TWI567197B - 表現元件、表現卡匣、及含其之載體 - Google Patents

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Description

表現元件、表現卡匣、及含其之載體
本發明關於一種表現元件，尤指一種阿拉伯糖誘導表現系統的表現元件。
表現系統(expression system)是由宿主細胞(host cell)與遺傳元件(genetic element)如轉錄及轉譯訊號(transcription and translation signals)、調節因子(regulatory factor)、基因及質體所組成。目前已有多種真核與原核表現系統被建立，甚至被商品化。
表現系統中，以大腸桿菌(Escherichia coli)表現系統之研究成果與開發經驗最為豐碩，與此系統相關之基因操作技術與發酵技術發展得十分純熟。以大腸桿菌生產重組蛋白質之優勢包括基因操作簡易、培養容易、生長快速且能於廉價之培養基中進行高密度(high density)培養、表現載體(expression vector)與改良宿主如蛋白酶缺損株(protease deficient strain)之選擇性高、蛋白質產量高及生產時程短。
目前已有多種大腸桿菌表現系統可供使用，如trc表現系統、T7表現系統及pBAD表現系統等。其中，pBAD表現系統是一種阿拉伯糖誘導表現系統，由含有阿拉伯糖誘導表現元件與調控基因之表現載體搭配大腸桿菌宿主所構成，此表現系統優點為(1) 可緊密調控基因表現，避免某些基因之滲漏表現所造成之毒性。(2)以阿拉伯糖作為誘導劑之成本較為低廉。(3)可利用阿拉伯糖濃度調控蛋白質表現量。
鑑於阿拉伯糖誘導表現系統的上述優點，在研究及商業目的上都有開發更佳的表現元件的需求。
爰是，本發明的一個目的在於提供表現元件及含其之表現卡匣，前述表現元件可提高欲表現之基因的表現量，因此更具產業利用價值。
本發明的另一個目的在於提供一種載體，其含有前述表現卡匣，且適用於阿拉伯糖誘導表現系統，因此可提供該領域於阿拉伯糖誘導表現系統之應用的新穎選擇。
為了達到前述目的，本發明提供一種阿拉伯糖誘導表現系統的表現元件，其包含：一啟動子及至少一下列元件：一核醣體結合部位，其具有SEQ ID NO：01所示之序列；或一T7噬菌體轉譯增強元件，其具有SEQ ID NO：08所示之序列。
本發明又提供一種表現卡匣，其包含：一前述表現元件、一起始碼、一欲表現之基因、及一終止碼。
本發明另提供一種載體，其包含：一前述表現卡匣及一多重選殖部位。
較佳地，前述啟動子的-10部位具有SEQ ID NO：06所示之序列。
較佳地，前述啟動子的-16部位具有SEQ ID NO：07所示之序列。
較佳地，前述核醣體結合部位具有SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、或其組合所示之序列。
較佳地，前述表現元件具有：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、或其組合所示之序列。
較佳地，前述起始碼與前述欲表現之基因之間設有一下游序列；其中前述下游序列具有SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或其組合所示之序列。
較佳地，前述表現卡匣進一步包含一調控基因。較佳地，前述調控基因為阿拉伯糖誘導表現調控基因araC。
較佳地，前述欲表現之基因為：轉譯為綠色螢光蛋白質之基因、酵素基因、抗原基因、具生理活性之胜肽與蛋白質的基因、或其組合。
較佳地，前述載體進一步包含一複製起始區域、一篩選基因、訊息胜肽、或其組合。
較佳地，前述載體所含篩選基因為：抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。
綜合以上所述，本發明提供一阿拉伯糖誘導表現系統的表現元件及表現卡匣，以建構一載體。前述載體透過大腸桿菌系統表現欲表現之蛋白質，且對於欲表現之基因有提高表現量的效能。據此，本發明提供一表現載體作為基因工程領域中另一新穎的選擇。
第一圖顯示比較本發明實施例中各表現元件的序列。
有鑒於阿拉伯糖誘導表現系統於基因工程中的優點，本發明欲提供一種表現元件，其適用於阿拉伯糖誘導表現系統且有助於提高欲表現之基因的表現量。藉由使用本發明之表現元件，可使習用的阿拉伯糖表現系統更具產業價值。
本發明的一個面向係提供一種表現元件。前述表現元件包含一啟動子及至少一下列元件：一核醣體結合部位或T7噬菌體轉譯增強元件。
本發明所述之「表現元件」係指起始碼上游與基因表現有關的核苷酸序列。在一可行實施態樣中，前述表現元件包含：啟動子(含-10部位、-16部位、及/或-35部位)、核醣體結合部位、基因表現調控序列、或其組合。
在一可行實施態樣中，前述啟動子的種類無需限制，所屬領域具有通常知識者自可依其需求選用合適的啟動子。在一較佳實施態樣中，前述「啟動子」為araB的啟動子，而使得前述表現元件可適用於阿拉伯糖誘導表現系統中。在一個較佳實施態樣中，前述啟動子的-10部位具有SEQ ID NO：06所示之序列。在另一個較佳實施態樣中，前述表現元件所含啟動子的-16部位具有SEQ ID NO：07所示之序列。
本發明所述「核醣體結合部位」係指在轉譯過程中可為核醣體所辨識與結合的序列。在一個較佳實施態樣中，前述核醣體結合部位具有SEQ ID NO：01。在一個可行實施態樣中，前述核醣體結合部位具有SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、或其組合所示之序列。本發明所稱「T7噬菌體轉譯增強元件」為一來自於噬菌體T7第十號基因起始碼上游的核苷酸序列。於一可行實施態樣中，前述T7噬菌體轉譯增強元 件具有SEQ ID NO：08所示之序列。
