CN111926029A - 一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法。所述方法包括下述步骤：将包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶加入到无细胞体系中进行蛋白质的合成。本发明通过使用响应性水凝胶，使得基因聚集在水凝胶的表面，其相对比基因溶液，在进行无细胞反应时具有更高的蛋白质表达量，并且当吸附的基因浓度为10ng/μL时，蛋白质产量为原来的3.7倍，动力学实验显示水凝胶聚集基因进行无细胞反应时具有更好的动力学行为，能够更高效快速的合成目标蛋白质，并且转录过程分析显示水凝胶能够显著的提高无细胞蛋白合成系统的转录水平。

Description

一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法
技术领域
本发明涉及合成生物学技术领域，尤其涉及一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法。
背景技术
无细胞蛋白合成系统是利用微生物、动植物的细胞提取物所提供包括转录、翻译、蛋白质折叠和能量代谢所需的必要原件，以外源DNA或mRNA为遗传模板，同时在反应体系中补充氨基酸、辅因子和盐离子等底物和能量代谢物质，通过共同作用实现蛋白质体外表达的系统。
几十年来，无细胞体系发展迅速，与传统的体内细胞系统相比，无细胞体系减少了对细胞的依赖性，主要具有以下几个方面的优势：
(1)对反应环境直接控制：由于无细胞体系没有了细胞膜、细胞壁的局限性，可以直接控制影响无细胞蛋白合成过程的环境变量，如：离子强度、pH值、温度、氧化还原环境等。
(2)对反应过程直接影响：通过改变反应离子的浓度来影响反应过程。
(3)加快目标蛋白的合成与纯化：无细胞体系不受细胞生长的影响，可以避开前期细胞生长的过程直接进行目标蛋白的合成，并且得到的蛋白质可以直接进行纯化。
(4)能够表达对细胞存在毒性的蛋白质：无细胞体系不存在活细胞，也就可以避免蛋白质的毒性作用。
(5)扩大生命化学：可以生产具有新的结构或功能特性的非天然产物，例如含有非天然氨基酸的蛋白质。
(6)可以高通量筛选定向进化的蛋白质。
(7)能够灵活的调节蛋白质的二级结构形成，加大目标构象蛋白生产的比例。
由于无细胞系统相比于传统的胞内生产蛋白质的方法具有诸多的优势，因此目前无细胞体系被广泛的应用于工业化高通量蛋白质生产的平台技术开发。而这其中首要的任务就是实现无细胞系统的高产量表达，目前已经产生了很多用于提高无细胞体系蛋白质产量的方法，分为以下五个方面：(1)优化细胞提取物制备程序；(2)改善能量供应方法；(3)增强蛋白质合成的途径；(4)优化转录翻译原件；(5)大分子拥挤效应。
而对于大分子拥挤效应，其是所有生物体普遍存在的基本特征，人们对研究它在各种生物过程中产生的影响越来越感兴趣，例如，Sanders等人通过使用聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇，葡聚糖等拥挤剂研究了噬菌体T4晚期基因的转录激活(SANDERS G M，KASSAVETISG A，GEIDUSCHEK E P.Use of a macromolecular crowding agent to dissectinteractions and define functions in transcriptional activation by a DNA-tracking protein:bacteriophage T4gene 45protein and late transcription[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1994，91(16):7703-7707)。Nakano等人通过使用浓缩小麦胚芽提取物或在大肠杆菌提取物中添加PEG来增强蛋白质表达(NAKANO H，TANAKA T，KAWARASAKI Y，et al.Highly productive cell-free proteinsynthesis system using condensed wheat-germ extract[J].Journal ofbiotechnology，1996，46(3):275-282)。这些结果都表明在无细胞体系中模拟大分子拥挤环境有助于增强蛋白质的转录与翻译，可以提高蛋白质的表达量。
然而这些研究构建的大分子拥挤环境主要还是通过向无细胞体系中添加试剂形成的。这样创造出来的拥挤环境有限，形成的无细胞体系蛋白质表达提升率也有限。因此，需要寻求其他的方法。细胞质被认为是“半固体”的状态，人们认为这种状态会强烈影响到细胞成分的扩散动力学。例如细菌mRNA，它很少从生产部位分散。因此，DNA和mRNA在细菌细胞中都可以看作是不动的，而不是像在典型的体外实验那样在溶液中自由扩散。
基于这一点，2009年Park等人通过利用X-DNA作为交联剂，将线性DNA与水凝胶进行连接，进行无细胞反应，使得无细胞体系的蛋白质产量提高近300倍(PARK N，UM S H，FUNABASHI H，et al.A cell-free protein-producing gel[J].Nature materials，2009，8(5):432)。这其中的原理就是将DNA固定在无细胞体系中，提高局部的DNA浓度，形成局部的大分子拥挤环境，从而达到了无细胞体系的高效率高产量表达。这说明，大分子拥挤环境所产生的影响并没有局限于整体的细胞，而是表现在胞内的每个隔室。扩展到无细胞体系来说，就是整体的无细胞体系存在大分子拥挤环境可以帮助增强蛋白质转录与翻译过程，同时局部的拥挤环境同样也能够带来蛋白质表达提升的效果。以基因模板来说，当局部的基因浓度提高时，无细胞体系的蛋白质表达量也会随之提高。
