CN115970598A

CN115970598A - 一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法

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Publication number: CN115970598A
Application number: CN202111205245.4A
Authority: CN
Inventors: 陈庭坚; 张汝洁; 彭乐丽; 叶方开; 陈薛亦; 何传平
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明公开了一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，属于生物材料技术领域。本发明方法操作如下：在含有phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基修饰的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸；所得核酸浓缩、退火，将退火产物与化学交联剂在磷酸盐缓冲液中混合，孵育，即获得所述的水凝胶。本发明通过酶法合成碱基上有修饰的核酸，提供了共价结合位点，通过引入共价键解决了基于氢键结合的DNA水凝胶稳定性低的问题。通过滚环扩增可快捷获取大量核酸，为新型核酸水凝胶的形成提供了一种简易、普适性高的制作方法。

Description

一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法。

背景技术

phi29DNA聚合酶是来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的嗜温(30℃)DNA聚合酶，属于B型DNA聚合酶^[1]。2001年phi29DNA聚合酶首次被用于等温多重引物滚环扩增^[2]，利用phi29DNA聚合酶特殊的链置换和连续合成特性，以环状DNA为模板，以短的与部分环状模板互补的DNA为引物，在phi29DNA聚合酶的催化下，以dNTPs为原料合成单链DNA。该单链DNA产物包含多个串联重复序列的核酸片段，无需常规PCR所需的热循环步骤即可形成。等温多重引物滚环扩增方法具有高速、有效的特点，短时间内即可实现1万倍的扩增，可连续合成长达70kb的DNA片段。同时，phi29DNA聚合酶具有3’到5’外切酶校正功能，因而错误率比标准的Taq聚合酶低1000倍^[3]。扩增产物可用于SNP基因分型、DNA测序等。使用phi29DNA聚合酶的多引物滚环扩增还具有能够产生双链产物的优点，使其应用于后续限制性内切酶消化或其他基因克隆、核酸标记和靶标检测的相关方法成为可能。

已有研究探索了phi29DNA聚合酶识别部分糖修饰核酸的活性。己糖核酸(HNA)和阿拉伯糖核酸(FANA)在该聚合酶的活性位点中没有明显的空间位阻，核酸外切酶缺失的phi29DNA聚合酶表现出了对此类XNA的合成活性，并可能实现滚环扩增，合成含有这类XNA的长链核酸分子^[4]。近年来，phi29DNA聚合酶凭借这些独特的性质，被广泛应用于多种DNA功能高分子材料的制备中。其中，DNA水凝胶是一种交联亲水性聚合物，是以DNA为结构基元构筑的三维高分子网络，近年来成为国际热点研究方向。DNA水凝胶既利用了水凝胶的骨架结构，也保留了DNA的生物功能，实现了水凝胶材料结构与功能的完美融合，在生物传感器制备、药物递送、细胞培养、蛋白质体外合成、智能器件开发、环境保护等领域表现出广泛的应用前景。此外，随着精准医疗和分子诊断技术的出现，phi29DNA聚合酶将在核酸测序和病毒检测中具有重要的应用价值。DNA是生命系统的核心遗传物质，引导生物发育和生命机能运作。从材料化学角度，DNA是一种天然的生物高分子，具有合成高分子无法比拟的特点。例如：碱基互补配对特性使DNA具有精准、高效的自组装能力；DNA序列多样可调，结构精准可控，具有丰富的刺激响应性；自然进化赋予生物体丰富多样的生物酶，可在分子水平对DNA进行精准操作；DNA具有良好的生物相容性和生物可降解性。

碱基修饰核酸大多是在天然碱基的不同部位进行化学修饰后而形成的衍生物。相比天然核酸，某些碱基修饰核酸具有更加丰富的性能，在生物工程、纳米技术、分子生物学和医学等领域具有巨大的应用潜力。合成碱基修饰核酸主要有化学合成和酶合成两种方法。通常情况下，化学合成碱基修饰核酸操作困难且效率低下，此外，某些修饰不能用化学方法引入。酶合成是另一种制备碱基修饰核酸对方法。目前已经报道了用聚合酶链式反应(PCR)合成含有5-取代嘧啶类似物^[5-6]和各种嘌呤衍生物的碱基修饰核酸^[7]。然而，这类合成方法依赖繁琐的热循环步骤，效率低下，且无法均一扩增产物，极大限制了碱基修饰核酸的推广应用。

参考文献：

[1]Arunas L,Zivile K,Vilma Z-R等.Duality of polynucleotide substratesfor Phi29 DNA polymerase:3’-->5’RNase activity of the enzyme.[J].RNA(NewYork,N.Y.),2008,14(3).