本發明的又一個面向係提供一種表現卡匣，其包含一前述表現元件、一起始碼、一欲表現之基因、及一終止碼。在一個較佳實施態樣中，前述起始碼與前述欲表現之基因之間設有一下游序列；其中前述下游序列具有SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或其組合所示之序列。在一個較佳實施態樣中，前述表現卡匣進一步包含一調控基因。
本發明所述之「調控基因」係指可轉譯出基因表現調控蛋白質之DNA序列。在一可行實施態樣中，前述調控基因為：araC。
本發明所述之「欲表現之基因」可依據使用者的需求不同而有所變動。前述欲表現基因例如，但不限於：轉譯綠色螢光蛋白質之基因、酵素基因、抗原基因、具生理活性之胜肽與蛋白質的基因、或其組合。本發明所述之「起始碼」係指mRNA中起始轉譯之密碼子。在一可行實施態樣中，前述起始碼為：ATG。本發明所述之「終止碼」係指終止轉譯的密碼子。在一可行實施態樣中，前述終止碼為：TAA、TAG、或TGA。
本發明的另一個面向係提供一種載體，其包含一前述表現卡匣及一多重選殖部位。在一個較佳實施態樣中，前述載體進一步包含一複製起始區域、一篩選基因、一訊息胜肽、或其組合。
在一可行實施態樣中，前述多重選殖部位包含一種以上可為限制酶所辨識的核苷酸序列。前述限制酶包括但不限於：BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、NdeI、PstI、SalI、SpeI、XbaI、XhoI、XmaI、或其組合。
本發明所稱「篩選基因」係用來確認前述載體是否有順利轉形(transform)進入宿主體內。前述篩選基因可為但不限於：抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。
本發明所稱「抗藥性篩選基因」係指以對抗生素之抗性確認 載體的轉形成功與否。舉例來說，前述抗藥性篩選基因為四環素抗性基因。在此可行實施態樣中，順利轉形載體的宿主(如，大腸桿菌)便可以產生對四環素的抗性，而得以存活於含有四環素的環境。
本發明所稱「非抗藥性篩選基因」係指非以對抗生素之抗性與否來確認轉形的基因。前述非抗藥性篩選基因例如但不限於：β-半乳糖苷酶的核酸序列。在採用β-半乳糖苷酶的核酸序列作為篩選基因的實施態樣中，轉形成功的菌株會將X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)分解為半乳糖和5-溴-4-氯-3-羥基吲哚，而5-溴-4-氯-3-羥基吲哚會二聚合為5,5'-二溴-4,4'-二氯靛藍，因此產生不可溶而可供辨識的藍色物質。
在一較佳實施態樣中，前述非抗藥性篩選基因為營養缺損株之互補基因(如，胸苷酸合成酶基因、胺基酸合成相關基因、糖類合成相關基因及菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸合成相關基因)、脂肪酸合成基因fabI。
實施例一：本發明之阿拉伯糖誘導表現載體的建構與轉形
本實施例係取得原始的阿拉伯糖誘導表現系統之表現元件，並分別對其中啟動子-10部位、啟動子-16部位、核醣體結合部位(Shine-Dalgarno sequence；SD)進行修飾，或額外添加T7噬菌體轉譯增強序列(T7)及/或下游序列。再將前述表現元件與pRPSJ-GFPT、pARABM7-GFPT或pARABM11-GFPT接合，以構成本發明之表現載體。最後，以增強型綠螢光蛋白質基因作為報導基因，透過大腸桿菌表現系統表現欲表現之基因。本實施例中所製得的表現元件如下表1中所示：
本實施例之各式阿拉伯糖誘導表現載體建構過程如下：
1. 原始阿拉伯糖誘導表現載體之建構
以大腸桿菌ECOS 9-5之染色體作為模板，利用AraCF及AraWR(GATATACATATGTTCACTCCATCCAAAAAAACGGGT；SEQ ID NO：46)引子組合進行原始阿拉伯糖誘導表現元件之擴增。在50μL聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng ECOS 9-5之染色體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。將PCR產物以PCR-MTM Clean Up system回收，以T4 DNA連接酶黏合至pJET1.2質體中，並利用DNA定序確認序列正確無誤後，將質體命名為pJET-ARABW。之後，以EcoRI與NdeI剪切pJET-ARABW，並利用Gel-MTM gel extraction system kit(GMbiolab,Taiwan)回收含有araC與araB-W表現元件之DNA片段。利用T4 DNA連接酶將araC與araB-W表現元件接入以相同限制酶剪切之pRPSJ-GFPT中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將序列正確無誤之質體命名為pARABW-GFPT。
2. 核醣體結合部位經修飾之表現載體的建構
