CN106350493A - 一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法 - Google Patents

一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，通过SELEX技术从人工合成ssDNA文库中筛选一种与Taq DNA聚合酶高亲和性，而且在45℃以下亲和性稳定的阳性克隆菌，进一步分析该克隆菌的序列组成，人工合成这一ssDNA适配子，该适配子与Taq DNA聚合酶按照一定比例溶解于Enhancer溶液中。本发明在PCR过程中不仅在第一步实现热启动，在PCR反应的后续步骤中同样可以实现热启动，从而避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高反应特异性和灵敏度。

Description

一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法。
背景技术
聚合酶链式反应即PCR技术，用于体外扩增特定的DNA片段，不必依赖大肠杆菌等生物体，被广泛的应用于医学和生物学实验室。PCR反应所需DNA聚合酶目前广泛采用嗜热细菌水生栖热菌产生的具有热稳定性的DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶。但是Taq DNA聚合酶缺少3′到5′校正外切酶活性，容易产生非特异性扩增和引物二聚体。为了解决这一技术问题，人们发明了热启动PCR技术来解决，在热启动PCR技术中需要特定的热启动Taq DNA聚合酶的加入来实现整个热启动过程。因为热启动Taq DNA聚合酶活性是在反应体系由高温降至退火温度时释放恢复活性，也就是在反应体系中引物与模板处于配对结合状态下开始PCR过程的，所以扩增的条带杂带少，无拖带，扩增效率高。
在我国研究热启动Taq DNA酶的报道还很少，ssDNA适配子抑制剂结合普通TaqDNA聚合酶的研究更少。用ssDNA适配子制备的热启动Taq DNA酶无需预加热，而是像普通Taq DNA酶一样一次性直接加入PCR循环，这样就不会造成DNA损伤，污染扩增产物，而且缩短了反应时间。同时，适配子热稳定性好，可以在PCR反应整个过程中都起作用而不是仅仅在第一步起作用。适配子方法简便、快速、成本低等特点，与抗体、肽相比，适配子具有更高的亲和力和特异性；适配子可以通过SELEX技术筛选，然后人工合成，免去了一系列繁琐的抗体、肽生产过程，而且筛选的适配子序列可以一直沿用，降低了成本。
到目前为止，热启动Taq DNA聚合酶制备方法主要有：1、蜡隔绝法2、抗体抑制法3、化学修饰法4、肝素盐法5、肽抑制法。但是化学修饰及肝素盐法需要预加热，容易造成DNA损伤；蜡隔绝法操作步骤繁琐，容易污染扩增产物；抗体及肽经过多次高低温循环容易使肽键断裂，失去活性。
发明内容
针对以上现有技术问题，本发明的目的在于提供一种可以在PCR反应整个过程中都起作用而不是仅仅在第一步起作用的热启动Taq DNA聚合酶制备方法，通过指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术筛选ssDNA适配子序列可以一直用于制备该热启动Taq DNA聚合酶。具体技术方案如下：
一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)筛选一种与Taq DNA聚合酶高亲和性的阳性克隆菌；
(2)分析步骤(1)中阳性克隆菌的序列组成；
(3)人工合成ssDNA适配子；
(4)步骤(3)中适配子与Taq DNA聚合酶按照一定比例溶解于溶液中。
进一步地，步骤(1)中通过SELEX技术从人工合成ssDNA文库中进行筛选。
进一步地，步骤(1)中阳性克隆菌在45℃以下亲和性稳定。
进一步地，步骤(4)中溶解于Enhancer溶液中。
进一步地，步骤(1)中进一步包括：通过ELISA技术鉴定阳性克隆菌，选择亲和力较高的阳性克隆菌。
进一步地，通过设定ELISA技术中结合缓冲液的温度为45℃进行筛选。
进一步地，所述Enhancer溶液中含有0.1～2.0M Betaine、0.5～5.0M DMSO、1.0～10.0M Tris-HCL以及0.5～5.0M EDTA。
进一步地，步骤(1)中进一步包括如下步骤：
(1-1)酶标板的包被及封闭；
(1-2)ssDNA的结合；
(1-3)洗脱与提取；
(1-4)筛选产物扩增；
(1-5)重复上述步骤(1-1)至(1-4)；
(1-6)ssDNA克隆；
(1-7)ELISA法鉴定阳性克隆菌；
(1-8)筛选亲和性热稳定的阳性克隆菌。
