CN115558661A - 用于使用模板转换反应进行cDNA合成和单细胞转录组概况分析的方法和组合物 - Google Patents

用于使用模板转换反应进行cDNA合成和单细胞转录组概况分析的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本申请披露了用于以改善的逆转录、模板转换以及预扩增合成cDNA以增加由个体细胞产生的cDNA文库的收率和平均长度的方法。这些新方法包括将TSO 3'端的单个核苷酸残基换成锁核酸(INA)、使用甲基基团供体、和/或高于常规所用的MgCb浓度。结合这些差异的单细胞转录组分析具有全长覆盖度、改善的灵敏度和准确度，具有较少偏差并且更易进行成本有效的自动化。本发明还提供了在3'端包含锁核酸的cDNA分子、包含这些cDNA分子的组合物和cDNA文库，以及用于单细胞转录组概况分析的方法。

Description

用于使用模板转换反应进行cDNA合成和单细胞转录组概况分 析的方法和组合物
本申请是申请日为2014年8月22日，申请号为201480053360.6，发明名称为“用于使用模板转换反应进行cDNA合成和单细胞转录组概况分析的方法和组合物”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月23日提交的美国临时专利申请序列号61/869,220的优先权，该申请的内容通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及用于以改善的收率和平均长度合成双链cDNA的方法、以及合成的cDNA分子和由个体细胞产生的cDNA文库。
背景技术
单细胞基因表达分析具有表征细胞异质性的前景，但是目前的方法牺牲了覆盖度、灵敏度或通量。存在若干用于由大量RNA构建全长cDNA的方法，包括帽富集过程(capenrichment procedure)(丸山·K.(Maruyama,K.)和菅野·S.(Sugano,S.)，基因(Gene)138，171–174(1994)；卡宁奇·P.(Carninci,P.)和林崎·Y.(Hayashizaki,Y.)，酶学方法(Meth.Enzymol.)303，19–44(1999)；达什·M.(Das,M.)等人，生理基因组学(Physiol.Genomics)6，57–80(2001))，但是由单细胞量RNA获得全长覆盖度仍然是具有挑战性的。现有方法使用cDNA的3'端polyA加尾(例如，唐F.(Tang,F.)等人，自然方法(Nat.Methods)6,377–382(2009)；笹川·Y.(Sasagawa,Y.)等人，基因组生物学(GenomeBiol.)14，R31(2013))或模板转换(朱Y.Y.(Zhu,Y.Y.)等人，生物技术(BioTechniques)30，892–897(2001)；拉姆斯科尔德·D.(
Figure BDA0003858277650000011
D.)等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)30，777–782(2012))，而其他方法由于早期多重化完全牺牲了全长覆盖度(伊斯兰·S.(Islam,S.)等人，基因组研究(Genome Res.)(2011)doi：10.1101/gr.110882.110；哈希姆绍尼T.(Hashimshony T.)等人，细胞报告(Cell Rep.)2，666–673(2012))。最近已经表明，与polyA加尾方法相比，依赖模板转换的Smart-Seq在整个转录物上具有更加均匀的读段覆盖度(拉姆斯科尔德·D.等人，自然生物技术30，777–782(2012))，与模板转换在设计来直接捕获RNA 5'端的应用中的常见使用一致，这些应用包括nanoCAGE(普莱西C.(Plessy,C.)等人，自然方法7,528–534(2010))和STRT(伊斯兰S.等人，基因组研究(2011)doi：10.1101/gr.110882.110)。利用模板转换的单细胞应用依赖于逆转录、模板转换反应以及统一聚合酶链式反应(PCR)预扩增的效率来获得足量的代表性cDNA以用于测序。尽管广泛使用这些反应，但是尚未报道由单细胞量改善cDNA文库收率和平均长度的系统性努力。
发明内容
本发明提供用于合成cDNA的改进方法，具体而言，在逆转录中，利用模板转换反应进行单细胞应用的模板转换和预扩增，以增加由个体细胞产生的cDNA文库的收率和平均长度。结合这些差异的单细胞转录组分析具有改善的灵敏度和准确度，并且偏差较少且更易进行成本有效的自动化。
确切地讲，为了改善由单细胞进行的全长转录组概况分析，本申请披露了在cDNA文库收率和长度方面对逆转录、模板转换寡核苷酸(TSO)以及PCR预扩增的大量变型的评估、以及这些结果与商用Smart-Seq(以下称为
Figure BDA0003858277650000021
)的比较。在此披露的改进出人意料且显著地增加了从少至1ng的启动总RNA获得的cDNA的收率和长度。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于制备与RNA分子互补的DNA的方法，该方法包括在包含锁核酸残基的模板转换寡核苷酸(TSO)的存在下进行逆转录反应。