以大腸桿菌ECOS 9-5之染色體作為模板，利用AraCF引子搭配AraM1R、AraM2R、AraM3R、AraM4R、AraM5R引子進行核醣體結合部位序列之修飾。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng ECOS 9-5之染色體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應 5分鐘(1個步驟)。將PCR產物以PCR-MTM Clean Up system回收，以T4 DNA連接酶黏合至pJET1.2質體中，並利用DNA定序確認序列正確無誤後，將質體分別命名為pJET-ARABM1、pJET-ARABM2、pJET-ARABM3、pJET-ARABM4、及pJET-ARABM5共5種。之後，以EcoRI與NdeI分別剪切此5種質體，並利用Gel-MTM gel extraction system kit(GMbiolab,Taiwan)回收含有araC與araB-M1、araC與araB-M2、araC與araB-M3、araC與araB-M4、及araC與araB-M5表現元件之DNA片段。利用T4 DNA連接酶將前述5種表現元件接入以相同限制酶剪切之pRPSJ-GFPT中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將序列正確無誤之質體分別命名為pARABM1-GFPT、pARABM2-GFPT、pARABM3-GFPT、pARABM4-GFPT、及pARABM5-GFPT。
3. 啟動子-10部位、及核醣體結合部位經修飾之表現載體的建構
以pARABM4-GFPT作為模版，利用AraCF/AraM6-2與AraM6-1/GFPSALIR等引子組分別進行DNA片段增幅。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pARABM4-GFPT及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段PCR產物以Gel-MTM gel extraction system kit回收。之後，以回收之兩個PCR產物作為模版，利用AraCF/GFPSALIR引子組合進行DNA增幅。PCR反應之條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。經此步驟後，即可獲得araC與araB-M6 表現元件。將PCR產物以PCR-MTM Clean Up system回收，以T4 DNA連接酶黏合至pJET1.2質體中，並利用DNA定序確認序列正確無誤後，將質體命名為pJET-ARABM6。之後，以EcoRI與NdeI剪切pJET-ARABM6，並利用Gel-MTM gel extraction system kit回收含有araC與araB-M6表現元件之DNA片段。利用T4 DNA連接酶將araC與araB-M6表現元件接入以相同限制酶剪切之pRPSJ-GFPT中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將序列正確無誤之質體命名為pARABM6-GFPT。
4. 啟動子-16部位、及核醣體結合部位經修飾之表現載體的建構
以pARABM4-GFPT作為模版，利用AraCF/AraM7-2與AraM7-1/GFPSALIR等引子組分別進行DNA片段增幅。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pARABM4-GFPT及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物以Gel-MTM gel extraction system kit回收。之後，以回收之兩個PCR產物作為模版，利用AraCF/GFPSALIR引子組合進行DNA增幅。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。經此步驟後，即可獲得araC與araB-M7表現元件。將PCR產物以PCR-MTM Clean Up system回收，以T4 DNA連接酶黏合至pJET1.2質體中，並利用DNA定序確認序列正確無誤後，將質體命名為pJET-ARABM7。之後，以EcoRI與NdeI剪切pJET-ARABM7，並利用Gel-MTM gel extraction system kit回收含有araC與araB-M7表現元件之DNA片段。利用T4 DNA 連接酶將araC與araB-M7表現元件接入以相同限制酶剪切之pRPSJ-GFPT中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將序列正確無誤之質體命名為pARABM7-GFPT。
5. 核醣體結合部位、及T7噬菌體轉譯增強序列經修飾之表現載體的建構
以大腸桿菌ECOS 9-5之染色體作為模板，利用AraCF引子搭配AraM10R引子進行表現元件之改造。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng ECOS 9-5之染色體及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。將PCR產物以PCR-MTM Clean Up system回收，以T4 DNA連接酶黏合至pJET1.2質體中，並利用DNA定序確認序列正確無誤後，將質體命名為pJET-ARABM10。之後，以EcoRI與NdeI剪切pJET-ARABM10，並利用Gel-MTM gel extraction system kit回收含有araC與araB-M10表現元件之DNA片段。利用T4 DNA連接酶將araC與araB-M10表現元件接入以相同限制酶剪切之pRPSJ-GFPT中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將序列正確無誤之質體命名為pARABM10-GFPT。
6. 啟動子-16部位、核醣體結合部位、及T7噬菌體轉譯增強序列經修飾之表現載體的建構
