CN105368800A - 一种热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种热启动Taq？DNA聚合酶及其制备方法。所述热启动Taq？DNA聚合酶由Taq？DNA聚合酶与醛基化多聚糖结合获得，所述结合通过Taq？DNA聚合酶的氨基与醛基化多聚糖的醛基反应形成酰胺键实现，所述酰胺键能在95℃温度下5分钟以上断开，从而释放Taq？DNA聚合酶的聚合活性，同时多聚糖对Taq？DNA聚合酶具有保护作用，既抑制了Taq？DNA聚合酶在低温下3’到5’的聚合活性，又作为Taq？DNA聚合酶的保护剂有利于增强PCR反应的效率。使用该方法制备的热启动Taq？DNA聚合酶可以广泛使用分子生物学，法医DNA检测等领域。
Description
技术领域
本发明涉及DNA聚合酶及其制备方法，尤其涉及一种热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法。
背景技术
PCR反应(PolymeraseChainReaction)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它的目的是使得DNA片断在短时间内迅速扩增，具有特异，敏感，产率高，快速，简便，重复性好，易于自动化等突出优点，使它在分子生物学和医学领域迅速得到了广泛的实际应用。被许多科学家视为近几十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。
PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，它可以使人们通过几个小时的试管内的DNA聚合反应，就可将DNA扩增109倍。通过PCR技术不仅可以扩增存在于样品中的DNA，也可以富集混合DNA分子中的任一种。PCR的重要价值在于扩增存在微量而特殊的DNA序列。这项技术是由KaryMullis于1985年发明的，为此他获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的原理：
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加人DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
标准的PCR过程分为三步:
1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
2.退火(8℃-65℃):系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸(70℃-75℃):在耐热性DNA聚合酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下，以dNTP为原料，从引物的3’端向5’端延伸，合成与模板互补的DNA链。
在PCR技术中，耐热的TAQDNA聚合酶是一个关键。耐热性DNA聚合酶的应用价值依赖于它的功能特性，主要功能特性有:
(1)耐热性:耐热DNA聚合酶是聚合酶链式反应(PCR)技术得以实现自动化的关键。它使PCR过程中高温(90℃以上)解链、低温(60℃左右)退火和中温(约70℃)延长均可在酶一次性加入的情况下反复循环。
(2)聚合活性和效率:是指酶分子对模板和底物的亲和性以及酶的催化效率，一般以转换数和最高比活表示。反应体系中模板和底物浓度、缓冲体系和二价离子及扩增目标DNA的长度对聚合活性和催化效率也有较大的影响。
(3)3’－5’外切酶活性:有的DNA聚合酶具有3’－5’外切活性，使TAQDNA聚合酶具有校读或更正复制或修复过程中的3’末端错误。
(4)5’－3’外切酶活性:有的DNA聚合酶具有5’－3’外切活性，它可用在PCR产物检测系统，以产生特异性的可检测的扩增的信号。但对模板特别是环状DNA的质粒模板的水解作用会影响PCR的扩增效率。