在另一个实施例中，本发明提供了一种增加cDNA收率的方法，包括在cDNA合成中使用诸如甲基基团供体的添加剂。在一个实施例中，该甲基基团供体是甜菜碱。
在另一个实施例中，本发明提供了一种增加cDNA收率的方法，包括在cDNA的合成中使用增大浓度的金属盐，例如MgCl2。
在一个优选实施例中，该方法包括在cDNA合成中与增大浓度的MgCl2结合使用甲基基团供体。在一个特别优选的实施例中，该方法包括与增大浓度的MgCl2结合使用甲基基团供体甜菜碱，该方法已显示出对cDNA收率的显著的正面影响。
在另一个实施例中，本发明提供了一种增加预扩增cDNA的平均长度的方法，包括在RNA变性之前而不是在逆转录酶(RT)主混合物中给予dNTP。
在另一个实施例中，本发明提供了一种通过根据在此披露的实施例中任一个所述的方法产生的cDNA文库。
在另一个实施例中，本发明提供了根据在此披露的实施例中任一个产生的cDNA文库用于单细胞转录组概况分析的用途。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于分析多个单细胞中的基因表达的方法，包括根据在此披露的实施例中任一个所述的方法制备cDNA文库的步骤；并且对该cDNA文库进行测序。
已根据本发明证实，在纯化的RNA上进行的这些方法可适用于包括例如哺乳动物细胞的个体后生动物细胞。
在另一个实施例中，本发明提供了一种在其3’末端包含LNA的模板转换寡核苷酸(TSO)。
在另一个实施例中，本发明提供了根据在此披露的实施例中任一个所述的TSO用于合成双链cDNA的用途。
参考以下附图和详细描述将更好地理解本发明的这些和其他方面。
附图说明
图1示出cDNA文库收率和长度的改善。(A)相对于使用rG3 oligo获得的那些，使用不同的模板转换寡核苷酸，由1ng总RNA获得的预扩增cDNA的中值收率。所有oligo序列见于表1中。(B)相对于使用类似
Figure BDA0003858277650000031
的条件(甜菜碱和6mM Mg2+)获得的cDNA收率，在具有甜菜碱(黑色)或不具有甜菜碱(灰色)的反应液中由1ng总RNA获得且随着增大的Mg2+浓度变化的预扩增cDNA的中值收率。(C)在RNA变性之前(早期)或在RT主混合物(晚期)中采用dNTP的反应液中由1ng总小鼠脑RNA产生的预扩增cDNA的长度。(D)利用优化方案使用LNA-G和
Figure BDA0003858277650000032
IIA模板转换寡核苷酸由HEK293T细胞获得的预扩增cDNA的中值收率。虚线指示从商用
Figure BDA0003858277650000034
反应液获得的中值收率。(E)在具有或不具有甜菜碱的反应液中由DG-75细胞获得的预扩增cDNA的中值收率。(F)在具有或不具有珠粒提取的情况下在反应液中由单一HEK293T细胞产生的cDNA文库的长度。注意，脑mRNA天然长于细胞系mRNA。(A-F)以柱状图表示重复测量结果，并且每种条件的重复数在括号中指出。使用学生t检验确定平均收率或长度的显著差异。
图2示出单细胞中的灵敏的全长转录组概况分析。(A)根据表达水平分框的平行细胞中可重复检测的基因的百分比。在优化方案和
Figure BDA0003858277650000033
的重复内进行所有成对比较并且报告为平均值和90％的置信区间。(B)根据表达水平分类的基因框中的重复之内的基因表达估测值的标准差。误差条，s.e.m。(n≥4)。(C)在不同的RPKM截止值下，使用
Figure BDA0003858277650000035
和优化方案在HEK293T细胞中检测到的基因的平均数目。在所有RPKM阈值下均获得优化方案中基因检测的显著增加(全部在p<0.5下；学生t检验)。(D)在根据它们的GC含量分类的基因框中表达的(RPKM>1)检测基因的平均分数。来自人组织的mRNA-Seq数据被包含作为未预扩增对照。误差条表示SEM(n≥4)，并且下方的图示出每个框中的基因的GC范围。(E)对于使用不同方案产生的单细胞数据，比对到基因的3'最末端的20％、5'最末端的20％以及中间60％的读段的平均分数。(F)单细胞基因表达数据的主成分分析显示出两个最显著的成分。根据预扩增酶和方案变体对细胞进行着色。
图3示出在模板转换寡核苷酸中使用LNA碱基的cDNA收率。
图4示出单细胞RNA-Seq灵敏度和变异性。(A)平行细胞中可重复检测的基因的百分比。(B)基因表达估测值的标准差。
图5示出使用另一个分析通道对单细胞RNA-Seq结果的验证。(A)平行细胞中可重复检测的基因的百分比。(B)基因表达估测值的标准差。(C)检测基因的平均数目。(D)所表达的检测基因的平均分数。(E)对于使用不同方案产生的单细胞数据，比对到基因的3'最末端的20％、5'最末端的20％以及中间60％的读段的平均分数。
图6示出用Smart-Seq2、Quartz-Seq以及SMARTer产生的单细胞转录组学数据的比较。(A)平行细胞中可重复检测的基因的百分比。用Smart-Seq2和Quartz-seq进行所有成对比较，并且报告为平均数和90％的置信区间。(B)(A)中基因表达估测值的标准差。(C)平行细胞中可重复检测的基因的百分比。用Smart-Seq2和
Figure BDA0003858277650000036