以pARABM7-GFPT作為模版，利用AraCF/AraM10R引子組進行DNA片段增幅。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pARABM7-GFPT及1U GDP-HiFi DNA 聚合酶。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物以Gel-MTM gel extraction system kit回收，以T4 DNA連接酶黏合至pJET1.2質體中，並利用DNA定序確認序列正確無誤後，將質體命名為pJET-ARABM11。之後，以EcoRI與NdeI剪切pJET-ARABM11，並利用Gel-MTM gel extraction system kit回收含有araC與araB-M11表現元件之DNA片段。利用T4 DNA連接酶將araC與araB-M11表現元件接入以相同限制酶剪切之pRPSJ-GFPT中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將序列正確無誤之質體命名為pARABM11-GFPT。
7. 添加下游序列之表現載體的建構
針對不同下游序列設計引子並利用聚合酶連鎖反應進行DNA之增幅。以pARABM7-GFPT作為模版，利用不同引子組合分別進行DNA片段增幅。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pARABM7-GFPT及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。4種PCR產物以Gel-MTM gel extraction system kit回收後，以NdeI與SalI進行剪切。經限制酶剪切之PCR產物以PCR-MTM Clean Up system回收後，利用T4 DNA連接酶將前述4種含下游序列與綠螢光蛋白質基因之DNA片段接入以相同限制酶剪切之pARABM7-GFPT及pARABM11-GFPT中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。 以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株並抽取質體進行DNA定序確認。將接入pARABM7-GFPT且序列正確無誤之質體分別命名為pARABM7-DS1GFPT、pARABM7-DS2GFPT、pARABM7-DS4GFPT、及pARABM7-DS5GFPT，而接入pARABM11-GFPT且序列正確無誤之質體則分別命名為pARABM11-DS1GFPT、pARABM11-DS2GFPT、pARABM11-DS4GFPT、及pARABM11-DS5GFPT。
前述實驗流程中所用引子對係如下表中所述。
實施例二：本發明之阿拉伯糖誘導表現載體的分析
本實施例將實施例一所得之阿拉伯糖誘導表現載體轉形進入大腸桿菌(ECOS 9-5)中，並誘導蛋白質(GFP)表現。接著，再以微盤分析儀測量螢光強度，以估算實施例一之表現元件與原始表現元件的表現量差異。
1. 帶有阿拉伯糖誘導表現載體之轉形株進行誘導與螢光強度之測定
將大腸桿菌ECOS 9-5轉形株接種於含四環素(25μg/mL)之LB培養基中，於37℃、180rpm之條件下進行振盪培養。經隔夜培養後，將菌液以1：20之比例接種至含有四環素(25μg/mL)之LB培養基中。於37℃、180rpm之條件下進行振盪培養。將細菌培養至以分光光度計量測細胞濃度達OD600約0.4，加入0.2%阿拉伯糖進行蛋白質誘導表現。誘導4小時後，離心(20630×g，5分鐘，4℃)收集菌體部分，以1mL PBS緩衝溶液洗滌菌體。離心(20630×g，5分鐘，4℃)收集菌體部分並懸浮於1mL PBS緩衝溶液。取出100μL菌液，利用TECAN INFINITE M200微盤分析儀，在波長600nm下，測量菌液之吸光度，亦於激發光波長為482nm，放射光波長為512nm下，測定樣品之螢光值。螢光強度(fluorescence intensity)以每單位細胞之螢光值(fluorescence/OD600)表示。實驗結果請參表三及表四。
比較針對核醣體結合部位進行修飾所得之araB-M1、araB-M2、araB-M3、araB-M4、及araB-M5表現元件。從實驗數據中可觀察到所有前揭5個表現元件相較於原始表現元件而論，皆顯著地提升欲表現之基因的表現量，其中使用araB-M4之欲表現之基因的表現量是使用原始表現元件的2.14倍。
接著，比較針對啟動子-10部位或-16部位進行修飾所得之araB-M6及araB-M7表現元件與原始表現元件。從數據中可觀察到使用araB-M6之欲表現之基因的表現量是使用原始表現元件的3.42倍，而使用araB-M7者則為原始表現元件的2.87倍。值得注意的是，araB-M6及araB-M7表現元件的數據分別為araB-M4的1.6及1.34倍，意味著針對啟動子-10部位或-16部位所進行的修飾與針對核醣體結合部位所進行的修飾有加成的效果。
比較加入T7噬菌體轉譯增強序列所得之araB-M10與araB-M4及原始表現元件，可觀察到使用araB-M10者的表現量為araB-M4的1.07倍，且為原始表現元件的2.3倍。此外，比較加入T7噬菌體轉譯增強序列所得之araB-M11與araB-M7及原始表現元件，可觀察到使用araB-M11者的表現量為araB-M7的1.08倍，且為原始表現元件的3.11倍。證實加入T7噬菌體轉譯增強序列對於表現量的正向效果。
根據表三，將araB-M7與araB-M11之起始碼下游加入不同下游序列的8種表現元件與原始表現元件做比較，其中可觀察到 araB-M7-DS4之表現效率為araB-M7之1.04倍，且為原始表現元件之4.07倍。此外，其他表現元件和原始表現元件相較，表現效率也都有提升。
