JP6336080B2 - 鋳型切り替え反応を用いるcDNA合成および単一細胞トランスクリプトームプロファイリングのための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年8月23日に出願された米国仮特許出願第61/869,220号明細書に対する優先権を主張するものであり、その仮特許出願の内容は、参照により本明細書に援用される。
[1]
RNA分子に相補的なDNAを調製するための方法であって、
前記RNA分子にcDNA合成プライマーをアニールし、および第1cDNA鎖を合成して、RNA−cDNA中間体を形成する工程と、
前記RNA分子に相補的な前記第1DNA鎖の伸長に好適な条件下で前記RNA−cDNA中間体を鋳型切り替えオリゴヌクレオチド(TSO)と接触させることにより逆転写酵素反応を行い、前記第1DNA鎖をさらに前記TSOに対して相補的にする工程であって、前記TSOは、その3’末端にロックド核酸(LNA)を含む、工程と
を含む、方法。
[2]
前記逆転写反応が、メチル基供与体および金属塩の存在下で行われる、[1]に記載の方法。
[3]
前記メチル基供与体が、ベタインである、[2]に記載の方法。
[4]
前記金属塩が、マグネシウム塩である、[2]に記載の方法。
[5]
前記マグネシウム塩が、少なくとも7mM、少なくとも8mM、または少なくとも9mMの濃度を有する、[4]に記載の方法。
[6]
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、少なくとも1個または2個のリボヌクレオチド残基および前記LNA残基を含む、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]
前記少なくとも1個または2個のリボヌクレオチド残基が、リボグアニンである、[6]に記載の方法。
[8]
前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド5−メチルシトシンからなる群から選択される、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9]
前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニンである、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]
前記ロックド核酸残基が、最も3’側の位置にある、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11]
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、前記3’末端に、式rGrG+N(式中、+Nは、ロックドヌクレオチド残基を表す)により特徴付けられる3個のヌクレオチド残基を含む、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の方法。
[12]
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、rGrG+Gを含む、[11]に記載の方法。
[13]
前記メチル基供与体がベタインであり、かつ前記金属塩が少なくとも9mMの濃度のMgCl 2 である、[2]〜[12]のいずれか一項に記載の方法。
[14]
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記RNA分子および前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドに相補的な前記DNA鎖を増幅することをさらに含む、[1]〜[13]のいずれか一項に記載の方法。
[15]
前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、表S2中のオリゴヌクレオチドから選択される、[1]〜[14]のいずれか一項に記載の方法。
[16]
前記cDNAが、固定されたオリゴ−dTプライマーを含むビーズ上で合成される、[1]〜[15]のいずれか一項に記載の方法。
[17]
前記オリゴ−dTプライマーが、5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT 30 VN−3’の配列を含み、ここで、「N」は任意のヌクレオシド塩基であり、かつ「V」は「A」、「C」および「G」からなる群から選択される、[16]に記載の方法。
[18]
PCR予備増幅、タグメンテーション、および最終PCR増幅をさらに含む、[13]〜[17]のいずれか一項に記載の方法。
[19]
前記PCR予備増幅が、逆転写反応から得られた前記cDNAを精製することなしに行われる、[18]に記載の方法。
[20]
前記RNAが、細胞中の全RNAである、[1]〜[19]のいずれか一項に記載の方法。
[21]
[1]〜[20]のいずれか一項に記載の方法により作製されるcDNAライブラリー。
[22]
単一細胞トランスクリプトームプロファイリングのための、[21]に記載のcDNAライブラリーの使用。
[23]
複数の単一細胞中の遺伝子発現を解析するための方法であって、[1]〜[20]のいずれか一項に記載の方法に従ってcDNAライブラリーを調製する工程と、前記cDNAライブラリーを配列決定する工程とを含む、方法。
[24]
鋳型切り替えオリゴヌクレオチド(TSO)であって、その3’末端にロックドヌクレオチド残基を含む、鋳型切り替えオリゴヌクレオチド(TSO)。
[25]
前記3’末端に+N+N+N、N+N+N、NN+N、rN+N+N、およびrNrN+Nからなる群から選択される3個のヌクレオチド残基を含む[24]に記載のTSOであって、Nは、各存在において独立して、デオキシリボヌクレオチド残基であり、rNは、各存在において独立して、リボヌクレオチド残基であり、および+Nは、各存在において独立して、ロックドヌクレオチド残基である、TSO。