进行所有成对比较，并且报告为平均数和90％的置信区间。(D)(C)中基因表达估测值的标准差。(E)平行细胞中可重复检测的基因的百分比。用Quartz-seq进行所有成对比较，并且报告为平均数和90％的置信区间。(F)(E)中基因表达估测值的标准差。
图7示出使用SMARTer、优化的Smart-Seq以及优化方案的变体产生的单细胞文库的映射统计。(A)对于每个单细胞RNA-Seq文库，具有1至9个错配的唯一比对读段(uniquelyalinged reads)的分数。(B)唯一比对、比对到多个基因组坐标、或不比对到所有单细胞RNA-Seq文库的读段的百分比。(C)映射到外显子、内含子或基因间区域的唯一比对读段的分数。(D)每个细胞和文库制备方案的测序读段的数目。
图8示出单细胞RNA-Seq方案中的基因表达和GC水平。
图9示出单细胞RNA-Seq灵敏度和变异性。(A)平行细胞中可重复检测的基因的百分比。(B)基因表达估测值中的标准差。
图10示出单细胞RNA-Seq数据中的在整个基因上的读段覆盖度。
图11示出在整个转录物上的读段覆盖度。(A)所有基因的读段覆盖度的平均分数。(B)-(F)通过长度分组成5个相等大小的框的转录物。
图12示出单细胞RNA-Seq数据中的读段峰。(A)每个单细胞RNA-Seq文库具有一个或多个高密度峰的基因的数目。(B)在最高数目的文库中具有峰的整个基因的读段密度的热图。
图13示出使用Smart-Seq2的单细胞转录组学的技术和生物学变异性的评估。(A)在HEK细胞的稀释液中可重复检测的基因的百分比。(B)(A)中基因表达估测值的标准差。(C)在HEK总RNA的稀释液中可重复检测的基因的百分比。(D)(D)中基因表达估测值的标准差。(E)具有个体细胞的成对比较的(D)的基因表达估测值的标准差。
图14示出用商用Tn5(Nextera公司(Nextera))产生的文库与用内部制备的Tn5产生的文库的比较。(A)使用内部条件可重复检测的基因的百分比。(B)(A)中基因表达估测值的标准差。(C)使用商用缓冲液和条件可重复检测的基因的百分比。(D)(D)中基因表达估测值的标准差。(E)在(A)中进行的反应的差异。
具体实施方式
本申请披露了用于以改善的逆转录、模板转换以及预扩增进行cDNA合成以增加由个体细胞产生的cDNA文库的收率和平均长度的方法。
在一个实施例中，本发明提供一种用于制备与RNA分子互补的DNA的方法，包括以下步骤：
使cDNA合成引物退火于该RNA分子并且合成第一cDNA链以形成RNA-cDNA中间体；并且
通过使该RNA-cDNA中间体与模板转换寡核苷酸(TSO)在适于与该RNA分子互补的该第一DNA链延伸的条件下接触进行逆转录酶反应，从而使该第一DNA链另外与该TSO互补，其中该TSO在其3'末端包含锁核酸(LNA)。
在本发明的另一个实施例中，该逆转录反应在甲基基团供体和金属盐的存在下进行。
在本发明的另一个实施例中，该甲基基团供体是甜菜碱。
在本发明的另一个实施例中，该金属盐是镁盐。
在本发明的另一个实施例中，该镁盐具有至少7mM、至少8mM或至少9mM的浓度。
在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸任选地包含一个或两个核糖核苷酸残基。
在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸包含至少一个或两个核糖核苷酸残基和一个LNA残基。
在本发明的另一个实施例中，该至少一个或两个核糖核苷酸残基是核糖鸟嘌呤。
在本发明的另一个实施例中，该锁核酸残基选自下组，该组由以下各项组成：锁鸟嘌呤、锁腺嘌呤、锁尿嘧啶、锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶以及锁5-甲基胞嘧啶。
在本发明的另一个实施例中，该锁核酸残基是锁鸟嘌呤。
在本发明的另一个实施例中，该锁核酸残基处于3'最末端位置。
在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸在3'端包含两个核糖核苷酸残基以及由式rGrG+N表征的一个锁核苷酸残基，其中+N表示一个锁核苷酸残基。
在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸包含rCrG+G。
在本发明的另一个实施例中，该甲基基团供体是甜菜碱，并且该金属盐是浓度为至少9mM的MgCl2。
在本发明的另一个实施例中，该方法进一步包括使用寡核苷酸引物扩增与RNA分子和模板转换寡核苷酸互补的DNA链。
在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸选自表S2中的这些寡核苷酸。
在本发明的另一个实施例中，该cDNA合成引物是一种oligo-dT引物。
在本发明的另一个实施例中，该cDNA是在包括锚定的oligo-dT引物的珠粒上合成的。
在本发明的另一个实施例中，该oligo-dT引物包含5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3'的序列，其中“N”是任何核苷碱基，并且“V”选自下组，该组由以下各项组成：“A”、“C”以及“G”。
在本发明的另一个实施例中，该方法进一步包括PCR预扩增、标签化、以及最终PCR扩增。
在本发明的另一个实施例中，该PCR预扩增在未纯化从逆转录反应获得的cDNA的情况下进行。
