WO2021006353A1 - 固相担体を用いた核酸増幅方法 - Google Patents

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綱治 松島
悟史 上羽
成之 七野
伊藤　哲
寛泰 青木
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification method using a solid phase carrier.
  • Non-Patent Document 1 It is the driving force for promoting the understanding of biology at an unprecedented resolution.
  • T cells include tumor-infiltrating T cells contained in the biopsy specimens of primary and metastatic lesions collected for the purpose of diagnosing cancer patients.
  • the sequence of T cell receptor (TCR) on CD8 + T cells is analyzed to determine TCR repertoire (type of clone and frequency of existence of each clone), and tumor.
  • Non-Patent Document 3 Some discuss specific clone responses, and it has also been reported that TCR repertoire fluctuations actually correlate with the therapeutic effect of anti-CD4 antibodies on cancer (Non-Patent Document 3).
  • most of the tumor-infiltrating T cell cells are cancer cells and histiocytes, and in most cases, the content of T cells is extremely low. Therefore, for SCT analysis and robust TCR repertoire analysis at the cancer site, it is important to develop a method for amplifying mRNA extracted from the sample and individual T cell-derived mRNA derived from the sample with high sensitivity and high throughput. Yes, it is increasing.
  • a liquid phase system such as Smart-Seq2 that amplifies individual cells or a small amount of mRNA by dispensing it onto a 96-well plate (Patent Document 1, Non-Patent Document 4), or microflow.
  • droplet systems such as Chromium of 10X Genomics (Patent Document 2) that form droplets using pathways and capture one cell in each droplet, and methods that capture mRNA of individual samples using solid phase beads.
  • Smart-Seq2 is highly sensitive, but it has low throughput and high cost because individual cells are sorted into 96-well or 384-well plates with a flow cytometer.
  • the droplet system such as 10X Chromium has a problem that the throughput is high but the sensitivity is significantly inferior to that of Smart-Seq2 (Non-Patent Document 5).
  • a surfactant having a strong protein denaturing effect cannot be used as a reagent for cell lysis, and cells with a large amount of RNA degrading enzyme cannot be used. There is a problem that is difficult to analyze.
  • the mRNA / cDNA amplification method via immobilization on beads can easily replace the reaction solution between reaction steps without significantly losing the substrate cDNA, so that a surfactant having a strong protein denaturing effect can be used. It is compatible with a wider variety of reaction conditions compared to liquid phase systems. Furthermore, by using magnetic beads as the solid-phase bead carrier, it is possible to automate and semi-automate the process using a magnet stand and an automatic dispensing workstation, which is a useful technology for high-throughput SCT and TCR analysis. .. In fact, Kamihara et al. Have shown that the use of magnetic beads can amplify trace amounts or single-cell-derived cDNA (Patent Document 3, Non-Patent Document 6).
  • Exonuclease I is widely used to remove primers containing unreacted cell barcodes, but in the high-sensitivity amplification method of Kamihara et al. There is also a problem that Exonuclease I treatment cannot be performed because the ratio of the number of DNA substrate molecules to the amount of TdT enzyme is changed.
  • the DNA tag is oligo DNA, but its length is relatively long, 84 base pairs or more, and 1 Combined with the cell barcode used for the cell transcriptome, the length is 145 base pairs or more.
  • the conventional TdT method cannot separate cDNA and their products well in the presence of DNA fragments that are shorter than cDNA but relatively long, such as primers with 126 base pairs or more.
  • Non-Patent Document 9 In general, the expression level of protein is significantly higher than the expression level of mRNA, so that it is difficult to separate the DNA tag product and the amplified cDNA for detecting the protein by the conventional TdT method.
  • Beckton Dickinson has launched a SCT analysis system called the BD Rhapsody system that uses solid-phase magnetic beads and microwells (Patent Document 4), but Beckton Dickinson's RNA analysis method has a limited number of about 500 genes.
  • the gene analysis panel of No. 1 or the low-sensitivity amplification system having the same efficiency as Chromium of 10X Genomics has not been provided to meet the needs of researchers.
  • Other SCT analysis methods using solid-phase beads include the Drop-seq method (Non-Patent Document 10) and the Seq-well method (Non-Patent Document 11), but these are also less efficient than the TdT method.
  • the SMART method is used, and low sensitivity is a problem.
  • Quartz-Seq a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression Yohei Sasagawa, Hiroki Danno, Hitomi Takada, Masashi Ebisawa, Kaori Tanaka, Tetsutaro Hayashi, Akira Kurisaki, and Itoshi Nikaido. Quartz-Seq2: a high-throughput that .. Macosko EZ et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell 2015; 161 (5): 1202-1214. Gierahn TM et al. Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput. Nat Methods 2017; 14 (4): 395-398.
  • An object of the present invention is to provide a method for amplifying nucleic acids such as cDNA using a solid phase carrier, which can comprehensively amplify mRNA from a very small amount of cell sample with high efficiency.
  • a target nucleic acid containing mRNA is captured on a solid-phase carrier such as beads, complementary strand synthesis is performed on the solid phase, and unreacted target-capturing nucleic acid on the solid phase is decomposed and removed, and then mRNA is used.
  • a nucleic acid amplification method using a solid phase carrier which comprises performing homopolymer addition by TdT reaction in the presence of degradation and chain-stopped nucleotide triphosphate, including the following aspects.
  • Target nucleic acid capture step of capturing a target nucleic acid containing mRNA on a solid phase carrier via a target capture nucleic acid bound on the solid phase carrier;
  • Complementary strand synthesis step of synthesizing a DNA strand complementary to the target nucleic acid, including cDNA, from the target nucleic acid captured on the solid phase carrier;
  • An exonuclease treatment step of decomposing and removing a target capture nucleic acid on a solid phase carrier that does not capture the target nucleic acid by exonuclease treatment;
  • An mRNA degradation step that degrades mRNA with an RNA-degrading enzyme;
  • a homopolymer addition step in which a reaction is carried out with terminal deoxynucleotidine transferase in the presence of dATP, dTTP, dCTP or dGTP and a chain-stopped nucleotide triphosphate to add a nucleotide homopolymer to the end of
  • a nucleic acid amplification method using a solid phase carrier which comprises a nucleic acid amplification step in which a nucleic acid amplification reaction is carried out using a double strand of DNA synthesized on the solid phase carrier as a template.
  • Method. (16)
  • the target nucleic acid contains an mRNA and an oligonucleic acid bound to a specific binding molecule, and the target capture nucleic acid contains a nucleic acid containing an mRNA capture sequence for capturing the mRNA and a nucleic acid for capturing the oligonucleic acid.
  • the oligonucleic acid contains a capture region having a sequence complementary to the oligonucleic acid capture region, and in the complementary strand synthesis step, cDNA synthesis by a reverse transcription reaction from mRNA and the oligonucleic acid
  • the capture region is poly A
  • the target capture nucleic acid contains a nucleic acid containing an mRNA capture region and a nucleic acid containing a poly T portion as a nucleic acid containing an oligonucleic acid capture region. ..
  • the oligonucleic acid contains a common sequence on the 5'side of the capture region, and the target capture nucleic acid contains a first adapter portion on the 5'side of the poly T portion (16) to (21).
  • the method according to any one of the above.
  • the primer according to (22) or (23), wherein the primer for second chain synthesis contains a primer containing a second adapter portion on the 5'side of the complementary homopolymer moiety and a primer containing the common sequence.
  • a nucleic acid amplification reaction is carried out using a primer that targets the first adapter portion, a primer that targets the second adapter portion, and a primer that contains a common sequence.
  • a primer that targets a desired region in cDNA, a primer that targets the first adapter portion, a primer that targets the second adapter portion, and a primer that contains a common sequence is carried out using and.
  • a chain-terminating reaction using a chain-terminating nucleotide triphosphate such as ddNTP is used in the nucleotide homopolymer addition reaction to cDNA synthesized on a solid-phase carrier.
  • cDNA can be stably and efficiently amplified even from a small amount of sample regardless of the excess of the amount ratio of the enzyme to the DNA substrate on the solid phase, the excess of the reaction time, and the difference in the reagent lot.
  • both sensitivity and robustness are affected by differences in the proficiency of the experimenter (low proficiency causes a time lag in the experimental operation and tends to cause an excess of the reaction time) and differences in reagent lots.
  • a small amount of difficult-to-handle sample such as 1 cell or tumor biopsy sample can be used according to the proficiency level of the experimenter and the reagent lot. It can amplify mRNA by covering mRNA robustly and with high sensitivity without being affected by differences.
  • the method of Kamihara et al. is a method capable of amplifying cDNA with high sensitivity using magnetic beads, but the parameters of the homopolymer addition reaction by TdT (DNA substrate and enzyme on magnetic beads). Strict control of the amount ratio, reaction time, temperature, etc.) is required. Since the Exonuclease I treatment changes the amount ratio of the DNA substrate and TdT enzyme on the solid phase, there is a problem that the amplification method of Kamihara et al. Cannot remove the unreacted primer by Exonuclease I.
  • expression analysis and TCR analysis can be performed even with a small amount of sample. Therefore, for example, the accuracy of therapeutic effect determination using expression analysis and TCR analysis can be significantly improved, and medical resources can be obtained. It can contribute to the reduction of waste.
  • oligonucleic acid-labeled antibodies against a plurality of proteins in combination it is possible to simultaneously perform highly sensitive analysis of protein and mRNA expression in each cell.
  • oligonucleic acid-labeled antibodies against cell surface molecules that are stably expressed in the cells to be analyzed specific binding molecules labeled with oligonucleic acids that can non-specifically label cell surface molecules in general, and their partner molecules.
  • simultaneous analysis of multiple samples becomes possible, so the cost required to create a cDNA library can be reduced in proportion to the number of samples to be analyzed simultaneously.
  • the TdT method yields higher amplified cDNA than the SMART method, but it also produces smaller DNA size by-products.
  • Exonuclease I treatment Treatment with Exonuclease I does not reduce the amount of small-sized free primer-derived by-products. In addition, extension of the chain length of the by-product by Exonuclease I treatment is observed. Suppression of TdT method by-product production by addition of ddATP. By adding a certain amount of ddATP, excessive elongation of by-products derived from free primers is suppressed. Suppression of by-product production of TdT method by addition of ddATP / ddCTP.
  • the ddATP method yields higher yields
  • the ddCTP method is superior in suppressing the elongation of by-products derived from free primers.
  • Effect of combined use of ddCTP-TdT method and ExonucleaseI treatment By applying Exonuclease I treatment to the ddCTP-TdT method, the by-products derived from free primers were significantly reduced, and the extension of by-products derived from free primers observed when ddNTP was not used was not observed, and the yield of amplified cDNA was not observed. An increase is observed regardless of various reverse transcription reaction conditions.
  • the combination of the total cDNA amplification method according to the present invention and the BD Rhapsody system has gene detection sensitivity per cell (compared to 10X Genomics Chromium and Smart-Seq2) and the number of genes detected per same sequence read (sequence read utilization efficiency, Smart).
  • -Comparison with Seq2) Existing methods in all aspects of resolution to capture differences in gene expression between cells (evaluated by the total number of detected genes and the number of highly-variable genes by Seurat analysis, lower in Fig. 11) Is exceeded.
  • double-stranded DNA derived from a DNA-labeled antibody for sample identification and double-stranded DNA derived from cDNA could be clearly separated. Furthermore, the origin of each cell contained in the SCT data can be separated based on the size of the signal (number of reads) derived from the DNA-labeled antibody used for labeling, and many genes can be detected evenly in each sample. It was confirmed that there was.
  • a target-capturing nucleic acid an oligonucleic acid bound to a specific binding molecule
  • oligonucleic acid means an oligonucleic acid bound to a specific binding molecule
  • primer an oligonucleic acid bound to a specific binding molecule
  • a nucleotide homopolymer A, T, G, and C that compose the base sequence of, etc. include not only deoxyribonucleotides that compose DNA (A, T, G, C of DNA) but also ribonucleotides that compose RNA (A, T of RNA).
  • nucleotide analogs eg, bridged nucleic acids such as LNA, ENA, PNA
  • Super T 5-hydroxybutynl-2'-deoxyuridine
  • Super G 8-aza-7-deazaguanosine
  • deoxyinosine 5-methyldC, deoxyuridine, 2,6-diaminopurine, 2-aminopurine, modified bases such as 2-Amino-dATP, etc.
  • target capture nucleic acid for example, poly T moiety, first adapter moiety, bar code moiety, oligonucleic acid capture region, and any portion other than these
  • nucleotide homopolymer for example, poly T moiety, first adapter moiety, bar code moiety, oligonucleic acid capture region, and any portion other than these
  • Primers eg, complementary homopolymer moiety, second adapter moiety, molecular nucleotide moiety, and any other moiety
  • oligonucleic acid eg, captured region, common sequence, specific binding molecule identification
  • One or more selected from ribonucleotides and nucleotide analogs for each primer used in the bar code portion and any portion other than these and in the nucleic acid amplification step. 1 to 12 or 1 to several) monomers may be contained.
  • primer that targets a certain region X means a primer that specifically hybridizes to this region X or its complementary strand.
  • Primers targeting region X include primers containing the same sequence as region X or a sequence complementary thereto.
  • primer set in region X which means a primer that specifically hybridizes to region X or its complementary strand, and includes a primer containing the same sequence as region X or a sequence complementary thereto.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention includes a target nucleic acid capture step, a complementary strand synthesis step, an exonuclease treatment step, an mRNA degradation step, a homopolymer addition step, a second strand synthesis step, and a nucleic acid amplification step.
  • a target nucleic acid capture step a complementary strand synthesis step
  • an exonuclease treatment step an mRNA degradation step
  • a homopolymer addition step a second strand synthesis step
  • a second strand synthesis step a nucleic acid amplification step.
  • ⁇ Target nucleic acid capture step In the target nucleic acid capture step, the target nucleic acid is captured on the solid phase carrier via the target capture nucleic acid bound on the solid phase carrier (Step 1 of FIGS. 1 and 2).
  • the target nucleic acid is a nucleic acid containing mRNA, and may target only mRNA, or may also target nucleic acids other than mRNA.
  • a target nucleic acid other than mRNA an oligonucleic acid bound to a specific binding molecule can be mentioned.
  • FIGS. 1 and 2 show an embodiment in which beads are used as the solid phase carrier, and for convenience, a state in which one molecule of mRNA is captured on one bead carrier is shown.
  • Step 1 of FIG. 1 shows an embodiment in which mRNA and oligonucleic acid are targeted as target nucleic acids, and also shows a state in which one molecule of oligonucleic acid is captured on one bead carrier. In reality, a large number of oligonucleic acid molecules are captured on one bead carrier.
  • the solid phase carrier may be beads or a plate such as a slide glass.
  • Examples of the single cell analysis system using solid phase beads include the Drop-seq method (Non-Patent Document 10, WO 2016/040476 A1) and the Nx1-seq method (WO 2015/166768 A1; Hashimoto et al. Scientific Reports). 2017 Oct 27; 7 (1): 14225. Doi: 10.1038 / s41598-017-14676-3.), Seq-well method (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5376227/ ), BD Rhapsody system, etc. are known.
  • a spatial transcriptome method (spatical transcriptomics, https://spatialtranscriptomics.com/products/) using an oligonucleic acid immobilized on a slide glass is known. Has been done.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is applicable to any of these.
  • the material of the beads is not particularly limited, and various materials used for the nucleic acid capture carrier of the nucleic acid analysis kit and the solid phase particle carrier of the immunoassay kit can be adopted.
  • bead materials include organic polymer beads such as resin beads such as polystyrene and polypropylene, cadmium selenide (CdSe), zinc sulfide (ZnS), cadmium sulfide (CdS), zinc selenide (ZnSe), and oxidation.
  • examples thereof include semiconductor beads such as quantum dots (semiconductor nanoparticles) made of a semiconductor material such as zinc (ZnO), metal beads such as gold, and polymer beads such as silica beads.
  • cellulose examples include cellulose, cellulose derivatives, acrylic resins, glass, silica gel, polystyrene, gelatin, polyvinylpyrrolidone, copolymers of vinyl and acrylamide, divinylbenzene crosslinked polystyrene, etc. (see Merrifield Biochemistry 1964, 3,1385-1390), poly. Acrylamide, latex gel, polystyrene, dextran, rubber, silicon, plastic, nitrocellulose, cellulose, natural sponge, silica gel, glass, metallic plastic, cellulose, crosslinked dextran (eg Sephadex (trade name)) and agarose gel (Sepharose (trade name)) ))
  • crosslinked dextran eg Sephadex (trade name)
  • agarose gel Sepharose (trade name)
  • beads can be mentioned. Either a non-magnetic material or a magnetic material may be used, but magnetic beads that are easier to handle can be preferably used.
  • the material of the plate is not particularly limited, and for example, various materials used for the substrate of the microarray can be adopted. Glass is a typical example of a material that can be used, but silicon, plastic, and the like can also be used.
  • the target capture nucleic acid is usually immobilized (typically spot-aligned and immobilized) in multiple compartments on the plate.
  • the cells from which mRNA is derived are not particularly limited, and various cells such as cells derived from individual mice, various cultured cells, cells derived from healthy individuals, cells derived from cancer patients, cells derived from patients with various diseases, and the like are targeted. Become.
  • the cells derived from a cancer patient may be cells derived from a cancer patient receiving cancer immunotherapy.
  • the cells derived from a healthy person or patient may be cells collected from peripheral blood or a lesion (for example, a tumor).
  • the specific binding molecule labeled with the oligonucleic acid is preferably at least one molecule that binds directly to the cell surface molecule or indirectly via a specific binding partner molecule. is there.
  • Antibodies to cell surface molecules can be mentioned as typical examples of specific binding molecules that directly and specifically bind to cell surface molecules.
  • the antibody may have a binding ability to specifically bind to a cell surface molecule as an antigen by an antigen-antibody reaction, and is Fab, F (ab') 2 , scFv (single chain fragment of variable region, single chain antibody). ) And other antibody fragments (antigen-binding fragments) can also be used.
  • the term "antibody fragment to a cell surface molecule” means an antibody fragment having the ability to specifically bind to a cell surface molecule as an antigen by an antigen-antibody reaction.
  • an antibody or antibody fragment against one or more desired proteins may be used as a specific binding molecule.