进一步地，步骤(1-1)中，配置100μl Taq酶，作为第一轮筛选液包被于96孔酶联板A孔中，之后筛选液的浓度逐次递减；再加入100μl包被液混匀；同时设空白对照孔--B孔，用100μl去离子水代替Taq酶加入B孔包被；置于自封袋内，4℃过夜；弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；以200μl 3％BSA处理A孔和B孔，37℃封闭2h，弃封闭液；和/或，
步骤(1-2)中，向上述步骤1的经3％BSA封闭的B孔加入100ul SELEX结合缓冲液，然后加入一定量ssDNA库和一定量的tRNA，37℃、40min,以除去ssDNA文库中与BSA结合的ssDNA；然后再将B孔中的液体转移到A孔，使ssDNA与包被好的Taq蛋白特异性结合，37℃、40min；和/或，
步骤(1-3)中，将上述步骤2的酶标板包被液弃之，用200μlSELEX冲洗缓冲洗板4次，每次3min，洗去未结合或低亲和力的ssDNA；再加入SELEX洗脱缓冲液，80℃、10min,洗脱下与Taq蛋白结合的ssDNA；用寡核普酸纯化试剂盒进行回收纯化，去除Taq蛋白及其他杂质，最终的筛选产物ssDNA即为筛选一轮的适配子；和/或，
步骤(1-4)中，将上述步骤3提取的ssDNA经PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切下目的条带dsDNA，用DNA回收试剂盒纯化回收；以纯化的dsDNA为模板，经过不对称PCR扩增，获得ssDNA，作为下一轮筛选ssDNA；和/或，
步骤(1-5)中，反复“结合—洗脱—扩增”过程，通过10轮筛选直至洗脱的ssDNA与Taq蛋白结合比例不断增加，到第10轮结合比例达到30％，继续筛选3轮结合比例没有显著提高；和/或，
步骤(1-6)中，对上述步骤5所述第10轮筛选出的ssDNA适配子进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切下目的条带，用DNA回收试剂盒纯化回收，回收后的产物连接T载体，全部的连接产物与大肠杆菌JM 109感受态100μL混匀后在冰上放置30min；42℃热休克45s，冰上放置40min；然后接种于含有氨苄青霉素并加入IPTG和X-gal的LB平板培养基上，37℃培养12-18h，进行蓝白筛选；随机挑取50个阳性菌落接种于Amp的LB固体培养基中，37℃、过夜；和/或，
步骤(1-7)中，将含Taq蛋白的包被液按100μl/孔包被96孔酶联板50孔，同时设空白对照孔50个，用含3％BSA的包被液包被B孔，置于自封袋内，4℃过夜；弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；用200μl 3％BSA处理A孔和B孔，37℃封闭2h，弃封闭液；将上述步骤六制备的克隆菌液按100μl/孔分别加入A孔和B孔，37℃结合2h；加入200μlSELEXl冲洗缓冲液洗板4次，每次3min，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl，37℃1h，再加入冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；ELISA TMB即用型显色试剂盒显色，37℃避光显色15min；酶标仪测定450nm的吸光度值；选择亲和力较高的克隆菌10个；和/或，
步骤(1-8)中，筛选亲和性热稳定的阳性克隆菌：对步骤7筛选出的10个克隆菌，共需要11个孔，5个热处理孔，5个常温处理孔，同时设1个空白对照孔50个，将含Taq蛋白的包被液按100μl/孔包被96孔酶联板上的这11个孔，置于自封袋内，4℃过夜；弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；用200μl 3％BSA处理11个孔，37℃封闭2h，弃封闭液；将上述步骤7制备的克隆菌液按100μl/孔分别加入11个孔，A孔用45℃、100μlSELEX结合缓冲液处理，B孔、C孔用常温的SELEX结合缓冲液处理，37℃结合2h；200μl冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；加入辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl，37℃、1h，再加入SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；ELISA TMB即用型显色试剂盒显色，37℃避光显色15min；酶标仪测定450nm的OD值；选择常温、45℃两种条件下OD值最高的阳性克隆菌。