[26]
前記ロックドヌクレオチド残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド5−メチルシトシンからなる群から選択される、[24]または[25]に記載のTSO。
[27]
前記3個のヌクレオチド残基が、NN+GまたはrNrN+Gである、[25]に記載のTSO。
[28]
前記3個のヌクレオチド残基が、rGrG+NまたはGG+Nである、[25]に記載のTSO。
[29]
前記3個のヌクレオチド残基が、rGrG+GまたはGG+Gである、[25]に記載のTSO。
[30]
[1]〜[20]のいずれか一項に記載の方法に従う二本鎖cDNAの合成における、[24]〜[29]のいずれか一項に記載のTSOの使用。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の図面および詳細な説明を参照することによってより良く理解されるであろう。
RNA分子にcDNA合成プライマーをアニールし、および第1cDNA鎖を合成して、RNA−cDNA中間体を形成する工程と、
RNA分子に相補的な第1DNA鎖の伸長に好適な条件下でRNA−cDNA中間体を鋳型切り替えオリゴヌクレオチド(TSO)と接触させることにより逆転写酵素反応を行い、第1DNA鎖をさらにTSOに対して相補的にする工程であって、TSOは、その3’末端にロックド核酸(LNA)を含む、工程と
を含む、方法を提供する。
方法
全RNAを用いた実験
RNA実験を、SMARTer(登録商標)Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing(Clontech)と共に供給される、マウス脳から抽出されたControl Total RNAを用いて行った。1マイクロリットルの1ng/μl溶液を各実験において使用し、1μlの固定されたオリゴ−dTプライマー(10mM、5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN−3’(「N」は任意の塩基であり、「V」は「A」、「C」または「G」のいずれかである))および1μlのdNTPミックス(10mM、Fermentas)と混合し、72℃で3分間変性させ、その後、氷の上に即座に置いた。0.50μlのSuperScript II RT(200U ml−1、Invitrogen)、0.25μlのRNAse阻害剤(20U ml−1、Clontech)、2μlのSuperscript II First−Strand Buffer(5×、Invitrogen)、0.25μlのDTT(100mM、Invitrogen)、2μlのベタイン(5M、Sigma)、0.9μlのMgCl2(100mM、Sigma)、1μlのTSO(10μM、オリゴの完全な一覧は表S1に見出され得る)および0.1μlのヌクレアーゼ非含有水(Gibco)を含有する7μlの第1鎖反応混合物を、各試料に添加した。逆転写反応を、42℃での90分間のインキュベーション、続いて10サイクルの(50℃2分間、42℃2分間)を行うことより実施した。最後に、70℃での15分間のインキュベーションにより、RTを不活性化した。
元のSmart−Seqプロトコルでは、第1鎖cDNA合成後に、Ampure XPビーズでの精製が行われる。次いで、2μlのAdvantage 2 Polymerase Mix(50×、Clontech)、5μlのAdvantage 2 PCR Buffer(10×、Clontech)、2μlのdNTPミックス(10mM、Clontech)、2μlのIS PCRプライマー(12μM、Clontech)および50μlの最終反応体積までの39μlのヌクレアーゼ非含有水を添加した後に、ビーズ上に固定化されたcDNAに対して直接PCRが実施される。本実施例では、RT後のcDNAの精製は行わず、第1鎖cDNA合成後の体積が10μlであることを考慮し、それに応じて水量を調整しながら、同じPCRマスターミックスの添加のみを行った。反応物を95℃で1分間インキュベートし、次いで、(95℃15秒、65℃30秒、68℃6分)の間を15回循環させ、72℃で10分間最終伸長させた。
次いで、5ナノグラムのcDNAを、Nextera(登録商標)DNA Sample Preparationキット(Illumina)を用いて実施したタグメンテーション反応のために、25μlの2×Tagment DNA Bufferおよび5μlのTagment DNA Enzymeを添加して50μlの最終体積で使用した。タグメンテーション反応物を55℃で5分間インキュベートし、続いてDNA Clean&Concentrator(商標)−5キット(Zymo Research)を用いて精製し、Nextera(登録商標)キットからの20μlのResuspension Buffer(RSB)中で最終溶出を行った。次いで、全体積を、15μlのNextera(登録商標)PCR Primer Mix(NPM)、5μlのIndex 1プライマー(N7xx)、5μlのIndex 2プライマー(N5xx)および5μlのPCR Primer Cocktail(PPC)と一緒に、限られたサイクルの富化PCRのために使用した。第2の増幅ラウンドは、次のとおり行った:72℃3分、98℃30秒、次いで、5サイクルの(98℃10秒、63℃30秒、72℃3分)。1:1比のAMPure XPビーズを用いて精製を行い、試料をHigh−Sensitivity DNAチップ上に負荷してライブラリーの品質を調べ、さらにQubit High−Sensitivity DNAキット(Invitrogen)を用いて定量を行った。ライブラリーを2nMの最終濃度に希釈し、プールし、Illumina HiSeq 2000で配列決定した。
