa 3240

gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca ggatgctgct ggctaccctg 3300

tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga ccctgagtga tttttctctg 3360

gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa cgttccagta accgggcatg 3420

ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt ttcatcggta tcattacccc 3480

catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct 3540

taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct 3600

ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta 3660

ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 3720

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 3780

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg 3840

agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatata 3900

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cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 4020

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gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 4140

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<210> 2

<211> 7213

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

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cactagcact atcagcgtta ttaagctact aaagcgtagt tttcgtcgtt tgcagcgcca 600

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<210> 3

<211> 1143

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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tacgtaaatc aaggctttgt tcaaatgacc ggctacgaga ccgaggaaat tttaggaaag 180

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

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<400> 10

atgcaagttc agctggttga aagcggtggt ggtagcgttc aagccggtgg cagtctgcgt 60

ctgagctgtg ccgcgagcgg tgatacctat ggcagctact ggatgggttg gtttcgccaa 120

gccccgggta aagaacgcga aggcgttgcg gccatcaatc gcggtggtgg ctacaccgtt 180

tacgcggata gcgtgaaagg ccgctttacc atcagtcgcg ataccgcgaa gaacacggtg 240

tatctgcaga tgaacagcct ccgtccggat gataccgccg actactactg cgccgccagt 300

ggtgttctgg gtggtctgca cgaagactgg ttcaattact ggggtcaagg cacccaagtt 360

accgtgagca gcacgagcca tcatcatcat caccattaa 399

<210> 11

<211> 744

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

agctactaaa gcgtagtttt cgtcgtttgc agcgccaaac gtctcttcag gccactgact 60

agcgataact ttccccacaa cggaacaact ctcattgcat gggatcattg ggtactgtgg 120

gtttagtggt tgtaaaaaca cctgaccgct atccctgatc agtttcttga aggtaaactc 180

atcaccccca agtctggcta tgcagaaatc acctggctca acagcctgct cagggtcaac 240

gagaattaac attccgtcag gaaagctcgg cttggagcct gttggtgcgg tcatggaatt 300

accttcaacc tcaagccaga atgcagaatc actggctttt ttggttgtgc ttacccatct 360

ctccgcatca cctttggtaa aggttctaag ctcaggtgag aacatccctg cctgaacatg 420

agaaaaaaca gggtactcat actcacttct aagtgacggc tgcatactaa ccgcttcata 480

catctcgtag atttctctgg cgattgaagg gctaaattct tcaacgctaa ctttgagaat 540

ttttgcaagc aatgcggcgt tataagcatt taatgcattg atgccattaa ataaagcacc 600

aacgcctgac tgccccatcc ccatcttgtc tgcgacagat tcctgggata agccaagttc 660

atttttcttt ttttcataaa ttgctttaag gcgacgtgcg tcctcaagct gctcttgtgt 720

taatggtttc ttttttgtgc tcat 744

<210> 12

<211> 248

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Met Ser Thr Lys Lys Lys Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Glu Asp Ala

1 5 10 15

Arg Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Asn Glu Leu Gly Leu

20 25 30

Ser Gln Glu Ser Val Ala Asp Lys Met Gly Met Gly Gln Ser Gly Val

35 40 45

Gly Ala Leu Phe Asn Gly Ile Asn Ala Leu Asn Ala Tyr Asn Ala Ala

50 55 60

Leu Leu Ala Lys Ile Leu Lys Val Ser Val Glu Glu Phe Ser Pro Ser

65 70 75 80

Ile Ala Arg Glu Ile Tyr Glu Met Tyr Glu Ala Val Ser Met Gln Pro

85 90 95

Ser Leu Arg Ser Glu Tyr Glu Tyr Pro Val Phe Ser His Val Gln Ala

100 105 110

Gly Met Phe Ser Pro Glu Leu Arg Thr Phe Thr Lys Gly Asp Ala Glu

115 120 125

Arg Trp Val Ser Thr Thr Lys Lys Ala Ser Asp Ser Ala Phe Trp Leu

130 135 140

Glu Val Glu Gly Asn Ser Met Thr Ala Pro Thr Gly Ser Lys Pro Ser

145 150 155 160

Phe Pro Asp Gly Met Leu Ile Leu Val Asp Pro Glu Gln Ala Val Glu

165 170 175

Pro Gly Asp Phe Cys Ile Ala Arg Leu Gly Gly Asp Glu Phe Thr Phe

180 185 190

Lys Lys Leu Ile Arg Asp Ser Gly Gln Val Phe Leu Gln Pro Leu Asn

195 200 205

Pro Gln Tyr Pro Met Ile Pro Cys Asn Glu Ser Cys Ser Val Val Gly

210 215 220

Lys Val Ile Ala Ser Gln Trp Pro Glu Glu Thr Phe Gly Ala Ala Asn

225 230 235 240

Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Val Ala

245

<210> 13

<211> 380

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Met Ala Ser Phe Gln Ser Phe Gly Ile Pro Gly Gln Leu Glu Val Ile