进一步地，步骤(2)中，对上述步骤(1-8)所述的亲和力最高的克隆菌使用二代测序仪进行序列测定；步骤(3)中，将所述的序列进行人工合成，获得大量ssDNA；步骤(4)中Enhancer溶液配置：将甜菜碱和二甲基亚砜溶于去离子水溶液终浓度为0.4mol/L以上，4℃保存；步骤(4)中配置热启动Taq酶：将所述的ssDNA、Taq DNA聚合酶以及步骤六11所述的Enhancer溶液按照比例混合即成热启动Taq DNA聚合酶。
与目前现有技术相比，本发明在PCR过程中不仅在第一步实现热启动，在PCR反应的后续步骤中同样可以实现热启动，从而避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高反应特异性和灵敏度。这种基于适配子的热启动不需要一个单独的高温温育步骤来激活酶。通过SELEX技术筛选的克隆菌ssDNA适配子序列可以一直用于制备该热启动Taq DNA聚合酶。
附图说明
图1为本发明热启动酶与进口和国产的Taq DNA聚合酶扩增条带图
图中：
1号是达辉生物热启动酶
2号是进口Taq DNA聚合酶
3号是国产Taq DNA聚合酶
具体实施方式
下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。
在一个优选实施例中，一种热启动Taq DNA聚合酶试剂盒及其制备方法，通过SELEX技术从人工合成ssDNA文库中筛选一种与Taq DNA聚合酶高亲和性，而且在45℃以下亲和性稳定的阳性克隆菌，进一步分析该克隆菌的序列组成，人工合成这一ssDNA适配子，该适配子与Taq DNA聚合酶按照一定比例溶解于Enhancer溶液中。
通过SELEX技术从ssDNA文库中筛选出与Taq DNA聚合酶高亲和的阳性克隆菌，通过ELISA技术鉴定阳性克隆菌，选择亲和力较高的阳性克隆菌，通过设定ELISA技术中结合缓冲液的温度为45℃，筛选出与Taq DNA聚合酶在45℃以下亲和性稳定的阳性克隆菌。测序、分析该阳性克隆菌的序列组成，人工合成这一ssDNA适配子，所述Enhancer溶液中含有0.1～2.0M Betaine、0.5～5.0M DMSO、1.0～10.0M Tris-HCL以及0.5～5.0M EDTA，将人工合成的ssDNA适配子、Taq DNA聚合酶Enhancer溶液按照一定比例混合即成热启动Taq DNA聚合酶。
在另一个优选实施例中，可以采用如下方案：通过SELEX技术从人工合成ssDNA文库中筛选一种与Taq DNA聚合酶高亲和性，而且在45℃以下亲和性稳定的阳性克隆菌，进一步分析该克隆菌的序列组成，人工合成这一ssDNA适配子，该适配子与Taq DNA聚合酶按照一定比例溶解于Enhancer溶液中。
通过SELEX技术从ssDNA文库中筛选出与Taq DNA聚合酶高亲和的阳性克隆菌，通过ELISA技术鉴定阳性克隆菌，选择亲和力较高的阳性克隆菌，通过设定ELISA技术中结合缓冲液的温度为45℃，筛选出与Taq DNA聚合酶在45℃以下亲和性稳定的阳性克隆菌。测序、分析该阳性克隆菌的序列组成，人工合成这一ssDNA适配子，所述Enhancer溶液中含有0.1～2.0M Betaine、0.5～5.0M DMSO、1.0～10.0M Tris-HCL以及0.5～5.0M EDTA，将人工合成的ssDNA适配子、Taq DNA聚合酶、Enhancer溶液按照一定比例混合即成热启动Taq DNA聚合酶。
通过SELEX技术从人工合成ssDNA文库中筛选一种与Taq DNA聚合酶高亲和性，而且在45℃以下亲和性稳定的阳性克隆菌，进一步分析该克隆菌的序列组成，人工合成这一ssDNA适配子，该适配子与Taq DNA聚合酶按照一定比例溶解于Enhancer溶液中。
实施例：制备热启动Taq DNA聚合酶
1)酶标板的包被及封闭：配置100μl Taq酶，作为第一轮筛选液包被于96孔酶联板A孔中，之后筛选液的浓度逐次递减。再加入100μl包被液(0.05mol/L NaHCO3，pH9.6)混匀。同时设空白对照孔--B孔，用100μl去离子水代替Taq酶加入B孔包被。置于自封袋内，4℃过夜。弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液(SHCMK+0.05％Tween 20)洗板4次，每次3min。以200μl3％BSA处理A孔和B孔，37℃封闭2h，弃封闭液。
2)ssDNA的结合：向上述步骤1的经3％BSA封闭的B孔加入100ul SELEX结合缓冲液(SHCMK液：20mmol/L Hepes pH7.35,120mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,1mmol/LCaCl2,1mmol/L MgCl2)，然后加入一定量ssDNA库和一定量的tRNA，37℃、40min,以除去ssDNA文库中与BSA结合的ssDNA。然后再将B孔中的液体转移到A孔，使ssDNA与包被好的Taq蛋白特异性结合，37℃、40min。
