CN114096679A - 使用固相载体的核酸扩增方法 - Google Patents

使用固相载体的核酸扩增方法 Download PDF

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Abstract

本发明的使用固相载体的核酸扩增法包括：将包含mRNA的靶核酸捕捉到固相载体上以在固相上进行互补链合成，通过核酸外切酶处理降解去除固相上的未反应的靶捕捉用核酸，之后进行mRNA降解和在链终止核苷酸三磷酸存在下的基于TdT反应的同聚物添加。根据本发明的方法，不受固相上酶与DNA底物的量比过高、反应时间过长、以及试剂批次差异的影响，由微量的样品即可稳定且高效地扩增cDNA。另外，根据本发明的扩增法，可扩大同时进行使用DNA标记抗体等用寡核酸标记的特异结合分子的分析和转录物的分析的技术的应用范围。

Description

使用固相载体的核酸扩增方法
技术领域
本发明涉及使用固相载体的核酸扩增方法。
背景技术
近年来，已经使用各单个细胞等微量样品进行了网罗性基因表达分析。这种技术可实现单细胞RNA-seq分析(单细胞转录组(single cell transcriptome：SCT)分析)，其网罗性地捕捉数百～万个单位的各个细胞的性质，关系到细胞群内的多态性的有无、或新的细胞亚群的鉴定、与病情相关的特殊的细胞群的鉴定，要在人类中制作单个细胞水平的图谱的国际项目于2016年启动(非专利文献1)等，成为以迄今为止所没有的分辨率推动生物学理解的原动力。
作为其他的代表性的微量样品，可列举：为了癌症患者的诊断而采集的原发灶/转移灶的活检样本中所含的肿瘤浸润T细胞。从抗PD-1抗体等作为免疫疗法的本质的CTL的实际状态为CD8+ T细胞的观点来看，测定具有癌抗原特异性识别能力的CD8+T细胞被诱导到何种程度的方法备受关注(非专利文献2)。作为其测定方法之一，有下述方法：分析CD8+ T细胞上的T细胞受体(T Cell Receptor; TCR)的序列以确定TCR组库(repertoire) (克隆的种类和各克隆的存在频率)，讨论肿瘤特异性克隆的应答，还报道了：实际上TCR组库变动与抗CD4抗体对癌症的治疗效果相关(非专利文献3)。然而，肿瘤浸润T细胞的大部分细胞是癌细胞或组织细胞，在大多数情况下T细胞的含量极少。因此，为了进行SCT分析或癌症部位的稳健的TCR组库分析，开发以高灵敏度且高通量地扩增由样本提取的mRNA或来源于来自样本的各个T细胞的mRNA的方法的重要性日益增加。
作为由微量样品进行的mRNA扩增法，有在96孔板中分别注入各个细胞或微量mRNA以进行扩增的Smart-Seq2等液相系统(专利文献1、非专利文献4)、或利用微通道形成小液滴并在各小液滴中捕捉1个细胞的10×Genomics公司的Chromium等小液滴系统(专利文献2)、使用固相珠粒捕捉各个样品的mRNA的方法等。虽然Smart-Seq2为高灵敏度，但其使用流式细胞仪在96孔或384孔板上对各个细胞进行分选，因此通量低、成本高。另一方面，10×Chromium等小液滴系统虽然通量高，但其问题在于与Smart-Seq2相比灵敏度大幅变差(非专利文献5)。另外，液相系统/小液滴系统两者均发生反应液的带入，因此作为用于溶解(裂解)细胞的试剂，无法使用具有强蛋白变性作用的表面活性剂，问题在于难以分析RNA降解酶多的细胞等。
经由在珠粒上的固相化的mRNA/cDNA扩增法不会大幅损失底物cDNA，容易进行反应步骤间的反应液置换，因此可使用蛋白变性作用强的表面活性剂等，与液相系统相比在更多样的反应条件下具有互换性。而且，通过使用磁珠作为固相珠粒载体，可实现使用磁性支架和自动分注工作台的步骤的自动化/半自动化，因此在高通量的SCT、TCR分析中是有用的技术。实际上，神原等人显示了：通过使用磁珠，可扩增微量或来自单个细胞的cDNA (专利文献3、非专利文献6)。然而，上述现有技术需要严格控制基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的polyA添加反应参数(磁珠上的DNA底物与酶的量比、反应时间、温度等)。例如，若磁珠上的引物密度高，则生成大量的基于TdT的来自引物的反应副产物，cDNA的扩增效率大幅地降低(非专利文献7)。另外，若TdT的反应时间长，则来自引物的副产物的伸长过度，无法分离cDNA和该副产物(非专利文献8)。即，问题在于受到TdT的酶活性的批次间差异、反应系统中的引物含量或cDNA含量的差异、自动分注系统的操作时滞等的影响较大。而且，在使用珠粒的综合性的来自单个细胞的mRNA分析技术中，为了去除未反应的包含细胞条形码的引物而广泛使用核酸外切酶I，但在上述神原等人的高灵敏度扩增法中，由于改变了DNA底物分子数与TdT酶的量比，所以还存在无法进行核酸外切酶I处理的问题。