  • an antibody or antibody fragment against a cell surface molecule that is stably expressed in the cell to be analyzed may be used as a specific binding molecule.
  • Avidins and biotins can be mentioned as preferable examples of the specific binding molecule and the specific binding partner molecule which is the binding partner thereof.
  • avidins such as avidin, streptavidin or neutravidin can be preferably used as the specific binding molecule
  • biotins such as biotin or desthiobiotin can be preferably used as the specific binding partner molecule.
  • a specific binding molecule that indirectly binds to a cell surface molecule via a specific binding partner molecule is used, the cell is treated with the specific binding partner molecule to label the entire cell surface molecule, and then the oligo. It may be reacted with a specific binding molecule labeled with a nucleic acid.
  • a hydrophilic biotin-labeled reagent such as Biotin-Sulfo-OSu or Biotin-SS-Sulfo-OSu
  • the cell surface molecules present on the surface can be non-specifically labeled with biotin.
  • the indirect labeling method using a specific binding molecule-partner molecule is suitable for multiplex analysis because it can label the entire cell surface molecule non-specifically without being affected by the presence or absence of expression of the cell surface molecule, the expression pattern, etc. Is.
  • the cell surface molecule is not particularly limited, and various cell surface molecules such as various CD molecules, major histocompatibility complex antigens, and cell surface receptors are included.
  • the oligonucleic acid is typically a single-stranded DNA, and the strand length is usually about several tens to 150 bases, for example, about 60 to 100 bases.
  • the 3'side of the oligonucleic acid (the terminal side not bound to the specific binding molecule) contains a capture region for capture by the target capture nucleic acid.
  • the region that hybridizes with the capture region in the target capture nucleic acid is referred to as an "oligonucleic acid capture region" for convenience, and the capture region has a sequence complementary to the oligonucleic acid capture region.
  • Poly A can be mentioned as a preferable example of the captured region, but the present invention is not limited to this, and it may consist of any sequence other than poly A.
  • a sequence in which the melting temperature of the capture region is higher than that of the poly A sequence and five or more G or C do not appear consecutively can be preferably adopted as an arbitrary sequence other than poly A.
  • a primer for second chain synthesis and a primer used in the nucleic acid amplification step are set on the 5'side of the oligonucleic acid (the terminal side that is bound to the specific binding molecule), that is, on the 5'upstream side of the captured region.
  • a primer for second chain synthesis and a primer used in the nucleic acid amplification step are set.
  • a specific binding molecule identification barcode for identifying the specific binding molecule may be included between the common sequence and the captured region. By using the type of specific binding molecule identification barcode according to the number of samples, it is possible to identify which sample the finally amplified nucleic acid is derived from.
  • an mRNA sample is prepared from a cell sample such as a lesion tissue sample or a cell suspension, and the solid phase carrier to which the target nucleic acid is bound is brought into contact with the mRNA sample.
  • a cell sample such as a lesion tissue sample or a cell suspension
  • the solid phase carrier to which the target nucleic acid is bound is brought into contact with the mRNA sample.
  • An embodiment of capturing mRNA on a solid phase can be mentioned.
  • To prepare the mRNA sample first, total RNA may be extracted from the cell sample, and then the mRNA may be extracted, or the mRNA may be directly extracted from the cell sample without extracting the total RNA.
  • RNA is extracted from each individual cell in microwells or microdroplets using a single cell transcriptome (SCT) analysis platform using solid-phase beads for target capture.
  • SCT single cell transcriptome
  • An embodiment in which mRNA as a target nucleic acid is captured on a bead in a microwell or a microdroplet by contacting with a bead carrier to which a nucleic acid is bound can be mentioned.
  • micro in the terms microwells and microdroplets typically means that the volume is on the order of 5-100 pl.
  • Non-Patent Document 10 As an example of a general method of an SCT analysis platform using solid-phase beads, Beckton Dickinson's BD Rhapsody system (Patent Document 4) and Seq-well system (Non-Patent Document 11) using a plate having microwells, And Nx1-seq system (WO2015 / 166768 A1; Hashimoto et al. Scientific Reports 2017 Oct 27; 7 (1): 14225. Doi: 10.1038 / s41598-017-14676-3.) And mRNA in microdroplets
  • the Drop-seq method (Non-Patent Document 10) for capturing the above can be mentioned, and these general methods can be preferably used in the present invention.
  • a spatial transcriptome platform is used to permeate the tissue sample onto the target capture nucleic acid-immobilized plate and to permeate the mRNA from each cell of the tissue specimen onto the plate.
  • Examples thereof include a mode of capturing with a capturing nucleic acid aligned and immobilized in.
  • a nucleic acid containing a poly T moiety can be preferably used as the target capture nucleic acid.
  • a nucleic acid not containing the poly T moiety may be additionally immobilized on the solid phase carrier as the target capture nucleic acid.
  • a nucleic acid that captures mRNA is immobilized on a solid-phase carrier as a target-capturing nucleic acid, but a nucleic acid that captures a target nucleic acid other than mRNA may also be immobilized. ..
  • the nucleic acid that captures the oligonucleic acid may be further immobilized on the solid phase carrier as the target capture nucleic acid.
  • the embodiment in which the oligonucleic acid-labeled specific binding molecule is used in combination with the amplification method of the present invention will be described in detail later, but the target capture nucleic acid for capturing mRNA and the oligonucleic acid immobilized on the solid-phase carrier are used.
  • the target capture nucleic acids for capture may be the same or different.
  • the target capture nucleic acid may contain a first adapter portion on the 5'side of the poly T moiety, that is, on the solid phase carrier side.
  • the portion shown as Universal 1 in FIGS. 1 and 2 is the first adapter portion.
  • the first adapter portion serves as a region for setting one of the primers in the nucleic acid amplification step.
  • the target capture nucleic acid may contain a bar code portion for identifying the position on each solid phase carrier or solid phase carrier between the first adapter portion and the poly T portion.
  • This barcode portion is a bead identification barcode when the solid phase carrier is a bead, and when the solid phase carrier is a plate, in order to identify in which compartment on the plate it is immobilized. It is a division identification barcode of.
  • the nucleic acid containing cDNA, which is amplified in the nucleic acid amplification step will contain the barcode sequence derived from the identification barcode portion.
  • the bead identification bar code portion has the same arrangement on the same bead and has a different arrangement for each bead.
  • cDNA derived from the same cell can be distinguished from cDNA derived from other cells.
  • Immobilized mRNA capture nucleic acids containing such bead identification barcode moieties can be prepared by known methods (see, eg, WO 2015/166768 A1).
  • the compartment identification barcode portions have the same arrangement within the same compartment (spot) on the plate, and each compartment (spot) has a different arrangement. This makes it possible to grasp what kind of mRNA is expressed at which part of the tissue, for example, when the sample is a tissue sample.
  • a DNA strand complementary thereto is synthesized from the target nucleic acid captured on the solid phase carrier.
  • the target nucleic acid is mRNA
  • cDNA is synthesized by the reverse transcription reaction.
  • the target nucleic acid contains a nucleic acid other than mRNA, for example, oligo DNA bound to a specific binding molecule
  • a reverse transcription reaction of cDNA from mRNA and a complementary strand synthesis reaction from oligo DNA using DNA polymerase And are done.
  • a DNA strand complementary to the target nucleic acid containing cDNA is synthesized from the target nucleic acid containing mRNA captured on the solid phase carrier.
  • the solid phase carrier is recovered, and a reverse transcription reaction or the like is carried out in a state where the target nucleic acid is captured on the solid phase carrier (Step 1 in FIGS. 1 and 2).
  • the reverse transcription reaction from the target mRNA and the complementary strand synthesis reaction itself from the target DNA can be carried out as usual.
  • the solid phase carrier is washed and the process proceeds to the next step.
  • ⁇ Exonuclease treatment process> the target capture nucleic acid on the solid phase carrier that does not capture the target nucleic acid is decomposed and removed by the exonuclease treatment (Step 2 in FIGS. 1 and 2; RT primers in the figure are the target capture nucleic acids. Means).
  • Examples of common exonucleases that specifically degrade single-stranded DNA include Exonuclease I and Exonuclease T. At least one such common exonuclease can be used in the present invention.
  • the solid phase carrier is washed and the process proceeds to the next step.
  • RNA degradation step the mRNA of the mRNA-cDNA hybrid bound on the solid phase carrier is degraded by an RNA degrading enzyme (Step 3 in FIGS. 1 and 2).
  • RNA degrading enzymes such as RNase H can be used.
  • the solid phase carrier may be washed and recovered before proceeding to the homopolymer addition step, or may proceed to the homopolymer addition step as it is without washing.
  • the mRNA degradation step and the homopolymer addition step can be performed at the same time.
  • dATP, dTTP, dCTP, or dGTP is reacted with terminal deoxynucleotidine transferase (TdT) in the presence of chain-stop nucleotide triphosphate (chain-stop NTP), and is synthesized on the solid phase.
  • TdT terminal deoxynucleotidine transferase
  • chain-stop NTP chain-stop nucleotide triphosphate
  • a nucleotide homopolymer is added to the end of the DNA strand (Step 3 in FIGS. 1 and 2; the figure shows an example of poly C).
  • chain-stopped NTP chain-stopped ATP, chain-stopped TTP, chain-stopped CTP, or chain-stopped GTP
  • chain-stopped NTP chain-stopped ATP, chain-stopped TTP, chain-stopped CTP, or chain-stopped GTP
  • ddNTP deoxynucleotide triphosphate
  • ddATP deoxynucleotide triphosphate
  • ddCTP deoxynucleotide triphosphate
  • ddGTP ddGTP
  • ddTTP ddTTP
  • ddUTP deoxynucleotide triphosphate
  • derivatives of ddNTP typically, OH groups
  • It is a ddNTP whose 3'position is modified with an atomic group that does not have it, for example, 3'-Azido-ddATP, 3'-Azido-ddCTP, 3'-Azido-ddGTP, 3'-Azido-ddTTP, 3'-Azido.
  • ddNTP modified at the 3'position with an azido group or amino group
  • 3 '-Deoxynucleotide triphosphate (3'-dNTP) (3'-dATP, 3'-dCTP, 3'-dGTP, 3'-dTTP, 3'-dUTP)
  • 3'-deoxy-5-methyluridine- Examples include, but are not limited to, 5'-triphosphate, ddNTPs, or ddNTPs modified at the 3'position with an azide group, particularly ddNTPs.
  • the chain stop NTP and the substrate (dNTP) forming the homopolymer used have the same base chains. Since the minimum homopolymer length required for the second chain synthesis reaction, the required length of the 3'-terminal homopolymer portion of the primer used for the second chain synthesis, and the chain length of the by-product derived from the free primer can be particularly preferably suppressed, for example, ddCTP etc. It is particularly preferable to carry out poly-C addition or poly-G addition by a combination of chain stop GTP + dGTP such as chain stop CTP + dCTP or ddGTP.
  • the reaction time is adjusted according to the difference in activity between lots of the enzyme and the difference in the amount of substrate such as primer and cDNA in order to control the chain length of the homopolymer. It needs to be tightly controlled.
  • the chain-stopped NTP is stochastically incorporated and the homopolymer extension reaction is stopped, so that the reaction time is extended by TdT. Allowance is greatly increased.
  • the homopolymer addition reaction by TdT is generally carried out in the presence of a divalent cation.
  • Bivalent cations that can be used include divalent metal cations such as Zn 2+ , Cu 2+ , Ni 2+ , Co 2+ , Mn 2+ , and Mg 2+ , such as Co 2+ or Mn 2+. However, it is not limited to these.
  • the permissible amount of reaction time extension by TdT is greatly increased by the addition of chain-stopping NTP, RNase H can be added to the TdT reaction solution to simultaneously carry out the mRNA decomposition reaction and the homopolymer addition reaction. Therefore, in one embodiment of the present invention, the mRNA degradation step and the homopolymer addition step are carried out simultaneously.
  • ⁇ Second chain synthesis step> After the homopolymer addition reaction, the solid phase carrier is washed and the process proceeds to the second chain synthesis step.
  • a solid phase is used using a primer for second strand synthesis containing a primer containing a homopolymer moiety complementary to the nucleotide homopolymer added to the end of the complementary DNA strand containing cDNA. Second-strand synthesis is performed on the complementary DNA strand bound on the carrier (Step 4 in FIGS. 1 and 2).
  • the primers for second chain synthesis include the above-mentioned primer containing the complementary homopolymer moiety and a partial region in the oligonucleic acid (described later). It may contain a primer containing a common sequence).
  • the complementary homopolymer moiety is located on the 3'end side of the primer for second chain synthesis.
  • the chain length of the complementary homopolymer moiety is usually about 6 to 20 bases, for example, about 6 to 13 bases, 7 to 15 bases when the homopolymer tail added to the complementary DNA strand is poly C or poly G. It is about 7 to 11 bases, and when the homopolymer tail is poly A or poly T, it is usually about 15 to 30 bases, for example, about 18 to 25 bases.
  • the complementary homopolymer moiety may have an anchor sequence of about 1 to 2 bases added to the 3'end.
  • the steps of annealing / extension of the second chain synthesis primer may be carried out a plurality of times by a thermal cycling reaction.
  • the follow-up reaction may be carried out with a polymerase having a strand substitution activity such as Bst DNA polymerase.
  • the primer for second chain synthesis may contain a second adapter moiety on the 5'side of the complementary homopolymer moiety.
  • the portion shown as Universal 2 in Step 4 of FIG. 1 and trP1 in Step 4 of FIG. 2 is the second adapter portion.
  • the second adapter portion serves as a region for setting one of the primers in the nucleic acid amplification step.
  • the primer for second chain synthesis may contain a molecular barcode moiety between the second adapter moiety and the complementary homopolymer moiety.
  • the primer for second chain synthesis in this embodiment has a structure in which each portion is linked in the order of [second adapter]-[molecular barcode]-[complementary homopolymer] from the 5'side.
  • the molecular bar code has a random base sequence, and the DNA molecule amplified in the subsequent nucleic acid amplification step has the same molecular bar code as long as it is a DNA derived from the same double-stranded cDNA. DNAs derived from the double-stranded cDNAs of the above will have different molecular bar codes.
  • the chain length of the molecular barcode is not particularly limited, but is typically about 12 to 30 bases.
  • the molecular barcode may have a structure in which a specific fixed sequence is inserted into a random base sequence in order to make it resistant to sequence errors.
  • nucleic acid amplification reaction is carried out using a double strand of DNA synthesized on a solid-phase carrier as a template (Steps 5 and 6 in FIGS. 1 and 2). Since high accuracy is required in this nucleic acid amplification reaction, it is desirable to use a polymerase generally known as a highly accurate PCR enzyme. Various high-accuracy PCR enzymes are commercially available.
  • the nucleic acid amplification reaction may be carried out as it is by additionally adding the nucleic acid amplification reaction solution without washing the solid phase carrier.
  • PCR can be performed with a set of primers set for those adapters.
  • SCT analysis Fig. 1
  • the mRNA expressed in each cell is comprehensively reverse-transcribed and amplified, so total cDNA amplification is performed with a primer set targeting the first and second adapters.
  • the primer set in this case is typically a set of a primer consisting of the first adapter sequence and a primer consisting of the second adapter sequence, but the 5'side is modified with an arbitrary addition sequence, biotin, or the like. It does not matter if it contains.
  • FIG. 1 SCT analysis
  • a partial region in the oligonucleic acid (in addition to the primer targeting the first adapter and the primer targeting the second adapter)
  • the cDNA and oligonucleic acid are simultaneously amplified using primers containing the common sequence described later).
  • the obtained amplification product can be size-fractionated using magnetic beads or the like to separate the amplified cDNA and oligonucleic acid, and each can be independently amplified in the second PCR.
  • a primer that targets the TCR constant region can be used instead of the primer that targets the first adapter.
  • a primer targeting the TCR constant region using the total cDNA amplification product as a template.
  • a primer that targets the second adapter may be used to amplify the TCR variable region cDNA.
  • nucleic acid amplification method of the present invention an example of use for SCT analysis, an example of use for TCR repertoire analysis, and an example of combined use with an analysis using an oligonucleic acid-labeled specific binding molecule will be described.
  • the use of the nucleic acid amplification method of the present invention is not limited to the use for these analysis methods, and can be used for various techniques including the step of cDNA amplification from a solid phase carrier such as beads or plates. it can.
  • Steps 1 to 4 may be performed according to the above-mentioned target nucleic acid capture step to second chain synthesis step.
  • the second chain synthesis primer does not have to contain a molecular barcode moiety between the second adapter moiety and the complementary homopolymer moiety.
  • the nucleic acid amplification step can be carried out as two amplification reactions (1st PCR, 2nd PCR). Both use a primer that targets the first adapter and a primer that targets the second adapter.
  • the 1st PCR (Step 5 in FIG. 1) is a PCR of several cycles, and the size selection and purification of the amplified product of the 1st PCR are performed.
  • 2nd PCR is performed to further amplify the total cDNA (Step 6 in FIG. 1), and size selection and purification are performed again to obtain an amplified product of the total cDNA.
  • a spacer such as biotin or amine may be used at the 5'end of both primers.
  • the obtained amplification product of total cDNA is subjected to processing such as fragmentation, end repair, A-tailing, and addition of a sequencing adapter in order to be used for sequencing by a next-generation sequencer.
  • processing such as fragmentation, end repair, A-tailing, and addition of a sequencing adapter in order to be used for sequencing by a next-generation sequencer.
  • These processes provide a library of cDNA processed into a sequencing construct.
  • the fragmentation means ultrasonic waves or enzymes can be used. Commonly used reagents can be used to create the construct for sequencing, and typical enzyme methods include NEBNext UltraII FS kit from New England Biolabs, KAPA HyperPlus kit from KAPA Biosystems, and ultrasonic fragments. Machines such as Covaris and Bioruptor can be used as the fragmentation device, but other equivalent products can also be used.
  • the sequence adapter an appropriate adapter may be used according to the next-generation sequencer to be used.
  • Sequencing of the library may be performed using a sequencer generally called a next-generation sequencer.
  • a sequencer generally called a next-generation sequencer.