1 5 10 15

Lys Lys Ala Leu Asp His Val Arg Val Gly Val Val Ile Thr Asp Pro

20 25 30

Ala Leu Glu Asp Asn Pro Ile Val Tyr Val Asn Gln Gly Phe Val Gln

35 40 45

Met Thr Gly Tyr Glu Thr Glu Glu Ile Leu Gly Lys Asn Cys Arg Phe

50 55 60

Leu Gln Gly Lys His Thr Asp Pro Ala Glu Val Asp Asn Ile Arg Thr

65 70 75 80

Ala Leu Gln Asn Lys Glu Pro Val Thr Val Gln Ile Gln Asn Tyr Lys

85 90 95

Lys Asp Gly Thr Met Phe Trp Asn Glu Leu Asn Ile Asp Pro Met Glu

100 105 110

Ile Glu Asp Lys Thr Tyr Phe Val Gly Ile Gln Asn Asp Ile Thr Glu

115 120 125

His Gln Gln Thr Gln Ala Arg Leu Gln Glu Leu Gln Ser Glu Leu Val

130 135 140

His Val Ser Arg Leu Ser Ala Met Gly Glu Met Ala Ser Ala Leu Ala

145 150 155 160

His Glu Leu Asn Gln Pro Leu Ala Ala Ile Ser Asn Tyr Met Lys Gly

165 170 175

Ser Arg Arg Leu Leu Ala Gly Ser Ser Asp Pro Asn Thr Pro Lys Val

180 185 190

Glu Ser Ala Leu Asp Arg Ala Ala Glu Gln Ala Leu Arg Ala Gly Gln

195 200 205

Ile Ile Arg Arg Leu Arg Asp Phe Val Ala Arg Gly Glu Ser Glu Lys

210 215 220

Arg Val Glu Ser Leu Ser Lys Leu Ile Glu Glu Ala Gly Ala Leu Gly

225 230 235 240

Leu Ala Gly Ala Arg Glu Gln Asn Val Gln Leu Arg Phe Ser Leu Asp

245 250 255

Pro Gly Ala Asp Leu Val Leu Ala Asp Arg Val Gln Ile Gln Gln Val

260 265 270

Leu Val Asn Leu Phe Arg Asn Ala Leu Glu Ala Met Ala Gln Ser Gln

275 280 285

Arg Arg Glu Leu Val Val Thr Asn Thr Pro Ala Ala Asp Asp Met Ile

290 295 300

Glu Val Glu Val Ser Asp Thr Gly Ser Gly Phe Gln Asp Asp Val Ile

305 310 315 320

Pro Asn Leu Phe Gln Thr Phe Phe Thr Thr Lys Asp Thr Gly Met Gly

325 330 335

Val Gly Leu Ser Ile Ser Arg Ser Ile Ile Glu Ala His Gly Gly Arg

340 345 350

Met Trp Ala Glu Ser Asn Ala Ser Gly Gly Ala Thr Phe Arg Phe Thr

355 360 365

Leu Pro Ala Ala Asp Glu Met Ile Gly Gly Leu Ala

370 375 380

<210> 14

<211> 205

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

Met Thr Thr Lys Gly His Ile Tyr Val Ile Asp Asp Asp Ala Ala Met

1 5 10 15

Arg Asp Ser Leu Asn Phe Leu Leu Asp Ser Ala Gly Phe Gly Val Thr

20 25 30

Leu Phe Asp Asp Ala Gln Ala Phe Leu Asp Ala Leu Pro Gly Leu Ser

35 40 45

Phe Gly Cys Val Val Ser Asp Val Arg Met Pro Gly Leu Asp Gly Ile

50 55 60

Glu Leu Leu Lys Arg Met Lys Ala Gln Gln Ser Pro Phe Pro Ile Leu

65 70 75 80

Ile Met Thr Gly His Gly Asp Val Pro Leu Ala Val Glu Ala Met Lys

85 90 95

Leu Gly Ala Val Asp Phe Leu Glu Lys Pro Phe Glu Asp Asp Arg Leu

100 105 110

Thr Ala Met Ile Glu Ser Ala Ile Arg Gln Ala Glu Pro Ala Ala Lys

115 120 125

Ser Glu Ala Val Ala Gln Asp Ile Ala Ala Arg Val Ala Ser Leu Ser

130 135 140

Pro Arg Glu Arg Gln Val Met Glu Gly Leu Ile Ala Gly Leu Ser Asn

145 150 155 160

Lys Leu Ile Ala Arg Glu Tyr Asp Ile Ser Pro Arg Thr Ile Glu Val

165 170 175

Tyr Arg Ala Asn Val Met Thr Lys Met Gln Ala Asn Ser Leu Ser Glu

180 185 190

Leu Val Arg Leu Ala Met Arg Ala Gly Met Leu Asn Asp

195 200 205

<210> 15

<211> 236

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 15

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 16

<211> 137

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Phe Ala Glu

20 25 30

Ser Ser Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Asn Leu Gly Asn Tyr Ile Ser Ser Asn Gln Arg Leu