<110> 財團法人農業科技研究所
<120> 表現元件、表現卡匣、及含其之載體
<130>
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (22)

  1. 一種用於阿拉伯糖誘導表現系統的表現元件，其包含：一啟動子及一核醣體結合部位；其中前述核醣體結合部位具有SEQ ID NO：01所示之序列；其中前述啟動子的-16部位具有SEQ ID NO：07所示之序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之表現元件，其中前述啟動子的-10部位具有SEQ ID NO：06所示之序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之表現元件，另包含一T7噬菌體轉譯增強元件，其具有SEQ ID NO：08所示之序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之表現元件，其中前述核醣體結合部位具有SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、或其組合所示之序列。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之表現元件，其具有：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、或其組合所示之序列。
  6. 一種表現卡匣，其包含：一如請求項第1項所述之表現元件、一起始碼、一欲表現之基因、及一終止碼。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣，其中前述表現元件中的啟動子的-10部位具有SEQ ID NO：06所示之序列。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣，另包含一T7噬菌體轉譯增強元件，其具有SEQ ID NO：08所示之序列。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣，其中前述表現元件中的核醣體結合部位具有SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、或其組合所示之序列。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣，其中前述起始碼與前述欲表現之基因之間設有一下游序列；其中前述下游序列具有SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或其組合所示之序列。
  11. 如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣，其中前述表現元件具有：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、或其組合所示之序列。
  12. 如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣，其進一步包含一調控基因。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之表現卡匣，其中前述調控基因為阿拉伯糖誘導表現調控基因araC。
  14. 如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣，其中前述欲表現基因為：轉譯為綠色螢光蛋白質之基因、酵素基因、抗原基因、具生理活性之胜肽與蛋白質的基因、或其組合。
  15. 一種載體，其包含：一如申請專利範圍第6項所述之表現卡匣及一多重選殖部位。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之載體，其中前述表現卡匣的表現元件中的啟動子-10部位具有SEQ ID NO：06所示之序列。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之載體，另包含一T7噬菌體轉譯增強元件，其具有SEQ ID NO：08所示之序列。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之載體，其中前述表現卡匣的表現元件中的核醣體結合部位具有SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、或其組合所示之序列。
  19. 如申請專利範圍第15項所述之載體，其中前述表現卡匣的前述起始碼與前述欲表現之基因之間設有一下游序列；其中前述下游序列具有SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO： 11、SEQ ID NO：12、或其組合所示之序列。
  20. 如申請專利範圍第15項所述之載體，其中前述表現卡匣的表現元件具有：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、或其組合所示之序列。
  21. 如申請專利範圍第15項所述之載體，其進一步包含一複製起始區域、一篩選基因、一訊息胜肽、或其組合。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之載體，其中前述篩選基因為：一抗藥性篩選基因、一非抗藥性篩選基因、或其組合。
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