(5)反转录活性:有的DNA聚合酶具有反转录活性，特别是耐热的具有反转录活性的DNA聚合酶，可用于cDNA文库的单酶法构建和扩增，可克服mRNA二级结构对反转录过程的抑制作用，简化构建和扩增过程。
(6)保真度:主要是与酶对模板和底物的亲和性及识别能力有关。其次是3’－5’外切的校正作用可大大提高DNA聚合酶的保真度。高保真度有利于扩增长片断DNA，保真度较低时容易在出错处中止扩增。
Taq酶是一种耐热性单亚基酶，分子量为93909Da，由832个氨基酸组成，含有有7个结构域,功能区域被定位在287-832氨基酸之间。酶学分类为EC1.7.7.7，具有5’－3’端聚合酶特性，最适温度为72-80℃，95℃半衰期为40min，100℃半衰期为5min。高于DNA变性温度，因此能够用于PCR扩增。TaqDNA聚合酶是至今发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种，每分子酶每秒钟可延伸150个核醉酸，是所有嗜热DNA聚合酶中延伸速度是最快的，扩增的DNA长度可达20kb。
热启动聚合酶链式反应(HotstartPCR)是一种改良的聚合酶链式反应方法，主要用来避免操作过程中产生非特异性序列的扩增。将DNA聚合酶与其他反应物隔绝，或是使用在高热状况下才会活化的聚合酶，避免在未达到设定温度前就开始反应。目前实现PCR热启动方法包括：手工热启动方法、蜡防护层包裹法、抗体修饰法以及化学修饰法等几种。商业化热启动TaqDNA聚合酶还包括抗体修饰法和化学修饰法等为主。手工热启动操作繁琐，在实际应用中不可行，蜡防护层包裹法非常不稳定无法商业化，抗体法使用的抗体是通过动物免疫得到的抗体，制备过程复杂，价格昂贵。
如何提供一种简单、有效的制备具有稳定增强PCR反应效率的热启动TaqDNA聚合酶的方法成为有待解决的问题。
发明内容
本发明提供一种热启动TaqDNA聚合酶,所述TaqDNA聚合酶由TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合获得，所述结合通过TaqDNA聚合酶的氨基与醛基化多聚糖的醛基反应形成酰胺键实现，所述酰胺键能在95℃温度下5分钟以上断开，从而释放TaqDNA聚合酶的聚合活性，同时多聚糖对蛋白有保护作用，既抑制了TaqDNA聚合酶在低温下3’到5’的聚合活性，又作为TaqDNA聚合酶的保护剂有利于增强PCR反应的效率。
本发明还提供了一种制备热启动TaqDNA聚合酶的方法，通过所述方法能简单、有效的制备具有稳定增强PCR反应效率的热启动TaqDNA聚合酶。
本发明提供的一种热启动TaqDNA聚合酶，所述TaqDNA聚合酶由TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合获得，所述结合通过TaqDNA聚合酶的氨基与醛基化多聚糖的醛基反应形成酰胺键实现，所述酰胺键能在95℃温度下5分钟以上断开，所述多聚糖由下式表示，其中n为40-200，
在本申请的方案中，用于制备本申请热启动TaqDNA聚合酶的TaqDNA聚合酶可以选自本领域常规使用的、可商购获得的普通TaqDNA聚合酶、快速TaqDNA聚合酶、高保真TaqDNA聚合酶和长片段扩增TaqDNA聚合酶等。进一步的，酶活力单位可以大于150U/mg。
在本发明的一个具体实施方式中，所述醛基化多聚糖由氧化剂氧化多聚糖获得，所述氧化剂为NaIO4。
在本申请的方案中，所述多聚糖为葡聚糖或壳聚糖。进一步的，所述多聚糖为葡聚糖40、葡聚糖70或壳聚糖50。
进一步的，所述氧化剂氧化多聚糖的条件为：将1g-10g所述多聚糖溶解于100mL的0.02M-0.2M的NaIO4的醋酸盐缓冲液中，该缓冲液的pH为4-6，然后在4℃-8℃避光反应20h-48h，反应结束后用蒸馏水透析3-4次，经浓缩干燥得到粉末状的醛基化多聚糖。
更进一步的，所述氧化剂氧化多聚糖的条件为：将2-5g所述多聚糖溶解于100mL的0.1M-0.15M的NaIO4的醋酸盐缓冲液中，该缓冲液的pH为4-6，然后在4℃-8℃避光反应20h-48h，反应结束后用蒸馏水透析3-4次，经浓缩干燥得到粉末状的醛基化多聚糖。