単一のHEK293T(ヒト)、DG−75(ヒト)、C2C12(マウス)およびMEF(マウス)細胞を、PBSへの再懸濁後に、顕微鏡下において手作業で採取した。液体の体積を、可能な限り小さく(通常は0.5μl未満、好ましくは0.3μl未満)維持した。次いで、0.2%Triton X−100(Sigma)および2U/μlのRNAse阻害剤(Clontech)からなる2μlの穏やかな低張溶解緩衝液を含有する0.2ml薄壁PCRチューブに細胞を移した。既に採取された細胞は、プロセスの間中氷の上で維持したか、または即座に使用しない場合は−80℃で貯蔵した。単一細胞ではRTから得られるcDNAの量が限られているため(希釈なしに)純粋な状態で試料を負荷したHigh Sensitivity DNAチップでの品質管理のみを除いて、下流工程は全て、全RNAを用いた場合(上記参照)と同じであった。
本方法の性能を評価および比較するために、Smart−Seqプロトコルを製造業者の指示(Clontechマニュアル参照)に従って用い、同じ全RNAおよび単一細胞を用いてcDNAライブラリーを生成した。PCR予備増幅後に、5ngのcDNAをタグメンテーション反応のために使用し、上に記載したのと全く同じ方法で処理した。
異なるプロトコルの性能を、3009,000bpの範囲において、Bioanalyzerにより、cDNA収量および平均cDNA長に関して評価した。マウス脳全RNA試料については、各実験変数を、全ての他の変数が同一である1組の実験を選択して、対様式で評価した。その実験組内において、2つの変数間の収量または長さの変化についての有意性を、スチューデントt検定およびウィルコクソン順位和検定を用いて評価した(表1、シートB)。
単一細胞ライブラリーを、Illumina HiSeq 2000でNexteraデュアルインデックス(i7+i5)を用いて配列決定し、デマルチプレックスおよび細胞バーコードの除去後に43bpのインサートリードを得た。これらのリードを、デフォルト設定を用いたSTAR v2.2.0(Dobin et al.Bioinformatics 2013 29(1):15−21)を用いてヒト(hg19)またはマウス(mm10)ゲノムに対してアライメントし、一意的にマッピングするリードを得るためにフィルタリングした。遺伝子発現値は、rpkmforgenes(Ramskoeld et al.PLoS Comp Biol.,5,e1000598,2009)を用いて、Ensembl release 69およびRefSeq(2013年2月)中の各転写物について、RPKM値として算出した。
単一HEK293T細胞における遺伝子検出の分析結果(図2A、図5A、および7A)は、各実験設定からの技術的反復試験の全ての可能な対に関して算出したものである。2つの試料において遺伝子を発現レベルによって値域ごとにまとめ、両方の試料においてRPKMが0.1より高かった場合に検出されたと見なした。修正Wald法を用いて、1つのグループ内の技術的反復試験の全ての可能な対についての平均値を標準偏差と共に使用した。変動の分析結果(図2Bおよび図5B&7B)もまた試料の対に関して算出したものであり、遺伝子をlog発現の平均値によって値域ごとにまとめ、いずれかの試料において0.1RPKM未満の遺伝子を排除した。単一細胞全体の遺伝子発現レベルは、多くの場合、対数正規分布している(Bengtsson Genome Res 2005 15(10):1388−1392)ため、log10発現値における絶対差および標準偏差を、値域中の平均差に0.886を乗じることにより算出した。
遺伝子本体カバレッジを、全てのタンパク質コード遺伝子の最も長い転写物について、RSeQC−2.3.4パッケージ(Wang,Wang and Li.Bioinformatics 2012;28(16):2184−5)を用いて算出した(図2Eおよび図8)。異なるGC含量における遺伝子検出を、GC含量によって10個の同サイズの値域に値域ごとにまとめられた全てのタンパク質コードRefSeq遺伝子について最も長い転写物を用いて算出し、および検出されなかった、または異なるRPKMカットオフにおいて検出された遺伝子の数を算出した(図2Dおよび図6)。
一部の遺伝子は、遺伝子本体内において高密度のリードを有する原因不明のピークを呈した。これらの領域を特定するために、各遺伝子の遺伝子本体を101個の同サイズの値域に分割し、各遺伝子は、その遺伝子内に平均リード分布に対して>5標準偏差のリード密度を有する少なくとも1つの値域を有していた。これらの分析において、低発現遺伝子(細胞ごとの配列決定深度によるが、約2,000〜10,000リードよりも少ないリードを有するもの)を含む遺伝子は除いた。各細胞中のそのような遺伝子の数を図9Aに示す。そして、最高数のHEK239T細胞においてピークを有する遺伝子を、図9Bにヒートマップとして表示しており、これらは、それらのピークが全ての実験において一貫して同じ位置で見出されることを図示している。
単一細胞からの全長トランスクリプトームプロファイリングを改善するために、逆転写、鋳型切り替えオリゴヌクレオチド(TSO)およびPCR予備増幅の多くの変形(合計457個の実験)を評価し、その結果を、cDNAライブラリーの収量および長さに関して市販のSmart−Seq(以後SMARTer(登録商標)と呼ぶ)と比較した(表1)。重要なことには、1ngの出発全RNAから得られるcDNAの収量および長さの両方を著しく増大させる改変が特定された(表1)。
Claims (25)
- RNA分子に相補的なDNAを調製するための方法であって、