在本发明的另一个实施例中，该RNA是细胞中的总RNA。
在另一个实施例中，本发明提供了一种通过根据在此披露的任一实施例所述的方法产生的cDNA文库。
在另一个实施例中，本发明提供了通过根据在此披露的任一实施例所述的方法产生的cDNA文库用于单细胞转录组概况分析的用途。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于分析多个单细胞中的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：制备通过根据在此披露的任一实施例所述的方法产生的cDNA文库；并且对该cDNA文库进行测序。
在另一个实施例中，本发明提供了一种在3'端包含锁核苷酸残基的模板转换寡核苷酸(TSO)。本发明的这些TSO可用于cDNA的合成以提高收率和长度。
在另一个实施例中，该TSO在3'端包含三个核苷酸残基，其中所述三个核苷酸残基选自下组，该组由以下各项组成：+N+N+N、N+N+N、NN+N、rN+N+N、以及rNrN+N，其中N在每次出现时独立地为脱氧核糖核苷酸残基，rN在每次出现时独立地为核糖核苷酸残基，并且+N在每次出现时独立地为锁核苷酸残基。
在一个实施例中，该TSO处于3'端的这三个核苷酸残基的5'侧的部分(在此也称为5'部分)包含由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其混合物构成的任意核苷酸序列。在一个优选实施例中，该TSO的5'部分包含所有核糖核苷酸。在另一个优选实施例中，该TSO的5'部分包含所有脱氧核糖核苷酸。
在另一个实施例中，这些TSO中的锁核苷酸残基选自下组，该组由以下各项组成：锁鸟嘌呤、锁腺嘌呤、锁尿嘧啶、锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶、以及锁5-甲基胞嘧啶。
在另一个实施例中，这些TSO的3'端的三个核苷酸残基是NN+G或rNrN+G，其中N在每次出现时独立地为脱氧核糖核苷酸残基，并且rN在每次出现时独立地为核糖核苷酸残基。
在另一个实施例中，这些TSO的3'端的三个核苷酸残基是rGrG+N，其中+N是锁核苷酸残基。
在另一个实施例中，这些TSO的3'端的三个核苷酸残基是rGrG+G。
这些TSO优选地具有从约10至约50个核苷酸、或从约15至约45个核苷酸、或从约20至约40个核苷酸、或从约24至约35个核苷酸、或约30个核苷酸的长度。
在另一个实施例中，本发明提供了根据在此披露的实施例中任一个所述的TSO在cDNA合成中的用途。
适用于本发明的金属阳离子的例子包括但不限于Mg2+和Mn2+，优选Mg2+；并且它们的浓度可在0-30μM的范围内，优选范围是3-20μM、更优选的范围是9-12μM。
除甲基供体甜菜碱之外，可在本发明的cDNA合成中添加的其他添加剂包括但不限于海藻糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、DMSO(二甲亚砜)、甲酰胺、非离子型洗涤剂、TMAC(氯化四甲基铵)、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷(dC7GTP)、牛血清白蛋白(BSA)、以及T4基因32蛋白。
本发明适用于使用MMLV相关且具有模板转换活性的所有逆转录酶的反应。MMLV相关的逆转录酶包括野生型莫洛尼氏鼠白血病病毒及其变体，包括例如缺乏RNA酶H活性的衍生物，诸如SUPER-SCRIPT II(英杰(Invitrogen))、POWER SCRIPT(BD生物科学(BDBiosciences))以及SMART SCRIBE(Clontech公司(Clontech))。适用于本发明的TSO可包括条形码，包括但不限于分子条形码或样品条形码。
根据本发明合成的cDNA可具有与根据任何文献方法合成的cDNA相同的应用，包括但不限于小量cDNA文库的构建、单细胞cDNA分析、单细胞基因表达分析、少数细胞cDNA分析、少数细胞基因表达分析、单细胞qPCR分析(使用该预扩增步骤)以及基于帽子捕获的扩增。
以下非限制性实例说明本发明的某些方面。
实例
实例1
方法
使用总RNA的实验
使用从小鼠脑中提取的、与用于Illumina测序的
Figure BDA0003858277650000061
Ultra Low RNA试剂盒(Clontech公司)一起提供的对照总RNA进行RNA实验。在每个实验中使用一微升的1ng/μl溶液并且将其与1μl锚定的oligo-dT引物(10mM，5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′，其中“N”是任何碱基并且“V”是“A”、“C”、或“G”)和1μl的dNTP混合物(10mM，富酶泰斯公司(Fermentas))混合，在72℃下变性3分钟并且之后立即放置在冰上。将7μl的第一链反应混合物添加至每个样品，该第一链反应混合物含有0.50μl SuperScript II RT(200U ml-1，英杰)、0.25μl RNA酶抑制剂(20U ml-1，Clontech公司)、2μl Superscript II第一链缓冲液(5x，英杰)、0.25μl DTT(100mM，英杰)、2μl甜菜碱(5M，西格玛(Sigma))、0.9μl MgCl2(100mM，西格玛)、1μl TSO(10μM，oligo的完全列表可见于表S1中)以及0.1μl不含核酸酶的水(吉博公司(Gibco))。通过以下方式进行逆转录反应：在42℃下温育90分钟，接着进行10个循环(50℃下2分钟，42℃下2分钟)。最后，通过在70℃下温育15分钟使RT失活。