3)洗脱与提取：将上述步骤2的酶标板包被液弃之，用200μlSELEX冲洗缓冲(SHCMK+0.05％Tween 20)洗板4次，每次3min，洗去未结合或低亲和力的ssDNA。再加入SELEX洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，4mol/L异硫氰酸胍,1mmol/L DTT，pH8.3)，80℃、10min,洗脱下与Taq蛋白结合的ssDNA。用寡核普酸纯化试剂盒进行回收纯化，去除Taq蛋白及其他杂质，最终的筛选产物ssDNA即为筛选一轮的适配子。
4)筛选产物扩增：将上述步骤3提取的ssDNA经PCR扩增(PCR反应体系为：模板2μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 1μL，Taq酶1μL，上游、下游引物各2μL，加去离子水至50μl。PCR反应条件为：92℃预变性2min，然后进行30个循环92℃变性15s，58℃复性15s，68℃延伸2min，最后68℃延伸3min)，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切下目的条带dsDNA，用DNA回收试剂盒纯化回收。以纯化的dsDNA为模板，经过不对称PCR扩增，获得ssDNA，作为下一轮筛选ssDNA。
5)重复上述步骤1至4：反复“结合—洗脱—扩增”过程，通过10轮筛选直至洗脱的ssDNA与Taq蛋白结合比例不断增加，到第10轮结合比例达到30％，继续筛选3轮结合比例没有显著提高。
6)ssDNA克隆：对上述步骤5所述第10轮筛选出的ssDNA适配子进行PCR扩增(PCR反应体系为：模板2μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 1μL，Taq酶1μL，上游、下游引物各2μL，加去离子水至50μl。PCR反应条件为：92℃预变性2min，然后进行30个循环92℃变性15s，58℃复性15s，68℃延伸2min，最后68℃延伸3min)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切下目的条带，用DNA回收试剂盒纯化回收，回收后的产物连接T载体，全部的连接产物与大肠杆菌JM109感受态100μL混匀后在冰上放置30min。42℃热休克45s，冰上放置40min。然后接种于含有氨苄青霉素并加入IPTG和X-gal的LB平板培养基上，37℃培养12-18h，进行蓝白筛选。随机挑取50个阳性菌落接种于Amp的LB固体培养基中，37℃、过夜。
7)ELISA法鉴定阳性克隆菌：将含Taq蛋白的包被液按100μl/孔包被96孔酶联板50孔(A孔)，同时设空白对照孔50个(B孔)，用含3％BSA的包被液包被B孔，置于自封袋内，4℃过夜。弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min。用200μl 3％BSA处理A孔和B孔，37℃封闭2h，弃封闭液。将上述步骤六制备的克隆菌液按100μl/孔分别加入A孔和B孔，37℃结合2h。加入200μl SELEXl冲洗缓冲液洗板4次，每次3min，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素(l:10000)100μl，37℃1h，再加入冲洗缓冲液洗板4次，每次3min。ELISA TMB即用型显色试剂盒显色，37℃避光显色15min。酶标仪测定450nm的吸光度值。选择亲和力较高的克隆菌10个。
8)筛选亲和性热稳定的阳性克隆菌：对步骤7筛选出的10个克隆菌，共需要11个孔，5个热处理孔(A孔)，5个常温处理孔(B孔)，同时设1个空白对照孔50个(C孔)，将含Taq蛋白的包被液按100μl/孔包被96孔酶联板上的这11个孔，置于自封袋内，4℃过夜。弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min。用200μl 3％BSA处理11个孔，37℃封闭2h，弃封闭液。将上述步骤7制备的克隆菌液按100μl/孔分别加入11个孔，A孔用45℃、100μlSELEX结合缓冲液处理，B孔、C孔用常温的SELEX结合缓冲液处理，37℃结合2h。200μl冲洗缓冲液洗板4次，每次3min。加入辣根过氧化物酶标记的亲和素(l:10000)100μl，37℃、1h，再加入SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min。ELISA TMB即用型显色试剂盒显色，37℃避光显色15min。酶标仪测定450nm的OD值。选择常温、45℃两种条件下OD值最高的阳性克隆菌。