[2]Dean F B,Nelson J R,Giesler T L等.Rapid Amplification of Plasmidand Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling CircleAmplification[J].Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001,11(6).

[3]练杜娟,仇建萍,张平静等.Phi29DNA聚合酶最新应用研究进展[J].药物生物技术,2016,23(02):150–154.

[4]Torres L L,Pinheiro V B.Xenobiotic Nucleic Acid(XNA)Synthesis byPhi29DNA Polymerase[J].Current Protocols in Chemical Biology,2018,10(2):e41.

[5]Ja¨ger,S.,and Famulok,M.(2004)Generation and enzymaticamplification of high-density functionalized DNA double strands.Angew.Chem.,Int.Ed.43,3337–3340.

[6]Wong,K.K.,and McClelland,M.(1991)PCR with 5-methyldCTP replacingdCTP.Nucleic Acids Res.19,1081–1085.

[7]Bailly,C.,and Waring,M.J.(1995)Transferring the purine 2-aminogroup from guanines to adenines in DNA changes the sequence-specific bindingof antibiotics.Nucleic Acids Res.23,885–892.

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述方法制备得到的非天然核酸水凝胶。

本发明的再一目的在于提供通过上述非天然核酸水凝胶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，包括如下步骤：

(1)制备碱基上含氨基连接臂的核酸：在含有phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基修饰的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸；

(2)制备非天然核酸水凝胶：步骤(1)所得核酸浓缩、退火，将退火产物与化学交联剂在磷酸盐缓冲液中混合，孵育，即获得所述的水凝胶。

步骤(1)中所述的掺入的方式可以是完全替代或部分替代天然核苷酸中的一种或多种，以最终得到的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸含量为10％～40％为优。

步骤(1)中所述的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸优选为间隔分布，更优选为等间隔分布，长度优选为1000～5000bp；更优选为2000bp。

步骤(1)的具体操作优选如下：在phi29DNA聚合酶缓冲液加入模板和引物，退火结合；退火后加入dNTPs、BSA(牛血清蛋白)和phi29DNA聚合酶，孵育。所述的phi29DNA聚合酶缓冲液中各物质的浓度以1×phi29DNA聚合酶缓冲液含有：模板5～20nmol/L、引物5～20μmol/L、dNTPs各0.4～0.6mmol/L、BSA 0.02～0.03mg/mL、phi29DNA聚合酶0.2～0.3U/μL计；更优选为模板10nmol/L、引物10μmol/L、dNTPs各0.5mmol/L、BSA 0.025mg/mL、phi29DNA聚合酶0.25U/μL。

所述的退火结合的条件为95℃，5min，逐渐冷却至室温(20～30℃)后于冰上放置5min；所述的孵育的条件为27～32℃，10～14h，更优选为30℃，12h。

步骤(1)中所述的滚环扩增反应优选进行2～4轮。

步骤(2)中所述的化学交联剂优选为磺基双琥珀酰亚胺酯多聚乙二醇NHS-PEG_n-NHS，其中，所述PEG_n中的n为聚乙二醇中乙二醇单体的个数，所述n的取值范围为2～12，更优选为6。

步骤(2)中所述的浓缩优选通过30kDa的过滤膜在6000rpm离心30min实现。

步骤(2)中所述的退火的条件优选为95℃，5min，逐渐冷却至室温。

步骤(2)中所述的孵育体系中各物质的终浓度分别优选为：退火产物2～4μg/μL、化学交联剂2～4mmol/L；孵育的条件为35～40℃，10～14h；更优选为退火产物3μg/μL、化学交联剂3mmol/L；孵育的条件为37℃，12h。

步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液优选pH 8.4～8.6的磷酸盐缓冲液。

一种非天然核酸水凝胶，通过上述方法制备得到。

上述非天然核酸水凝胶在生物医学领域中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明探究了phi29DNA聚合酶对碱基上带有修饰的核苷酸的识别，拓展了phi29DNA聚合酶底物谱，并在此基础上提出了一种利用非天然核酸骨架高效制备核酸水凝胶的方法。通过phi29DNA聚合酶滚环复制方法扩增碱基修饰核酸，从而制备共价交联的DNA水凝胶。在这之前从未有通过phi29DNA聚合酶滚环扩增制备共价交联水凝胶的相关研究。

本发明探究了phi29DNA聚合酶对含氨基连接臂的核苷酸识别以及对非天然碱基对的识别能力。通过酶法合成碱基上有修饰的核酸，提供了共价结合位点，由于共价键比氢键稳定性更强，从而可提高DNA水凝胶的稳定性。通过滚环扩增可快捷获取大量核酸，为新型核酸水凝胶的形成提供了一种简易、普适性高的制作方法。