PCR预扩增
在原始的Smart-Seq方案中，在第一链cDNA合成之后进行使用Ampure XP珠粒进行纯化。然后在添加2μl Advantage 2聚合酶混合物(50X，Clontech公司)、5μl Advantage2PCR缓冲液(10X，Clontech公司)、2μl dNTP混合物(10mM，Clontech公司)、2μl IS PCR引物(12μM，Clontech公司)以及39μl不含核酸酶的水至50μl的最终反应体积之后，在固定于珠粒上的cDNA上直接进行PCR。在本实例中，在RT之后不对cDNA进行纯化，而是仅添加相同的PCR主混合物，考虑到第一链cDNA合成之后的体积是10μl并且相应地调节水的量。将反应液在95℃下温育1分钟，然后在(95℃下15秒，65℃下30秒，68℃下6分钟)之间循环15次，在72℃下10分钟进行最终延伸。
显著改善cDNA收率的第二改进是用KAPA HiFi HotStart ReadyMix(卡帕生物系统公司(KAPA Biosystems))替换Advantage 2聚合酶混合物。在这种情况下也省略第一链cDNA合成之后的纯化。PCR主混合物具有以下组成：25μl KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X，卡帕生物系统公司)、1μl IS PCR引物(10mM，5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)以及14μl不含核酸酶的水(吉博公司)。所用程序如下：98℃ 3分钟，接着进行15个(98℃ 15秒，67℃ 20秒，72℃ 6分钟)循环，在72℃下5分钟进行最终延伸。
不考虑所用的PCR方案，使用1:1比率的AMPure XP珠粒(贝克曼库尔特(BeckmanCoulter))、在15μl的EB溶液(凯杰(Qiagen))中进行最终洗脱来纯化PCR。在1:5稀释之后，在高灵敏度DNA芯片(安捷伦生物分析仪(Agilent Bioanalyzer))上检查文库大小分布。预期的平均大小应在1.5-2.0kb左右并且应忽略低于300bp的片段的部分。为评估该方案中结合的不同改进的表现，对在安捷伦生物分析仪曲线图中包含在区间300-9000bp中的cDNA的量进行估测。
标签化反应和最终PCR扩增
然后将五纳克cDNA用于标签化反应，，添加25μl的2X Tagment DNA缓冲液和5μl的Tagment DNA酶，以50μl的最终体积使用
Figure BDA0003858277650000071
DNA样品制备试剂盒(Illumina公司)进行标签化反应。将标签化反应液在55℃下温育5分钟，接着用DNA Clean&ConcentratorTM-5试剂盒(Zymo研究公司(Zymo Research))进行纯化，在来自
Figure BDA0003858277650000072
试剂盒的20μl重悬缓冲液(RSB)中进行最终洗脱。然后使用全部体积，连同15μl的
Figure BDA0003858277650000073
PCR引物混合物(NPM)、5μl的Index 1引物(N7xx)、5μl的Index 2引物(N5xx)以及5μl的PCR引物混合液(PPC)进行有限循环富集PCR(limited-cycle enrichment PCR)。如下进行第二轮扩增：72℃ 3分钟，98℃ 30秒，接着进行5个(98℃ 10秒，63℃ 30秒，72℃ 3分钟)循环。用1:1比率的AMPure XP珠粒进行纯化并且将样品加样到高灵敏度DNA芯片上以检查文库的质量，同时使用Qubit高灵敏度DNA试剂盒(英杰)进行定量。将文库稀释至2nM的最终浓度，汇集并且在IlluminaHiSeq 2000上测序。
单细胞cDNA分离
重悬于PBS中之后，在显微镜下手动挑取单个HEK293T(人)、DG-75(人)、C2C12(小鼠)以及MEF(小鼠)细胞。保持尽可能低的液体体积，通常低于0.5μl且优选低于0.3μl。然后将细胞转移至0.2ml薄壁PCR管，该薄壁PCR管含有2μl由0.2％Triton X-100(西格玛)和2U/μl的RNA酶抑制剂(Clontech公司)构成的温和的低渗裂解缓冲液。在整个过程中，将已经挑取的细胞保持在冰上，或在不立即使用时储存在-80℃下。所有下游步骤与使用总RNA时(参见上文)相同，唯一例外的是由于在单细胞中由RT获得的cDNA的量有限，所以使用高灵敏度DNA芯片进行质量控制，其中用纯(未稀释)的样品加样。
当使用总RNA工作时，观察到使用双倍TSO量或TSO和PCR酶的不同组合可增大cDNA收率(数据未示出)。为了验证这种发现，使用不同的TSO量(1或2μl的10μM溶液)、TSO类型(rGrGrG、rGrG+G或rGrG+N)或PCR酶(KAPA HiFi或Advantage 2)重复在HEK293T细胞上进行的一些实验。最显著的比较的测序结果报告于图S2-S7中。最终方案(即“最优化的”)是指在第一PCR(不进行AMPure XP珠粒纯化)中仅使用1μl的10μM rGrG+G TSO且KAPA HiFiHotStart ReadyMix作为酶的方案。