水凝胶是一类嵌在富水环境中的亲水性高分子链形成的三维网络，具有广泛可调节的物理和化学性质。从物理缠结形成到通过共价交联稳定，各种天然衍生和合成聚合物都可以加工成水凝胶。水凝胶的高含水量有助于保护和封装生物分子的活性，因此常被用于药物输送。水凝胶的形成条件非常的温和，这使得它们非常适合于细胞和蛋白质的封装。利用可降解交联剂，可以控制水凝胶分子的释放。交联降解后，交联之间的“网孔大小”或分子量增加，使截留的生物分子扩散出水凝胶。它们可以利用环境因素，如温度或酸碱度来影响水凝胶变化。使得刺激性水凝胶有很大的药物释放潜力。
但是，目前现有技术还没有对根据水凝胶的响应型的性质从而对基因进行包裹，造成大分子拥挤效应进而提高无细胞体系蛋白质合成的报道。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷，本发明的目的在于提供一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，其是使用响应型水凝胶包裹基因，通过响应体积相变将基因聚集在其表面，造成大分子拥挤，提高局部的基因浓度，实现无细胞体系的蛋白质高产量表达。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，其包括下述步骤：将包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶加入到无细胞体系中进行蛋白质的合成。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述响应型水凝胶包括温度响应型水凝胶、pH响应型水凝胶、光响应型水凝胶、电场响应型水凝胶和溶液环境响应型水凝胶中的一种或两种以上，优选为温度响应型水凝胶。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述温度响应型水凝胶包括聚N-异丙基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸三甘醇酯和聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，优选为聚异丙基丙烯酰胺。
优选的，对于上述所述的方法，其中当响应型水凝胶为温度响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，然后经过温度变化实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
优选的，对于上述所述的方法，其中，当所述温度响应型水凝胶为聚异丙基丙烯酰胺时，实现凝胶收缩的温度为34℃以上，优选为34-37℃；
实现凝胶溶胀的温度低于34℃，优选为4-34℃。
优选的，对于上述所述的方法去，其中，所述编码待合成的目标蛋白质的基因的浓度为1-1000ng/μL，优选为10-1000ng/μL。
优选的，对于上述所述的方法，其中，当响应型水凝胶为pH响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，然后经过溶液pH变化实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
优选的，对于上述所述的方法，其中，当响应型水凝胶为光响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，通过对凝胶进行光照实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
优选的，对于上述所述的方法，其中，当响应型水凝胶为电场响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，通过对凝胶施加电场实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
优选的，对于上述所述的方法，其中，当响应型水凝胶为溶液环境响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，通过改变溶液中溶质的浓度，实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
优选的，对于上述所述的方法，其中，当所述温度响应型水凝胶为聚异丙基丙烯酰胺时，在34℃以上的条件下，优选在34-37℃，将包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的聚异丙基丙烯酰胺水凝胶加入到无细胞体系中进行蛋白质的合成。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述无细胞体系的制备方法包括下述步骤：将细胞破碎得到细胞提取物，然后加入RNA聚合酶和辅助因子得到无细胞体系。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶。
优选的，对于上述所述的方法，其中，当编码待合成的目标蛋白质的基因的浓度为1-1000ng/μL，优选为10-1000ng/μL时，参与无细胞反应的基因量为0.14-139.33ng，优选为1.39-139.33ng。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述编码目标蛋白质的基因是以质粒或线性DNA形式存在的。
发明的效果
(1)聚集在水凝胶表面的基因相比于基因溶液来说，在进行无细胞反应时具有更高的蛋白质表达量，并且当吸附的基因浓度为10ng/μL时，蛋白质产量为原来的3.7倍。
(2)动力学试验显示水凝胶聚集基因进行无细胞反应时具有更好的动力学行为，能够更高效快速的合成目标蛋白质。
(3)转录过程分析显示水凝胶能够显著的提高无细胞蛋白合成系统的转录水平。
附图说明
图1是实施例1.1中所制备的水凝胶发生体积相变的示意图，其中，a为体积相变开始，b为体积相变结束，c为恢复到原有状态。