近年来，有人开发了下述方法：通过用寡DNA标记特异性地识别各个蛋白的抗体，同时定量在各单个细胞上表达的数十个蛋白的表达量和各单个细胞转录组，其由Biolegend公司等市售(https://www.biolegend.com/en-us/totalseq)。在该方法中，将各蛋白的表达量作为基于序列分析的各抗体的DNA标签的表达量来分析。而且，通过以在各细胞种中广泛地表达的蛋白为靶、并改变DNA标签的种类，也可用于分离多个样品混合存在的单个细胞转录组数据的每个样品，且可用于削减成本或降低批次效应、生物学重复(biological replicate)的分析等(https://www.biolegend.com/en-us/bio-bits/new-cell-hashtag-reagents-for-single-cell-analysis)。像这样组合有DNA标记抗体的细胞标记的单个细胞转录组分析具有各种应用可能性，但DNA标签是寡DNA，其长度较长而达到84个碱基对以上，若与用于单个细胞转录组的细胞条形码合并，则达到145个碱基对以上的长度。另一方面，有报道称：在以往的TdT法中，在存在126个碱基对以上的引物等较cDNA短但却较长的DNA片段的情况下，无法顺利地分离cDNA和这些产物(非专利文献9)。通常，由于蛋白表达量远高于mRNA的表达量，所以用于检测蛋白的DNA标签产物与扩增cDNA的分离在以往的TdT法中较为困难。
Beckton Dickinson公司已将称为BD Rhapsody系统的、使用固相磁珠和微孔的SCT分析系统上市销售(专利文献4)，但Beckton Dickinson公司的RNA分析法仅限于提供如500个基因的有限数目的基因分析面板、或者只具有与10×Genomics公司的Chromium相同程度的效率的低灵敏度的扩增系统，无法满足研究者的需要。作为其他的使用固相珠粒的SCT分析法，有Drop-seq法(非专利文献10)、Seq-孔法(非专利文献11)等，但这些也采用效率较TdT法低的SMART法，灵敏度低是个问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2015/027135 A1；
专利文献2：WO 2015/200893 A2；
专利文献3：WO 2013/145431 A1；
专利文献4：US 2018/0258500 A1；
非专利文献
非专利文献1：Regev A等人. The Human Cell Atlas. eLife 2017; e27041；
非专利文献2：Zaretsky JM, Garcia-Diaz A, Shin DS等人. MutationsAssociated with Acquired Resistance to PD-1 Blockade in Melanoma. N Engl JMed 2016; 375: 819-2；
非专利文献3：Aoki H等人. TCR Repertoire Analysis Reveals Mobilizationof Novel CD8+ T Cell Clones Into the Cancer-Immunity Cycle Following Anti-CD4Antibody Administration. Front Immunol. 2019 Jan; 9 (3185)；
非专利文献4：Picelli S等人. Full-length RNA-seq from single cellsusing Smart-seq2. Nat Protoc. 2014 Jan; 9(1): 171-81；
非专利文献5：Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates aTabula Muris. Nature. 2018 Oct; 562 (7727): 367-372；
非专利文献6：Matsunaga H, Goto M, Arikawa K等人. A highly sensitiveand accurate gene expression analysis by sequencing (“bead-seq”) for a singlecell. Anal Biochem 2015; 471: 9-16；
非专利文献7：Huan Huang, Mari Goto, Hiroyuki Tsunoda, Lizhou Sun,Kiyomi Taniguchi, Hiroko Matsunaga, Hideki Kambara. Non-biased and efficientglobal amplification of a single-cell cDNA library. Nucleic Acid Research2013；
非专利文献8：Sasagawa Y, Nikaido I, Hayashi T, Danno H, Uno KD, ImaiT, Ueda HR. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNAsequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. GenomeBiol 2013；