  • next-generation sequencers that can be preferably used include Illumina's Novaseq 6000 system, Hiseq system, Nextseq system, MiSeq system, Thermo Fisher Scientific's Ion Proton system, and Thermo Fisher Scientific's Ion S5 / Ion S5 XL system. Can be mentioned.
  • Steps 1 to 4 may be performed in the same manner as the target nucleic acid capture step to the second chain synthesis step described above, but as the second adapter, a sequence adapter suitable for the next-generation sequencer used for sequence analysis (FIG. 2). , Step 4 trP1) is used.
  • a primer for second chain synthesis a primer containing a molecular barcode portion is preferably used.
  • the nucleic acid amplification step can be carried out as two amplification reactions (1st PCR, 2nd PCR).
  • a primer set in the TCR constant region (TRAc and / or TRBc external primer (s) in Fig. 2, Step 5) and a primer targeting the second adapter (trP1 primer in Fig. 2) are used.
  • a primer targeting the ⁇ chain constant region (TRBc external primer) and a primer targeting the second adapter may be used.
  • a primer targeting the ⁇ chain constant region TRAc external primer
  • TRAc external primer may be used instead of the primer targeting the ⁇ chain constant region.
  • both a primer that targets the ⁇ -chain constant region and a primer that targets the ⁇ -chain constant region are mixed (TRAc and / or TRBc external primers) and used in combination with a primer that targets the second adapter, ⁇ Both the chain variable region and the ⁇ chain variable region can be amplified.
  • the 1st PCR of Step 5 may be performed by nested PCR.
  • the primer to be combined with the primer targeting the second adapter may be set within the constant region in both the first and second nested PCR. In this way, when one of the primers is the same in the first and second times, it may be called semi-nested PCR. Also in this step, by using a set of primers set in the adapter and a primer set in the constant region, the cDNA of TCR can be amplified without applying PCR bias.
  • 2nd PCR After size selection and purification of the amplified product of 1st PCR, perform 2nd PCR (Step 6 in Fig. 2).
  • a primer consisting of the second adapter sequence (trP1 primer) and a primer targeting the constant region on the TCR cDNA fragment (A-BC-TRC primer) are used.
  • A-BC-TRC primers targeting the TCR constant region have a sequence of a second sequencing adapter (lonA) at the 5'end.
  • Primer A-BC-TRC primer that targets the TCR constant region used in 2nd PCR has a molecular barcode sequence (BC) between the sequence of the second sequencing adapter (lonA) and the TCR constant region target sequence. ..
  • BC molecular barcode sequence
  • the same molecular barcode is used for the same library prepared from the same sample, and different molecular barcodes are used for each library. This makes it possible to identify which library a TCR variable region sequence is derived from after mass analysis of sequences by a next-generation sequencer.
  • Sequencing of the TCR variable region library may be performed using a sequencer generally called a next-generation sequencer.
  • a sequencer generally called a next-generation sequencer.
  • Specific examples of the next-generation sequencer that can be preferably used include Thermo Fisher Scientific's Ion S5 / Ion S5 XL system, Illumina's MiSeq system, and Novaseq 6000 system.
  • FIG. 1 shows an example when the amplification method of the present invention is used for SCT analysis, but the combination example of the oligonucleic acid-labeled specific binding molecule and the amplification method of the present invention is not limited to this, and can be used together with the TCR repertoire analysis.
  • it can be used in combination with various techniques including the step of amplifying cDNA from a solid support such as beads or plates.
  • mRNA and oligonucleic acid are the target nucleic acids.
  • the target capture nucleic acid immobilized on the solid phase carrier includes a nucleic acid containing an mRNA capture region for capturing mRNA and a nucleic acid containing an oligonucleic acid capture region for capturing the oligonucleic acid. May be the same or different.
  • the capture region of the oligonucleic acid is poly A
  • poly T can be used as the oligonucleic acid capture region of the target capture nucleic acid, but in this case, both of the two target nucleic acids have the poly T portion.
  • target capture nucleic acid can be captured by one type of target capture nucleic acid, including.
  • an oligonucleic acid is provided with an arbitrary sequence other than poly A as a capture region
  • an oligonucleic acid in which a specific binding molecule is bound to a nucleic acid containing an oligonucleic acid capture region having a sequence complementary to the arbitrary sequence is used. It can be used as a target capture nucleic acid for capture, and the bead carrier contains a target capture nucleic acid containing poly T as an mRNA capture region and a sequence complementary to the above arbitrary sequence as an oligonucleic acid capture region. Two types of target capture nucleic acids are immobilized.
  • a step of binding the oligonucleic acid-labeled specific binding molecule to the cell surface by contacting the sample containing the cell with the oligonucleic acid-labeled specific binding molecule, and a step of lysing the cell are performed. carry out.
  • the cell is first treated with a specific binding partner molecule (biotins, etc.) to nonspecifically label the entire cell surface molecule. Then, the sample containing the cells may be brought into contact with a specific binding molecule labeled with oligonucleic acid (such as avidins) and reacted.
  • the specific binding partner molecule is brought into contact with the cell sample to bind the specific binding partner molecule to the cell surface molecule existing on the cell surface, and then the oligonucleic acid-labeled specific binding molecule is used. It suffices to carry out the step of binding to the cell surface.
  • cells reacted with oligonucleic acid-labeled specific binding molecules may be loaded onto the SCT analysis platform and lysed in microwells or microdroplets.
  • Step 1 mRNA and oligonucleic acid are captured on the bead carrier, and cDNA synthesis from mRNA by reverse transcription reaction and complementary strand synthesis from oligonucleic acid by DNA polymerase are performed.
  • Step 2 may be performed according to the above-mentioned exonuclease treatment step.
  • Step 3 may be performed according to the above-mentioned mRNA degradation step and homopolymer addition step. Homopolymers are added to the ends of both the cDNA reverse transcribed from mRNA and the complementary DNA strand synthesized from oligonucleic acid. Due to mRNA degradation, the cDNA on the bead carrier becomes a single strand, but the oligonucleic acid is captured on the bead carrier in a state of forming a double strand with the complementary strand.
  • the double strand may be heat-modified before the homopolymer addition reaction to dissociate the oligonucleic acid chain to which the specific binding molecule is bound, or may be heat-modified and dissociated after the homopolymer addition reaction. ..
  • Step 4 as the primer for second chain synthesis, a primer containing a second adapter portion on the 5'side of the complementary homopolymer moiety and a primer containing a common sequence are used.
  • the former is a primer for synthesizing a second strand against cDNA synthesized from mRNA
  • the latter is a primer for synthesizing a second strand against a complementary strand synthesized from oligonucleic acid.
  • the former primer for second chain synthesis does not have to contain a molecular barcode portion between the second adapter moiety and the complementary homopolymer moiety, and TCR repertoire analysis.
  • a primer for second chain synthesis containing a molecular barcode is preferably used.
  • Step 5 the 1st PCR of the nucleic acid amplification step is performed using a primer that targets the first adapter portion, a primer that targets the second adapter portion, and a primer that contains a common sequence.
  • the set of primers that target the first adapter and the primers that target the second adapter amplifies the cDNA synthesized from the mRNA.
  • the oligonucleic acid is amplified by a set of primers that target the first adapter and that contain a common sequence.
  • a primer that targets a desired region in the cDNA may be further used in combination.
  • primer X a primer that targets the TCR constant region
  • the TCR variable region is amplified by a set of primers targeting Primer X and a second adapter, and a complementary strand synthesized from an oligonucleic acid by a set of primers targeting the first adapter and a primer containing a common sequence. Is amplified.
  • the amplification product obtained by 1st PCR is size-fractionated using magnetic beads or the like to separate the amplified cDNA and oligonucleic acid, and in the 2nd PCR of Step 6, the cDNA and oligonucleic acid are amplified separately and independently. ..
  • a nucleic acid having a universal adapter portion, a bead identification barcode portion and a poly T portion was immobilized on non-magnetic beads as a target capture nucleic acid.
  • a microwell plate was used in which the wells were filled with these beads one by one.
  • Cells derived from mouse lung single cell suspension were loaded so that 1 or 0 cells were contained in most of each well, and mRNA molecules derived from these individual cells were captured on a single bead as a target nucleic acid.
  • the above-mentioned mRNA trapping beads are subjected to the reverse transcription reaction solution (Superscript II reverse transcriptase, Betain, First-strand buffer, RNase Inhibitor, MgCl 2 , Biosg-LibB-) by the method described in Non-Patent Document 4.
  • the reverse transcription reaction solution Superscript II reverse transcriptase, Betain, First-strand buffer, RNase Inhibitor, MgCl 2 , Biosg-LibB-
  • TSO primer reverse transcriptase
  • double-strand cDNA double-strand cDNA
  • PCR primers (Biosg-LibA-primer, Biosg-LibB-primer) for the LibB / LibA sequence added to both sides of the cDNA.
  • the total cDNA was amplified in.
  • the primer-derived by-product is excessively elongated, it becomes difficult to separate the by-product and the cDNA amplification product because the size becomes close to the target cDNA amplification product, and as a result, there arises a problem that the cDNA amplification is inhibited.
  • the primer-derived by-product is excessive. Since no significant elongation occurs, inhibition of cDNA amplification by the elongated by-product can be prevented.
  • the yield of cDNA was increased by both the ddATP method and the ddCTP method by performing the primer annealing reaction multiple times during the second strand synthesis reaction.
  • the ddATP method a slightly smaller size of by-product derived from the nucleic acid for mRNA capture was observed. From this, it was confirmed that the ddCTP method is superior to the ddATP method in order to robustly amplify the cDNA while maintaining a high yield.
  • the addition of RNase If which is a single-stranded RNA degrading enzyme, to the reaction system was found to have a slight effect of reducing the amount of cDNA.
  • the amplification method was applied to the BD Rhapsody system as an example, and steady-state mouse lung and bleomycin-injured mouse lung (3 days and 7 days after administration).
  • Single-cell transcriptome analysis of whole cells was performed.
  • a reverse transcription reaction was carried out as recommended by the manufacturer (cDNA synthesis step), and then unreacted mRNA capture nucleic acid on the beads was removed by Exonuclease I treatment (exonuclease treatment step).
  • the Rhapsody universal adapter immobilized on the beads is a DNA having the following structure, and CLS1 (cell label section 1) to CLS3 contain 96 types of known unique sequences consisting of 9 bases, for a total of 288. Seeds are used to make up about 900,000 bead identification barcodes in total.
  • SEQ ID NO: 11 of the sequence listing CLS1 to CLS3 are shown as NNNNNNNNN.
  • the total cDNA was amplified according to the amplification method of the present invention using half the amount of beads (approximately 3000-4000 cells).
  • the mRNA decomposition step and the homopolymer addition step were carried out simultaneously by adding RNase H and TdT to the reaction solution.
  • a poly-C tail was added to the cDNA ends on the magnetic beads in a limited length.
  • a second chain synthesis reaction was carried out using LibA-dG9 primer and KAPA HiFi Hotstart Readymix, which is a highly accurate PCR enzyme. The number of annealings was 16 times.
  • 1st PCR was performed using NH2-LibA primer, NH2-universal primer, and KAPA HiFi Hotstart Readymix.
  • 2nd PCR was performed using NH2-LibA primer, NH2-universal primer, and KAPA HiFi Hotstart Readymix.
  • the obtained single-cell transcriptome data was compared with the analysis data of steady-state mouse lung cells by the existing SCT analysis method (Smart-Seq2 method and 10X Genomics Chromium system).
  • the data of the existing analysis method the data of the Tabula Muris Consortium was used.
  • the combination of BD Rhapsody and the cDNA amplification method of the present invention is the total number of detected genes and the number of detected genes per cell. It was found that the above two methods were exceeded (Fig. 11).
  • the number of highly-variable genes detected by Seurat software to determine the resolution at which each single-cell transcriptome data captures gene expression differences between cells.
  • the labeled DNA is a DNA having the following structure, and 14 kinds of known unique sequences consisting of 15 bases are adopted for the barcode portion.
  • the barcode portion is shown as NNNNNNNNNNNNNNNN in SEQ ID NO: 25 of the sequence listing. It is a DNA having poly A as a capture region, and can be captured by a target capture nucleic acid having a poly T moiety like mRNA.
  • Subcutaneous tumors were removed from mice, enzymatically digested with LiberaseTM and DNaseI, and single cell suspensions were prepared, and then CD45-positive cells were separated by magnetic separation (MACS) with magnetic beads.
  • MCS magnetic separation
  • Each of the 14 samples obtained from different mice was stained with the above DNA-labeled antibody labeled with 14 different single-stranded DNAs, and the cells were washed with FACS buffer. After counting the cells with a flow cytometer, the cells labeled with the antibody are pooled in equal proportions, and the cells / beads are placed in a microwell cartridge at an appropriate density according to the Rhapsody specifications using the BD Rhapsody system.
  • Load and lyse cells trap each cell-derived mRNA and labeled single-stranded DNA bound to the cell-bound antibody on a single bead (including Rhapsody universal adapter as target capture nucleic acid) (Target nucleic acid capture step).
  • the reverse transcription reaction and the complementary strand synthesis of the antibody-labeled single-stranded DNA were performed as recommended by the manufacturer (complementary strand synthesis step), and then the unreacted target-capturing nucleic acid on the beads was removed by Exonuclease I treatment (exonuclease). Nuclease treatment step).
  • ddCTP 1: in a reaction solution containing Tris-HCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , KCl, K-phosphate, DDL 4 , CoCl 2 , TritonX-100, glycerol.
  • a second chain synthesis reaction was carried out using a 5'BDWTA-dG9 primer and a highly accurate PCR enzyme, KAPA HiFi Hotstart Readymix. The number of annealings was 16 times.
  • the cDNA fraction was subjected to 2nd PCR using NH2-5'BDWTA primer, NH2-universal primer, and KAPA HiFi Hotstart Readymix.
  • the antibody-labeled DNA fraction was subjected to 2nd PCR using Hashtag common primer, NH2-universal primer, and KAPA HiFi Hotstart Readymix.
  • the obtained library was quantified using KAPA Library quantization kit for Illumina, the size distribution was confirmed using Agilent Bioanalyzer, and sequencing was performed with Illumina Novaseq 6000.
  • Table 6 shows the adapter / primer sequences used to create the sequence analysis library.
  • the sample derived from each cell could be classified based on the expression level of the antibody-labeled DNA.
  • the number of cells obtained was almost constant (Fig. 13).
  • cells in which two or more types of tags derived from DNA-labeled antibodies were sufficiently detected were identified as doublets (FIG. 13).
  • the number of detected genes in each cell in each sample was plotted, it was found that genes were detected almost uniformly in 14 samples, and that the doublet sample had a larger number of detected genes than those (Fig. 13). .. From this, the usefulness of the amplification method of the present invention in the simultaneous single-cell transcriptome analysis of a plurality of samples by using a DNA-labeled antibody in combination was shown.