9)ssDNA测序：对上述步骤8所述的亲和力最高的克隆菌使用二代测序仪进行序列测定。
10)ssDNA人工合成：将上述步骤9所述的序列进行人工合成，获得大量ssDNA。
11)Enhancer溶液配置：将甜菜碱和二甲基亚砜溶于去离子水溶液终浓度为0.4mol/L以上，4℃保存。
12)配置热启动Taq酶：将上述步骤10所述的ssDNA、Taq DNA聚合酶以及步骤六11所述的Enhancer溶液按照比例混合即成热启动Taq DNA聚合酶。
实验结果：将上述步骤制备的热启动酶与进口和国产的Taq DNA聚合酶同时用于小鼠Genomic DNA扩增，所有目的基因全部得到扩增，但热启动Taq DNA聚合酶扩增条带清晰，无杂带和拖带。
本发明实现了在PCR过程中不仅在第一步实现热启动，在PCR反应的后续步骤中同样可以实现热启动，从而避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高反应特异性和灵敏度。这种基于适配子的热启动不需要一个单独的高温温育步骤来激活酶。通过SELEX技术筛选的ssDNA适配子序列可以一直用于制备该热启动Taq DNA聚合酶。
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)筛选一种与Taq DNA聚合酶高亲和性的阳性克隆菌；
(2)分析步骤(1)中阳性克隆菌的序列组成；
(3)人工合成ssDNA适配子；
(4)步骤(3)中适配子与Taq DNA聚合酶按照一定比例溶解于溶液中。
2.如权利要求1所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中通过SELEX技术从人工合成ssDNA文库中进行筛选。
3.如权利要求1和2所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中阳性克隆菌在45℃以下亲和性稳定。
4.如权利要求1-3所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中溶解于Enhancer溶液中。
5.如权利要求1-4所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中进一步包括：通过ELISA技术鉴定阳性克隆菌，选择亲和力较高的阳性克隆菌。
6.如权利要求5所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，通过设定ELISA技术中结合缓冲液的温度为45℃进行筛选。
7.如权利要求4所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述Enhancer溶液中含有0.1～2.0M Betaine、0.5～5.0M DMSO、1.0～10.0M Tris-HCL以及0.5～5.0MEDTA。
8.如权利要求1-7所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中进一步包括如下步骤：
(1-1)酶标板的包被及封闭；
(1-2)ssDNA的结合；
(1-3)洗脱与提取；
(1-4)筛选产物扩增；
(1-5)重复上述步骤(1-1)至(1-4)；
(1-6)ssDNA克隆；
(1-7)ELISA法鉴定阳性克隆菌；
(1-8)筛选亲和性热稳定的阳性克隆菌。
9.如权利要求8所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，
步骤(1-1)中，配置100μl Taq酶，作为第一轮筛选液包被于96孔酶联板A孔中，之后筛选液的浓度逐次递减；再加入100μl包被液混匀；同时设空白对照孔--B孔，用100μl去离子水代替Taq酶加入B孔包被；置于自封袋内，4℃过夜；弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；以200μl 3％BSA处理A孔和B孔，37℃封闭2h，弃封闭液；和/或，
步骤(1-2)中，向上述步骤1的经3％BSA封闭的B孔加入100ul SELEX结合缓冲液，然后加入一定量ssDNA库和一定量的tRNA，37℃、40min,以除去ssDNA文库中与BSA结合的ssDNA；然后再将B孔中的液体转移到A孔，使ssDNA与包被好的Taq蛋白特异性结合，37℃、40min；和/或，
步骤(1-3)中，将上述步骤2的酶标板包被液弃之，用200μlSELEX冲洗缓冲洗板4次，每次3min，洗去未结合或低亲和力的ssDNA；再加入SELEX洗脱缓冲液，80℃、10min,洗脱下与Taq蛋白结合的ssDNA；用寡核普酸纯化试剂盒进行回收纯化，去除Taq蛋白及其他杂质，最终的筛选产物ssDNA即为筛选一轮的适配子；和/或，