Smart-Seq实验
为了评估和比较本发明的方法的表现，使用Smart-Seq方案按照制造商的说明书(参见Clontech手册)用相同的总RNA和单细胞产生cDNA文库。在PCR预扩增之后，将5ng的cDNA用于标签化反应并且以与如上所述完全相同的方式处理。
cDNA收率和长度的统计分析
参照根据生物分析仪在3009,000bp范围内的cDNA收率和平均cDNA长度评估不同方案的表现。对于小鼠脑总RNA样品，选择一组实验以成对方式评估每个实验变量，其中所有其他变量是相同的。在该组实验之内，使用学生t检验和威尔科克森秩和检验评估两个变量之间收率或长度变化的显著性(表1，表单B)。
在HEK293T细胞实验中，使用学生t检验和威尔科克森秩和检验将每个优化的实验设置彼此比较，并且与
Figure BDA0003858277650000081
方案相比较(表3，表单B)。所有分析和图均在使用R的情况下产生。
读段比对和基因表达评估
使用Nextera双索引(i7+i5)在Illumina HiSeq 2000上对单细胞文库进行测序，在多路分用(demultiplexing)和去除细胞条形码之后，得到43bp插入读段。使用STAR2.2.0版本(道斌(Dobin)等人，生物信息学(Bioinformatics)201329(1):15-21)利用默认设置将读段与人(hg19)或小鼠(mm10)基因组比对并且将这些读段过滤以获得唯一映射读段(uniquely mapping reads)。使用rpkmforgenes(拉姆斯科尔德(Ramskold)等人，PLoS计算生物学(PLoS Comp Biol)，5，el000598，2009)，作为RPKM值计算Ensembl版本69和RefSeq(2013年2月)中的每个转录物的基因表达值。
单细胞RNA-Seq灵敏度和变异性
对来自每个实验设置的所有可能的技术重复对计算单一HEK293T细胞中的基因检测的分析(图2A、图5A以及7A)。通过两个样本中的表达水平将基因分框，并且如果两个样本中的RPKM均在0.1以上，那么视为已检测的。使用调整的沃尔德法(Wald method)将一个组之内所有可能的技术重复对的平均数与标准差一起使用。差异的分析(图2B和图5B以及7B)也在样本对上进行计算，通过对数表达的平均数将基因分框，排除任一样本中低于0.1RPKM的基因。由于所有单细胞的基因表达水平通常是对数正态分布的(本特松(Bengtsson)基因组研究(Genome Res)200515(10):1388-1392)，所以通过将一个框的平均差乘以0.886来计算log10表达值的绝对差和标准差。
读段覆盖度和GC公差的分析
针对所有蛋白质编码基因的最长转录物，使用RSeQC-2.3.4软件包(王(Wang)、王(Wang)以及李(Li).生物信息学2012；28(16):2184-5)计算基因体覆盖度(图2E和图8)。对于通过GC含量分框成10个相等大小的框的所有编码蛋白质的RefSeq基因，使用最长转录物计算在不同GC含量下的基因检测，并且计算没有检测或具有在不同RPKM截止值下的检测的基因的数目(图2D和图6)。
读段峰分析
一些基因表现出基因体之内的高密度读段无法解释的峰。为了鉴定这些区域，将每个基因的基因体分成101个相等大小的框，并且每个基因在该基因之内的平均读段分布上具有至少一个具有>5的标准差读段密度的框。在这些分析中，弃去具有低表达基因的基因(根据测序深度/细胞，所具有的读段少于大约2,000-10,000个读段的那些)。每个细胞中这类基因的数目在图9A中示出。并且在最高数目的HEK239T细胞中具有峰的基因表现为图9B中的热图，示出这些峰在所有实验中始终存在于相同位置。
实例2
为改善由单细胞获得的全长转录组概况分析，在cDNA文库收率和长度方面对逆转录、模板转换寡核苷酸(TSO)以及PCR预扩增的大量变型(总计457个实验)进行评估，并且将这些结果与商用Smart-Seq(以下称为
Figure BDA0003858277650000091
)相比较(表1)。重要的是，改进被鉴定显著增大了由1ng启动总RNA获得的cDNA收率和长度(表1)。
具体而言，相对于商用Smart-Seq所用的
Figure BDA0003858277650000092
IIA oligo，仅将TSO 3'端(rGrG+G)的单个鸟苷酸换成锁核酸(LNA)鸟苷酸导致cDNA收率增加了2倍(p＝0.003，学生t检验；图1a、表2以及图3)。
另外，发现甲基基团供体甜菜碱与较高的MgCl2浓度结合对收率具有显著的正面影响(增加2-4倍，p＝0.0012，学生t检验，针对所有比较)(图1b)。商用Smart-Seq缓冲液具有6mM MgCl2的最终浓度，但是在此发现当浓度增加至9mM或超出时获得较高的收率。最后，当在RNA变性之前而不是在RT主混合物中给予dNTP时，预扩增cDNA的平均长度增加370nt(p＝7.8×109，学生t检验；图1c)。