Abstract

本発明による固相担体を用いた核酸増幅法は、固相担体上にmRNAを含む標的核酸を捕捉して固相上で相補鎖合成を行ない、固相上の未反応の標的捕捉用核酸をエキソヌクレアーゼ処理により分解除去した後にmRNA分解および連鎖停止ヌクレオチド三リン酸存在下でのTdT反応によるホモポリマー付加を行なうことを含む。本発明の方法によれば、固相上のDNA基質に対する酵素の量比の超過、反応時間の超過、試薬ロットの差異によらず、微量のサンプルからもcDNAを安定して高効率に増幅できる。また本発明の増幅法によれば、DNA標識抗体等の、オリゴ核酸で標識された特異結合分子を用いた解析と転写物の解析を同時に行なう技術の応用範囲を広げることができる。

Description

固相担体を用いた核酸増幅方法
　本発明は、固相担体を用いた核酸増幅方法に関する。
　昨今、個々の１細胞など、微量サンプルを用いた網羅的遺伝子発現解析が行われるようになってきている。このような技術は数百～万の単位の個々の細胞の性質を網羅的に捉えるsingle-cell RNA-seq解析（single cell transcriptome（SCT）解析）を可能とし、細胞集団内の多様性の有無や、新たな細胞亜集団の同定、病態と相関した特殊な細胞集団の同定につながり、ヒトにおける１細胞レベルのアトラスを作ろうとする国際プロジェクトが2016年よりスタートしている（非特許文献１)など、これまでにない解像度での生物学の理解を推し進める原動力となっている。
　その他代表的な微量サンプルとしては、がん患者の診断目的で採取される原発巣・転移巣のバイオプシー検体に含まれる腫瘍浸潤T細胞が挙げられる。抗PD-1抗体などの免疫療法の本質であるCTLの実態がCD8+ T細胞という観点から、がん抗原特異的な認識能を有するCD8+ T細胞がどの程度誘導されているかを測定する方法に注目が集まっている（非特許文献２）。その測定方法の一つとして、CD8+ T細胞上のT細胞受容体(T Cell Receptor; TCR)の配列を解析して、TCRレパトア（クローンの種類と各クローンの存在頻度）を決定し、腫瘍特異的なクローンの応答を論じるものがあり、実際にTCRレパトア変動と抗CD4抗体のがんに対する治療効果が相関することも報告されている(非特許文献３)。しかしながら、腫瘍浸潤T細胞の細胞の大半はがん細胞や組織細胞であり、T細胞の含有量が極めて少ない場合がほとんどである。そのため、SCT解析やがん部位における頑健なTCRレパトア解析のためには、検体より抽出したmRNAや、検体由来の個々のT細胞由来mRNAを高感度かつ高スループットに増幅する方法の開発の重要性はいや増している。
　微量サンプルからのmRNA増幅法としては、96 wellプレートに個々の細胞や微量mRNAを分注して増幅を行うSmart-Seq2などの液相系や（特許文献１、非特許文献４）、マイクロ流路を用いてdropletを形成し、各dropletに１細胞を捉える10X Genomics社のChromiumなどのdroplet系（特許文献２）、固相ビーズを用いて個々のサンプルのmRNAを捉える方法などがある。Smart-Seq2は高感度であるが、96 wellまたは384 wellプレートに個々の細胞をフローサイトメーターによりソーティングを行うので、スループットが低くコストが高い。一方で、10X Chromiumなどのdroplet系は、スループットは高いがSmart-Seq2に比して感度が大幅に劣るのが問題点である（非特許文献５）。また、液相系・droplet系の両者ともに、反応液の持ち込みが生じるため、細胞溶解のための試薬として、強いタンパク質変性作用のある界面活性剤が使用できず、RNA分解酵素の多い細胞などは解析困難な点が問題として存在する。
　ビーズへの固相化を介したmRNA/cDNA増幅法は、基質cDNAを大幅に失うことなく反応ステップ間の反応液置換を容易に行えるため、タンパク質変性作用の強い界面活性剤を使用できるなど、液相系と比べてより多様な反応条件に互換性を有している。さらに、固相ビーズ担体として磁性ビーズを用いることで、マグネットスタンドおよび自動分注ワークステーションを用いた工程の自動化・半自動化が可能になるため、ハイスループットなSCT, TCR解析において有用な技術である。実際に、神原らは磁性ビーズを用いることで微量や１細胞由来cDNAを増幅できることを示している（特許文献３、非特許文献６）。しかしながら、上記過去技術は、terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)によるポリA付加反応パラメータ（磁性ビーズ上のDNA基質と酵素の量比、反応時間、温度など）の厳密なコントロールが必要である。例えば、磁性ビーズ上のプライマー密度が高いと、TdTによるプライマー由来反応副産物が多量に生成し、cDNAの増幅効率が大幅に低下する（非特許文献７）。また、TdTの反応時間が長いと、プライマー由来副産物の伸長が過剰となり、cDNAと当該副産物を分離できなくなる（非特許文献８）。すなわち、TdTの酵素活性のロット間の差異、反応系中のプライマー含有量やcDNA含有量の差異、自動分注システムの操作タイムラグなどに大きく影響されることが問題点として存在する。さらに、ビーズを用いた包括的な１細胞由来mRNA解析技術では、未反応の細胞バーコードを含むプライマーを除去するためにExonuclease Iが広く用いられているが、上記神原らの高感度増幅法では、DNA基質分子数とTdT酵素の量比を変えてしまうため、Exonuclease I処理を行えないという問題点もある。
　昨今、各々のタンパク質を特異的に認識する抗体をオリゴDNAで標識することにより、各１細胞上に発現している数十のタンパク質の発現量を、各１細胞トランスクリプトームと同時に定量する手法が開発され、Biolegend社等より市販されている(https://www.biolegend.com/en-us/totalseq)。本手法では各タンパク質の発現量を、シーケンス解析による各抗体のDNAタグの発現量として解析する。さらに、様々な細胞種において広範に発現するタンパク質を標的とし、DNAタグの種類を変えることで、複数のサンプルが混在した1細胞トランスクリプトームデータのサンプルごとの分離にも使用でき、コスト削減やバッチエフェクトの低減、biological replicateの解析等に用いることができる(https://www.biolegend.com/en-us/bio-bits/new-cell-hashtag-reagents-for-single-cell-analysis)。このようにDNAラベル抗体による細胞標識を組み合わせた１細胞トランスクリプトーム解析は様々な応用可能性があるものの、DNAタグは、オリゴDNAではあるが長さは84塩基対以上と比較的長く、１細胞トランスクリプトームに用いる細胞バーコードと合わせると145塩基対以上の長さとなる。一方で、従来のTdT法では、126塩基対以上のプライマーなど、cDNAと比べれば短いものの比較的長さのあるDNA断片が存在する場合、cDNAとそれら産物をうまく分離できないことが報告されている（非特許文献９）。一般にタンパク質の発現量はmRNAの発現量と比べて大幅に高いため、タンパク質を検出するためのDNAタグ産物と増幅cDNAの分離は、従来のTdT法では困難であった。
　Beckton Dickinson社はBD Rhapsodyシステムという、固相磁性ビーズとマイクロウェルを用いたSCT解析系を上市しているが（特許文献４）、Beckton Dickinson社のRNA解析法は500遺伝子ほどの限られた数の遺伝子解析パネルか、もしくは10X Genomics社Chromiumと同程度の効率しか有しない低感度の増幅系の提供にとどまっており、研究者のニーズを満たすには至っていない。その他の固相ビーズを用いたSCT解析法としてはDrop-seq法(非特許文献１０), Seq-well法(非特許文献１１)などがあるが、これらもTdT法と比較して効率の低いSMART法を用いており、感度の低さが問題である。
WO 2015/027135 A1 WO 2015/200893 A2 WO 2013/145431 A1 US 2018/0258500 A1
Regev A., et al. The Human Cell Atlas. eLife 2017;e27041. Zaretsky JM, Garcia-Diaz A, Shin DS, et al. Mutations Associated with Acquired Resistance to PD-1 Blockade in Melanoma. N Engl J Med 2016;375:819-2. Aoki H., et al. TCR Repertoire Analysis Reveals Mobilization of Novel CD8+ T Cell Clones Into the Cancer-Immunity Cycle Following Anti-CD4 Antibody Administration. Front Immunol. 2019 Jan; 9(3185). Picelli S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 2014 Jan;9(1):171-81. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 2018 Oct;562(7727):367-372. Matsunaga H, Goto M, Arikawa K, et al. A highly sensitive and accurate gene expression analysis by sequencing ("bead-seq") for a single cell. Anal Biochem 2015;471:9-16. Huan Huang, Mari Goto, Hiroyuki Tsunoda, Lizhou Sun, Kiyomi Taniguchi, Hiroko Matsunaga, Hideki Kambara. Non-biased and efficient global amplification of a single-cell cDNA library. Nucleic Acid Research 2013. Sasagawa Y, Nikaido I, Hayashi T, Danno H, Uno KD, Imai T, Ueda HR. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol 2013. Yohei Sasagawa, Hiroki Danno, Hitomi Takada, Masashi Ebisawa, Kaori Tanaka, Tetsutaro Hayashi, Akira Kurisaki, and Itoshi Nikaido. Quartz-Seq2: a high-throughput single-cell RNA-sequencing method that effectively uses limited sequence reads. Genome Biol 2018. Macosko EZ et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell 2015;161(5):1202-1214. Gierahn TM et al. Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput. Nat Methods 2017;14(4):395-398.
　本発明は、ごく微量の細胞サンプルからもmRNAを高い効率で網羅的に増幅できる、固相担体を用いたcDNA等の核酸の増幅方法を提供することを目的とする。
　臨床現場で可能なことは、末梢血中のCD8+ T細胞のTCRレパトアから、CD8+ TILのTCRレパトア応答を議論する方法である。残念ながら、本願発明者らによる検討の結果、末梢血CD8+ T細胞の解析だけでは腫瘍免疫応答を反映した情報は得られないことも判明した。従って臨床現場で適用可能な手段は、TILの分離無しにCD8+ TILのレパトア変動を解析できるかという一点にかかっている。言い換えれば、組織生検検体そのものをそのまま解析することで、すなわち、TILの分離なしで解析に供することで十分な腫瘍免疫応答の情報が得られることを示せば、少量の組織であっても、貴重な情報が得られることになる。臨床サイドではその情報が、治療方針決定に重要な情報となる。また、固相担体を用いた代表的なSCT解析プラットフォームとして、BD Rhapsodyシステムがあるが、１回の解析に要する費用は実費で数十万円と極めて高額である。このような貴重なサンプルを対象とする場合、感度と頑健性の両者を高いレベルで保つことが広く臨床応用する上では重要である。残念ながら、本願発明者らによる検討の結果、試薬ロットの違いや実験者の手技の差異などに対し、ビーズ担体を用いた既存の増幅法は脆弱性を有することが判明した。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、固相担体上で合成したcDNAへのヌクレオチドホモポリマー付加反応において、連鎖停止ヌクレオチド三リン酸によるchain-terminating reactionを用いることにより、固相上のDNA基質と酵素の量比の超過、反応時間の超過、試薬ロットの差異によらず安定して微量cDNAを高効率に増幅できることを見出した。さらに、本法は、Exonuclease I処理と併用することで副産物量の大幅な低減とcDNA増幅効率の増大を達成できることを見出した。さらに、本法は、オリゴDNA標識抗体等のオリゴDNAラベルに由来する、cDNAよりは短いが比較的長さのあるDNA産物が含まれていても、未反応プライマー由来の副産物、それらオリゴDNA標識抗体由来の増幅産物とcDNA増幅産物をそれらの鎖長の違いに基づき明確に分離できることを見出し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、ビーズ等の固相担体上にmRNAを含む標的核酸を捕捉して固相上で相補鎖合成を行ない、固相上の未反応の標的捕捉用核酸を分解除去した後にmRNA分解および連鎖停止ヌクレオチド三リン酸存在下でのTdT反応によるホモポリマー付加を行なうことを含む、固相担体を用いた核酸増幅法であって、以下の態様を包含する。
(１)　固相担体上に結合した標的捕捉用核酸を介して、mRNAを含む標的核酸を固相担体上に捕捉する、標的核酸捕捉工程；
　固相担体上に捕捉された標的核酸より、cDNAを含む、標的核酸と相補的なDNA鎖を合成する、相補鎖合成工程；
　標的核酸を捕捉していない固相担体上の標的捕捉用核酸をエキソヌクレアーゼ処理により分解除去する、エキソヌクレアーゼ処理工程；
　RNA分解酵素によりmRNAを分解する、mRNA分解工程；
　dATP、dTTP、dCTP又はdGTPと連鎖停止ヌクレオチド三リン酸との存在下でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる反応を行ない、前記相補的なDNA鎖の末端にヌクレオチドホモポリマーを付加する、ホモポリマー付加工程；
　前記ヌクレオチドホモポリマーに対し相補的なホモポリマー部分を含む第２鎖合成用プライマーを用いて、固相上に結合した前記相補的なDNA鎖に対し第２鎖合成を行なう、第２鎖合成工程；及び
　固相担体上に合成されたDNA２本鎖を鋳型として核酸増幅反応を行なう、核酸増幅工程
を含む、固相担体を用いた核酸増幅方法。
(２)　連鎖停止ヌクレオチド三リン酸が、ddNTP、ddNTPの誘導体、3'-dNTP、又は3'-デオキシ-5-メチルウリジン-5'-三リン酸である、(１)記載の方法。
(３)　ddNTPの誘導体が、OH基を有しない原子団で3'位が修飾されたddNTPである、(２)記載の方法。
(４)　連鎖停止ヌクレオチド三リン酸がddNTPである、(１)記載の方法。
(５)　mRNA分解工程とホモポリマー付加工程が同時に実施される、(１)～(４)のいずれか１項に記載の方法。
(６)　ホモポリマー付加工程において、ポリC付加又はポリG付加を行なう、(１)～(５)のいずれか１項に記載の方法。
(７)　標的捕捉用核酸が、ポリT部分を含む核酸を含む、(１)～(６)のいずれか１項に記載の方法。
(８)　標的捕捉用核酸が、ポリT部分の5'側に第１のアダプター部分を含む、(７)記載の方法。
(９)　固相担体がビーズであり、標的捕捉用核酸が、第１のアダプター部分とポリT部分の間にビーズ識別バーコード部分を含む、(８)記載の方法。
(１０)　固相担体がプレートであり、標的捕捉用核酸がプレートの複数箇所の区画に固定化され、第１のアダプター部分とポリT部分の間に区画識別バーコード部分を含む、(８)記載の方法。
(１１)　第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むプライマーを含む、(１)～(１０)のいずれか１項に記載の方法。
(１２)　第２鎖合成用プライマーが、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間に分子バーコード部分を含む、(１１)記載の方法。
(１３)　核酸増幅工程において、第１のアダプター部分を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーとを用いて核酸増幅反応を行なう、(８)～(１２)のいずれか１項に記載の方法。
(１４)　固相担体がビーズであり、標的核酸捕捉工程が、微小ウェル又は微小液滴中で実施される、(１３)記載の方法。
(１５)　核酸増幅工程において、cDNA中の所望の領域を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーとを用いて核酸増幅反応を行なう、(１１)又は(１２)記載の方法。
(１６)　標的核酸が、mRNAと、特異結合分子に結合したオリゴ核酸とを含み、標的捕捉用核酸が、mRNAを捕捉するためのmRNA捕捉配列を含む核酸と、前記オリゴ核酸を捕捉するためのオリゴ核酸捕捉領域を含む核酸を含み、前記オリゴ核酸が、オリゴ核酸捕捉領域と相補的な配列の被捕捉領域を含み、相補鎖合成工程において、mRNAからの逆転写反応によるcDNA合成と前記オリゴ核酸からの相補鎖合成が行なわれる、(１)～(１５)のいずれか１項に記載の方法。
(１７)　前記被捕捉領域がポリAであり、標的捕捉用核酸が、mRNA捕捉領域を含む核酸及びオリゴ核酸捕捉領域を含む核酸として、ポリT部分を含む核酸を含む、(１６)記載の方法。
(１８)　特異結合分子が、細胞表面分子に直接、又は特異結合パートナー分子を介して間接的に結合する少なくとも１種の分子である、(１６)又は(１７)記載の方法。
(１９)　特異結合分子が、細胞表面分子に対する少なくとも１種の抗体又は抗体断片である、(１８)記載の方法。
(２０)　特異結合分子がアビジン類であり、特異結合パートナー分子がビオチン類である、(１８)記載の方法。
(２１)　標的核酸捕捉工程の前に、細胞を含むサンプルと、前記オリゴ核酸で標識された特異結合分子を接触させることにより、該特異結合分子を細胞表面に直接又は間接的に結合させる工程、及び、細胞を溶解させる工程を含む、(１６)～(２０)のいずれか１項に記載の方法。
(２２)　前記オリゴ核酸が、被捕捉領域の5'側に共通配列を含み、標的捕捉用核酸が、ポリT部分の5'側に第１のアダプター部分を含む、(１６)～(２１)のいずれか１項に記載の方法。
(２３)　前記オリゴ核酸が、共通配列と被捕捉領域の間に特異結合分子識別バーコード部分を含む、(２２)記載の方法。
(２４)　第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むプライマーと、前記共通配列を含むプライマーとを含む、(２２)又は(２３)記載の方法。
(２５)　核酸増幅工程において、第１のアダプター部分を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーと、共通配列を含むプライマーとを用いて核酸増幅反応を行なう、(２４)記載の方法。
(２６)　核酸増幅工程において、cDNA中の所望の領域を標的とするプライマーと、第１のアダプター部分を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーと、共通配列を含むプライマーとを用いて核酸増幅反応を行なう、(２４)記載の方法。
　本発明の増幅法では、固相担体上で合成したcDNAへのヌクレオチドホモポリマー付加反応において、ddNTP等の連鎖停止ヌクレオチド三リン酸によるchain-terminating reactionを用いる。これにより、固相上のDNA基質に対する酵素の量比の超過、反応時間の超過、試薬ロットの差異によらず、微量のサンプルからもcDNAを安定して高効率に増幅できる。
　従来技術では、実験者の習熟度の差異（習熟度が低いと、実験操作のタイムラグを生じ、反応時間の超過をもたらしやすい）や、試薬ロットの違いなどにより影響され、感度と頑健性の両者を高いレベルで保つことが困難であったが、本発明の方法によれば、１細胞や腫瘍バイオプシー検体を始めとする扱いの難しい微量サンプルであっても、実験者の習熟度や試薬ロットの違いなどにより影響されることなく、頑健かつ高感度にmRNAを網羅してcDNAを増幅できる。
　実験者の習熟や自動化に要するコストを下げることができるので、普及へのハードルも低下させることができる。
　神原ら（特許文献３、非特許文献６）の方法は、磁性ビーズを用いて高感度にcDNAを増幅できる方法であるが、TdTによるホモポリマー付加反応のパラメータ（磁性ビーズ上のDNA基質と酵素の量比、反応時間、温度など）の厳密なコントロールが必要である。Exonuclease I処理は固相上のDNA基質とTdT酵素の量比を変えてしまうため、神原らの増幅法では、Exonuclease Iによる未反応プライマーの除去が行えないという問題点がある。一方、連鎖停止ヌクレオチド三リン酸によるchain-terminating reactionを用いた本発明の方法では、TdTによるホモポリマー付加反応のパラメータを厳密にコントロールする必要がないので、Exonuclease Iによる未反応プライマーの除去が可能である。