图2是制备包裹有sfGFP基因的质粒的聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶的过程示意图，首先空白水凝胶置于质粒溶液中，然后在环境温度上升至37℃时，水凝胶皱缩吸收质粒，当环境温度降低至4℃，水凝胶恢复包裹质粒。
图3是质粒包裹验证示意图，a为水凝胶表面，b为水凝胶中间层。
图4是实施例3.1无细胞反应初步测试的示意图。
图5是实施例3.2中包裹不同质粒量的水凝胶表达出的蛋白荧光值对比示意图。
图6是实施例3.4中响应型水凝胶的反应时间曲线
图7是实施例3.5中mRNA浓度随时间变化的曲线。
图8是实施例3.6中不同温度下水凝胶表达出的蛋白荧光值对比示意图。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，其包括下述步骤：将将包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶加入到无细胞体系中进行蛋白质的合成。
对于编码有待合成的目标蛋白质的基因的类型，本发明没有任何限制，只要是能作为基因模板用于合成目标蛋白质即可，例如可以为线性DNA或者mRNA，也可以为环状DNA或RNA，可以是任何来源的DNA或RNA，也可以是任何结构形式的DNA或RNA，只要是能作为基因模板最终转录翻译成蛋白质即可。具体来说，如果是质粒DNA，其表达质粒上只要是携带有编码目标蛋白质的基因即可。
对于待合成的目标蛋白质含有的氨基酸的数量，本发明没有任何限制，例如，待合成的目标蛋白质可以含有10-3000个氨基酸，优选为10-1000个氨基酸，例如，待合成的目标蛋白质可以含有10个氨基酸、50个氨基酸、100个氨基酸、200个氨基酸、300个氨基酸、400个氨基酸、500个氨基酸、600个氨基酸、700个氨基酸、800个氨基酸、900个氨基酸、1000个氨基酸、2000个氨基酸、3000个氨基酸等。
对于待合成的目标蛋白质的基因，本发明没有任何限制，例如可以为编码荧光蛋白的基因、编码生物催化酶的基因、编码疫苗蛋白的基因、编码抗体蛋白的基因、编码膜蛋白的基因、编码多肽的基因等。
所述响应型水凝胶指的是对温度或者pH或者光或者电场或者溶液环境具有响应型的水凝胶。
例如，温度响应型水凝胶为大分子链上同时具有亲水性的酰胺基团和疏水性基团，温度的变化可影响这些基团的疏水作用和大分子链间的氢键及大分子链和水分子间的相互作用力，从而破坏了凝胶体系中的平衡，使凝胶结构改变，发生体积相变。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述温度响应型水凝胶包括聚N-异丙基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸三甘醇酯和聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，优选为聚异丙基丙烯酰胺。
所述聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)含有酰胺基和异丙基，当温度较低时，亲水分酰胺基被水分子溶解，因此，聚合物是可溶的，这种氢键形成了高度结构化的水壳，当温度升高时，氢键减弱，随时疏水基团(异丙基)之间的相互作用变强，最终导致水从结构中释放出来，发生了体积相变，通常PNIPAM的相变转变温度为34℃，即当温度在34℃以上时，所述PNIPAM开始发生皱缩，释放出水凝胶内部的液体而当温度在低于34℃时，水凝胶又会吸收其周围的液体，恢复到原来的状态。
所述聚甲基丙烯酸三甘醇酯，由二甲基丙烯酸三甘醇酯缩聚而成，分子结构单元中同时存在亲水性的羰基、醚键以及疏水性的烷基基团。具有温度响应性，其相变转变温度为65℃，在65℃以上发生疏水性坍缩，在65℃以下即恢复原状。
所述聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯的分子结构单元中同时存在亲水性的叔胺基、羰基和疏水性的烷基基团，两类基团在空间结构上互相匹配，其具有温度和pH双重响应性，聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯的相变转变温度为55℃。
所述pH响应性水凝胶含有一定比例易水解或易质子化的酸、碱基团，如羧基或氨基，这些基团在溶剂中的行为强烈受pH值的影响，当外界的pH变化时，凝胶可电离基团发生质子化或去质子化效应，分子内和分子间的静电力作用使得体系发生可逆体积相转变。
所述光响应型水凝胶是一类在光(如紫外光、可见光、红外线等)作用下能迅速发生化学或物理变化而做出的刺激响应型水凝胶，且响应过程具有可逆性，停止光的作用后，水凝胶能够恢复到原来的状态。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，当响应型水凝胶为温度响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，然后经过温度变化实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。例如，当所述温度响应型水凝胶为聚N-异丙基丙烯酰胺时，其制备方法包括下述步骤：将聚N-异丙基丙烯酰胺与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，先升温到34℃以上水凝胶皱缩，优选在34-37℃的范围内水凝胶皱缩，然后再降温到低于34℃时，优选在4-34℃(此处不包含34℃)时，水凝胶通过体积相变可逆性进而将周围的基因吸入内部，从而得到包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶。
当所述温度响应型水凝胶为聚甲基丙烯酸三甘醇酯时，其制备方法包括下述步骤：将聚甲基丙烯酸三甘醇酯凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，先升温到65℃以上水凝胶皱缩，然后再降温到65℃以下时，水凝胶通过体积相变可逆性进而将周围的基因吸入内部，从而得到包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶。