100 105 110

Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Pro Phe

115 120 125

Thr Thr Ser His His His His His His

130 135

<210> 17

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 17

Met Ala Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ala

1 5 10 15

Gly Asp Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

Gly Tyr Val Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Ala Glu Arg Glu

35 40 45

Phe Val Gly Ala Ile Arg Trp Ser Glu Asp Ser Thr Trp Tyr Gly Asp

50 55 60

Ser Met Lys Gly Arg Ile Leu Ile Ser Arg Asn Asn Ile Lys Asn Thr

65 70 75 80

Val Asn Leu Gln Met Phe Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Val Cys Ala Ala Gly Ala Gly Asp Ile Val Thr Thr Glu Thr Ser Tyr

100 105 110

Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Arg Gly Arg

115 120 125

Thr Ser His His His His His His

130 135

<210> 18

<211> 132

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 18

Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Tyr Gly Ser

20 25 30

Tyr Trp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly

35 40 45

Val Ala Ala Ile Asn Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Val Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Ser Gly Val Leu Gly Gly Leu His Glu Asp Trp Phe Asn

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Ser His His

115 120 125

His His His His

130

Claims

1.一种质粒，其包括：

编码光敏蛋白的基因；

能够对所述光敏蛋白作出响应的启动子；

与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因或与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路；

其中，所述编码光敏蛋白的基因为编码YF1/FixJ蛋白的基因，所述启动子是FixK2启动子；而所述反转电路含有编码cI蛋白的基因和pR启动子；

其中，

所述外源基因编码荧光蛋白、疫苗蛋白、抗体蛋白、生物催化酶、膜蛋白、多肽、细胞因子蛋白、激素蛋白或补体蛋白中的任意一种或两种以上；当所述外源基因编码荧光蛋白时，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白。

2.根据权利要求1所述的质粒在无细胞蛋白质合成系统中用于合成外源蛋白的用途。

3.一种教学用试剂盒，其包括：

如权利要求1所述的质粒，其中的外源基因编码荧光蛋白；

原核细胞或真核细胞的无细胞提取物；以及光敏蛋白。

4.一种脂质体药物递送系统，其包括

如权利要求1所述的质粒，其中的外源基因编码药物蛋白；

原核细胞或真核细胞的无细胞提取物；以及光敏蛋白。

5.一种光控无细胞合成蛋白质的方法，该方法包括下述步骤：

-由含有光敏蛋白的细胞培养物制得细胞提取物；

-使所述细胞提取物与下述质粒混合以形成无细胞反应体系，该质粒包括编码光敏蛋白的基因、能够对该光敏蛋白作出响应的启动子以及与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因或与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路；所述启动子是FixK2启动子；而所述反转电路含有编码cI蛋白的基因和pR启动子；

-向所述无细胞反应体系中添加能量源物质和氨基酸混合液，无机盐，转录翻译辅助物质；

-在黑暗或者蓝光照射下在反应体系中表达所述外源蛋白；

其中所述编码光敏蛋白的基因为编码YF1/FixJ蛋白的基因，在将所述细胞提取物与所述质粒混合的步骤中控制YF1与FixJ的重量比在0.05至0.5范围。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述细胞提取物是来自于大肠杆菌的、古细菌的、麦芽细胞的、酵母细胞的、兔网织红细胞的、烟叶细胞的、昆虫细胞的或中国仓鼠卵巢细胞的细胞提取物。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述能量源物质选自蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、磷酸甘油酸、磷酸肌酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸、谷氨酸盐、多磷酸盐和磷酸烯醇式丙酮酸中的一种或两种以上。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述氨基酸混合液选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或两种以上。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述细胞提取物的制备方法是发酵液离心法，具体步骤为：

-对细胞进行培养，得到细胞培养物；

-对所述培养物进行破碎，破碎压力为15000-20000 psi；

-在4℃的温度、10000g以上的条件下进行离心获得上清液。

10.根据权利要求5所述的方法，其中当所述质粒所包含的外源基因是与所述启动子连接的作为外源蛋白质转录模板的外源基因时，控制无细胞系统中YF1与FixJ的重量比在0.2~0.3。

11.根据权利要求5所述的方法，其中当所述质粒所包含的外源基因对应物是与所述启动子相连的包括作为外源蛋白质转录模板的外源基因的反转电路时，控制无细胞系统中YF1与FixJ的重量比在0.05~0.5。