进一步证实了用纯化RNA获得的这些改善扩展至在个体人和小鼠细胞的裂解物中直接进行的cDNA反应。为此，由跨越不同细胞大小和总RNA含量的总计262个个体人或小鼠细胞(159 HEK293T、34 DG-75、30 C2C12以及39MEF细胞)产生单细胞cDNA文库(表3)。单细胞cDNA文库的分析表明在两种情况下获得较高的cDNA收率：使用含LNA的TSO(3倍增加，p<0.001，学生t检验；图1d)和甜菜碱连同高Mg2+浓度一起存在(4倍增加，p＝3.7×10-6，学生t检验；图1e)。
单细胞方法的灵敏度和准确度受每个样本处理步骤效率的限制。在用Advantage2聚合酶(Adv2)预扩增之前，
Figure BDA0003858277650000093
方案使用珠粒纯化从第一链cDNA反应液中去除未掺入的衔接子。然而，在小体积中进行珠粒纯化对液体处理自动化提出重大的回收挑战。在此确定，KAPA HiFi Hot Start(KAPA)DNA聚合酶在逆转录之后立即有效地扩增第一链cDNA，而无需前面的珠粒纯化。不经珠粒纯化预扩增的文库的收率没有降低，但是平均cDNA长度增加了450nt(p＝2.6×1012，学生t检验；图1f)，表明KAPA预扩增改善了cDNA生成并且提供用于Smart-Seq自动化的可行方法。
为了展示改善的cDNA生成对下游应用的重要性，估计了其对单细胞转录组概况分析的影响。为此，对根据商用SMARTer(n＝4)和使用本发明方案的变型产生的单一HEK293T细胞文库进行测序(Smart-Seq2，n＝35)(表4)。
由于可获得更多原始RNA分子用于测序，所以改善的RNA至cDNA转化率应改善基因表达概况分析。实际上，对于低丰度和中等丰度转录物观察到检测基因表达的能力的显著增加(图2a)和技术性偏差的降低(图2b和图4)。优化方案的改善的灵敏度导致在每个细胞中平均检测到2,372个以上的基因(p<0.05，学生t检验；图2c)。使用替代性RNA-Seq比对和分析策略独立验证所有这些改善(图5)。此外，与Quartz-Seq获得的数据相比，在用Smart-Seq2产生的单细胞转录组数据中获得更好的灵敏度和更低的变异性(图6)。尽管测序的文库具有与SARTer文库相似的映射特征，但是注意到未映射的读段增加了7％(图7)。
相比于与
Figure BDA0003858277650000101
一起使用的Advantage 2(Adv2)，若干预扩增酶具有更低的GC偏差，表明使用KAPA的cDNA预扩增也可改善单细胞概况分析。事实上，用KAPA预扩增的单细胞文库在更高GC水平下检测到更多的基因(图2d和图8)并且改善灵敏度和准确度(图9)。当与通过cDNA的3'端polyA加尾产生的单细胞数据中的5'区域的低覆盖度相比时，已用KAPA预扩增的单细胞RNA-Seq文库在整个转录物全长上具有显著更好的覆盖度(p<10-5，对于5'和3'端分别为1.6×10-3，学生t检验)，因为它们在5'和3'端达到预期的读段分数(图2e和图10-11)。重要的是，在第一主成分上分离的使用KAPA和Adv2预扩增的细胞的总体基因表达谱(图2f)表明预扩增偏差对绝对表达水平具有显著影响。对与必定会过滤的预扩增酶无关而在Smart-Seq中系统性地出现的具有所比对的人工大量读段的区域(即，峰)进行测序(图12)。总而言之，数据显示使用KAPA进行预扩增改善了GC公差和在整个转录物上的读段覆盖度。
为确定使用Smart-Seq2的单细胞转录组概况分析中的技术变异性程度，由HEK293T细胞的稀释系列(100、50以及10个细胞)以及总RNA(1ng、100pg、10pg)产生测序文库。当分析10个或更多个细胞时，技术性损失和偏差是小的，但是在单细胞水平下存在相当大的变异性，如先前所观察到的。将相同或不同细胞类型来源的细胞中存在的技术变异性与生物学变异性相对比是有益的(图13A-D)。为此，对来自DG-75(n＝7)、C2C12(n＝6)以及MEF(n＝7)细胞的另外的单细胞转录组进行测序。分析细胞群之间和细胞群之内的生物学变异性揭示，与细胞类型特异性表达相关的生物学变异性超过技术变异性大约50RPKM，但是确切的阈值将取决于所研究的细胞类型中的RNA含量(图13E)。
本发明提供一种改善灵敏度、准确度以及在整个转录物上的覆盖度且更易于自动化的新方案。此外，新方案每个反应的费用小于当前方案的12％并且当使用内部制备的Tn5时仅为3％(图14)。
尽管在Smart-Seq单细胞基因表达分析的背景中实现了这些结果，但是这些改进也可适用于依赖于模板转换的其他单细胞方法，包括在微流控芯片(例如Fluidigm C1)上或在乳液滴内部进行的那些。
上述实例和优选实施例的描述应视为说明而不是限制如权利要求所限定的本发明。应当容易认识到，在不脱离如权利要求所阐述的本发明的情况下，可利用以上所阐述的特征的大量变型和组合。这类变型不视为脱离本发明的精神和范围，并且所有这类变型旨在被包括在以下权利要求的范围内。
在此所引用的所有参考文件通过引用以其全部内容结合在此。
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Claims (28)

1.一种用于改善与RNA分子互补的DNA的合成收率和/或平均长度的方法，该方法包括以下步骤：
使cDNA合成引物退火于所述RNA分子并且合成第一cDNA链以形成RNA-cDNA中间体；并且