当所述温度响应型水凝胶为聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，其制备方法包括下述步骤：将聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，先升温到55℃以上水凝胶皱缩，然后再降温到55℃以下时，水凝胶通过体积相变可逆性进而将周围的基因吸入内部，从而得到包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述编码待合成的目标蛋白质的基因的浓度为1-1000ng/μL，优选为10-1000ng/μL。
例如，所述含待合成的目标蛋白质的基因的浓度可以为1ng/μL、5ng/μL、10ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL、300ng/μL、400ng/μL、500ng/μL、600ng/μL、700ng/μL、800ng/μL、900ng/μL、1000ng/μL或其之间的任意范围。
所述基因的浓度指的是在制备包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶时反应体系中基因的浓度，进而所述响应型水凝胶中包裹的编码待合成的目标蛋白质的基因的浓度为0.99-986.07ng/μL，优选为9.86-986.07ng/μL，例如，所述响应型水凝胶中包裹的编码待合成的目标蛋白质的基因的浓度可以为0.99ng/μL、9.86ng/μL、15ng/μL、20ng/μL、30ng/μL、50ng/μL、80ng/μL、98.6ng/μL、200ng/μL、300ng/μL、400ng/μL、500ng/μL、600ng/μL、700ng/μL、800ng/μL、900ng/μL、986.07ng/μL或其之间的任意范围。
当基因的浓度为1-1000ng/μL，优选为10-1000ng/μL时，参与无细胞反应的基因量为0.14-139.33ng，优选为1.39-139.33ng，例如参与无细胞反应的基因量为0.14ng、1ng、1.39ng、10ng、13.93ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、110ng、120ng、130ng、139.33ng或其之间的任意范围。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，当所述响应型水凝胶为pH响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，然后经过溶液pH(例如在水凝胶单体pKa附近)变化实现凝胶的收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，当响应型水凝胶为光响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，通过对凝胶进行光照实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，当响应型水凝胶为溶液环境响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，通过改变溶液中溶质(如葡萄糖、酶等)的浓度，实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，当所述温度响应型水凝胶为聚异丙基丙烯酰胺时，在34℃以上的条件下，优选在34-37℃下，将包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的聚异丙基丙烯酰胺水凝胶在加入到无细胞体系中进行蛋白质的合成，例如，当温度在34℃、35℃、36℃、37℃或者以上时将包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的聚异丙基丙烯酰胺水凝胶加入到无细胞体系中进行蛋白质的合成。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述无细胞体系包括细胞提取物、RNA聚合酶和辅助因子。
所述细胞提取物来源于细菌细胞或者兔网状细胞或者小麦胚芽或者昆虫，优选为细菌细胞提取物；所述细菌细胞可以为任何细菌菌株的细胞提取物，例如大肠杆菌。
RNA聚合酶，其识别目标基因可操作地连接的启动子，例如T7RNA聚合酶；
在进行无细胞合成时，所述辅助因子提供蛋白质合成所需要的物质，所述辅助因子例如包括能量来源物质、氨基酸、盐、Mg2+以及其他试剂。
所述能量来源物质为化学底物，其可被酶促地作用以提供能量来实现期望的化学反应，通常使用的能量来源允许通过断裂如存在于核苷三磷酸(例如ATP)中的高能磷酸键来释放能量用于合成，可转变高能磷酸键的任何来源是特别适合的，通常，ATP、GTP以及其他磷酸盐被认为是用于支持蛋白合成的等同的能量来源，在本发明中优选为核苷三磷酸混合物(NTP mix)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，所述核苷三磷酸混合物包括亚精胺、腐胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、ATP、CTP、GTP、UTP、CoA、tRNA和亚叶酸。
所述氨基酸包括精氨酸(Arg)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、天冬酰氨(Asn)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)；
所述盐包括谷氨酸钾、谷氨酸铵和一水合草酸钾；