非专利文献9：Yohei Sasagawa, Hiroki Danno, Hitomi Takada, MasashiEbisawa, Kaori Tanaka, Tetsutaro Hayashi, Akira Kurisaki, and Itoshi Nikaido.Quartz-Seq2: a high-throughput single-cell RNA-sequencing method thateffectively uses limited sequence reads. Genome Biol 2018；
非专利文献10：Macosko EZ等人. Highly Parallel Genome-wide ExpressionProfiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell 2015; 161(5):1202-1214；
非专利文献11：Gierahn TM等人. Seq-Well: portable, low-cost RNAsequencing of single cells at high throughput. Nat Methods 2017; 14(4): 395-398。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供：使用固相载体的cDNA等核酸的扩增方法，该扩增方法由极微量细胞样品也能够以高效且网罗性地扩增mRNA。
用于解决课题的手段
在临床现场可行的方法是：由外周血中的CD8+ T细胞的TCR组库讨论CD8+ TIL的TCR组库应答。很遗憾，本申请发明人研究的结果还判明了：仅通过分析外周血CD8+ T细胞，无法得到反映肿瘤免疫应答的信息。因此，在临床现场可适用的手段取决于以下方面：能否在无需分离TIL的情况下分析CD8+ TIL的组库变动。换言之，如果显示通过直接分析组织活检样本本身、即无需分离TIL而供于分析即可得到足够的肿瘤免疫应答的信息，则即使是少量的组织，也可得到珍贵的信息。在临床方面，其信息对确定治疗方针较为重要。另外，作为使用固相载体的代表性的SCT分析平台，有BD Rhapsody系统，但1次分析所需的费用极高，以实际费用计达数十万元。在以这样的贵重样品为对象的情况下，以高水平保持灵敏度和稳健性两者在广泛进行临床应用上较为重要。很遗憾，本申请发明人研究的结果判明：使用珠粒载体的以往的扩增法对试剂批次的不同或实验者的手法差异等具有脆弱性。
本申请发明人深入研究的结果发现了：在针对固相载体上合成的cDNA的核苷酸同聚物添加反应中，通过采用基于链终止核苷酸三磷酸的链终止反应，不受固相上的DNA底物与酶的量比过高、反应时间过长、以及试剂批次差异的影响，可稳定且高效地扩增微量cDNA。还发现了：本方法通过并用核酸外切酶I处理，可实现副产物量的大幅减少和cDNA扩增效率的增大。进一步发现了：即使包含来自寡DNA标记抗体等寡DNA标记的较cDNA短但却较长的DNA产物，本方法也可将来自未反应引物的副产物、来自这些寡DNA标记抗体的扩增产物和cDNA扩增产物根据它们的链长度的不同明确地分离，从而完成了本申请发明。
即，本发明为使用固相载体的核酸扩增法，其包括：将包含mRNA的靶核酸捕捉到珠粒等固相载体上以在固相上进行互补链合成，降解去除固相上的未反应的靶捕捉用核酸，之后进行mRNA降解和在链终止核苷酸三磷酸存在下的基于TdT反应的同聚物添加，包含以下的方案。
(1) 使用固相载体的核酸扩增方法，包括以下步骤：
靶核酸捕捉步骤，经由固相载体上所结合的靶捕捉用核酸，将包含mRNA的靶核酸捕捉到固相载体上；
互补链合成步骤，由捕捉到固相载体上的靶核酸合成包含cDNA的与靶核酸互补的DNA链；
核酸外切酶处理步骤，通过核酸外切酶处理降解去除未捕捉靶核酸的固相载体上的靶捕捉用核酸；
mRNA降解步骤，利用RNA降解酶来降解mRNA；
同聚物添加步骤，在dATP、dTTP、dCTP或dGTP和链终止核苷酸三磷酸的存在下进行基于末端脱氧核苷酸转移酶的反应，在上述互补的DNA链的末端添加核苷酸同聚物；
第2链合成步骤，使用包含与上述核苷酸同聚物互补的同聚物部分的第2链合成用引物，对固相上所结合的上述互补的DNA链进行第2链合成；以及
核酸扩增步骤，以在固相载体上合成的双链DNA为模板进行核酸扩增反应。
(2) (1)所述的方法，其中，链终止核苷酸三磷酸为ddNTP、ddNTP的衍生物、3’-dNTP、或3’-脱氧-5-甲基尿苷-5’-三磷酸。
(3) (2)所述的方法，其中，ddNTP的衍生物为3’位用不具有OH基的原子团修饰而得的ddNTP。
(4) (1)所述的方法，其中，链终止核苷酸三磷酸为ddNTP。