　本発明の増幅法によれば、検体が微量であっても発現解析やTCR解析が可能になるので、例えば、発現解析やTCR解析を利用した治療効果判定の精度を大幅に向上でき、医療資源の浪費の抑制などに貢献できる。
　オリゴDNAタグで標識した抗体を用いて、各1細胞プロテオーム解析と各１細胞トランスクリプトーム解析を同時に行なう技術が開発されており、様々な応用可能性があるものの、従来のTdT法ではオリゴDNAタグに由来する増幅産物とcDNA増幅産物の分離が困難であることから、DNA標識抗体を併用する解析技術の応用の自由度は低かった。これに対し、本発明の増幅法では、オリゴDNAタグに由来するDNA増幅産物とmRNAに由来するcDNA増幅産物を明確に分離することができるので（実施例、図１３参照）、本発明によれば、DNA標識抗体等の、オリゴ核酸で標識された特異結合分子を用いた解析と転写物の解析を同時に行なう技術の応用範囲を広げることができる。
　本発明の増幅法において、複数のタンパク質に対するオリゴ核酸標識抗体を併用することで、各１細胞のタンパク質とmRNAの発現解析を同時に高感度に実施できる。また、解析対象の細胞で安定して発現している細胞表面分子に対するオリゴ核酸標識抗体や、細胞表面分子全般を非特異的に標識できる、オリゴ核酸で標識された特異結合分子及びそのパートナー分子を併用することで、複数サンプルの同時解析（マルチプレックス解析）が可能となるので、cDNAライブラリー作成に要する費用を、同時解析するサンプル数に比例して削減できる。
ビーズ固相担体からの全cDNA増幅方法の概略である（SCT解析への利用の一例）。 ビーズ固相担体からのTCR cDNA増幅方法の概略である（TCRレパトア解析への利用の一例）。 Nx1-seqにおける、ddNTP・Exonuclease Iを用いない場合のTdT法・SMART法による全cDNA増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果である。TdT法はSMART法と比較して増幅cDNAの収量が多いが、DNAサイズの小さい副産物の生成もまた認められる。 ddNTPを用いない場合の、TdT法の副産物生成に対するExonuclease I処理の影響。Exonuclease Iの処置を実施しても、サイズの小さいフリープライマー由来の副産物の量の低減は認められない。また、副産物の鎖長のExonuclease I処理による伸長が認められる。 ddATPの添加によるTdT法の副産物生成の抑制。ddATPを一定量添加することでフリープライマー由来の副産物の過剰な伸長が抑制される。 ddATP/ddCTPの添加によるTdT法の副産物生成の抑制。ddATP・ddCTPの両者ともに、TdT反応に一定量添加することでフリープライマー由来の副産物の過剰な伸長が抑制される。また、ddCTPのほうが短鎖長のフリープライマー由来の副産物の長さがより短く抑えられる。 ddCTPの添加によるTdT法の副産物生成の抑制効果における反応時間の影響。ddCTPを添加しない場合はフリープライマー由来の副産物が、反応時間を5分から30分に延長することにより伸長するのに対し(lane 2及びLane 6)、ddCTPの添加により反応時間が5分から30分に延長しても、フリープライマー由来の副産物の長さは一定の短い鎖長にとどまっている。反応時間の多寡による副産物伸長への影響がddCTPの添加により低減されていることが見て取れる。 ddATP/ddCTPの添加によるTdT法のcDNA増幅パターンの比較、およびRNase If, 第二鎖合成反応におけるmultiple annealing法の影響。第２鎖合成時にMultiple annealingを実施するとdATP, dCTP法の両者でcDNA収量が増加する一方、RNase Ifは負の影響がある。ddATP法は収量が多い一方で、フリープライマー由来の副産物の伸長抑制にはddCTP法の方がより優れていることが見て取れる。 ddCTP-TdT法とExonucleaseI処理の併用効果。ddCTP-TdT法に対し、Exonuclease I処理を施すことで、フリープライマー由来の副産物が大幅に減少し、ddNTP非使用時に認められたフリープライマー由来の副産物の伸長も認められず、なおかつ増幅cDNAの収量増加が、様々な逆転写反応条件の如何にかかわらず認められる。 本発明の方法によるビーズ固相担体からの全cDNA増幅を、ビーズ固相担体を用いるSCT解析プラットフォームの一つであるBD Rhapsodyシステムと併用する場合の方法の概略である。右に増幅cDNA, シーケンスライブラリーのDNAサイズ分布をAgilent Bioanalyzerで解析した結果を示す。 本発明の方法によるビーズ固相担体からの全cDNA増幅とBD Rhapsodyシステムとを組み合わせたSCT解析結果と、既存のSCT解析方法とのパフォーマンスの比較。定常状態マウス肺より調製した単細胞（single cells）において比較した（既存プラットフォームのデータはTabula Murisコンソーシアムのデータを利用）。本発明による全cDNA増幅方法とBD Rhapsodyシステムの組み合わせは、１細胞あたりの遺伝子検出感度（10X Genomics ChromiumおよびSmart-Seq2と比較）・同一シーケンスリードあたりの遺伝子検出数（シーケンスリードの利用効率、Smart-Seq2と比較）・各細胞間の遺伝子発現の差異を捉える解像度（総検出遺伝子数およびSeurat analysisによるhighly-variable geneの数の多寡にて評価、図１１下）のすべての面で、既存方法を上回っている。 本発明の方法によるビーズ固相担体からの全cDNA増幅とBD Rhapsodyシステムを組み合わせたSCT解析法による、ブレオマイシン誘導肺線維症マウスモデルの経時的解析結果。投与後0,3,7,10日目のマウス肺のデータを用い、Seuratソフトウェアにより解析を行った。肺の様々な細胞集団が網羅的に同定され、それぞれの細胞集団を特徴づけるマーカー遺伝子もまた同定された。 本発明の方法によるビーズ固相担体からの全cDNA増幅とBD Rhapsodyシステム、DNA標識抗体を組み合わせたSCT解析法による、colon26皮下移植腫瘍マウスモデル由来CD45+白血球の14検体のマルチプレックス解析結果。全cDNA増幅に本発明の方法を用いることで、サンプル識別のためのDNAラベル抗体由来の２本鎖DNAと、cDNA由来の2本鎖DNAが明確に分離できた。さらに、SCTデータに含まれる各細胞の由来を、標識に用いたDNA標識抗体由来のシグナル（リード数）の大きさに基づき分離できており、かつ各検体において多くの遺伝子が均等に検出できていることが認められた。
　本発明において、標的捕捉用核酸、特異結合分子に結合したオリゴ核酸（以下、単に「オリゴ核酸」といった場合には、特異結合分子に結合したオリゴ核酸を意味する）、プライマー、アダプター、ヌクレオチドホモポリマー等の塩基配列を構成するA、T、G、Cには、DNAを構成するデオキシリボヌクレオチド（DNAのA、T、G、C）のみならず、RNAを構成するリボヌクレオチド（RNAのA、T、G、C）も包含され、さらには、対応するヌクレオチドアナログ（例えば、LNA, ENA, PNAなどの架橋化核酸（bridged nucleic acid）や、Super T (5-hydroxybutynl-2’-deoxyuridine), Super G (8-aza-7-deazaguanosine), deoxyinosine, 5-methyl dC, deoxyuridine, 2,6-diaminopurine, 2-aminopurine, 2-Amino-dATPなどの修飾塩基など）も包含される。すなわち、標的捕捉用核酸（例えば、ポリT部分、第１のアダプター部分、バーコード部分、オリゴ核酸捕捉領域、及びこれら以外の部分のうちのいずれかの部分）、ヌクレオチドホモポリマー、第２鎖合成用プライマー（例えば、相補的ホモポリマー部分、第２のアダプター部分、分子バーコード部分、及びこれら以外のうちのいずれかの部分）、オリゴ核酸（例えば、被捕捉領域、共通配列、特異結合分子識別バーコード部分、及びこれら以外の部分のうちのいずれかの部分）、並びに、核酸増幅工程において使用する各プライマーには、リボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択される１個以上（例えば１～１５個程度、１～１２個程度、又は１～数個程度）のモノマーが含まれていてもよい。
　また、本発明において、ある領域Xを標的とするプライマーといった場合、この領域X又はその相補鎖に特異的にハイブリダイズするプライマーを意味する。領域Xを標的とするプライマーには、領域Xと同一の配列又はこれと相補的な配列を含むプライマーが包含される。領域Xに設定したプライマーという語も同様であり、領域X又はその相補鎖に特異的にハイブリダイズするプライマーを意味し、領域Xと同一の配列又はこれと相補的な配列を含むプライマーが包含される。
　本発明の核酸増幅方法は、標的核酸捕捉工程、相補鎖合成工程、エキソヌクレアーゼ処理工程、mRNA分解工程、ホモポリマー付加工程、第２鎖合成工程、及び核酸増幅工程を含む。以下、適宜図１及び図２を参照しながら各工程を説明する。
＜標的核酸捕捉工程＞
　標的核酸捕捉工程では、固相担体上に結合した標的捕捉用核酸を介して、固相担体上に標的核酸を捕捉する（図１、図２のStep 1）。標的核酸は、mRNAを含む核酸であり、mRNAのみを標的としてもよいし、mRNA以外の核酸も併せて標的としてもよい。mRNA以外の標的核酸の一例として、特異結合分子に結合したオリゴ核酸を挙げることができる。なお、図１及び図２では、固相担体としてビーズを用いる態様が示されており、便宜的に、１個のビーズ担体上に１分子のmRNAを捕捉した様子が示されているが、実際には１個のビーズ担体上に多数のmRNA分子が捕捉される。図１のStep 1には、mRNA及びオリゴ核酸を標的核酸とする場合の態様を示しており、ここでも１個のビーズ担体上に１分子のオリゴ核酸を捕捉した様子が示されているが、実際には、１個のビーズ担体上に多数のオリゴ核酸分子が捕捉される。
　固相担体は、ビーズでもよいし、スライドグラス等のプレートでもよい。固相ビーズを用いた単一細胞解析システムとしては、例えば、Drop-seq法(非特許文献１０、WO 2016/040476 A1)、Nx1-seq法(WO 2015/166768 A1; Hashimoto et al. Scientific Reports 2017 Oct 27;7(1):14225. doi: 10.1038/s41598-017-14676-3.)、Seq-well法（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5376227/）、BD Rhapsodyシステム等が知られている。固相担体としてプレートを用いた解析方法としては、例えば、スライドグラス上に固相化したオリゴ核酸を用いた空間トランスクリプトーム法（spatical transcriptomics, https://spatialtranscriptomics.com/products/）が知られている。本発明の核酸増幅法はこれらのいずれにも適用可能である。
　ビーズの材質は特に限定されず、核酸解析キットの核酸捕捉担体やイムノアッセイキットの固相粒子担体に用いられる種々の材質を採用できる。ビーズの材質の例として、ポリスチレン、ポリプロピレン等の樹脂製のビーズ等の有機ポリマー製ビーズ、セレン化カドミウム（CdSe）、硫化亜鉛（ZnS）、硫化カドミウム（CdS）、セレン化亜鉛（ZnSe）、酸化亜鉛（ZnO）等の半導体材料でできた量子ドット（半導体ナノ粒子）等の半導体製ビーズ、金等の金属製ビーズ、シリカ製ビーズなどの重合体ビーズ等を挙げることができる。具体例として、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン等（Merrifield Biochemistry 1964,3,1385-1390参照）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然海綿、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（例えばSephadex(商品名)）およびアガロースゲル（Sepharose(商品名)）等の材質のビーズを挙げることができる。非磁性体、磁性体のいずれでも良いが、取扱いがより容易な磁性ビーズを好ましく用いることができる。
　プレートの材質も特に限定されず、例えば、マイクロアレイの基板に用いられる種々の材質を採用できる。使用可能な材質の代表的な例としてガラスが挙げられるが、その他、シリコン、プラスチック等も使用できる。固相担体がプレートの場合、標的捕捉用核酸は、通常、プレート上の複数箇所の区画に固定化（典型的には、スポット状に整列固定化）される。
　mRNAが由来する細胞は特に限定されず、例えば、マウス個体由来の細胞、各種培養細胞、健常人由来の細胞、がん患者由来の細胞、各種疾患患者由来の細胞など、種々の細胞が対象となる。がん患者由来の細胞は、がん免疫療法を受けているがん患者に由来する細胞であってもよい。健常人や患者に由来する細胞は、末梢血や病変部（例えば腫瘍）から採取された細胞であってよい。
　オリゴ核酸をmRNAと共に標的核酸とする場合、オリゴ核酸で標識される特異結合分子は、好ましくは、細胞表面分子に直接、又は特異結合パートナー分子を介して間接的に結合する少なくとも１種の分子である。
　細胞表面分子に直接特異的に結合する特異結合分子の典型的な例として、細胞表面分子に対する抗体を挙げることができる。抗体は、抗原としての細胞表面分子に抗原抗体反応により特異的に結合する結合能を有していればよく、Fab、F(ab')2、scFv（single chain fragment of variable region、単鎖抗体）等の抗体断片（抗原結合性断片）を用いることもできる。「細胞表面分子に対する抗体断片」という語は、抗原としての細胞表面分子に抗原抗体反応により特異的に結合する結合能を有する抗体断片を意味する。mRNA発現とタンパク質発現の同時解析を行なう場合には、所望の１種又は２種以上のタンパク質に対する抗体又は抗体断片を特異結合分子として用いればよい。複数サンプルの同時解析（マルチプレックス解析）を行なう場合には、解析対象の細胞において安定して発現している細胞表面分子に対する抗体又は抗体断片を特異結合分子として用いればよい。
　特異結合分子及びその結合パートナーである特異結合パートナー分子の好ましい例として、アビジン類及びビオチン類をそれぞれ挙げることができる。具体的には、特異結合分子としてはアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジン等のアビジン類を好ましく用いることができ、特異結合パートナー分子としてはビオチン又はデスチオビオチン等のビオチン類を好ましく用いることができる。細胞表面分子に対し、特異結合パートナー分子を介して間接的に結合する特異結合分子を用いる場合には、特異結合パートナー分子で細胞を処理して細胞表面分子全般を標識しておき、次いで、オリゴ核酸で標識された特異結合分子と反応させればよい。例えば、Biotin-Sulfo-OSu, Biotin-SS-Sulfo-OSuなどの親水性ビオチン標識試薬を用い、PBS中に該試薬と細胞を添加して4℃で10-30分程度インキュベートすることにより、細胞表面に存在する細胞表面分子を非特異的にビオチン標識できる。特異結合分子－パートナー分子を用いた間接標識法は、細胞表面分子の発現の有無、発現パターンなどに影響されず、細胞表面分子全般を非特異的に標識できるため、マルチプレックス解析に適した手法である。
　細胞表面分子は特に限定されず、各種のCD分子や主要組織適合抗原、細胞表面受容体等の様々な細胞表面分子が包含される。
　オリゴ核酸は、典型的には一本鎖DNAであり、鎖長は通常数十塩基～150塩基程度、例えば60塩基～100塩基程度である。該オリゴ核酸の3'側（特異結合分子と結合していない末端側）には、標的捕捉用核酸により捕捉されるための被捕捉領域が含まれる。標的捕捉用核酸中で被捕捉領域とハイブリダイズする領域を便宜的に「オリゴ核酸捕捉領域」と呼ぶと、被捕捉領域は、オリゴ核酸捕捉領域と相補的な配列を有する。被捕捉領域の好ましい例としてポリAを挙げることができるが、これに限らず、ポリAではない任意の配列からなっていてもよい。捕捉領域の融解温度がポリA配列よりも高く、かつ、G又はCが連続して５個以上出現しない配列を、ポリAではない任意の配列として好ましく採用することができる。オリゴ核酸の5'側（特異結合分子と結合している末端側）、すなわち被捕捉領域の5'上流側には、第２鎖合成時のプライマーや核酸増幅工程で用いるプライマーを設定するための共通配列が含まれる。共通配列と被捕捉領域との間には、特異結合分子を識別するための特異結合分子識別バーコードが含まれていてよい。サンプル数に応じた種類の特異結合分子識別バーコードを利用することで、最終的に増幅された核酸がどのサンプルに由来するかを識別することができる。
　標的核酸捕捉工程の実施態様の１つとして、病変部組織検体や細胞懸濁液等の細胞試料よりmRNA試料を調製し、標的捕捉用核酸が結合した固相担体とmRNA試料を接触させることにより、固相上にmRNAを捕捉する態様を挙げることができる。mRNA試料の調製は、まず細胞試料よりtotal RNAを抽出してからmRNAの抽出を行なってもよいし、細胞試料からtotal RNAの抽出を経ず直接的にmRNAを抽出してもよい。
　標的核酸捕捉工程の別の実施態様として、固相ビーズを用いたsingle cell transcriptome（SCT）解析プラットフォームを用いて、微小ウェルや微小液滴中で個々の１細胞からRNAを抽出し、標的捕捉用核酸が結合したビーズ担体と接触させることにより、微小ウェル又は微小液滴中でビーズ上に標的核酸としてのmRNAを捕捉する態様を挙げることができる。微小ウェル、微小液滴という用語における「微小」という語は、典型的にはボリュームが5～100pl程度であることを意味する。固相ビーズを用いたSCT解析プラットフォームの一般的な手法の一例として、微小ウェルを有するプレートを用いたBeckton Dickinson社のBD Rhapsodyシステム（特許文献４）、Seq-wellシステム（非特許文献１１）、及びNx1-seqシステム（WO 2015/166768 A1; Hashimoto et al. Scientific Reports 2017 Oct 27;7(1):14225. doi: 10.1038/s41598-017-14676-3.）や、微小液滴中でmRNAを捕捉するDrop-seq法（非特許文献１０）を挙げることができ、本発明においてはこれらの一般的手法を好ましく用いることができる。
　核酸捕捉工程のさらに別の実施態様として、空間トランスクリプトーム法のプラットフォームを用いて、標的捕捉核酸固定化プレート上で組織サンプルを透過処理し、組織標本の各細胞より出てきたmRNAをプレート上に整列固定化された捕捉核酸にて捕捉する態様を挙げることができる。
　標的捕捉用核酸としては、ポリT部分を含む核酸を好ましく用いることができる。固相担体上には、標的捕捉用核酸として、ポリT部分を含む核酸の他、ポリT部分を含まない核酸も追加で固相化されていてもよい。本発明の方法においては、標的捕捉用核酸として、mRNAを捕捉する核酸が固相担体上に固定化されているが、mRNA以外の標的核酸を捕捉する核酸も併せて固定化されていてもよい。例えば、上述したように、オリゴ核酸を捕捉する核酸が標的捕捉用核酸としてさらに固相担体上に固定化されていてもよい。本発明の増幅方法にオリゴ核酸標識特異結合分子を併用する場合の態様は後に詳述するが、固相担体上に固定化される、mRNAを捕捉するための標的捕捉用核酸と、オリゴ核酸を捕捉するための標的捕捉用核酸は、同一の場合もあるし、異なる場合もある。
　標的捕捉用核酸は、ポリT部分の5'側、すなわち固相担体側に第１のアダプター部分を含んでいてよい。図１及び図２中でUniversal 1として示されている部分が第１のアダプター部分である。第１のアダプター部分は、核酸増幅工程においてプライマーの一方を設定する領域となる。
　また、標的捕捉用核酸は、第１のアダプター部分とポリT部分の間に、個々の固相担体ないしは固相担体上の位置を識別するためのバーコード部分を含んでいてよい。このバーコード部分とは、固相担体がビーズである場合にはビーズ識別バーコードであり、固相担体がプレートである場合には、プレート上のどの区画に固定化されているかを識別するための区画識別バーコードである。そのようなバーコード部分を含む態様においては、核酸増幅工程で増幅される、cDNAを含む核酸には、識別バーコード部分に由来するバーコード配列が含まれることになる。ビーズ識別バーコード部分は、同一のビーズ上では同一の配列であり、ビーズごとに異なる配列を有する。これにより、同じビーズ上に捕捉されたmRNAに由来するcDNAを、他のビーズ上に捕捉されたmRNAに由来するcDNAと区別することができる。SCT解析においては、同じ細胞に由来するcDNAを、他の細胞に由来するcDNAと区別することができる。そのようなビーズ識別バーコード部分を含む、固相化されたmRNA捕捉用核酸は、公知の方法で調製することができる（例えば、WO 2015/166768 A1など参照）。また、区画識別バーコード部分は、プレート上の同一の区画（スポット）内では同一の配列であり、区画（スポット）ごとに異なる配列を有する。これにより、例えばサンプルが組織標本である場合に、組織のどの部位でどのようなmRNAが発現しているかを把握することができる。
＜相補鎖合成工程＞