更进一步的，所述TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合的条件为：将所述醛基化多聚糖加入浓度为50mg/L的TaqDNA聚合酶的水溶液中形成氧化混合物，其中所述醛基化多聚糖与TaqDNA聚合酶的摩尔比为100-150:1，4℃-8℃避光反应20h-48h，基于反应后混合物的总重，加入1-5wt％浓度为10wt％的牛血清蛋白(BSA),然后在4℃-8℃下避光反应封闭20h-48h，分离产生的获得热启动TaqDNA聚合酶。所述分离可以使用本领域常规手段进行，例如透析，柱分离或超滤等。进一步的，在本发明的方案中，所述醛基化多聚糖与TaqDNA聚合酶的摩尔比为100-130:1。
本发明提供的一种制备热启动TaqDNA聚合酶的方法，将TaqDNA聚合酶由TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合获得热启动TaqDNA聚合酶，所述结合通过TaqDNA聚合酶的氨基与醛基化多聚糖的醛基反应形成酰胺键实现，所述酰胺键能在95℃温度下5分钟以上断开，所述多聚糖由下式表示，其中n为40-200，
在本发明的一个具体实施方式中，所述醛基化多聚糖由氧化剂氧化所述多聚糖获得，所述氧化剂为NaIO4。
进一步的，所述多聚糖为葡聚糖或壳聚糖。
进一步的，所述氧化剂氧化多聚糖的条件为：将1g-10g所述多聚糖溶解于100mL的0.02M-0.2M的NaIO4的醋酸盐缓冲液中，该缓冲液的pH为4-6，然后在4℃-8℃避光反应20h-48h，反应结束后用蒸馏水透析3-4次，经浓缩干燥得到粉末状的醛基化多聚糖。
更进一步的，所述氧化剂氧化多聚糖的条件为：将2-5g所述多聚糖溶解于100mL的0.1M-0.15M的NaIO4的醋酸盐缓冲液中，该缓冲液的pH为4-6，然后在4℃-8℃避光反应20h-48h，反应结束后用蒸馏水透析3-4次，经浓缩干燥得到粉末状的醛基化多聚糖。
更进一步的，所述TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合的条件为：将所述醛基化多聚糖加入浓度为50mg/LTaqDNA聚合酶的水溶液中形成氧化混合物，其中所述醛基化多聚糖与TaqDNA聚合酶的摩尔比为100-150:1，4℃-8℃避光反应20h-48h，再基于反应后混合物的总重，加入1-5wt％浓度为10wt％的牛血清蛋白在4℃-8℃下避光反应封闭20h-48h，分离产生的热启动TaqDNA聚合酶。
本发明方案具有以下优点：
1)本发明的热启动TaqDNA聚合酶中的酰胺键能在95℃高温作用下5分钟以上断开，从而释放TaqDNA聚合酶的聚合活性，由于在初始循环的热变性之前它没有活性，从而抑制了低温条件下由引物非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，扩增时具有普通耐高温DNA聚合酶的活性，同时具有更强的特异性。
2)本发明的热启动TaqDNA聚合酶可广泛应用于高灵敏度和有较强背景基因组扩增(如基因组中某个特定基因位点或外源病原体的检测)、荧光定量PCR、DNA序列测定、MultiplexPCR、TA克隆等。
3)本发明提供的制备热启动TaqDNA聚合酶方法能简单、有效的制备具有稳定增强PCR反应效率的热启动TaqDNA聚合酶。
附图说明
图1为醛基化多聚糖分子式；
图2为本发明热启动TaqDNA聚合酶的结构示意图；
图3A为使用非热启动酶扩增人类基因组获得的琼脂糖电泳图；图3B为使用本发明的热启动TaqDNA聚合酶扩增人类基因组获得的琼脂糖电泳图；
图4为使用本发明方法制备的热启动TaqDNA聚合酶扩增北京玉衡普泰科技有限公司InteligeneSearchC试剂盒后获得的扩增产物的分型图谱。
具体实施方式
实施例1
本发明热启动TaqDNA聚合酶的制备