所述其他试剂包括氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽以及PEG8000。
在本发明中，所使用的表达基团为编码sfGFP的基因，所表达的荧光蛋白sfGFP的激发波长为485nm，发射波长为535nm。
本发明通过使用响应型水凝胶的可逆性相变反应，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中，在无细胞体系中，通过发生相变使质粒释放出来聚集在其表面形成了大分子拥挤效应，这极大的提高了无细胞体系的局部基因浓度，进而提高了酶转换效率，实现了蛋白质的高产量表达。
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
其中，大肠杆菌购自于北京博迈德基因技术有限公司
菌株E.coli BL21(DE3)-pAR1219，在Addgene购买含有编码T7RNA聚合酶基因的质粒，通过化学转化转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。
LSM-780激光共聚焦显微镜购自于Zeiss
QuantStudio实时荧光定量PCR仪购自于Applied Biosystems
Sirion 200扫描电子显微镜购自于日立高新技术公司
TI-2荧光显微镜购自于日本尼康
C1000PCR仪购自于Bio-Rad
引物1和引物2购自于苏州金唯智生物科技公司，引物1和引物2的序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
其中，引物1的序列为CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCAC
引物2的序列为TTAATGATGGTGATGGTGATGTTTGTACAGTTCATC
实施例1制备包裹有sfGFP基因的质粒的聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶
(1)制备微流控芯片：该芯片采用十字通道结构，使用厚度为3mm的透明PMMA板，经数控机床和直径为1mm的铣刀铣削而成，通道宽度1.05mm，深度1.05mm。将一块有十字通道的亚克力板与同尺寸无凹槽的PMMA板用热压机压合，内部插入外径1.0mm，内径0.7mm的玻璃毛细管。毛细管事先用拉伸仪拉制出直径约为100μm的尖端。在使用玻璃管组装芯片前，需要进行疏水性改造。使用95wt％乙醇的水溶液配置0.5wt％乙酸和2wt％十二烷基三甲氧基硅烷。将拉好的毛细管和承接管泡在改性液中放置一夜，然后放入90℃烘箱中烘干即可。
(2)制备热响应水凝胶：液滴微流控系统连续相(油相)为包含1wt％ABIL EM90的大豆油，分散相(水相)包含11.32wt％的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，0.77wt％的MBA以及0.6wt％的APS。在注射泵的推动下，控制分散相流速为300μL/min，连续相总流速为1000μL/min。芯片的通道交汇处连续形成大小均一的液滴。液滴被收集到装有连续相的培养皿中，在紫外灯面光源下照射20min固化，得到形态完整、透明的热响应水凝胶，其半径约为150μm。
将所形成的水凝胶放置在水相中，提高温度到37℃，然后再降温至4℃，整个过程在显微镜下观察，其结果如图1所示。
从图1可以看出，当温度在34℃以上时会发生体积相变。皱缩释放水凝胶内部的液体，当温度降低至4℃时，水凝胶又会吸收其周围的液体，恢复到原来的状态，即水凝胶具有体积相变可逆性。
(3)制备包含sfGFP基因的质粒：联系金唯智生物科技公司合成含有序列已知的sfGFP基因的质粒，利用PCR技术扩增sfGFP基因片段与pET-23a骨架，再通过Gibson组装反应将目的基因与质粒骨架连接即可。
(4)水凝胶包裹质粒：制备的水凝胶放入去离子水中1000rpm下离心清洗，去掉水凝胶表面的油相，取50个这样的空白水凝胶放在已知浓度的质粒溶液中，在37℃培养箱中放置1h，然后取出放置在4℃冰箱中1h。体积相变可逆性会使水凝胶将周围的质粒吸入内部，进而得到包裹质粒的热响应水凝胶，其制备流程如图2所示。
为了确认质粒能够通过热响应水凝胶的体积相变可逆性被包裹进水凝胶中，进行了激光共聚焦显微镜检测，将所得到的水凝胶加到载玻片上，使用Zeiss LSM-780倒置激光共聚焦显微镜进行逐层扫描观察，观察结果如图3所示。
从图3可以看出，通过对水凝胶表层和中间层对比发现质粒能够被吸附到水凝胶内部。
实施例2无细胞体系的制备
(1)制备大肠杆菌细胞提取物
A相关溶液的配置
①培养基：2×YTP：16g/L蛋白胨，10g/L酵母浸提物，5g/L NaCl，40mM K2HPO4，22mMKH2PO4，在制作固体平板时需加1.5％琼脂。
②Tris：2M Tris，高温灭菌后室温贮存。
③DTT：1M DTT，需用0.22μm滤头过滤除菌，-20℃贮存。
④S30A：14mM谷氨酸镁，60mM谷氨酸钾，50mMTris，乙酸调pH为7.7，4℃贮存。
⑤S30B：14mM谷氨酸镁，60mM谷氨酸钾，2M Tris调至pH值为8.2，4℃贮存。
B方法步骤
①一级种子液：挑菌到10mL 2×YTP培养基中，37℃，220rpm过夜培养。
②二级种子液：一级种子液转接到200mL 2×YTP培养基中，37℃220rpm培养约3h。
③三级发酵：二级种子液转接到1L摇瓶，37℃，220rpm培养；若接种于4L发酵罐中，则在37℃，500rpm的条件下培养。
④收获细胞：培养过程中监测生长状况，在对数生长期中后期(约3～4h)，8000rpm，10min离心沉淀收获细胞，用S30A清洗菌体2次，称量菌体质量，直接进行后续操作或﹣80℃保存待用。
⑤破碎细胞：按1g菌体湿重添加1mL S30A，重悬至匀浆。向高压破碎仪的腔室中加入大量的冰或冰袋，保持低温，控制压力在15000～20000psi，破碎2次。