　相補鎖合成工程では、固相担体上に捕捉された標的核酸から、これと相補的なDNA鎖を合成する。標的核酸がmRNAの場合には、逆転写反応によりcDNAが合成される。標的核酸がmRNA以外の核酸、例えば特異結合分子に結合したオリゴDNAを含む場合、相補鎖合成工程では、mRNAからのcDNAの逆転写反応と、DNAポリメラーゼを用いたオリゴDNAからの相補鎖合成反応とが行われる。この工程により、固相担体上に捕捉された、mRNAを含む標的核酸から、cDNAを含む、標的核酸と相補的なDNA鎖が合成される。標的核酸捕捉工程の後、固相担体を回収し、固相担体上に標的核酸が捕捉された状態で逆転写反応等を行なう（図１及び図２のStep 1）。標的mRNAからの逆転写反応及び標的DNAからの相補鎖合成反応自体は常法通りに行なうことができる。相補鎖合成後、固相担体を洗浄して次の工程に進む。
＜エキソヌクレアーゼ処理工程＞
　エキソヌクレアーゼ処理工程では、標的核酸を捕捉していない固相担体上の標的捕捉用核酸をエキソヌクレアーゼ処理により分解除去する（図１及び図２のStep 2; 図中のRT primersは標的捕捉用核酸を意味している）。一本鎖DNAを特異的に分解する一般的なエキソヌクレアーゼの例として、Exonuclease IやExonuclease Tを挙げることができる。本発明ではそのような一般的なエキソヌクレアーゼの少なくとも1種を用いることができる。エキソヌクレアーゼ処理後、固相担体を洗浄して次の工程に進む。
＜mRNA分解工程＞
　mRNA分解工程では、固相担体上に結合しているmRNA-cDNAハイブリッドのmRNAをRNA分解酵素で分解する（図１、図２のStep 3）。RNase Hなどの一般的なRNA分解酵素を利用できる。RNAの分解後は、固相担体を洗浄、回収してからホモポリマー付加工程に進んでもよいし、洗浄せずにそのままホモポリマー付加工程に進んでもよい。後述するように、mRNA分解工程とホモポリマー付加工程を同時に行なうこともできる。
＜ホモポリマー付加工程＞
　ホモポリマー付加工程では、dATP、dTTP、dCTP、又はdGTPと連鎖停止ヌクレオチド三リン酸（連鎖停止NTP）との存在下でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）による反応を行ない、固相上に合成されたDNA鎖の末端にヌクレオチドホモポリマーを付加する（図１、図２のStep 3; 図にはポリCの例を示す）。連鎖停止NTP（連鎖停止ATP、連鎖停止TTP、連鎖停止CTP、又は連鎖停止GTP）とは、この分野で周知の通り、ヌクレオチドの3'位のOH基が、他のヌクレオチド分子の5'-リン酸部分との間でリン酸エステル結合を形成できないように修飾ないし改変されたヌクレオチドであり、3'位のOH基を有しない（3'位に結合する原子団にOH基を含まない）ヌクレオチド三リン酸ともいうことができる。本発明においても使用可能な一般的な連鎖停止NTPの具体例として、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ddNTP）(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, ddUTP), ddNTPの誘導体（典型的には、OH基を有しない原子団で3'位が修飾されたddNTPであり、例えば、3'-Azido-ddATP, 3'-Azido-ddCTP, 3'-Azido-ddGTP, 3'-Azido-ddTTP, 3'-Azido-ddUTP, 3'-Amino-ddATP, 3'-Amino-ddCTP, 3'-Amino-ddGTP, 3'-Amino-ddTTP等の、アジド基若しくはアミノ基で3'位が修飾されたddNTP）, 3'-デオキシヌクレオチド三リン酸（3'-dNTP）(3’-dATP, 3’-dCTP, 3’-dGTP, 3’-dTTP, 3’-dUTP) , 3'-デオキシ-5-メチルウリジン-5'-三リン酸が挙げられ、例えばddNTP、又はアジド基で3'位が修飾されたddNTP、特にddNTPであってよいが、これらに限定されない。使用する連鎖停止NTP及びホモポリマーを形成する基質（dNTP）は、両者の塩基鎖を揃えることが望ましい。第２鎖合成反応に必要な最低ホモポリマー長、第２鎖合成に用いるプライマーの3’末端ホモポリマー部分の必要長、フリープライマー由来副産物の鎖長を特に望ましく抑えられることから、例えばddCTP等の連鎖停止CTP＋dCTP、又はddGTP等の連鎖停止GTP＋dGTPの組み合わせにより、ポリC付加又はポリG付加を行なうことが特に好ましい。
　連鎖停止NTPの添加量は、例えばddNTPを用いる場合、dNTP（dATP、dTTP、dCTP、又はdGTP）に対する比率でddNTP:dNTP＝1:10～1:100程度であればよく、例えば1:10～1:80、1:10～1:60、1:10～1:40、1:15～1:80、1:15～1:60、又は1:15～1:40の比率で用いることができる。他の連鎖停止NTPもこの比率に準じて使用量を設定できる。連鎖停止NTPの非共存下でTdT反応を行なう場合、ホモポリマーの鎖長を制御するために、酵素のロット間の活性の違いや、プライマーやcDNAなど基質の量の差異に応じて反応時間を厳密に制御する必要がある。一方、本発明では、連鎖停止NTPの共存下でTdTによるホモポリマー付加反応を行なうことにより、確率論的に連鎖停止NTPが取り込まれてホモポリマー伸長反応が停止するので、TdTによる反応時間延長の許容量が大幅に増大する。
　TdTによるホモポリマー付加反応は、一般に、2価カチオンの存在下で行なわれる。使用可能な2価カチオンとしては、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Mg2+などの２価金属カチオンが挙げられ、例えばCo2+又はMn2+であってよいが、これらに限定されない。
　連鎖停止NTP添加により、TdTによる反応時間延長の許容量が大幅に増大するため、TdT反応液にRNase Hを添加してmRNA分解反応とホモポリマー付加反応を同時に行うことができる。従って、本発明の１つの態様において、mRNA分解工程とホモポリマー付加工程は同時に実施される。
＜第２鎖合成工程＞
　ホモポリマー付加反応の後、固相担体を洗浄して第２鎖合成工程に進む。第２鎖合成工程では、cDNAを含む相補的なDNA鎖の末端に付加されたヌクレオチドホモポリマーに対して相補的なホモポリマー部分を含むプライマーを含む第２鎖合成用プライマーを用いて、固相担体上に結合した相補的DNA鎖に対し第２鎖合成を行なう（図１、図２のStep 4）。mRNAに加えて、特異結合分子に結合したオリゴ核酸も標的核酸とした場合には、第２鎖合成用プライマーは、上記した相補的ホモポリマー部分を含むプライマーと、オリゴ核酸中の部分領域（後述する共通配列）を含むプライマーとを含んでいてよい。
　相補的ホモポリマー部分は、第２鎖合成用プライマーの3'末端側に存在する。相補的ホモポリマー部分の鎖長は、相補的DNA鎖に付加されたホモポリマーテイルがポリC又はポリGである場合には通常6～20塩基程度、例えば6～13塩基程度、7～15塩基程度、又は7～11塩基程度であり、ホモポリマーテイルがポリA又はポリTである場合には通常15～30塩基程度、例えば18～25塩基程度である。また、相補的ホモポリマー部分は、その3'末端に1～2塩基程度のアンカー配列が付加されていてもよい。アンカー配列を付加することで、TdTによりcDNAに付加されたホモポリマーテイルの開始点に第２鎖合成用プライマーがアニーリングする確率を高めることができる。アンカー配列は、相補的ホモポリマー部分がポリGの場合はHまたはHN (H = A, T又はC; N = any base (A, T, C又はG))、ポリCの場合はDまたはDN（D = A, T又はG; N = any base (A, T, C又はG)）、ポリAの場合はBまたはBN（B = T, G又はC; N = any base (A, T, C又はG)）、ポリTの場合はVまたはVN（V = A, G又はC; N = any base (A, T, C又はG)）を用いることができる。
　第２鎖合成工程では、サーマルサイクリング反応により第２鎖合成用プライマーのアニーリング/伸長の工程を複数回実施してよい。また、1度のサイクリングにより第２鎖合成を実施したのち、Bst DNA polymerase等の鎖置換活性のあるポリメラーゼにより後追い反応を実施してもよい。このような処理により、第２鎖合成効率を高めることができる。
　第２鎖合成用プライマーは、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含んでいてよい。図１のStep 4でUniversal 2、図２のStep 4でtrP1として示されている部分が第２のアダプター部分である。第２のアダプター部分は、核酸増幅工程においてプライマーの一方を設定する領域となる。
　第２鎖合成用プライマーは、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間に分子バーコード部分を含んでいてよい。この態様の第２鎖合成用プライマーは、5'側から[第２のアダプター]-[分子バーコード]-[相補的ホモポリマー]の順序に各部分が連結した構造を有する。分子バーコードはランダムな塩基配列を有しており、後の核酸増幅工程で増幅されたDNA分子は、同一の2本鎖cDNAに由来するDNAであれば同一の分子バーコードを有し、別の2本鎖cDNAに由来するDNAであれば互いに異なる分子バーコードを有することになる。異なる分子バーコードを有するDNAのみを数えることで、出発時のcDNA分子数の推定や、異なるcDNA間のPCR増幅効率の差の補正が可能となる。分子バーコードの鎖長は特に限定されないが、典型的には12塩基～30塩基程度である。分子バーコードは、シークエンスエラーに耐性を持たせるため、ランダム塩基配列中に特定の固定配列が挿入された構成にしてもよい。
＜核酸増幅工程＞
　第２鎖合成後、固相担体を洗浄して、又は洗浄せずに核酸増幅工程に進む。核酸増幅工程では、固相担体上に合成されたDNA２本鎖を鋳型として核酸増幅反応を行なう（図１、図２のStep 5、Step 6）。この核酸増幅反応では高い正確性が求められるため、一般に高正確性PCR酵素として知られているポリメラーゼを用いることが望ましい。高正確性PCR酵素は種々のものが市販されている。本工程では、固相担体を洗浄せずに核酸増幅反応液を追加添加することにより、そのまま核酸増幅反応を実施してもよい。
　第１のアダプターと第２のアダプターを採用する態様では、それらのアダプターに設定したプライマーのセットでPCRを行なうことができる。SCT解析の場合は（図１）、各細胞中で発現しているmRNAを網羅的に逆転写して増幅するので、第１及び第２のアダプターを標的とするプライマーセットで全cDNA増幅を行なうのが一般的である。この場合のプライマーセットは、典型的には、第１のアダプター配列からなるプライマーと、第２のアダプター配列からなるプライマーとのセットであるが、5'側に任意の付加配列やビオチン等による修飾を含んでいても差し支えない。図１に示した例では、第１のアダプター配列からなるプライマー（Universal 1 primer）と第２のアダプター配列からなるプライマー（Universal 2 primer）を用いたPCRを２回行なっているが、これはSCT解析において本発明の核酸増幅方法を利用する場合の一例であり、SCT解析に利用する態様がこの一例に限定されるものではない。
　mRNAに加えて、特異結合分子に結合したオリゴ核酸も標的核酸とした場合は、第１のアダプターを標的とするプライマー及び第２のアダプターを標的とするプライマーに加え、オリゴ核酸中の部分領域（後述する共通配列）を含むプライマーを用いて、cDNAとオリゴ核酸を同時に増幅する。得られた増幅産物は、磁気ビーズ等を用いてサイズ分画を行ない、増幅されたcDNAとオリゴ核酸を分離し、２回目のPCRにおいて各々を独立に増幅することができる。
　TCRレパトア解析におけるTCR可変領域ライブラリーの調製で本発明を実施する場合は（図２）、固相担体上で合成されたcDNA分子のうちでTCR可変領域をコードするcDNA領域を増幅できればよい。そのため、この場合の核酸増幅工程では、第１のアダプターを標的とするプライマーの代わりに、TCR定常領域を標的とするプライマーを用いることができる。もっとも、図１と同様に、第１のアダプターと第２のアダプターを標的とするプライマーセットを用いて全cDNA増幅を行なった後、全cDNA増幅産物を鋳型として、TCR定常領域を標的とするプライマーと第２のアダプターを標的とするプライマーを用いてTCR可変領域cDNAを増幅してもよい。
　以下、本発明の核酸増幅方法の利用例として、SCT解析への利用例、TCRレパトア解析への利用例、及びオリゴ核酸標識特異結合分子を用いた解析との併用例を説明する。もっとも、本発明の核酸増幅方法の利用はこれらの解析法への利用に限定されるものではなく、ビーズやプレート等の固相担体からのcDNA増幅のステップを含む様々な技術に利用することができる。
＜SCT解析への利用例（図１）＞
　SCT解析に本発明の核酸増幅方法を利用する場合の一例を図１に基づいて説明する。もっとも、SCT解析への利用例はこの一例に限定されるものではない。
　Step 1～Step 4は、上述した標的核酸捕捉工程～第２鎖合成工程の通りに行なえばよい。第２鎖合成用プライマーは、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間に分子バーコード部分は含んでいなくても良い。
　核酸増幅工程は、２回の増幅反応（1st PCR、2nd PCR）として実施できる。どちらも第１のアダプターを標的とするプライマーと第２のアダプターを標的とするプライマーを用いる。1st PCR（図１のStep 5）は数サイクルのPCRとし、1st PCRの増幅産物のサイズセレクション及び精製を行なう。次いで、2nd PCRを行ない全cDNAをさらに増幅し（図１のStep 6）、再びサイズセレクションおよび精製を行なうことにより、全cDNAの増幅産物を得る。後のステップで配列解析対象の断片を回収する便宜のため、2nd PCRでは、両プライマーの5'末端にビオチンやアミン等のスペーサーを結合させたものを用いてもよい。
　得られた全cDNAの増幅産物は、次世代シークエンサーによるシークエンシングに供するために、断片化、末端修復、A-tailing、シークエンス用アダプターの付加等の加工を行なう。これらの加工により、シークエンス用コンストラクトに加工されたcDNAのライブラリーが得られる。断片化手段としては、超音波や酵素を用いることができる。シークエンス用コンストラクトの作成は、一般的に用いられる試薬を用いることができ、酵素法の代表的なものとしてはNew England Biolabs社のNEBNext UltraII FS kitや、KAPA Biosystems社のKAPA HyperPlus kit、超音波断片化装置としてはCovarisやBioruptorなどの機械を用いることができるが、その他の同等品でも使用可能である。シークエンス用アダプターは、使用する次世代シークエンサーに応じて適当なアダプターを用いればよい。
　ライブラリーのシークエンシングは、一般に次世代シークエンサーと呼ばれるシークエンサーを用いて実施すればよい。好ましく使用できる次世代シークエンサーの具体例としては、イルミナ社のNovaseq 6000システム、Hiseqシステム、Nextseqシステム、MiSeqシステム、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のIon Protonシステム、同社のIon S5/Ion S5 XLシステム等が挙げられる。
＜TCRレパトア解析への利用例（図２）＞
　TCRレパトア解析に本発明の核酸増幅方法を利用する場合の一例を図２に基づいて説明する。もっとも、TCRレパトア解析への利用例はこの一例に限定されるものではない。
　Step 1～Step 4は、上述した標的核酸捕捉工程～第２鎖合成工程の通りに行なえばよいが、第２のアダプターとして、配列解析に使用する次世代シークエンサーに適したシークエンス用アダプター（図２、Step 4のtrP1）を用いる。第２鎖合成用プライマーは、分子バーコード部分を含むものが好ましく用いられる。
　核酸増幅工程は、２回の増幅反応（1st PCR、2nd PCR）として実施できる。1st PCRでは、TCR定常領域に設定したプライマー（図２、Step 5のTRAc and/or TRBc external primer(s)）と、第２のアダプターを標的とするプライマー（図２のtrP1 primer）を用いる。TCRレパトア解析の解析対象がβ鎖である場合には、β鎖定常領域を標的とするプライマー（TRBc external primer）と、第2のアダプターを標的とするプライマーを使用すればよい。解析対象がα鎖である場合には、β鎖定常領域を標的とするプライマーに代えて、α鎖定常領域を標的とするプライマー（TRAc external primer）を使用すればよい。β鎖定常領域を標的とするプライマーとα鎖定常領域を標的とするプライマーの両者を混合し（TRAc and/or TRBc external primers）、第2のアダプターを標的とするプライマーとセットで用いれば、β鎖可変領域とα鎖可変領域の両方を増幅できる。
　Step 5の1st PCRは、nested PCRにより行なってもよい。この場合、第2のアダプターを標的とするプライマーと組み合わせるプライマーは、nested PCRの1回目と2回目のいずれも、定常領域内に設定すればよい。なお、このように、一方のプライマーが1回目と2回目で同一である場合、semi-nested PCRと呼ぶことがある。このステップにおいても、アダプターに設定したプライマーと定常領域に設定したプライマーのセットを用いることで、PCRバイアスをかけることなくTCRのcDNAを増幅することができる。
　1st PCRの増幅産物のサイズセレクション及び精製を行なってから、2nd PCRを行なう（図２のStep 6）。2nd PCRでは、第２のアダプター配列からなるプライマー（trP1 primer）と、TCR cDNA断片上の定常領域を標的とするプライマー（A-BC-TRC primer）を用いる。TCR定常領域を標的とするA-BC-TRC primerは、第２のシークエンス用アダプター（lonA）の配列を5'末端に有する。この2nd PCRにより、両末端にシークエンシングのためのアダプターが付加された500～600 bp程度のサイズのDNA断片で構成されるTCR可変領域ライブラリーを得ることができる。2nd PCRで用いるTCR定常領域を標的とするプライマーA-BC-TRC primerは、第２のシークエンス用アダプター（lonA）の配列とTCR定常領域標的配列との間に分子バーコード配列（BC）を有する。分子バーコードは、同じサンプルから調製した同じライブラリーに対して同一の分子バーコードを使用し、ライブラリーごとに異なる分子バーコードを用いる。これにより、次世代シークエンサーによる配列大量解析後に、あるTCR可変領域配列がどのライブラリーに由来するかを識別することができる。
　TCR可変領域ライブラリーのシークエンシングは、一般に次世代シークエンサーと呼ばれるシークエンサーを用いて実施すればよい。好ましく使用できる次世代シークエンサーの具体例としては、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のIon S5/Ion S5 XLシステム、イルミナ社のMiSeqシステム、Novaseq 6000システム等が挙げられる。
＜オリゴ核酸標識特異結合分子を用いた解析との併用例（図１）＞
　オリゴ核酸標識特異結合分子と本発明の増幅法を併用する場合の一例を、図１に基づいて説明する。図１は本発明の増幅法をSCT解析に利用した場合の例であるが、オリゴ核酸標識特異結合分子と本発明の増幅法の併用例はこれに限定されず、TCRレパトア解析とも併用できるし、それ以外にも、ビーズやプレート等の固相担体からのcDNA増幅のステップを含む様々な技術と併用できる。
　オリゴ核酸標識特異結合分子と併用する場合、mRNAとオリゴ核酸が標的核酸となる。固相担体上に固定化する標的捕捉用核酸には、mRNAを捕捉するためのmRNA捕捉領域を含む核酸と、前記オリゴ核酸を捕捉するためのオリゴ核酸捕捉領域を含む核酸が含まれるが、両者は同一の場合もあるし、異なっている場合もある。オリゴ核酸が有する被捕捉領域がポリAである場合、標的捕捉核酸が有するオリゴ核酸捕捉領域としてはポリTを利用できるが、この場合には、２種の標的核酸のどちらも、ポリT部分を含む１種類の標的捕捉用核酸により捕捉することができる。ポリAではない任意の配列を被捕捉領域としてオリゴ核酸に持たせた場合には、当該任意の配列と相補的な配列のオリゴ核酸捕捉領域を含む核酸を、特異結合分子が結合したオリゴ核酸を捕捉するための標的捕捉用核酸として用いることができ、ビーズ担体上には、mRNA捕捉領域としてポリTを含む標的捕捉用核酸と、オリゴ核酸捕捉領域として上記任意の配列と相補的な配列を含む標的捕捉用核酸の２種類が固定化される。
　Step 1の標的核酸捕捉工程に先立ち、細胞を含むサンプルと、オリゴ核酸標識特異結合分子を接触させることにより、オリゴ核酸標識特異結合分子を細胞表面に結合させる工程、及び、細胞を溶解させる工程を実施する。特異結合分子及びそのパートナー分子を用いる間接標識の場合には、上述したように、まず特異結合パートナー分子（ビオチン類など）で細胞を処理して細胞表面分子全般を非特異的に標識しておき、次いで、この細胞を含むサンプルを、オリゴ核酸で標識された特異結合分子（アビジン類など）と接触させて反応させればよい。つまり、間接標識の場合には、特異結合パートナー分子と細胞サンプルを接触させることにより、細胞表面に存在する細胞表面分子に特異結合パートナー分子を結合させる工程を行ってから、オリゴ核酸標識特異結合分子を細胞表面に結合させる工程を実施すればよい。SCT解析との併用の場合には、オリゴ核酸標識特異結合分子を反応させた細胞を、SCT解析のプラットフォームにロードして、微小ウェル又は微小液滴内で細胞を溶解すればよい。