1、制备醛基化多聚糖：将葡聚糖40(分子量40kDa)2.5g溶解于NaIO4(0.12M)的醋酸盐缓冲液(pH6)100ml中，于4℃避光反应24h，用蒸馏水透析3次，经浓缩，干燥得粉末状醛基化葡聚糖；图1为醛基化多聚糖分子式。
2、TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖的结合：
将粉末状醛基化葡聚糖8mg，加入3ml的Promga公司生产的50mg/LTaqDNA聚合酶(分子量75kDa)的水溶液中形成氧化混合物，酶活力单位大于150U/mg，4℃避光反应24h，再基于反应后混合物的总重，加入1％的质量分数为10wt％的牛血清蛋白BSA，在4℃下避光反应封闭24h；
将反应完成的含TaqDNA聚合酶的反应混合物，上1.6×55cm，SephadexG100柱子，按照SephadexG100柱使用说明书进行操作，调节流速为0.3ml/min，收集第一个大于90KD的目的蛋白峰，加入保存缓冲液(50mmolTris-HCl(PH,8.0)，50mmolKCl，0.1mmolEDTA,1mmolDTT,0.5mmolPMSF,50％甘油)，即得热启动TaqDNA聚合酶。图2为本申请的热启动TaqDNA聚合酶结构示意图。
实施例2
本发明热启动TaqDNA聚合酶的制备
1、制备醛基化多聚糖：葡聚糖70(分子量70kDa)4.375g溶解于NaIO4(0.12M)的醋酸盐缓冲液(pH4)100ml中，于4℃避光反应24h，用蒸馏水透析4次，浓缩，干燥得粉末状醛基化葡聚糖；
2、TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖的结合：
将粉末状醛基化葡聚糖14mg，加入3ml的Takara公司生产的50mg/L高保真TaqDNA聚合酶(分子量90kDa)的水溶液中形成氧化混合物，酶活力单位大于150U/mg，4℃避光反应24h，再基于反应后混合物的总重，加入1％的质量分数为10wt％的BSA，在8℃下避光反应封闭30h；
将反应完成的含TaqDNA聚合酶的反应混合物，用截留分子量为70KD的超滤管进行浓缩，4℃条件下8000rpm离心30min，浓缩液用保存缓冲液(50mmolTris-HCl(PH,8.0)，50mmolKCl，0.1mmolEDTA,1mmolDTT,0.5mmolPMSF)缓冲液恢复至反应混合物原体积，加入与等体积的甘油，混匀，即得热启动TaqDNA聚合酶。图2为本申请的热启动TaqDNA聚合酶结构示意图。
实施例3
本发明热启动TaqDNA聚合酶的制备
1、制备醛基化多聚糖：壳聚糖50(分子量50kDa)3.125g溶解于NaIO4(0.12M)的醋酸盐缓冲液(pH4-6)100ml中，于4℃避光反应24h，用蒸馏水透析3次，浓缩，干燥得粉末状醛基化壳聚糖；
2、TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖的结合：
将粉末状醛基化壳聚糖10mg，加入3ml的Promega公司生产的50mg/L快速TaqDNA聚合酶(分子量94kDa)的水溶液中形成氧化混合物，酶活力单位大于150U/mg，4℃避光反应24h，再基于反应后混合物的总重，加入1％的质量分数为10wt％的BSA，在6℃下避光反应封闭40h；
将反应完成的含TaqDNA聚合酶的反应混合物，用截留分子量为70KD透析膜，4℃用保存缓冲液(50mmolTris-HCl(PH,8.0)，50mmolKCl，0.1mmolEDTA，1mmolDTT，0.5mmolPMSF)，透析48h，加入与等体积的甘油，混匀，即得热启动TaqDNA聚合酶。图2为本申请的热启动TaqDNA聚合酶结构示意图。
实施例4
分别使用本申请的热启动TaqDNA聚合酶与非热启动TaqDNA聚合酶，扩增人的基因组DNA(来源：9947Apromega公司)，包括以下步骤：
1、使用omega血液基因组提取试剂盒提取人血液的基因组DNA；
2、在ABI9700PCR仪器上对上述基因组DNA进行扩增，扩增体系为：
扩增条件为：
3、对扩增获得的扩增DNA使用1.5％的琼脂糖进行电泳分析，结果如图3所示。