⑥孵育：4℃，13000rpm，30min离心细胞破碎物，收集上清及测量体积，按1mL细胞裂解物中添加3μL 1M DDT的比例加入DTT，避光，37℃，120rpm孵育80min。
⑦透析：4℃，13000rpm离心30min，上清转至6～8kDa透析袋中，置于1L S30B中，4℃透析过夜。
⑧分装、冻存：收集透析过后的细胞提取物并4℃，13000rpm离心30min，将所得的上清分装于1.5mL EP管中，液氮闪冻，-80℃贮存。
(2)制备T7RNA聚合酶
A相关溶液配制
①培养基：LB液体(固体)培养基：1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸提物(1.5％琼脂)。
②细胞裂解液：50mMNaCl，10mM EDTA，10mM K2HPO4，1mM DTT，10mMβ-巯基乙醇，1×蛋白酶抑制剂，5％甘油，pH 8.0。
③透析缓冲液：50mMNaCl，1mM EDTA，40mM K2HPO4，1mM DTT，20％蔗糖，pH 7.7。
④S30缓冲液：10mMTris-乙酸，14mM乙酸镁，60mM乙酸钾，乙酸调至pH 8.2。
B操作步骤
①将含有T7RNA聚合酶质粒的菌株E.coli BL21(DE3)-pAR1219(Amp抗性)活化，挑菌到10mL LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养，获得种子液。
②转接到含有200mL LB培养基的1L挡板瓶中，37℃，220rpm培养。
③测量OD600值达到0.6～0.8时，加IPTG使其终浓度为0.1mM。
④继续培养2～3h，当OD600为2时，4℃，10000rpm，10min离心收获菌体，同时预冷细胞裂解液及透析缓冲液。
⑤将菌体转移至50mL BD管中，测量湿重，用菌体质量10倍体积的S30缓冲液洗涤菌体2次(4℃，10000rpm，10min)。
⑥每克菌体湿重加入预冷的细胞裂解液，重悬菌体，超声破碎仪破碎细胞(冰上进行)，程序设定为总时间40min，功率35％，超声2s，间歇6s。
⑦将破碎液于4℃，13000rpm，离心30min，留上清。
⑧将上清转移至6～8kDa透析袋中，置于1L预冷的缓冲液中透析过夜。
⑨将透析过的破碎液转移至新的BD管中，4℃，13000rpm离心30min，收集上清。
⑩分装到1.5mL EP管中，液氮闪冻，﹣80℃贮存。
(3)无细胞体系其他组分
A NTP Mix：配制1.5M亚精胺以及1M腐胺放置于﹣80℃。其他组分按下表顺序逐个添加，待上一试剂全部溶解后再加入下一种试剂。溶液的最终pH在7.4-7.6之间，液氮闪冻后﹣80℃保存。
表1 NTP Mix组分
Figure BDA0002579053540000141
Figure BDA0002579053540000151
B 25×PEP：磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)配制全程要在冰上进行。按1g/mL的比例加入无菌水，然后室温下用10M KOH调节溶液pH为7.4，由于在添加KOH的时候会放出较大热量，因此要缓慢滴入KOH。
C 19AAs：19种氨基酸浓度均为50mM，采取逐一添加的方式配制。顺序为精氨酸(Arg)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、天冬酰氨(Asn)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)，无需过滤，最终pH在8左右，加入浓盐酸调pH至7.4。
D 10×Salt：用摩尔比为1∶1的氨水(NH3·H2O)和谷氨酸(Glu)配制谷氨酸铵，无需调pH和过滤，分装，液氮闪冻，﹣80℃贮存。
表2 10×Salt组分
试剂 分子量(g/mol) 储备液浓度 CFPS浓度
谷氨酸钾 203.2 1.75M 175mM
谷氨酸铵 164.2 100mM 10mM
一水合草酸钾 184.2 27mM 2.7mM
E Mg2+：配制浓度为1M的Mg2+溶液，液氮闪冻，﹣80℃贮存。
F其他试剂配制：
①氧化型谷胱甘肽(GSSG)：储备液浓度为100mM，在CFPS中浓度一般为4mM，液氮闪冻，﹣80℃贮存。
②还原性谷胱甘肽(GSH)：储备液浓度为100mM，CFPS中浓度一般为1mM，液氮闪冻，﹣80℃贮存。
③PEG8000：取20g PEG8000溶于100mL去离子水中，常温保存。
实施例3无细胞体系中蛋白质的合成
按表3所示组分，在1mL EP管中构建无细胞蛋白合成系统：
表3无细胞体系组成
组分 反应体系(20μL)
10×Salt 2μL
PEP 1.6μL
NTP Mix 0.8μL
19AAs 0.8μL
GSSG 0.8μL
GSH 0.2μL
Mg<sup>2+</sup> 0.4μL
T7RNA聚合酶 0.2μL
PEG8000 2.5μL
细胞提取物 5μL
质粒 待定
ddH2O 待定
实施例3.1采用包裹有sfGFP基因的质粒的聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶的无细胞反应初步测试
由于实施例1所制备得到的水凝胶本身包含有一定量的溶液，温度上升，发生体积相变，水凝胶皱缩挤出所包裹的溶液进入质粒溶液中，导致了质粒溶液浓度降低，因此需要计算出水凝胶最终包裹的质粒浓度。
制备出的水凝胶近似看为球体，显微镜下测量出水凝胶的半径为150μm，通过球体体积计算公式得到50个水凝胶所包裹的溶液体积为：
Figure BDA0002579053540000161
质粒溶液浓度为：
Figure BDA0002579053540000162
选取10个包裹质粒的水凝胶按照表3的组分进行无细胞反应，计算加入的质粒量为：
P＝10VC＝10×0.1413×98.6＝139.3ng