(5) (1)～(4)中任一项所述的方法，其中，mRNA降解步骤和同聚物添加步骤同时进行实施。
(6) (1)～(5)中任一项所述的方法，其中，在同聚物添加步骤中，进行polyC添加或polyG添加。
(7) (1)～(6)中任一项所述的方法，其中，靶捕捉用核酸含有包含polyT部分的核酸。
(8) (7)所述的方法，其中，靶捕捉用核酸在polyT部分的5’侧包含第1接头(adapter)部分。
(9) (8)所述的方法，其中，固相载体为珠粒，靶捕捉用核酸在第1接头部分与polyT部分之间包含珠粒识别条形码部分。
(10) (8)所述的方法，其中，固相载体为板，靶捕捉用核酸被固定在板的多处的分区上，在第1接头部分与polyT部分之间包含分区识别条形码部分。
(11) (1)～(10)中任一项所述的方法，其中，第2链合成用引物在互补的同聚物部分的5’侧含有包含第2接头部分的引物。
(12) (11)所述的方法，其中，第2链合成用引物在第2接头部分与互补的同聚物部分之间包含分子条形码部分。
(13) (8)～(12)中任一项所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使用以第1接头部分为靶的引物和以第2接头部分为靶的引物，进行核酸扩增反应。
(14) (13)所述的方法，其中，固相载体为珠粒，靶核酸捕捉步骤在微小孔或微小液滴中进行实施。
(15) (11)或(12)所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使用以cDNA中的所期望的区域为靶的引物和以第2接头部分为靶的引物，进行核酸扩增反应。
(16) (1)～(15)中任一项所述的方法，其中，靶核酸包含mRNA和与特异结合分子结合的寡核酸，靶捕捉用核酸含有：包含用于捕捉mRNA的mRNA捕捉序列的核酸、和包含用于捕捉上述寡核酸的寡核酸捕捉区的核酸，上述寡核酸包含与寡核酸捕捉区互补的序列的被捕捉区，在互补链合成步骤中，进行由mRNA通过逆转录反应合成cDNA和由上述寡核酸合成互补链。
(17) (16)所述的方法，其中，上述被捕捉区为polyA，靶捕捉用核酸含有包含polyT部分的核酸作为包含mRNA捕捉区的核酸和包含寡核酸捕捉区的核酸。
(18) (16)或(17)所述的方法，其中，特异结合分子是直接或经由特异结合伙伴分子(partner molecule，配偶体分子)间接地与细胞表面分子结合的至少1种分子。
(19) (18)所述的方法，其中，特异结合分子为针对细胞表面分子的至少1种抗体或抗体片段。
(20) (18)所述的方法，其中，特异结合分子为亲和素类，特异结合伙伴分子为生物素类。
(21) (16)～(20)中任一项所述的方法，该方法包括：在靶核酸捕捉步骤之前，使包含细胞的样品与用上述寡核酸标记的特异结合分子接触，从而使该特异结合分子直接或间接地与细胞表面结合的步骤；以及溶解细胞的步骤。
(22) (16)～(21)中任一项所述的方法，其中，上述寡核酸在被捕捉区的5’侧包含通用序列，靶捕捉用核酸在polyT部分的5’侧包含第1接头部分。
(23) (22)所述的方法，其中，上述寡核酸在通用序列与被捕捉区之间包含特异结合分子识别条形码部分。
(24) (22)或(23)所述的方法，其中，第2链合成用引物在互补的同聚物部分的5’侧含有包含第2接头部分的引物和包含上述通用序列的引物。
(25) (24)所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使用以第1接头部分为靶的引物、以第2接头部分为靶的引物和包含通用序列的引物，进行核酸扩增反应。
(26) (24)所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使用以cDNA中的所期望的区域为靶的引物、以第1接头部分为靶的引物、以第2接头部分为靶的引物和包含通用序列的引物，进行核酸扩增反应。
发明效果
本发明的扩增法中，在针对在固相载体上合成的cDNA的核苷酸同聚物添加反应中，采用基于ddNTP等链终止核苷酸三磷酸的链终止反应。由此，不受固相上酶与DNA底物的量比过高、反应时间过长、试剂批次差异的影响，由微量的样品即可稳定且高效地扩增cDNA。
在现有技术中，受到实验者的熟练度的差异(若熟练度低，则产生实验操作的时滞，容易导致反应时间过长)或试剂批次的不同等的影响，难以保持灵敏度和稳健性两者均为高水平，但根据本发明的方法，即使是单个细胞或以肿瘤活检样本为首的不易处理的微量样品，也不会受到实验者的熟练度或试剂批次的不同等的影响，可稳健且以高灵敏度网罗mRNA而扩增cDNA。
由于可降低实验者的熟练度或自动化所需的成本，所以也可降低普及的难度。