附图说明

图1是本发明非天然核酸水凝胶的制作流程示意图；其中，a)为dCTP分子结构；b)为5-propargylamino-dCTP分子结构；c)为NHS-PEG₆-NHS的结构；d)为非天然核酸与PEG交联制备水凝胶的示意图。

图2是通过引物延伸验证phi29DNA聚合酶对碱基修饰核苷三磷酸(以5-propargylamino-dCTP为例)识别活性结果图；其中，泳道P0为引物；泳道P1为阳性对照组，以天然的dNTPs为底物的延伸产物；泳道P2为实验组，以5-propargylamino-dCTP、天然的dGTP、dTTP和dATP为底物的延伸产物；泳道P3为阴性对照组，以不含5-propargylamino-dCTP的dNTPs(只有天然的dGTP、dTTP和dATP)为底物的延伸产物(P3)。

图3是通过phi29DNA聚合酶RCA掺入有碱基修饰核苷酸(5-propargylamino-dCTP)扩增产物电泳图；其中，泳道1为实验组，以天然的dGTP、dTTP、dATP和含有修饰的5-propargylamino-dCTP的RCA产物；泳道2为对照组，以天然的dNTPs为底物的RCA产物。

图4是水凝胶形貌图；其中，a)为含氨基连接臂的核苷酸(5-propargylamino-dCTP)滚环扩增3轮图；b)为滚环扩增3轮产物与NHS-PEG₆-NHS反应产物照片。

图5是非天然核酸水凝胶的荧光显微镜和扫描电子显微镜观察结果图；其中，a)为荧光显微镜；b)为扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

下述实施例中涉及的材料或试剂：

phi29DNA聚合酶购自：New England Biolabs，型号为M0269S；

5-propargylamino-dCTP购自：芜湖华仁科技有限公司，型号为HR-00104022；

NHS-PEG₆-NHS购自：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，型号为N164063；

dNTP套装购自：New England Biolabs，型号为N0446S；

下述实施例中涉及的序列如下表1所示，委托上海生物工程股份有限公司合成：

表1序列名称和序列

注：N为任意碱基

实施例1探究phi29DNA聚合酶对碱基修饰核苷酸(5-propargylamino-dCTP)的识别性能

1)利用碱基修饰核苷三磷酸(5-propargylamino-dCTP)的引物延伸：

将5'端羧基荧光素(FAM)修饰的引物FAM-T75-R(1μmol/L)在2×phi29DNA聚合酶缓冲液中退火到DNA模板T1(2μmol/L)上(反应条件：95℃，5min，逐渐冷却至室温后于冰上放置5min)。将退火后的模板/引物混合物(0.5μmol/L)、天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各0.4mmol/L、BSA(0.05mg/mL)、phi29DNA聚合酶(0.25U/μL)在1×phi29DNA聚合酶缓冲液中30℃孵育12h。除了实验组(P2)外，设置阳性对照组：以天然的dNTPs为底物的延伸产物(P1)；阴性对照组：以不含5-propargylamino-dCTP的dNTPs(只有天然的dGTP、dTTP和dATP)为底物的延伸产物(P3)。用15％尿素胶电泳，可直接通过照胶仪呈现含有5’-FAM引物的延伸条带。结果如图2所示。实验组用5-propargylamino-dCTP替代天然的dCTP，延伸产物的条带位置(P2)与阳性对照组的条带位置(P1)基本一致，而阴性对照组(P3)不加入5-propargylamino-dCTP则无法延伸。说明phi29DNA聚合酶能识别5-propargylamino-dCTP，并且可以合成含有炔丙氨基的核酸链。

2)通过phi29DNA聚合酶RCA掺入有碱基修饰(5-propargylamino-dCTP)核苷酸：

在1×phi29DNA聚合酶缓冲液中，将pUC19质粒作为模板(10nmol/L)与六碱基随机引物Hexamer(5μmol/L)退火结合(反应条件：95℃，5min，逐渐冷却至室温后于冰上放置5min)。退火后加入dNTPs(0.5mmol/L)、BSA(0.025mg/mL)和phi29DNA聚合酶(0.25U/μL)，其中对照组以天然的dNTPs为底物，实验组以天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP为底物。在1×phi29DNA聚合酶缓冲液中以30℃孵育12h。RCA反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳验证是否有堵在孔里的大分子，从而验证是否形成长链DNA。如图3，泳道1为用5-propargylamino-dCTP替代天然的dCTP的RCA产物，泳道2为天然dNTPs为底物的RCA产物。与对照组相比，实验组的RCA产物略微较少，但胶孔里有明显条带，说明phi29DNA聚合酶可以通过RCA将5-propargylamino-dCTP整合到核酸链，合成含有炔丙氨基的大分子长链DNA。