通过使所述RNA-cDNA中间体与模板转换寡核苷酸(TSO)在适于与该RNA分子互补的该第一DNA链延伸的条件下接触进行逆转录反应，从而使该第一DNA链另外与该TSO互补，其中该TSO的3'最末端核苷酸是锁核酸(LNA)，其中所述LNA选自由以下项组成的组：锁鸟嘌呤、锁腺嘌呤、锁尿嘧啶、锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶、以及锁5-甲基胞嘧啶，其中所述TSO包括AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+N，其中3'端的+N表示锁核苷酸残基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述逆转录反应在甲基基团供体和金属盐的存在下进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述甲基基团供体是甜菜碱。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述金属盐是镁盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述镁盐具有至少7mM的浓度。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述镁盐具有至少8mM的浓度。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述镁盐具有至少9mM的浓度。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述锁核酸残基选自由锁腺嘌呤和锁尿嘧啶组成的组。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述锁核酸残基选自由锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶以及锁5-甲基胞嘧啶组成的组。
10.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述甲基基团供体是甜菜碱，并且所述金属盐是浓度为至少9mM的MgC12。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，该方法进一步包括使用寡核苷酸引物扩增与所述RNA分子和所述模板转换寡核苷酸互补的所述DNA链。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸选自下表中的这些寡核苷酸
条目 TSO名称 序列(5′->3′) 1 rGrG+G AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G
。
13.根据权利要求1至7和12中任一项所述的方法，其中该cDNA是在包含锚定的oligo-dT引物的珠粒上合成的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述oligo-dT引物包含5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3'的序列，其中“N”是任何核苷碱基，并且“V”选自下组，该组由以下各项组成：“A”、“C”以及“G”。
15.根据权利要求10所述的方法，该方法进一步包括PCR预扩增、标签化、以及最终PCR扩增。
16.根据权利要求15所述的方法，其中该PCR预扩增在未纯化从逆转录反应获得的该cDNA的情况下进行。
17.根据权利要求1至7、12，和14至16中任一项所述的方法，其中所述RNA是细胞中的总RNA。
18.一种cDNA文库，该cDNA文库通过根据权利要求1至17中任一项所述的方法产生。
19.根据权利要求18所述的cDNA文库用于单细胞转录组概况分析的用途。
20.一种用于分析多个单细胞中的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：根据权利要求1至17中任一项所述的方法制备cDNA文库；并且对该cDNA文库进行测序。
21.一种模板转换寡核苷酸(TSO)，该TSO包含AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+N，其中3'最末端的+N表示锁核苷酸残基，其中所述锁核酸残基选自由以下项组成的组：锁鸟嘌呤、锁腺嘌呤、锁尿嘧啶、锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶、以及锁5-甲基胞嘧啶。
22.根据权利要求21所述的TSO，其中所述锁核苷酸残基是锁鸟嘌呤。
23.根据权利要求21所述的TSO，其中所述锁核苷酸残基是锁腺嘌呤。
24.根据权利要求21所述的TSO，其中所述锁核苷酸残基是锁尿嘧啶。
25.根据权利要求21所述的TSO，其中所述锁核苷酸残基是锁胸腺嘧啶。
26.根据权利要求21所述的TSO，其中所述锁核苷酸残基是锁胞嘧啶。
27.根据权利要求21所述的TSO，其中所述锁核苷酸残基是锁5-甲基胞嘧啶。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的TSO在根据权利要求1-17中任一项所述的方法的双链cDNA的合成中的用途。
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