神原等人(专利文献3、非专利文献6)的方法虽然是可使用磁珠以高灵敏度扩增cDNA的方法，但需要严格控制基于TdT的同聚物添加反应的参数(磁珠上的DNA底物与酶的量比、反应时间、温度等)。由于核酸外切酶I处理改变了固相上的DNA底物与TdT酶的量比，所以在神原等人的扩增法中存在无法利用核酸外切酶I进行未反应引物的去除的问题。另一方面，在利用了基于链终止核苷酸三磷酸的链终止反应的本发明的方法中，无需严格控制基于TdT的同聚物添加反应的参数，因此可利用核酸外切酶I去除未反应引物。
根据本发明的扩增法，即使样本为微量，也可进行表达分析或TCR分析，因此例如可大幅地提高利用了表达分析或TCR分析的治疗效果判定的精度，可有助于抑制医疗资源的浪费等。
开发了使用经寡DNA标签标记的抗体来同时进行各单个细胞蛋白质组分析和各单个细胞转录组分析的技术，虽然具有各种应用可能性，但在以往的TdT法中难以分离来自寡DNA标签的扩增产物和cDNA扩增产物，因此并用DNA标记抗体的分析技术的应用自由度低。相对于此，在本发明的扩增法中，可明确地分离来自寡DNA标签的DNA扩增产物和来自mRNA的cDNA扩增产物(参照实施例、图13)，因此根据本发明可扩大同时进行使用DNA标记抗体等用寡核酸标记的特异结合分子的分析和转录物的分析的技术的应用范围。
在本发明的扩增法中，通过并用针对多个蛋白的寡核酸标记抗体，可同时以高灵敏度实施各单个细胞的蛋白与mRNA的表达分析。另外，通过并用针对在分析对象的细胞中稳定表达的细胞表面分子的寡核酸标记抗体、或可非特异性地标记细胞表面分子整体的用寡核酸标记的特异结合分子及其伙伴分子，可进行多个样品的同时分析(多重分析)，因此可与同时分析的样品数成比例地削减cDNA文库制作所需的费用。
附图说明
[图1] 是由珠粒固相载体扩增总cDNA的方法的概略(在SCT分析中应用的一例)。
[图2] 是由珠粒固相载体扩增TCR cDNA的方法的概略(在TCR组库分析中应用的一例)。
[图3] 是Nx1-seq中的未使用ddNTP/核酸外切酶I的情况下、基于TdT法/SMART法的总cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的结果。虽然TdT法与SMART法相比扩增cDNA的收量多，但观察到还生成了DNA尺寸小的副产物。
[图4] 在未使用ddNTP的情况下、核酸外切酶I处理对TdT法的副产物生成的影响。即使实施核酸外切酶I的处置，也没有观察到来自尺寸小的游离引物的副产物的量的减少。另外，观察到副产物的链长度通过核酸外切酶I处理而伸长。
[图5] ddATP的添加对TdT法的副产物生成的抑制。通过添加一定量的ddATP，来自游离引物的副产物的过度伸长得到抑制。
[图6] ddATP/ddCTP的添加对TdT法的副产物生成的抑制。通过在TdT反应中添加一定量的ddATP和ddCTP两者，使来自游离引物的副产物的过度伸长得到抑制。另外，ddCTP使来自短链长度的游离引物的副产物的长度抑制在更短的水平。
[图7] ddCTP的添加对TdT法的副产物生成的抑制效果中的反应时间的影响。在未添加ddCTP的情况下，通过将反应时间从5分钟延长至30分钟，来自游离引物的副产物伸长(泳道2和泳道6)，相对于此，通过添加ddCTP，即使反应时间从5分钟延长至30分钟，来自游离引物的副产物的长度也停留在一定的短链长度。判明了：反应时间的长短对副产物伸长的影响通过添加ddCTP而降低。
[图8] 通过添加ddATP/ddCTP来比较TdT法的cDNA扩增模式、以及RNase If、第二链合成反应中的多次退火法的影响。若在第2链合成时实施多次退火，则在dATP、dCTP法两者中cDNA收量均增加，而RNase If则有负面影响。可以看出：ddATP法的收量多，而ddCTP法在来自游离引物的副产物的伸长抑制方面更优异。
[图9] ddCTP-TdT法与核酸外切酶I处理的并用效果。通过对ddCTP-TdT法施行核酸外切酶I处理，来自游离引物的副产物大幅减少，也未观察到在未使用ddNTP时所观察到的来自游离引物的副产物的伸长，而且无论各种逆转录反应的条件如何，均观察到扩增cDNA的收量增加。
[图10] 是将基于本发明的方法的由珠粒固相载体进行的总cDNA扩增与作为使用珠粒固相载体的SCT分析平台之一的BD Rhapsody系统并用的情况下的方法的概略。图右显示使用安捷伦生物分析仪对扩增cDNA、序列文库的DNA尺寸分布进行分析而得的结果。
[图11] SCT分析结果与现有的SCT分析方法的性能的比较，该SCT分析结果是将基于本发明的方法的由珠粒固相载体进行的总cDNA扩增与BD Rhapsody系统组合而得的分析结果。在由稳定状态小鼠肺调制的单细胞(single cells)中进行比较(现有平台的数据采用Tabula Muris Consortium的数据)。本发明的总cDNA扩增方法与BD Rhapsody系统的组合在每1个细胞的基因检测灵敏度(与10×Genomics Chromium和Smart-Seq2比较)/每一个相同序列读取的基因检测数(序列读取的利用效率、与Smart-Seq2比较)/掌握各细胞间的基因表达的差异的分辨率(根据总检测基因数和Seurat分析的高变异基因数的多少进行评价、图11中的下图)方面均超过现有方法。