相同质粒量的质粒溶液进行无细胞反应作为阳性对照，其结果如图4所示。
从图4可以看出，利用体积相变可逆性将质粒进行包裹的水凝胶能够表达绿色荧光蛋白。对比发现，水凝胶表达出的荧光值高于质粒溶液的，说明水凝胶包裹质粒进行无细胞反应能够有效的提高无细胞体系的蛋白质产量。出现这一现象的原因，主要就是水凝胶在发生体积相变时，其孔状结构为质粒提供了一个限制环境。原来的无细胞体系是溶液体系，质粒在体系中处于游离的状态。而水凝胶将质粒固定在了无细胞体系中，提高局部基因浓度，形成大分子拥挤环境，提高了蛋白质的表达量。
实施例3.2质粒聚集量的评估
使用实施例1所述的方法制备出包裹不同质粒浓度的水凝胶，然后按照实施例表3进行无细胞反应，同时相同质粒量的质粒溶液进行无细胞反应作为阳性对照，其具体的质粒浓度和参与反应的质粒量如表4所示，包裹不同质粒浓度的水凝胶进行无细胞反应的结果如图5所示。
表4质粒浓度以及参与反应的质粒量
质粒溶液浓度(ng/μL) 水凝胶中的质粒浓度(ng/μL) 参与无细胞反应的质粒量(ng)
1000 986.07 139.33
100 98.61 13.93
10 9.86 1.39
1 0.99 0.14
从图5可以看出，在不同的基因浓度下，被水凝胶包裹的质粒相比于原有的质粒溶液在进行无细胞反应时都表现出了始终如一的蛋白质高产率。随着质粒浓度的降低，蛋白质产量的增加率持续提高，到质粒浓度为10ng/μL时，蛋白质产量增加为原始的无细胞体系的3.7倍，但是随后质粒浓度降低，蛋白质产量的增加率开始降低。可能原因是受到水凝胶自身结构的限制，当所包裹的质粒溶液浓度过高时(即超过1000ng/μL)，水凝胶可能没有办法实现质粒的完全包裹。同时高浓度的质粒溶液还会形成阻碍，影响无细胞体系转录和翻译的正常进行。但当质粒溶液浓度过低时(即低于10ng/μL)，使得被包裹进水凝胶的质粒过少，无法形成大分子拥挤效应，也不会提高蛋白的表达量，即当质粒溶液的浓度在10-1000ng/μL范围内，能够形成大分子拥挤效应，从而提高蛋白的表达量。
实施例3.3热响应水凝胶聚集质粒所形成的大分子拥挤效应是否对无细胞反应的动力学行为造成影响
按照实施例1所述的方法制备包裹质粒的响应型水凝胶，其中，所使用的质粒溶液的浓度为10ng/μL，50个水凝胶添加到50μL质粒溶液中通过温度的变换进行质粒的包裹，取10个水凝胶参与无细胞反应，37℃过夜表达。每隔一个小时取样测量荧光值。同时使用具有相同质粒量的质粒溶液进行无细胞反应，每隔一小时取样一次作为阳性对照，结果如图6所示。
从图6可以看出，荧光蛋白表达量随着时间的延长表现出了逐渐增加的趋势。但是水凝胶与质粒溶液这两个体系之间还是存在明显的差异。首先是水凝胶的时间跨度要长，水凝胶聚集质粒在进行无细胞反应，8个小时后达到蛋白质表达的平台期，而质粒溶液则在反应4小时后就达到了平台期。另外就是水凝胶聚集质粒表达蛋白质的速度要快于质粒溶液。因此，热响应水凝胶聚集质粒进行无细胞反应时具有更好的动力学行为。
分析上述现象产生的原因，应该是热响应水凝胶通过体积相变导致的。包裹质粒的水凝胶受到环境温度的影响发生体积相变，皱缩释放出质粒。由于水凝胶的多孔结构使得水凝胶发生皱缩时能够将质粒聚集在其表面，从而固定在无细胞体系当中，形成了大分子拥挤环境。这导致更高的局部基因浓度，使得酶转换效率大大提高，帮助无细胞体系快速合成目标蛋白质。
实施例3.5响应型水凝胶对转录过程的影响
步骤如下：
1.首先从反应体系中提取总mRNA(Eastep Super Total RNA Extraction Kit，Promega Corporation)
(1)样品裂解物制备：吸取5μL无细胞体系(体系中水凝胶包裹质粒量为9.86ng/μL)，添加100μL无核酸酶水进行稀释，加入200μL RNA裂解液，混匀。
(2)向样品裂解物中添加300μL RNA稀释液，静置3-5min。
(3)加入300μL的无水乙醇，吹打3-4次，混合均匀。
(4)将混合物添加到离心柱中，13000rpm离心1min，弃管中液体。
(5)加600μL RNA洗液，13000rpm离心1min，弃管中液体。
(6)配制DNA酶Ⅰ孵育液，如下表所示：
表5 DNA酶Ⅰ孵育液组分
试剂 体积
10×DNA酶Ⅰ缓冲液 5μL
DNA酶Ⅰ 5μL
无核酸酶水 40μL
(7)将50μL DNA酶Ⅰ孵育液添加到吸附膜中，室温静置15min。
(8)添加600μL RNA洗液，13000rpm离心45s，弃滤液，重复一次，将离心柱重新安置在管上，13000rpm离心2min。
(9)离心柱中央加入50～200μL无核酸酶水，然后将其转移到洗脱管上，室温静置2min，13000rpm离心1min，将RNA保存在-80℃中。
2.立即进行反转录得到cDNA(FastKing RT Kit(With gDNase)(TIANGEN，KR116))。
(1)将模板RNA冰上解冻，反应组分在室温下解冻，解冻后迅速置于冰上。(接下来的所有操作均在冰上进行)
(2)配制基因组DNA的去除体系混合液，如下表所示：
表6基因组DNA的去除体系混合液组分
组成成分 使用量
5×gDNA Buffer 2μL
RNA 8μL
Rnase-Free ddH2O 10L
(3)配制好的混合液42℃孵育3min，冰上静置。
(4)配制反转录反应体系混合液，如下表所示：
表7反转录反应体系混合液组分
Figure BDA0002579053540000191
Figure BDA0002579053540000201
(5)将反转录中的Mix添加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。
(6)42℃，孵育15min。
(7)95℃，cDNA孵育3min后低温保存。
3.进行实时荧光定量核酸扩增(TranStart Green qPCR SuperMix Kit(TranStart，AQ101))
按表8所示配置扩增体系，并按照表9程序进行扩增，用ABI 7300实时PCR系统读取CT值。