步骤(1-4)中，将上述步骤3提取的ssDNA经PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切下目的条带dsDNA，用DNA回收试剂盒纯化回收；以纯化的dsDNA为模板，经过不对称PCR扩增，获得ssDNA，作为下一轮筛选ssDNA；和/或，
步骤(1-5)中，反复“结合—洗脱—扩增”过程，通过10轮筛选直至洗脱的ssDNA与Taq蛋白结合比例不断增加，到第10轮结合比例达到30％，继续筛选3轮结合比例没有显著提高；和/或，
步骤(1-6)中，对上述步骤5所述第10轮筛选出的ssDNA适配子进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切下目的条带，用DNA回收试剂盒纯化回收，回收后的产物连接T载体，全部的连接产物与大肠杆菌JM 109感受态100μL混匀后在冰上放置30min；42℃热休克45s，冰上放置40min；然后接种于含有氨苄青霉素并加入IPTG和X-gal的LB平板培养基上，37℃培养12-18h，进行蓝白筛选；随机挑取50个阳性菌落接种于Amp的LB固体培养基中，37℃、过夜；和/或，
步骤(1-7)中，将含Taq蛋白的包被液按100μl/孔包被96孔酶联板50孔，同时设空白对照孔50个，用含3％BSA的包被液包被B孔，置于自封袋内，4℃过夜；弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；用200μl 3％BSA处理A孔和B孔，37℃封闭2h，弃封闭液；将上述步骤六制备的克隆菌液按100μl/孔分别加入A孔和B孔，37℃结合2h；加入200μl SELEXl冲洗缓冲液洗板4次，每次3min，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl，37℃1h，再加入冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；ELISA TMB即用型显色试剂盒显色，37℃避光显色15min；酶标仪测定450nm的吸光度值；选择亲和力较高的克隆菌10个；和/或，
步骤(1-8)中，筛选亲和性热稳定的阳性克隆菌：对步骤7筛选出的10个克隆菌，共需要11个孔，5个热处理孔，5个常温处理孔，同时设1个空白对照孔50个，将含Taq蛋白的包被液按100μl/孔包被96孔酶联板上的这11个孔，置于自封袋内，4℃过夜；弃包被液，用SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；用200μl 3％BSA处理11个孔，37℃封闭2h，弃封闭液；将上述步骤7制备的克隆菌液按100μl/孔分别加入11个孔，A孔用45℃、100μlSELEX结合缓冲液处理，B孔、C孔用常温的SELEX结合缓冲液处理，37℃结合2h；200μl冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；加入辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl，37℃、1h，再加入SELEX冲洗缓冲液洗板4次，每次3min；ELISA TMB即用型显色试剂盒显色，37℃避光显色15min；酶标仪测定450nm的OD值；选择常温、45℃两种条件下OD值最高的阳性克隆菌。
10.如权利要求9所述的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，对上述步骤(1-8)所述的亲和力最高的克隆菌使用二代测序仪进行序列测定；步骤(3)中，将所述的序列进行人工合成，获得大量ssDNA；步骤(4)中Enhancer溶液配置：将甜菜碱和二甲基亚砜溶于去离子水溶液终浓度为0.4mol/L以上，4℃保存；步骤(4)中配置热启动Taq酶：将所述的ssDNA、Taq DNA聚合酶以及步骤六11所述的Enhancer溶液按照比例混合即成热启动Taq DNA聚合酶。
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Assignee: Wuhu Dahui Biotechnology Co., Ltd.

Assignor: Zhou Hui

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Denomination of invention: A kind of preparation method of thermal starting taq dna polymerase

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