[图12] 通过SCT分析法进行的博莱霉素诱导肺纤维化小鼠模型的经时性分析结果，该SCT分析法是将基于本发明的方法的由珠粒固相载体进行的总cDNA扩增与BDRhapsody系统组合而成的分析法。使用给药后第0、3、7、10天的小鼠肺的数据，利用Seurat软件进行分析。网罗性地鉴定肺的各种细胞群，还鉴定了由各自的细胞群表征的标志物基因。
[图13] 通过SCT分析法进行的来自colon26皮下移植肿瘤小鼠模型的CD45+白细胞的14个样本的多重分析结果，该SCT分析法是将基于本发明的方法的由珠粒固相载体进行的总cDNA扩增与BD Rhapsody系统、DNA标记抗体组合而成的分析法。通过在总cDNA扩增中使用本发明的方法，可明确地分离来自用于识别样品的DNA标记抗体的双链DNA和来自cDNA的双链DNA。进一步观察到：根据来自用于标记的DNA标记抗体的信号(读数)的大小可分离SCT数据中所含的各细胞的来源，并且在各样本中可均等地检测到多个基因。
具体实施方式
本发明中，构成靶捕捉用核酸、与特异结合分子结合的寡核酸(以下，在简称为“寡核酸”的情况下，是指与特异结合分子结合的寡核酸)、引物、接头、核苷酸同聚物等的核苷酸序列(碱基序列)的A、T、G、C不仅包含构成DNA的脱氧核糖核苷酸(DNA的A、T、G、C)，还包括构成RNA的核糖核苷酸(RNA的A、T、G、C)，而且还包括对应的核苷酸类似物(例如，LNA、ENA、PNA等交联化核酸(bridged nucleic acid，桥联核酸)、或Super T (5-羟基丁炔基-2’-脱氧尿苷)、Super G (8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、脱氧肌苷、5-甲基dC、脱氧尿苷、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-dATP等修饰碱基等)。即，在靶捕捉用核酸(例如，polyT部分、第1接头部分、条形码部分、寡核酸捕捉区、和这些以外的部分中的任一部分)、核苷酸同聚物、第2链合成用引物(例如，互补的同聚物部分、第2接头部分、分子条形码部分、和这些以外的中的任一部分)、寡核酸(例如，被捕捉区、通用序列、特异结合分子识别条形码部分、和这些以外的部分中的任一部分)、以及核酸扩增步骤中使用的各引物中，可包含选自核糖核苷酸和核苷酸类似物的1个以上(例如，1～15个左右、1～12个左右、或1～数个左右)的单体。
另外，本发明中，在以某个区域X为靶的引物的情况下，是指与该区域X或其互补链特异性地杂交的引物。以区域X为靶的引物中包含含有与区域X相同的序列或与其互补的序列的引物。区域X中设定的引物的术语也同样，是指与区域X或其互补链特异性地杂交的引物，包含含有与区域X相同的序列或与其互补的序列的引物。
本发明的核酸扩增方法包括：靶核酸捕捉步骤、互补链合成步骤、核酸外切酶处理步骤、mRNA降解步骤、同聚物添加步骤、第2链合成步骤、和核酸扩增步骤。以下，边参照图1和图2边对各步骤进行适当说明。
＜靶核酸捕捉步骤＞
在靶核酸捕捉步骤中，经由固相载体上所结合的靶捕捉用核酸将靶核酸捕捉到固相载体上(图1、图2的步骤1)。靶核酸是包含mRNA的核酸，可仅以mRNA为靶，也可将mRNA以外的核酸一并作为靶。作为mRNA以外的靶核酸的一例，可列举：与特异结合分子结合的寡核酸。需要说明的是，图1和图2中显示使用珠粒作为固相载体的方案，为方便起见，显示在1个珠粒载体上捕捉有1个分子的mRNA的状况，但实际上在1个珠粒载体上捕捉有多个mRNA分子。在图1的步骤1中，显示以mRNA和寡核酸为靶核酸的情况的方案，这里也是显示在1个珠粒载体上捕捉有1个分子的寡核酸的状况，但实际上在1个珠粒载体上捕捉有多个寡核酸分子。
固相载体可以是珠粒，也可以是载玻片等板。作为使用固相珠粒的单一细胞分析系统，例如已知有：Drop-seq法(非专利文献10、WO 2016/040476 A1)、Nx1-seq法(WO 2015/166768 A1; Hashimoto等人. Scientific Reports 2017 Oct 27; 7(1): 14225. doi:10.1038/s41598-017- 14676-3.)、Seq-孔法(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC 5376227/)、BD Rhapsody系统等。作为使用板作为固相载体的分析方法，例如已知有：使用在载玻片上固相化的寡核酸的空间转录组法(spatical transcriptomics,https://spatialtranscriptomics.com/products/)。本发明的核酸扩增法也可适用于上述的任一种方法。