　Step 1では、mRNAとオリゴ核酸がビーズ担体上に捕捉され、逆転写反応によるmRNAからのcDNA合成と、DNAポリメラーゼによるオリゴ核酸からの相補鎖合成が行われる。
　Step 2は、上述したエキソヌクレアーゼ処理工程の通りに行なえばよい。
　Step 3は、上述したmRNA分解工程及びホモポリマー付加工程の通りに行なえばよい。mRNAから逆転写されたcDNA、及びオリゴ核酸から合成された相補的DNA鎖の両者の末端にホモポリマーが付加される。mRNA分解により、ビーズ担体上のcDNAは一本鎖の状態となるが、オリゴ核酸はその相補鎖と２本鎖を形成した状態でビーズ担体上に捕捉されている。この２本鎖は、ホモポリマー付加反応の前に熱変性させることで、特異結合分子が結合したオリゴ核酸鎖を解離させてもよいし、ホモポリマー付加反応後に熱変性させて解離させてもよい。
　Step 4では、第２鎖合成用プライマーとして、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むプライマーと、共通配列を含むプライマーを用いる。前者が、mRNAより合成されたcDNAに対して第２鎖を合成するためのプライマーであり、後者が、オリゴ核酸より合成された相補鎖に対して第２鎖を合成するためのプライマーである。SCT解析との併用の場合には、前者の第２鎖合成用プライマーは、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間に分子バーコード部分は含んでいなくても良く、TCRレパトア解析との併用の場合には、分子バーコードを含む第２鎖合成用プライマーが好ましく用いられる。
　Step 5では、第１のアダプター部分を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーと、共通配列を含むプライマーとを用いて、核酸増幅工程のうちの1st PCRを行なう。第１のアダプターを標的とするプライマー及び第２のアダプターを標的とするプライマーのセットにより、mRNAから合成されたcDNAが増幅される。第１のアダプターを標的とするプライマー及び共通配列を含むプライマーのセットにより、オリゴ核酸が増幅される。
　あるいは、Step 5において、cDNA中の所望の領域を標的とするプライマー（便宜的にプライマーXとする）をさらに組み合わせて用いてもよい。TCRレパトア解析との併用の場合には、プライマーXとして、TCR定常領域を標的とするプライマーを用いる。プライマーX及び第２のアダプターを標的とするプライマーのセットにより、TCR可変領域が増幅され、第１のアダプターを標的とするプライマー及び共通配列を含むプライマーのセットにより、オリゴ核酸から合成された相補鎖が増幅される。
　1st PCRにより得られた増幅産物は、磁気ビーズ等を用いてサイズ分画を行ない、増幅されたcDNAとオリゴ核酸を分離し、Step 6の2nd PCRにおいて、cDNAとオリゴ核酸を別個独立に増幅する。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．SMART法と従来のTdT法の比較（図３）
　Nx1-seq法（WO 2015/166768 A1; Hashimoto et al. Scientific Reports 2017 Oct 27;7(1):14225. doi: 10.1038/s41598-017-14676-3.）により調製した、固相ビーズ上にトラップされたシングルセルトランスクリプトームライブラリーを、SMART法および従来のTdT法を用いて増幅した（ddNTPならびにExonuclease Iは非使用）。使用したプライマーの配列は下記表１に示す。
　上記ライブラリーの調製には、標的捕捉用核酸として、ユニバーサルアダプター部分、ビーズ識別バーコード部分及びポリT部分を有する核酸(LibA-BC-linker-UMI-dT27VN)を非磁気ビーズ上に固相化し、これらのビーズを１個ずつウェルに充填したマイクロウェルプレートを用いた。マウス肺単細胞懸濁液由来の細胞が、各ウェルの大半で１個または０個入るように細胞をロードし、それら個々の細胞由来のmRNA分子を標的核酸として１個のビーズ上に捕捉したものを、シングルセルトランスクリプトームライブラリーとして用いた。
　SMART法は、上記のmRNA捕捉ビーズを非特許文献４に記載の通りの手法にて逆転写反応液（Superscript II逆転写酵素, Betain, First-strand buffer, RNase Inhibitor, MgCl2, Biosg-LibB-TSO primerを含む）を調製し逆転写、cDNAの2本鎖化を行い、cDNAの両側に付加されたLibB/LibA配列に対するプライマー(Biosg-LibA-primer, Biosg-LibB-primer)を用いたPCRにて全cDNAを増幅した。
　従来のTdT法は、Superscript IVにて逆転写、RNaseHにてmRNAを分解、ビーズを洗浄後、dATPおよびCoCl2を用いてTdT反応を50秒実施した。EDTAを用いて反応を直ちに停止、熱でTdTを不活化、ビーズを洗浄後、第２鎖合成反応をLibB-dT25VN-primerを用いて１回のアニーリングにて行った。ビーズを洗浄後、SMART法と同様にcDNAの両側に付加されたLibB/LibA配列に対するプライマー(Biosg-LibA-primer, Biosg-LibB-primer)を用いたPCRにて全cDNAを増幅した。
　結果を図３に示す。従来のTdT法はSMART法と比較してより多くのcDNAが得られている一方、サイズの小さい領域に、mRNA捕捉用核酸由来の副産物の混入が認められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．Exonuclease I処理のTdT法への影響（図４）
　Nx1-seq法で用いる固相ビーズを、mRNAトラップ・cDNA合成を行わずに、Exonuclease Iで処置し、TdT反応を行い、副産物の生成パターンを比較した。Exonuclease I処理を行ったにも関わらず、副産物の量の低減が認められず、その長さは逆に長くなっていることが認められる（図４）。
３．ddNTPのTdT法における副産物生成への影響（図５、６、７）
　Dynabeads M270 streptavidin（Thermo Fisher Scientific）に標的（mRNA）捕捉用核酸としてBioEcoP-dT25-adapterを固相化した。このビーズを用いて、TdT反応における、ddNTPの副産物生成に対する抑制効果を検証した。第２鎖合成には5’WTA-dT25 primerまたは5’WTA-dG9 primerを用い、cDNA増幅は5’WTA primer/3’WTA primerを用いて実施した。TdT反応でdATPを用いる場合（ポリAテール付加）はddATPを、dCTPを用いる場合（ポリCテール付加）はddCTPを、ddNTP:dNTP=1:20～1:100の比率で添加し、TdT反応を20分実施した(添加比率は図中に記載)。TdT反応時間が過剰であっても、ddATP、ddCTPともに副産物の伸長が完全に抑制されることが認められた（図５、６）。また、ddCTPを用いた場合のTdT反応が5分と30分の場合を比較したところ、ddCTP未添加群は反応時間が5分の時点にて1kbpを超えるプライマー由来の副産物の生成が認められ、その長さは30分でさらに拡大したのに対し、ddCTP添加群は反応時間5分と30分の両者においてプライマー由来副産物の長さは100bp付近にとどまり、顕著な伸長は認められなかった(図７)。さらに、Co2+添加群のほうがMg2+添加群よりも効率よく第二鎖が合成されており、それら副産物はExo I処理でほぼ完全な消失が認められた（図7 lane 10）。
　プライマー由来副産物が過剰に伸長してしまうと、目的とするcDNA増幅産物とサイズが近くなることで副産物とcDNA増幅産物の分離が困難となり、その結果cDNA増幅が阻害されてしまうという問題が生じる。本実験で明らかになったように、ddNTP添加してTdT反応を行なうことで、酵素のロットの違いや実験者の手技の違い等によりTdT反応が過剰に実施された場合でもプライマー由来副産物の過剰な伸長が起こらないため、伸長した副産物によるcDNA増幅の阻害を防止することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
４．ddNTP法によるcDNA増幅と、第２鎖合成反応における複数回アニーリングの影響（図８）
　上記３．で作製した標的捕捉用核酸を固相化したビーズを用いて、標的核酸であるmRNAを捕捉、逆転写し、ddNTP-TdT法（ddNTP共存下でTdT反応を行なう方法）によりcDNAを増幅した。ddNTP法としては、ポリAテールを付加するddATP法と、ポリCテールを付加するddCTP法を行なった。第２鎖合成反応時に、複数回プライマーアニーリング反応を行うことで、cDNAの収量がddATP法、ddCTP法の両者ともに増加することが見出された。その一方で、ddATP法の場合、わずかながらサイズの小さい、mRNA捕捉用核酸由来の副産物の生成が認められた。これより、収量を高く保ちつつ頑健にcDNAを増幅するためにはddATP法よりもddCTP法の方がより優れていることが確認された。一方で、１本鎖RNA分解酵素であるRNase Ifの反応系への添加は、わずかばかりcDNA量を減少させる影響が認められた。
５．ddCTP法によるcDNA増幅と、Exonuclease Iの併用効果（図９）
　上記３．で作製した標的捕捉用核酸を固相化したビーズを用いて、標的核酸であるmRNAを捕捉、様々な条件にて逆転写した。逆転写後のビーズを半量にわけ、一方をExonuclease I処理に供した。その後ddCTP-TdT法により全cDNAを増幅した。その結果、Exonuclease I処理により、標的捕捉用核酸由来の副産物が減少するとともに、cDNA収量が2-4倍程度増加することが見出された。
６．本発明を、固相磁性ビーズを用いたシングルセルトランスクリプトーム解析プラットフォームに適用した場合の効果
　本発明の方法による、ビーズに固相化されたcDNAの頑健・高感度な増幅法は、固相ビーズを用いた包括的single-cell RNA-seq法、例えばDrop-seq法(非特許文献１０、WO 2016/040476 A1)、Nx1-seq法(WO 2015/166768 A1; Hashimoto et al. Scientific Reports 2017 Oct 27;7(1):14225. doi: 10.1038/s41598-017-14676-3.)、Seq-well法（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5376227/）、BD Rhapsodyシステムなどや、ビーズ以外の固相担体としてスライドグラス上の固相オリゴを用いた空間トランスクリプトーム法（spatical transcriptomics社, https://spatialtranscriptomics.com/products/）など、プラットフォームを問わず固相担体を用いる系において広く適用可能である。シングルセルトランスクリプトーム解析における本発明の有用性を検証するため、一例として、BD Rhapsodyシステムに本増幅法を適用し、定常状態マウス肺、およびブレオマイシン傷害マウス肺（投与後３日目、７日目、10日目）の全細胞のシングルセルトランスクリプトーム解析を実施した。
　8週齢のマウス肺を還流後摘出し、カミソリで細切り後、Liberase TMおよびDNase Iを用いて酵素消化し、全肺の単細胞懸濁液を得た。死細胞・赤血球をPercollを用いた密度勾配遠心により除去し、フローサイトメーターで細胞をカウント、Rhapsodyの仕様書に従いマイクロウェルカートリッジに適切な密度で細胞・ビーズをロードし、細胞を溶解、各々１つの細胞由来mRNAを１つのビーズ上(mRNA捕捉用核酸として、Rhapsody universal adapterを含む)でトラップした（mRNA捕捉工程）。メーカー推奨の通りに逆転写反応を行ない（cDNA合成工程）、その後、Exonuclease I処理により、ビーズ上の未反応のmRNA捕捉用核酸を除去した（エキソヌクレアーゼ処理工程）。なお、ビーズ上に固相化されたRhapsody universal adapterは、下記の構造を有するDNAであり、CLS1（cell label section 1）～CLS3には、９塩基からなる各９６種の既知固有配列、合計２８８種が採用されており、全体で約90万通りのビーズ識別バーコード部分を構成している。配列表の配列番号１１には、CLS1～CLS3をNNNNNNNNNとして示す。
＜Rhapsody universal adapterの構造＞
ACACGACGCTCTTCCGATCT-(CLS1)-ACTGGCCTGCGA-(CLS2)-GGTAGCGGTGACA-(CLS3)-NNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTT（配列番号１１）
　Exonuclease I処理後、ビーズ半量（およそ3000-4000細胞分）を用い、本発明の増幅法に従い全cDNAを増幅した。mRNA分解工程とホモポリマー付加工程は、RNase HとTdTを反応液に添加して同時に進行させた。ホモポリマー付加工程では、Tris-HCl, (NH4)2SO4, KCl, K-phosphate, MgSO4, CoCl2, TritonX-100, glycerolを含む反応液中で、ddCTPをddCTP:dCTP＝1:20～1:40の量で使用してTdT反応を行なうことにより、磁気ビーズ上のcDNA末端に長さが制限される形でポリCテールを付加した。ビーズを洗浄後、LibA-dG9プライマーおよび高正確性PCR酵素であるKAPA HiFi Hotstart Readymixを用い、第２鎖合成反応を実施した。アニーリング回数は16回行った。ビーズを洗浄後、NH2-LibAプライマーおよびNH2-universalプライマー、KAPA HiFi Hotstart Readymixを用いて1st PCRを行った。0.65倍濃度のAmPure XPビーズで２回精製後、NH2-LibAプライマーおよびNH2-universalプライマー、KAPA HiFi Hotstart Readymixを用いて2nd PCRを行った。DNA濃度およびサイズ分布をAgilent Bioanalyzerを用いて確認したところ、合計17 cycleのPCRにより、1-1.5kbをピークとするおよそ1 μgのcDNAが得られた（図１０）。各ステップにおいて用いたプライマー配列は表３の通りである。得られたcDNAをNEBNext UltraII FSキットを用いて、キットのプロトコールに従い断片化、アダプター付加、PCRによるillumina用シーケンスアダプター・バーコードの付加を行いシーケンス解析用ライブラリーを構築した（図１０）。得られたライブラリーをKAPA Library quantification kit for Illuminaを用いて定量、サイズ分布をAgilent Bioanalyzerを用いて確認し、Illumina Novaseq 6000にてシーケンスを実施した。シーケンス解析用ライブラリーの作成に用いたアダプター・プライマー配列は表４の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　得られたシングルセルトランスクリプトームデータを、既存のSCT解析方法（Smart-Seq2法、及び10X Genomics社のChromiumシステム）による定常状態マウス肺細胞の解析データと比較した。既存の解析方法のデータは、Tabula Murisコンソーシアムのデータを利用した。その結果、シークエンスの量はSmart-seq2法の1/10であるにも関わらず、BD Rhapsodyと本発明のcDNA増幅法の組み合わせは、総検出遺伝子数、１細胞あたりの検出遺伝子数で、既存の２つの方法を上回ることが見出された（図１１）。各シングルセルトランスクリプトームデータがどの程度の解像度にて細胞間の遺伝子発現差異を捉えているかを、Seuratソフトウェアにより検出されるhighly-variable gene（細胞ごとに大きく発現変動している遺伝子）の数にて評価したところ、BD Rhapsodyと本発明のcDNA増幅法の組み合わせは、既存の２つの方法を上回る解像度を有していることが見出された（図１１）。さらに、ブレオマイシン傷害マウス肺を含んだ経時的(day0, day3, day7, day10)データのSeuratソフトウェアによる解析により、肺の様々な性質の異なる細胞集団が網羅的に同定され、その細胞集団それぞれ特異的に発現するマーカー遺伝子もまた同定された（図１２）。これより、本発明の増幅法の、シングルセルトランスクリプトーム解析における有用性が示された。
７．オリゴ核酸標識抗体を併用するシングルセルトランスクリプトーム解析における本発明の効果
　オリゴ核酸標識抗体を併用するシングルセルトランスクリプトーム解析の１例として、colon26 マウス皮下移植腫瘍モデル由来のCD45陽性白血球の解析例を示す。オリゴ核酸標識抗体として、14種類の異なる1本鎖DNAで抗体（抗CD45抗体および抗MHC class I抗体の混合物：商品名Biolegend Totalseq Hashtag-A：https://www.biolegend.com/en-us/totalseq）が標識されたDNA標識抗体を用いた。標識DNAは、下記の構造を有するDNAであり、バーコード部分には１５塩基からなる14種の既知固有配列が採用されている。配列表の配列番号２５には、バーコード部分をNNNNNNNNNNNNNNNとして示す。被捕捉領域としてポリAを有するDNAであり、mRNAと同様に、ポリT部分を有する標的捕捉核酸によって捕捉することができる。
＜Biolegend Hashtag Totalseq-Aの標識DNA構造＞
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNN-BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA*A*A（配列番号２５）＊はホスホロチオエート結合を示す。
　マウスより皮下腫瘍を摘出、Liberase TM及びDNase Iで酵素消化、単細胞懸濁液を調製後、CD45陽性細胞をマグネットビーズによる磁気分離(MACS)により分取した。得られた異なるマウス由来の14サンプルの各々を、14種類の異なる1本鎖DNAで標識された上記のDNA標識抗体で染色し、細胞をFACS bufferで洗浄した。抗体により標識された細胞を、フローサイトメーターで細胞をカウント後、等比率になるようにプールし、BD Rhapsodyシステムを用いて、Rhapsodyの仕様書に従いマイクロウェルカートリッジに適切な密度で細胞・ビーズをロードし、細胞を溶解、各々１つの細胞由来mRNA及び該細胞に結合した抗体に結合している標識1本鎖DNAを１つのビーズ上（標的捕捉用核酸として、Rhapsody universal adapterを含む）でトラップした（標的核酸捕捉工程）。メーカー推奨の通りに逆転写反応および抗体標識1本鎖DNAの相補鎖合成を行ない（相補鎖合成工程）、その後、Exonuclease I処理により、ビーズ上の未反応の標的捕捉用核酸を除去した（エキソヌクレアーゼ処理工程）。
　エキソヌクレアーゼ処理後、ビーズ半量（およそ9000-10000細胞分）を用い、本発明の増幅法に従い全cDNAを増幅した。mRNA分解工程とホモポリマー付加工程は、RNase HとTdTを反応液に添加して同時に進行させた。ホモポリマー付加工程では、Tris-HCl, (NH4)2SO4, KCl, K-phosphate, MgSO4, CoCl2, TritonX-100, glycerolを含む反応液中で、ddCTPをddCTP:dCTP＝1:20～1:40の量で使用してTdT反応を行なうことにより、磁気ビーズ上のcDNA末端に長さが制限される形でポリCテールを付加した。
　ビーズを洗浄後、5’BDWTA-dG9プライマーおよび高正確性PCR酵素であるKAPA HiFi Hotstart Readymixを用い、第２鎖合成反応を実施した。アニーリング回数は16回行った。
　ビーズを洗浄後、NH2-5’BDWTAプライマー・NH2-universalプライマーおよびHashtag Commonプライマー、KAPA HiFi Hotstart Readymixを用いて1st PCRを行った。PCR反応液50μLに対しAmPure XPビーズ溶液32.5μLを添加（ビーズ濃度0.65倍）して混合し、ビーズをマグネットで回収して洗浄・溶出することにより、鎖長が400bp以上のcDNA画分を取得した。さらに上清に対して0.65倍濃度のAmPure XPビーズ溶液を添加（終濃度1.3倍）して同様に精製することで、鎖長が150bp～400bpの抗体標識DNA画分を取得した。精製後、cDNA画分はNH2-5’BDWTAプライマーおよびNH2-universalプライマー、KAPA HiFi Hotstart Readymixを用いて2nd PCRを行った。抗体標識DNA画分はHashtag commonプライマーおよびNH2-universalプライマー、KAPA HiFi Hotstart Readymixを用いて2nd PCRを行った。