前記RNA分子にcDNA合成プライマーをアニールし、および第1cDNA鎖を合成して、RNA−cDNA中間体を形成する工程と、
前記RNA分子に相補的な前記第1DNA鎖の伸長に好適な条件下で前記RNA−cDNA中間体を鋳型切り替えオリゴヌクレオチド(TSO)と接触させることにより逆転写酵素反応を行い、前記第1DNA鎖をさらに前記TSOに対して相補的にする工程であって、前記TSOの最も3’側のヌクレオチドのみが、ロックド核酸(LNA)である、工程と
を含む、方法。 - 前記逆転写反応が、メチル基供与体および金属塩の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記メチル基供与体が、ベタインである、請求項2に記載の方法。
- 前記金属塩が、マグネシウム塩である、請求項2に記載の方法。
- 前記マグネシウム塩が、少なくとも7mMの濃度を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、少なくとも1個または2個のリボヌクレオチド残基および前記LNA残基を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1個または2個のリボヌクレオチド残基が、リボグアニンである、請求項6に記載の方法。
- 前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド5−メチルシトシンからなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ロックド核酸残基が、ロックドグアニンである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、前記3’末端に、式rGrG+N(式中、+Nは、ロックドヌクレオチド残基を表す)により特徴付けられる3個のヌクレオチド残基を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、rGrG+Gを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記メチル基供与体がベタインであり、かつ前記金属塩が少なくとも9mMの濃度のMgCl2である、請求項2〜5のいずれか一項、または請求項2〜5のいずれか一項を引用する請求項6〜11のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記RNA分子および前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドに相補的な前記DNA鎖を増幅することをさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド:
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G(TSO名:rGrG+G)、および
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+N(TSO名:rGrG+N)
からなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記cDNAが、固定されたオリゴ−dTプライマーを含むビーズ上で合成される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴ−dTプライマーが、5’−AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN−3’の配列を含み、ここで、「N」は任意のヌクレオシド塩基であり、かつ「V」は「A」、「C」および「G」からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- PCR予備増幅、タグメンテーション、および最終PCR増幅をさらに含む、請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCR予備増幅が、逆転写反応から得られた前記cDNAを精製することなしに行われる、請求項17に記載の方法。
- 前記RNAが、細胞中の全RNAである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の単一細胞中の遺伝子発現を解析するための方法であって、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法に従ってcDNAライブラリーを調製する工程と、前記cDNAライブラリーを配列決定する工程とを含む、方法。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法に従う二本鎖cDNAの合成における、NN+N、およびrNrN+Nからなる群から選択される3’末端に3個のヌクレオチド残基を含むTSOの使用であって、Nは、各存在において独立して、デオキシリボヌクレオチド残基であり、rNは、各存在において独立して、リボヌクレオチド残基であり、および+Nは、各存在において独立して、ロックドヌクレオチド残基である、使用
- 前記ロックドヌクレオチド残基が、ロックドグアニン、ロックドアデニン、ロックドウラシル、ロックドチミン、ロックドシトシン、およびロックド5−メチルシトシンからなる群から選択される、請求項21に記載の使用。
- 前記3個のヌクレオチド残基が、NN+GまたはrNrN+Gである、請求項21に記載の使用。
- 前記3個のヌクレオチド残基が、rGrG+NまたはGG+Nである、請求項21に記載の使用。
- 前記3個のヌクレオチド残基が、rGrG+GまたはGG+Gである、請求項21に記載の使用。
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