表8实时荧光定量核酸扩增反应组分
组分 反应体系(20μL)
正向引物(10μM，引物1) 0.4μL
反向引物(10μM，引物2) 0.4μL
2×TransStart Top Green QPCR SuperMix 10μL
Passive Reference Dye(50×) 0.4μL
Nuclease-free Water 4μL
DNA模板 4.8μL
表9实时荧光定量核酸扩增循环设定
Figure BDA0002579053540000202
使用上述所述的方法扩增已知浓度的sfGFP基因，重复后续实验步骤得到cDNA浓度与CT值关系的标准曲线，进而可根据测量的CT值得到反应体系中的mRNA浓度，其反应体系中的mRNA浓度随时间变化的曲线如图7所示，质粒溶液作为阳性对照。
从图7可以看出，相比于质粒溶液，利用热响应水凝胶聚集质粒进行无细胞反应时具有更高的mRNA浓度，这说明水凝胶能够显著的提高无细胞蛋白合成系统的转录水平，从而导致更高量的蛋白质的表达。
推测实现高转录效率的原因主要是因为热响应水凝胶发生体积相变，将包裹在其内部的质粒聚集在其表面形成了大分子拥挤效应。这极大的提高了无细胞体系的局部基因浓度，进而提高了酶转换效率，实现了蛋白质的高产量表达。
实施例3.6不同的反应温度对无细胞体系反应的影响
将实施例1所得到的水凝胶加入到实施例3中表3的无细胞反应体系中，分别在30℃和37℃培养箱中进行无细胞反应，反应时间为10h，并使用具有相同质粒量的质粒溶液作为阳性对照，实验结果如图8所示。
从图8可以看出，当环境温度为30℃时，被水凝胶包裹的质粒进行无细胞反应表达出的荧光蛋白荧光值低于质粒溶液反应所得到的；而当环境温度为37℃时，被水凝胶包裹的质粒进行无细胞反应表达出的荧光蛋白荧光值则高于质粒溶液反应所得到的。这一结果显示水凝胶的体积相变释放并聚集质粒是导致无细胞体系蛋白质表达量提高的原因。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法
<130> PD01052
<141> 2020-07-10
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cgatcccgcg aaattaatac gactcac 27
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttaatgatgg tgatggtgat gtttgtacag ttcatc 36

Claims (10)

1.一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，其包括下述步骤：将包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶加入到无细胞体系中进行蛋白质的合成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述响应型水凝胶包括温度响应型水凝胶、pH响应型水凝胶、光响应型水凝胶、电场响应型水凝胶和溶液环境响应型水凝胶中的一种或两种以上，优选为温度响应型水凝胶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述温度响应型水凝胶包括聚N-异丙基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸三甘醇酯和聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯，优选为聚异丙基丙烯酰胺。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，当响应型水凝胶为温度响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，然后经过温度变化实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，当所述温度响应型水凝胶为聚异丙基丙烯酰胺时，实现凝胶收缩的温度为34℃以上，优选为34-37℃；
实现凝胶溶胀的温度低于34℃，优选为4-34℃。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述编码待合成的目标蛋白质的基因的浓度为1-1000ng/μL，优选为10-1000ng/μL。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，当响应型水凝胶为pH响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，然后经过溶液pH变化实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
8.根据权利要求2所述的方法，其中，当响应型水凝胶为光响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，通过对凝胶进行光照实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
9.根据权利要求2所述的方法，其中，当响应型水凝胶为电场响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，通过对凝胶施加电场实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，当响应型水凝胶为溶液环境响应型水凝胶时，所述包裹有编码待合成的目标蛋白质的基因的响应型水凝胶的制备方法包括下述步骤：将所述响应型水凝胶与编码待合成的目标蛋白质的基因混合，通过改变溶液中溶质的浓度，实现凝胶收缩与溶胀，使编码待合成的目标蛋白质的基因包裹于响应型水凝胶中。
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