实施例2非天然核酸水凝胶的制备

非天然核酸水凝胶的制备方法分为两步：

1)3轮RCA获取含有炔丙氨基的长链核酸。在1×phi29DNA聚合酶缓冲液中加入六碱基随机引物Hexamer(10μmol/L)，将其退火到质粒pUC19(10nmol/L)上(反应条件：95℃，5min，逐渐冷却至室温后于冰上放置5min)。退火后加入dNTPs(dGTP、dTTP、dATP和5-propargylamino-dCTP各0.5mmol/L)、BSA(0.025mg/mL)和phi29DNA聚合酶(0.25U/μL)，在30℃孵育12h。第一轮RCA结束后，在体系中补加六碱基随机引物Hexamer(5μmol/L)，再次退火，并加入dNTPs(dGTP、dTTP、dATP和5-propargylamino-dCTP各0.5mmol/L)、BSA(0.025mg/mL)和phi29DNA聚合酶(0.25U/μL)，在30℃孵育12h。第二轮反应结束后，再次重复第二轮RCA操作。反应产物如图4a)所示，通过RCA可整合含有炔丙氨基的长链核酸，但不能直接形成肉眼可见的大分子交联物。

2)RCA产物与NHS-PEG₆-NHS交联形成水凝胶。在三轮RCA获得长链核酸后，将扩增产物用30kDa的Amicon过滤器在6000rpm离心30min，将浓缩后的产物在95℃加热5min后逐渐冷却至室温。在1×PBS(pH 8.5)缓冲液中将浓缩并退火后的产物(3μg/μL)与NHS-PEG₆-NHS(3mmol/L)反应，37℃孵育12h即可形成水凝胶。如图4b)所示。RCA产物与NHS-PEG₆-NHS反应后可形成肉眼可见的水凝胶。

综上，RCA产物不能形成肉眼可见的产物，但加入NHS-PEG₆-NHS后可形成肉眼可见的水凝胶。

实施例3非天然核酸水凝胶的表征

1)用荧光显微镜表征形貌：取10μL核酸交联形成的大分子絮状液，滴加在载玻片上，取1μL Cyber Gold核酸染料与之混匀，静置15min，盖上盖玻片，将荧光显微镜调到绿光通道进行观察拍摄。如图5a)所示，水凝胶呈现大小不一的孔洞状。

2)用扫描电子显微镜表征形貌：取5μL核酸交联形成的大分子絮状液，滴加在玻璃片上，用冷冻真空干燥机将其干燥。在干燥后的样品表面喷金，即可用扫描电镜观察拍摄。观察其内部的精细结构，图5b)所示，水凝胶整体呈片层状。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 华南理工大学

<120> 一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T1

<400> 1

ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 60

ataaagtgta aagcc 75

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FAM-T1-R

<220>

<223> 5'端含羧基荧光素（FAM）修饰

<400> 2

tggctttaca ctttatgctt ccg 23

Claims

1.一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的化学交联剂为磺基双琥珀酰亚胺酯多聚乙二醇NHS-PEG_n-NHS，其中，PEG_n中的n为聚乙二醇中乙二醇单体的个数，所述n的取值范围为2～12，进一步为6。

3.根据权利要求1或2所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的浓缩通过30kDa的过滤膜在6000rpm离心30min实现；

步骤(2)中所述的退火的条件为95℃，5min，逐渐冷却至室温。

4.根据权利要求1或2所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的孵育体系中各物质的终浓度分别为：退火产物2～4μg/μL、化学交联剂2～4mmol/L；孵育的条件为35～40℃，10～14h；

步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液是pH 8.4～8.6的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1或2所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的掺入的方式是完全替代或部分替代天然核苷酸中的一种或多种，最终得到的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸含量为10％～40％；

步骤(1)中所述的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸为间隔分布，长度为1000～5000bp。

6.根据权利要求1或2所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(1)的具体操作如下：在phi29DNA聚合酶缓冲液加入模板和引物，退火结合；退火后加入dNTPs、牛血清蛋白和phi29DNA聚合酶，孵育。

7.根据权利要求6所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

所述的phi29DNA聚合酶缓冲液中各物质的浓度分别为：模板5～20nmol/L、引物5～20μmol/L、dNTPs各0.4～0.6mmol/L、牛血清蛋白0.02～0.03mg/mL、phi29DNA聚合酶0.2～0.3U/μL。

8.根据权利要求6所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

所述的退火结合的条件为95℃，5min，逐渐冷却至室温后于冰上放置5min；所述的孵育的条件为27～32℃，10～14h。

9.一种非天然核酸水凝胶，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。

10.权利要求1～8任一项所述的非天然核酸水凝胶在生物医学领域中的应用。