　2nd PCR反応液のDNA濃度およびサイズ分布をAgilent Bioanalyzerを用いて確認したところ、cDNA画分は1kbpを中心とするスメアなバンドが得られ、また一定鎖長の抗体標識DNA画分はシングルピークのDNAが得られた（図１３）。各ステップにおいて用いたプライマー配列は表５の通りである。得られたcDNAをNEBNext UltraII FSキットを用いて、キットのプロトコールに従い断片化、アダプター付加、PCRによるillumina用シーケンスアダプター・バーコードの付加を行いシーケンス解析用ライブラリーを構築した。DNA標識抗体に関しては、PCRによるillumina用シーケンスアダプター・バーコードの付加を行いシーケンス解析用ライブラリーを構築した。得られたライブラリーをKAPA Library quantification kit for Illuminaを用いて定量、サイズ分布をAgilent Bioanalyzerを用いて確認し、Illumina Novaseq 6000にてシーケンスを実施した。シーケンス解析用ライブラリーの作成に用いたアダプター・プライマー配列は表６の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　得られたシングルセルトランスクリプトームデータを、各細胞の抗体標識DNA由来のタグカウントの多寡に基づきクラスタリングを実施したところ、各細胞の由来サンプルを抗体標識DNAの発現量に基づき分類可能であることが見出され、また得られた各細胞の細胞数はほぼ一定であった（図１３）。また、DNA標識抗体由来のタグが２種類以上十分に検出された細胞がダブレットとして同定された（図１３）。さらに、各サンプルにおける各細胞の検出遺伝子数をプロットしたところ、14サンプルがほぼ均一に遺伝子が検出されており、ダブレットサンプルはそれらよりも検出遺伝子数が多いことが見出された（図１３）。これより、本発明の増幅法の、DNA標識抗体を併用することによる、複数サンプルの同時シングルセルトランスクリプトーム解析における有用性が示された。

Claims (26)

  1. 　固相担体上に結合した標的捕捉用核酸を介して、mRNAを含む標的核酸を固相担体上に捕捉する、標的核酸捕捉工程；
    　固相担体上に捕捉された標的核酸より、cDNAを含む、標的核酸と相補的なDNA鎖を合成する、相補鎖合成工程；
    　標的核酸を捕捉していない固相担体上の標的捕捉用核酸をエキソヌクレアーゼ処理により分解除去する、エキソヌクレアーゼ処理工程；
    　RNA分解酵素によりmRNAを分解する、mRNA分解工程；
    　dATP、dTTP、dCTP又はdGTPと連鎖停止ヌクレオチド三リン酸との存在下でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる反応を行ない、前記相補的なDNA鎖の末端にヌクレオチドホモポリマーを付加する、ホモポリマー付加工程；
    　前記ヌクレオチドホモポリマーに対し相補的なホモポリマー部分を含む第２鎖合成用プライマーを用いて、固相上に結合した前記相補的なDNA鎖に対し第２鎖合成を行なう、第２鎖合成工程；及び
    　固相担体上に合成されたDNA２本鎖を鋳型として核酸増幅反応を行なう、核酸増幅工程
    を含む、固相担体を用いた核酸増幅方法。
  2. 　連鎖停止ヌクレオチド三リン酸が、ddNTP、ddNTPの誘導体、3'-dNTP、又は3'-デオキシ-5-メチルウリジン-5'-三リン酸である、請求項１記載の方法。
  3. 　ddNTPの誘導体が、OH基を有しない原子団で3'位が修飾されたddNTPである、請求項２記載の方法。
  4. 　連鎖停止ヌクレオチド三リン酸がddNTPである、請求項１記載の方法。
  5. 　mRNA分解工程とホモポリマー付加工程が同時に実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　ホモポリマー付加工程において、ポリC付加又はポリG付加を行なう、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　標的捕捉用核酸が、ポリT部分を含む核酸を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　標的捕捉用核酸が、ポリT部分の5'側に第１のアダプター部分を含む、請求項７記載の方法。
  9. 　固相担体がビーズであり、標的捕捉用核酸が、第１のアダプター部分とポリT部分の間にビーズ識別バーコード部分を含む、請求項８記載の方法。
  10. 　固相担体がプレートであり、標的捕捉用核酸がプレートの複数箇所の区画に固定化され、第１のアダプター部分とポリT部分の間に区画識別バーコード部分を含む、請求項８記載の方法。
  11. 　第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むプライマーを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　第２鎖合成用プライマーが、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間に分子バーコード部分を含む、請求項１１記載の方法。
  13. 　核酸増幅工程において、第１のアダプター部分を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーとを用いて核酸増幅反応を行なう、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　固相担体がビーズであり、標的核酸捕捉工程が、微小ウェル又は微小液滴中で実施される、請求項１３記載の方法。
  15. 　核酸増幅工程において、cDNA中の所望の領域を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーとを用いて核酸増幅反応を行なう、請求項１１又は１２記載の方法。
  16. 　標的核酸が、mRNAと、特異結合分子に結合したオリゴ核酸とを含み、標的捕捉用核酸が、mRNAを捕捉するためのmRNA捕捉配列を含む核酸と、前記オリゴ核酸を捕捉するためのオリゴ核酸捕捉領域を含む核酸を含み、前記オリゴ核酸が、オリゴ核酸捕捉領域と相補的な配列の被捕捉領域を含み、相補鎖合成工程において、mRNAからの逆転写反応によるcDNA合成と前記オリゴ核酸からの相補鎖合成が行なわれる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記被捕捉領域がポリAであり、標的捕捉用核酸が、mRNA捕捉領域を含む核酸及びオリゴ核酸捕捉領域を含む核酸として、ポリT部分を含む核酸を含む、請求項１６記載の方法。
  18. 　特異結合分子が、細胞表面分子に直接、又は特異結合パートナー分子を介して間接的に結合する少なくとも１種の分子である、請求項１６又は１７記載の方法。
  19. 　特異結合分子が、細胞表面分子に対する少なくとも１種の抗体又は抗体断片である、請求項１８記載の方法。
  20. 　特異結合分子がアビジン類であり、特異結合パートナー分子がビオチン類である、請求項１８記載の方法。
  21. 　標的核酸捕捉工程の前に、細胞を含むサンプルと、前記オリゴ核酸で標識された特異結合分子を接触させることにより、該特異結合分子を細胞表面に直接又は間接的に結合させる工程、及び、細胞を溶解させる工程を含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　前記オリゴ核酸が、被捕捉領域の5'側に共通配列を含み、標的捕捉用核酸が、ポリT部分の5'側に第１のアダプター部分を含む、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　前記オリゴ核酸が、共通配列と被捕捉領域の間に特異結合分子識別バーコード部分を含む、請求項２２記載の方法。
  24. 　第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むプライマーと、前記共通配列を含むプライマーとを含む、請求項２２又は２３記載の方法。
  25. 　核酸増幅工程において、第１のアダプター部分を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーと、共通配列を含むプライマーとを用いて核酸増幅反応を行なう、請求項２４記載の方法。
  26. 　核酸増幅工程において、cDNA中の所望の領域を標的とするプライマーと、第１のアダプター部分を標的とするプライマーと、第２のアダプター部分を標的とするプライマーと、共通配列を含むプライマーとを用いて核酸増幅反応を行なう、請求項２４記載の方法。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013145431A1 (ja) 2012-03-30 2013-10-03 株式会社日立製作所 微量サンプル由来cDNA増幅法
WO2015027135A1 (en) 2013-08-23 2015-02-26 Ludwig Institute For Cancer Research Methods and compositions for cdna synthesis and single-cell transcriptome profiling using template switching reaction
WO2015166768A1 (ja) 2014-05-02 2015-11-05 国立大学法人金沢大学 単一細胞由来核酸の解析方法
WO2015200893A2 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
WO2016040476A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 The Broad Institute, Inc. A droplet-based method and apparatus for composite single-cell nucleic acid analysis
JP2016533187A (ja) * 2013-08-28 2016-10-27 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 大規模並列単一細胞分析
US20160312276A1 (en) * 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US20180251825A1 (en) * 2017-02-02 2018-09-06 New York Genome Center Inc. Methods and compositions for identifying or quantifying targets in a biological sample

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120225421A1 (en) * 2011-02-28 2012-09-06 Transgenomic, Inc. Kit and method for sequencing a target dna in a mixed population
US9914950B2 (en) * 2012-08-23 2018-03-13 Tufts University Homopolymer mediated nucleic acid amplification
WO2014108850A2 (en) * 2013-01-09 2014-07-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. High throughput transcriptome analysis
WO2018089550A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Takara Bio Usa, Inc. Methods of producing amplified double stranded deoxyribonucleic acids and compositions and kits for use therein

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013145431A1 (ja) 2012-03-30 2013-10-03 株式会社日立製作所 微量サンプル由来cDNA増幅法
WO2015027135A1 (en) 2013-08-23 2015-02-26 Ludwig Institute For Cancer Research Methods and compositions for cdna synthesis and single-cell transcriptome profiling using template switching reaction
JP2016533187A (ja) * 2013-08-28 2016-10-27 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 大規模並列単一細胞分析
US20180258500A1 (en) 2013-08-28 2018-09-13 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
WO2015166768A1 (ja) 2014-05-02 2015-11-05 国立大学法人金沢大学 単一細胞由来核酸の解析方法
WO2015200893A2 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
JP2017522867A (ja) * 2014-06-26 2017-08-17 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法
WO2016040476A1 (en) 2014-09-09 2016-03-17 The Broad Institute, Inc. A droplet-based method and apparatus for composite single-cell nucleic acid analysis
US20160312276A1 (en) * 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US20180251825A1 (en) * 2017-02-02 2018-09-06 New York Genome Center Inc. Methods and compositions for identifying or quantifying targets in a biological sample

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AOKI H. ET AL.: "TCR Repertoire Analysis Reveals Mobilization of Novel CD8+ T Cell Clones Into the Cancer-Immunity Cycle Following Anti-CD4 Antibody Administration", FRONT IMMUNOL, vol. 9, no. 3185, January 2019 (2019-01-01)
AOKI HIROYASU, UEHA SATOSHI, SHICHINO SHIGEYUKI, OGIWARA HARU, HASHIMOTO SHIN-ICHI, KAKIMI KAZUHIRO, ITO SATORU, MATSUSHIMA KOUJI: "TCR Repertoire Analysis Reveals Mobilization of Novel CD8+ T Cell Clones Into the Cancer-Immunity Cycle Following Anti-CD4 Antibody Administration", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, vol. 9, 1 January 2018 (2018-01-01), pages 3185, XP055785297, DOI: 10.3389/fimmu.2018.03185 *
GIERAHN TM: "Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput", NAT METHODS, vol. 14, no. 4, 2017, pages 395 - 398
HASHIMOTO ET AL., SCIENTIFIC REPORTS, vol. 7, no. I, 27 October 2017 (2017-10-27), pages 14225
HUAN HUANGMARI GOTOHIROYUKI TSUNODALIZHOU SUNKIYOMI TANIGUCHIHIROKO MATSUNAGAHIDEKI KAMBARA: "Non-biased and efficient global amplification of a single-cell cDNA library", NUCLEIC ACID RESEARCH, 2013
MACOSKO EZ ET AL.: "Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets", CELL, vol. 161, no. 5, 2015, pages 1202 - 1214, XP055586617, DOI: 10.1016/j.cell.2015.05.002
MARLON STOECKIUS, HAFEMEISTER CHRISTOPH, STEPHENSON WILLIAM, HOUCK-LOOMIS BRIAN, CHATTOPADHYAY PRATIP K, SWERDLOW HAROLD, SATIJA R: "Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells", NATURE METHODS, NATURE PUB. GROUP, NEW YORK, vol. 14, no. 9, 1 September 2017 (2017-09-01), New York, pages 865 - 868, XP055547724, ISSN: 1548-7091, DOI: 10.1038/nmeth.4380 *
MATSUNAGA HGOTO MARIKAWA K ET AL.: "A highly sensitive and accurate gene expression analysis by sequencing (''bead-seq'') for a single cell", ANAL BIOCHEM, vol. 471, 2015, pages 9 - 16
MERRIFIELD, BIOCHEMISTRY, vol. 3, 1964, pages 1385 - 1390
PICELLI S. ET AL.: "Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2", NAT PROTOC, vol. 9, no. 1, January 2014 (2014-01-01), pages 171 - 81, XP002742134, DOI: 10.1038/nprot.2014.006
REGEV A. ET AL.: "The Human Cell Atlas", ELIFE, 2017, pages e27041
SASAGAWA YNIKAIDO IHAYASHI TDANNO HUNO KDIMAI TUEDA HR: "Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity", GENOME BIOL, 2013
See also references of EP3998338A4
SINGLE-CELL TRANSCRIPTOMICS OF 20 MOUSE ORGANS CREATES A TABULA MURIS, NATURE, vol. 562, no. 7727, October 2018 (2018-10-01), pages 367 - 372
VANESSA M PETERSON, KELVIN XI ZHANG, NAMIT KUMAR, JERELYN WONG, LIXIA LI, DOUGLAS C WILSON, RENEE MOORE, TERRILL K MCCLANAHAN, SVE: "Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells", NATURE BIOTECHNOLOGY, GALE GROUP INC., NEW YORK, US, vol. 35, no. 10, us, pages 936 - 939, XP055587549, ISSN: 1087-0156, DOI: 10.1038/nbt.3973 *
YOHEI SASAGAWAHIROKI DANNOHITOMI TAKADAMASASHI EBISAWAKAORI TANAKATETSUTARO HAYASHIAKIRA KURISAKIITOSHI NIKAIDO: "Quartz-Seq2: a high-throughput single-cell RNA-sequencing method that effectively uses limited sequence reads", GENOME BIOL, 2018
ZARETSKY JMGARCIA-DIAZ A. SHIN DS ET AL.: "Mutations Associated with Acquired Resistance to PD-1 Blockade in Melanoma", N ENGL J MED, vol. 375, 2016, pages 819 - 2

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