对珠粒的材质没有特别限定，可采用用于核酸分析试剂盒的核酸捕捉载体或免疫测定试剂盒的固相颗粒载体的各种材质。作为珠粒的材质的例子，可列举：聚苯乙烯、聚丙烯等树脂制珠粒等有机聚合物制珠粒；由硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、硫化镉(CdS)、硒化锌(ZnSe)、氧化锌(ZnO)等半导体材料形成的量子点(半导体纳米颗粒)等半导体制珠粒；金等金属制珠粒、二氧化硅制珠粒等聚合物珠粒等。作为具体例子，可列举：纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、二乙烯基苯交联聚苯乙烯等(参照Merrifield Biochemistry 1964, 3, 1385-1390)、聚丙烯酰胺、胶乳凝胶、聚苯乙烯、葡聚糖、橡胶、硅、塑料、硝酸纤维素、纤维素、天然海绵、硅胶、玻璃、金属塑料、纤维素、交联葡聚糖(例如Sephadex (商品名))和琼脂糖凝胶(Sepharose (商品名))等材质的珠粒。可以是非磁体、磁体的任一种，可优选使用更容易操作的磁珠。
对板的材质也没有特别限定，例如可采用用于微阵列基板的各种材质。作为可使用的材质的代表例，可列举：玻璃，此外也可使用硅、塑料等。在固相载体为板的情况下，靶捕捉用核酸通常被固定在板上的多处的分区上(典型的是，被整列固定成点状)。
对mRNA来源的细胞没有特别限定，例如以来自小鼠个体的细胞、各种培养细胞、来自健康人的细胞、来自癌症患者的细胞、来自各种疾病患者的细胞等各种细胞为对象。来自癌症患者的细胞可以是来自正在接受癌免疫疗法的癌症患者的细胞。来自健康人或患者的细胞可以是由外周血或病变部位(例如肿瘤)采集的细胞。
在将寡核酸与mRNA一同作为靶核酸的情况下，用寡核酸标记的特异结合分子优选为直接或经由特异结合伙伴分子间接地与细胞表面分子结合的至少1种分子。
作为直接与细胞表面分子特异性地结合的特异结合分子的典型例子，可列举：针对细胞表面分子的抗体。抗体只要具有通过抗原抗体反应与作为抗原的细胞表面分子特异性地结合的结合能力即可，也可使用Fab、F(ab’)2、scFv (可变区的单链片段、单链抗体)等抗体片段(抗原结合性片段)。 “针对细胞表面分子的抗体片段”这一术语是指，具有通过抗原抗体反应与作为抗原的细胞表面分子特异性地结合的结合能力的抗体片段。在进行mRNA表达和蛋白表达的同时分析的情况下，只要使用针对所期望的1种或2种以上的蛋白的抗体或抗体片段作为特异结合分子即可。在进行多个样品的同时分析(多重分析)的情况下，只要使用针对在分析对象的细胞中稳定表达的细胞表面分子的抗体或抗体片段作为特异结合分子即可。
作为特异结合分子及其结合伙伴、即特异结合伙伴分子的优选例子，可分别列举：亲和素类和生物素类。具体而言，作为特异结合分子，可优选使用亲和素、链霉亲和素或NeutrAvidin (中性亲和素)等亲和素类，作为特异结合伙伴分子，可优选使用生物素或脱硫生物素等生物素类。在使用经由特异结合伙伴分子间接地与细胞表面分子结合的特异结合分子的情况下，只要用特异结合伙伴分子处理细胞以预先标记细胞表面分子整体，然后与用寡核酸标记的特异结合分子反应即可。例如使用生物素-Sulfo-OSu、生物素-SS-Sulfo-OSu等亲水性生物素标记试剂，在PBS中添加该试剂和细胞，在4℃下培养10-30分钟左右，从而可对存在于细胞表面的细胞表面分子非特异性地进行生物素标记。使用特异结合分子－伙伴分子的间接标记法不受细胞表面分子的表达与否、表达模式等的影响，可非特异性地标记细胞表面分子整体，因此是适合于多重分析的方法。
对细胞表面分子没有特别限定，包含各种的CD分子或主要组织相容性抗原、细胞表面受体等各种细胞表面分子。
寡核酸典型的是单链DNA，链长度通常为数十个碱基～150个碱基左右、例如为60个碱基～100个碱基左右。在该寡核酸的3’侧(不与特异结合分子结合的末端侧)包含用于被靶捕捉用核酸捕捉的被捕捉区。若为方便起见将在靶捕捉用核酸中与被捕捉区杂交的区域称为“寡核酸捕捉区”，则被捕捉区具有与寡核酸捕捉区互补的序列。作为被捕捉区的优选例子，可列举polyA，但并不限于此，可由非polyA的任意序列构成。可优选采用捕捉区的熔解温度较polyA序列高、且没有出现连续5个以上的G或C的序列作为非polyA的任意序列。在寡核酸的5’侧(与特异结合分子结合的末端侧)、即被捕捉区的5’上流侧包含用于设定第2链合成时的引物或核酸扩增步骤中使用的引物的通用序列。在通用序列与被捕捉区之间可包含用于识别特异结合分子的特异结合分子识别条形码。通过利用适合样品数的种类的特异结合分子识别条形码，可识别最终扩增的核酸来自哪一个样品。
作为靶核酸捕捉步骤的实施方案之一，可列举以下方案：由病变部位组织样本或细胞悬浮液等细胞样品调制mRNA样品，使结合有靶捕捉用核酸的固相载体与mRNA样品接触，从而将mRNA捕捉到固相上。关于mRNA样品的调制，可首先由细胞样品提取总RNA，之后进行mRNA的提取，也可由细胞样品直接提取mRNA而不经过总RNA的提取。