图3A显示了使用非热启动酶扩增人类基因组获得的琼脂糖电泳图；图3B显示了使用本申请的热启动TaqDNA聚合酶扩增人类基因组获得的琼脂糖电泳图，可以看出，由本发明方法制备热启动TaqDNA聚合酶相比于非热启动TaqDNA聚合酶，抑制了低温条件下由引物非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，扩增时具有普通耐高温DNA聚合酶的活性，同时具有更强的特异性。
实施例5
使用本申请的热启动TaqDNA聚合酶扩增北京玉衡普泰科技有限公司InteligeneSearchC试剂盒，按照试剂盒说明书进行扩增步骤，扩增后的产物经遗传分析仪分析获得的分型图谱结果如图4所示，说明由本发明方法制备热启动TaqDNA聚合酶能够很好的扩增多重荧光PCR，得到相应的目的片段。
Claims (10)
1.一种热启动TaqDNA聚合酶，所述热启动TaqDNA聚合酶由TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合获得，所述结合通过TaqDNA聚合酶的氨基与醛基化多聚糖的醛基反应形成酰胺键实现，所述酰胺键能在95℃温度下5分钟以上断开，所述多聚糖由下式表示，其中n为40-200，
2.根据权利要求1所述的热启动TaqDNA聚合酶，所述醛基化多聚糖由氧化剂氧化所述多聚糖获得，所述氧化剂为NaIO4。
3.根据权利要求1所述的热启动TaqDNA聚合酶，所述多聚糖为葡聚糖或壳聚糖。
4.根据权利要求2所述的热启动TaqDNA聚合酶，所述氧化剂氧化多聚糖的条件为：将1g-10g所述多聚糖溶解于100mL的0.02M-0.2M的NaIO4的醋酸盐缓冲液中，该缓冲液的pH为4-6，然后在4℃-8℃避光反应20h-48h，反应结束后用蒸馏水透析3-4次，经浓缩干燥得到粉末状的醛基化多聚糖。
5.根据权利要求1所述的热启动TaqDNA聚合酶，所述TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合的条件为：将所述醛基化多聚糖加入浓度为50mg/L的TaqDNA聚合酶的水溶液中形成氧化混合物，其中所述醛基化多聚糖与TaqDNA聚合酶的摩尔比为100-150:1，4℃-8℃避光反应20h-48h，再基于反应后混合物的总重，加入1-5wt％浓度为10wt％的牛血清蛋白，然后在4℃-8℃下避光反应封闭20h-48h，分离产生的热启动TaqDNA聚合酶。
6.一种制备热启动TaqDNA聚合酶的方法，将TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合获得热启动TaqDNA聚合酶，所述结合通过TaqDNA聚合酶的氨基与醛基化多聚糖的醛基反应形成酰胺键实现，所述酰胺键能在95℃温度下5分钟以上断开，所述多聚糖由下式表示，其中n为40-200，
7.根据权利要求6所述的方法，所述醛基化多聚糖由氧化剂氧化所述多聚糖获得，所述氧化剂为NaIO4。
8.根据权利要求6所述的方法，所述多聚糖为葡聚糖或壳聚糖。
9.根据权利要求7所述的方法，所述氧化剂氧化多聚糖的条件为：将1g-10g所述多聚糖溶解于100mL的0.02M-0.2M的NaIO4的醋酸盐缓冲液中，该缓冲液的pH为4-6，然后在4℃-8℃避光反应20h-48h，反应结束后用蒸馏水透析3-4次，经浓缩干燥得到粉末状的醛基化多聚糖。
10.根据权利要求6所述的方法，所述TaqDNA聚合酶与醛基化多聚糖结合的条件为：将所述醛基化多聚糖加入浓度为50mg/L的TaqDNA聚合酶的水溶液中形成氧化混合物，其中所述醛基化多聚糖与TaqDNA聚合酶的摩尔比为100-150:1，4℃-8℃避光反应20h-48h，再基于反应后混合物的总重，加入1-5wt％浓度为10wt％的牛血清蛋白在4℃-8℃下避光反应封闭20h-48h，分离产生的热启动TaqDNA聚合酶。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |