CN103820415A - 热启动dna聚合酶的制备方法、制备的聚合酶及其应用 - Google Patents

热启动dna聚合酶的制备方法、制备的聚合酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种热启动DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：获得单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶；将所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述TaqDNA聚合酶组分按照比例混合；所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶的含量分别都为20～40%，本发明还涉及由以上方法制备的热启动DNA聚合酶及其使用方法。本发明制备的热启动DNA聚合酶还可以解决热启动PCR技术中容易出现的DNA损伤、产物污染、封闭不完全导致热启动效果不好的问题。

Description

热启动DNA聚合酶的制备方法、制备的聚合酶及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热启动DNA聚合酶的制备方法、制备的聚合酶及其应用。
背景技术
PCR技术在应用时存在着非特异性扩增产物的出现、引物二聚体的形成或凝胶电泳上无扩增带的问题。
目前以上技术问题通常通过热启动PCR技术来解决，在热启动PCR技术中通过特定的热启动DNA聚合酶来帮助实现热启动PCR的过程，但是在常规的热启动PCR反应过程中需要对反应体系中的组分进行封闭来保证热启动PCR反应过程的顺利进行。常用的热启动PCR封闭方法有化学封闭法、物理隔绝法、DNA结合蛋白抑制法等。但是化学封闭法需要预加热，容易造成DNA损伤；物理隔绝法操作步骤复杂，容易对扩增产物造成污染；DNA结合蛋白抑制法是采用单链DNA结合蛋白与DNA链结合保持其单链特性，防止两条互补单链再次结合为双螺旋以及形成链内二级结构、防止被核酸酶水解，但是单链结合蛋白在反应体系中经过多次的高低温循环容易使肽键断裂丧失其应有的功能。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种热启动DNA聚合酶的制备方法、制备的聚合酶及其应用，可以解决热启动PCR技术中容易DNA损伤、产物污染、封闭不完全导致热启动效果不好的问题。
本发明通过以下技术方案实现：
一种热启动DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：获得单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶；
将所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶组分按照比例混合；
所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶的含量分别都为20～40%。
在上述技术方案中，所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶的比例为1：1：1。
根据上述技术方案的方法制备的热启动DNA聚合酶。
上述热启动DNA聚合酶在热启动PCR中的使用方法，所述热启动DNA聚合酶一次性加入PCR反应体系所需组分中。
本发明通过将单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶提前混合制备热启动DNA聚合酶，在使用时可以一次性加入，避免分别加入时的多次操作对PCR反应体系造成污染；单链DNA结合蛋白和引物结合，使得结合了DNA结合蛋白的引物无法与模板及DNA聚合酶结合，可避免产生非特异性扩增，单链DNA结合蛋白虽然在反应体系中经过多次的高低温循环容易使肽键断裂丧失功能，但通过Taq DNA聚合酶单克隆抗体的加入抑制了Taq DNA聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，弥补了单链DNA结合蛋白使用中的不足；本发明还选择了热启动DNA聚合酶中各组分合适的比例，提高了PCR反应的扩增特异性。
附图说明
图1为本发明实施例一、二、三及对比实施例一制备的热启动DNA聚合酶PCR实验效果比对图。其中1、2两条带为实施例一PCR样本跑胶结果；3、4两条带为实施例二PCR样本跑胶结果；5、6两条带为实施例三PCR样本跑胶结果；7、8两条带为对比实施例一PCR样本跑胶结果。
图2为本发明实施例1制备的热启动DNA聚合酶与商业用酶PCR实验效果比对图。其中1、2两条带为实施例一PCR样本跑胶结果；3、4两条带为TAKARA LA taq PCR样本跑胶结果；5、6两条带为TransTaqTM HiFiDNA Polymerase PCR样本跑胶结果；7、8两条带为Phire Hot Start DNAPolymerase PCR样本跑胶结果。
图3为本发明实施例2制备的热启动DNA聚合酶与商业用酶PCR实验效果比对图。其中1、2两条带为实施例一PCR样本跑胶结果；3、4两条带为TAKARA LA taq PCR样本跑胶结果；5、6两条带为TransTaqTM HiFiDNA Polymerase PCR样本跑胶结果；7、8两条带为Phire Hot Start DNAPolymerase PCR样本跑胶结果。
图4为本发明实施例3制备的热启动DNA聚合酶与商业用酶PCR实验效果比对图。其中1、2两条带为实施例一PCR样本跑胶结果；3、4两条带为TAKARA LA taq PCR样本跑胶结果；5、6两条带为TransTaqTM HiFiDNA Polymerase PCR样本跑胶结果；7、8两条带为Phire Hot Start DNAPolymerase PCR样本跑胶结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例一
制备单链DNA结合蛋白（SSB），采用pET28a(+)-ssb重组质粒进行表达（王建平，邹秉杰，陈之遥，马寅姣等.重组大肠杆菌单链结合蛋白性质表征及其提高焦磷酸测序准确性中的应用.生物工程学报.27（10）:1513-1520）或通过商业途径购买获得。另外Taq DNA聚合酶单克隆抗体的制备以及Taq DNA聚合酶的制备可以参考现有的文献报道制备得到，也可以通过商业途径（如通过上海闪晶分子生物科技有限公司购买）获得。
按照下表所示组分量取相应的单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及DNA聚合酶，混合均匀储存备用，既得热启动DNA聚合酶。
Taq DNA聚合酶 20uL
Taq DNA聚合酶单克隆抗体 20uL
单链DNA结合蛋白 20uL
实施例二
单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及DNA聚合酶的获得方法与实施例一相同。
按照下表所示组分量取相应的单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及DNA聚合酶，混合均匀储存备用，既得热启动DNA聚合酶。
Taq DNA聚合酶 30uL
Taq DNA聚合酶单克隆抗体 25uL
单链DNA结合蛋白 25uL
实施例三
单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及DNA聚合酶的获得方法与实施例一相同。
按照下表所示组分量取相应的单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及DNA聚合酶，混合均匀储存备用，既得热启动DNA聚合酶。
Taq DNA聚合酶 30uL
Taq DNA聚合酶单克隆抗体 28uL
单链DNA结合蛋白 28uL
对比实施例一
单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及DNA聚合酶的获得方法与实施例一相同。
按照下表所示组分量取相应的单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及DNA聚合酶，混合均匀储存备用，既得热启动DNA聚合酶。
Taq DNA聚合酶 35uL
Taq单克隆抗体 20uL
单链DNA结合蛋白 20uL
热启动PCR中的使用效果实施例一
用本发明具体实施方式中的实施例一、实施例二、实施例三和对比实施例一制备的热启动DNA聚合酶扩增片段为462bp的目的片段，比对不同配比的单链DNA结合蛋白、Taq单克隆抗体以及DNA聚合酶所制备的热启动DNA聚合酶，评价各实施例制备的热启动DNA聚合酶PCR效果。
ddH2O 14.4uL
10×Taq Buffer 2uL
2.5mM dNTP Mixture 1.6uL
各实施例制备的聚合酶体系 0.6uL
Forward Primer（50μM） 0.2uL
Reverse Primer（50μM） 0.2uL
cDNA 1uL
在本实验中PCR反应体系如下，所有组分的加入按照表格中由上至下的顺序。待所有组分加入后将反应体系用移液枪混合均匀，并进行PCR扩增反应，PCR反应程序如下：94℃（3min）；94℃（45sec），52℃（45sec），72℃（30sec），该步骤有25个循环；72℃（10min）。
待PCR反应结束后，各取5uL反应体系于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，实验的结果见图1，由图1的结果可知，实施例一的单链DNA结合蛋白、Taq单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶制备的热启动DNA聚合酶PCR效果最佳。对比实施例一PCR实验效果明显比实施例制备的热启动DNA聚合酶效果差。可见如果Taq DNA聚合酶的比例在整个体系中超过了20-40%的配比范围，会降低PCR反应的扩增特异性。
热启动PCR中的使用效果实施例二
用本发明实施例一所制备的热启动DNA聚合酶扩增片段为345bp的目的片段，同时与市售的TAKARA LA taq DNA聚合酶，TransTaqTM HiFiDNA聚合酶，Phire热启动DNA聚合酶这三种酶扩增的效果进行比对。
在本实验中PCR反应体系如下，所有组分的加入按照表格中由上至下的顺序。待所有组分加入后将反应体系用移液枪混合均匀，并进行PCR扩增反应，PCR反应程序如下：94℃（3min）；94℃（45sec），52℃（45sec），72℃（30sec），该步骤有25个循环；72℃（10min）。
ddH2O 14.4uL
10×Taq Buffer 2uL
2.5mM dNTP Mixture 1.6uL
实施例1聚合酶体系或商业酶体系 0.6uL
Forward Primer（50μM） 0.2uL
Reverse Primer（50μM） 0.2uL
cDNA 1uL
待PCR反应结束后，各取5uL反应体系于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，实验的结果见图2，由图2的结果可知，采用本发明实施例一制备的热启动DNA聚合酶其PCR反应的效果更好，扩增特异性更好，从胶图上看没有杂带和拖尾且目标条带颜色清晰，而对照商业用酶PCR的结果中有明显的杂带。
热启动PCR中的使用效果实施例三
用本发明实施例二所制备的热启动DNA聚合酶扩增片段为462bp的目的片段，TAKARA LA taq DNA聚合酶，TransTaqTM HiFi DNA聚合酶，Phire热启动DNA聚合酶这三种酶扩增的效果进行比对。
在本实验中PCR反应体系如下，所有组分的加入按照表格中由上至下的顺序。待所有组分加入后将反应体系用移液枪混合均匀，并进行PCR扩增反应，PCR反应程序如下：94℃（3min）；94℃（45sec），52℃（45sec），72℃（30sec），该步骤有25个循环；72℃（10min）。
ddH2O 14.4uL
10×Taq Buffer 2uL
2.5mM dNTP Mixture 1.6uL
实施例1聚合酶体系或商业酶体系 0.6uL
Forward Primer（50μM） 0.2uL
Reverse Primer（50μM） 0.2uL
cDNA 1uL
待PCR反应结束后，各取5uL反应体系于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，实验的结果见图3，由图3的结果可知，采用本发明实施例二制备的热启动DNA聚合酶其PCR反应的效果更好，扩增特异性更好，从胶图上看没有杂带和拖尾且目标条带颜色清晰，而对照商业用酶PCR的结果中有明显的杂带。
热启动PCR中的使用效果实施例四
用本发明实施例三所制备的热启动DNA聚合酶扩增片段为1801bp的目的片段，同时与市售的TAKARA LA taq DNA聚合酶，TransTaqTM HiFiDNA聚合酶，Phire热启动DNA聚合酶这三种酶扩增的效果进行比对。
在本实验中PCR反应体系如下，所有组分的加入按照表格中由上至下的顺序。待所有组分加入后将反应体系用移液枪混合均匀，并进行PCR扩增反应，PCR反应程序如下：94℃（3min）；94℃（45sec），52℃（45sec），72℃（30sec），该步骤有25个循环；72℃（10min）。
ddH2O 14.4uL
10×Taq Buffer 2uL
2.5mM dNTP Mixture 1.6uL
实施例3制备聚合酶体系 0.6uL
Forward Primer（50μM） 0.2uL
Reverse Primer（50μM） 0.2uL
cDNA 1uL
待PCR反应结束后，各取5uL反应体系于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，实验的结果见图4，由图4的结果可知，采用本发明实施例三制备的热启动DNA聚合酶其PCR反应的效果更好，扩增特异性更好，从胶图上看没有杂带和拖尾且目标条带颜色清晰，而对照商业用酶PCR的结果中有明显的杂带。
本发明利用单链DNA结合蛋白和引物结合，使得结合了DNA结合蛋白的引物无法与模板及DNA聚合酶结合，故可避免产生非特异性扩增；同时利用Taq单克隆抗体与Taq DNA聚合酶结合抑制Taq DNA聚合酶活性，从而有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。当PCR反应到变性步骤时，DNA单链结合蛋白变性，引物被释放与模板特异性结合；同时taq DNA聚合酶单克隆抗体变性，Taq DNA聚合酶释放恢复活性，PCR反应成功进行。与现有的单一的Taq DNA聚合酶相比由于加入了单链DNA结合蛋白以及Taq单克隆抗体可以很好的保证热启动PCR实现的效果，避免非特异性扩增的出现，同时采用本发明制备的热启动DNA聚合酶可以减少反应体系的加样次数，避免多次加样操作可能带来的实验污染。
本发明还通过大量的实验研究发现当采用适当比例的由单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶混合制备的热启动DNA聚合酶时，PCR实验不会再出现错误的扩增而导致的非特异性条带，同时还可减弱甚至消除引物二聚体的形成，采用本发明制备的热启动DNA聚合酶时，所开展的PCR反应实验均能得以顺利开展，并取得良好的实验效果。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本材料的技术实施方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种热启动DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶；
将所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶组分按照比例混合；
所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶的含量分别都为20～40%。
2.如权利要求1所述的热启动DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述TaqDNA聚合酶的比例为1：1：1。
3.如权利要求1或2所述的方法制备的热启动DNA聚合酶。
4.如权利要求3所述的热启动DNA聚合酶在热启动PCR中的使用方法，其特征在于，所述热启动DNA聚合酶一次性加入PCR反应体系所需组分中。
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