作为靶核酸捕捉步骤的另一个实施方案，可列举以下方案：利用使用了固相珠粒的单细胞转录组(SCT)分析平台，在微小孔或微小液滴中由各个单个细胞提取RNA，使其与结合有靶捕捉用核酸的珠粒载体接触，从而在微小孔或微小液滴中将作为靶核酸的mRNA捕捉到珠粒上。微小孔、微小液滴这样的术语中的“微小”一词典型的是指体积为5～100pl左右。作为使用固相珠粒的SCT分析平台的常规方法的一例，可列举：使用具有微小孔的板的Beckton Dickinson公司的BD Rhapsody系统(专利文献4)、Seq-孔系统(非专利文献11)和Nx1-seq系统(WO 2015/166768 A1; Hashimoto等人. Scientific Reports 2017 Oct 27;7(1):14225. doi: 10.1038/s41598-017-14676-3.)、或在微小液滴中捕捉mRNA的Drop-seq法(非专利文献10)，在本发明中可优选利用这些常规方法。
作为核酸捕捉步骤的又一个实施方案，可列举以下方案：使用空间转录组法的平台，在靶捕捉核酸固定板上对组织样品进行透过处理，利用被整列固定在板上的捕捉核酸捕捉由组织标本的各细胞产生的mRNA。
作为靶捕捉用核酸，可优选使用包含polyT部分的核酸。在固相载体上，作为靶捕捉用核酸，除包含polyT部分的核酸以外，不包含polyT部分的核酸也可被追加固相化。在本发明的方法中，作为靶捕捉用核酸，虽然是捕捉mRNA的核酸被固定在固相载体上，但捕捉除mRNA以外的靶核酸的核酸也可一并被固定。例如，如上所述，也可将捕捉寡核酸的核酸作为靶捕捉用核酸进一步被固定在固相载体上。在本发明的扩增方法中并用寡核酸标记特异结合分子的情况下的方案在后面有详述，被固定在固相载体上的用于捕捉mRNA的靶捕捉用核酸与用于捕捉寡核酸的靶捕捉用核酸有时相同也有时不同。
靶捕捉用核酸可在polyT部分的5’侧、即固相载体侧包含第1接头部分。在图1和图2中作为通用1显示的部分是第1接头部分。第1接头部分在核酸扩增步骤中成为设定其中一个引物的区域。
另外，靶捕捉用核酸可在第1接头部分与polyT部分之间包含条形码部分以识别各个固相载体或固相载体上的位置。关于该条形码部分，在固相载体为珠粒的情况下是指珠粒识别条形码，在固相载体为板的情况下是指用于识别被固定在板上的哪个分区的分区识别条形码。在包含这样的条形码部分的方案中，通过核酸扩增步骤扩增的、包含cDNA的核酸中，包含来自识别条形码部分的条形码序列。珠粒识别条形码部分在同一珠粒上是同一序列，每个珠粒具有不同的序列。由此，可将来自被捕捉到同一珠粒上的mRNA的cDNA与来自被捕捉到其他珠粒上的mRNA的cDNA相区别。在SCT分析中，可将来自相同细胞的cDNA与来自其他细胞的cDNA相区别。包含这样的珠粒识别条形码部分的固相化的mRNA捕捉用核酸可按照已知方法调制(例如，参照WO 2015/166768 A1等)。另外，分区识别条形码部分在板上的同一分区(点)内是同一序列，每个分区(点)具有不同的序列。由此，例如在样品为组织标本的情况下，可掌握在组织的哪个部位表达了怎样的mRNA。
＜互补链合成步骤＞
在互补链合成步骤中，由捕捉到固相载体上的靶核酸合成与其互补的DNA链。在靶核酸为mRNA的情况下，通过逆转录反应来合成cDNA。在靶核酸包含mRNA以外的核酸、例如与特异结合分子结合的寡DNA的情况下，在互补链合成步骤中，进行由mRNA逆转录cDNA的反应和使用DNA聚合酶由寡DNA合成互补链的反应。通过该步骤，由捕捉到固相载体上的包含mRNA的靶核酸合成包含cDNA的与靶核酸互补的DNA链。在靶核酸捕捉步骤之后，回收固相载体，在靶核酸被捕捉到固相载体上的状态下进行逆转录反应等(图1和图2的步骤1)。由靶mRNA进行的逆转录反应和由靶DNA进行的互补链合成反应本身可通过常规方法进行。在合成互补链后，洗涤固相载体，进入到下一步骤。
＜核酸外切酶处理步骤＞
在核酸外切酶处理步骤中，通过核酸外切酶处理降解去除未捕捉靶核酸的固相载体上的靶捕捉用核酸(图1和图2的步骤2; 图中的RT引物是指靶捕捉用核酸)。作为特异性地降解单链DNA的普通的核酸外切酶的例子，可列举：核酸外切酶I或核酸外切酶T。在本发明中可使用这样的普通的核酸外切酶的至少1种。在核酸外切酶处理后，洗涤固相载体，进入到下一步骤。
＜mRNA降解步骤＞
在mRNA降解步骤中，利用RNA降解酶来降解固相载体上所结合的mRNA-cDNA杂交物的mRNA (图1、图2的步骤3)。可利用RNase H等普通的RNA降解酶。在RNA的降解后，可洗涤、回收固相载体，之后进入到同聚物添加步骤，也可不经洗涤而直接进入到同聚物添加步骤。如后所述，也可同时进行mRNA降解步骤和同聚物添加步骤。
＜同聚物添加步骤＞
同聚物添加步骤中，在dATP、dTTP、dCTP或dGTP和链终止核苷酸三磷酸(链终止NTP)的存在下利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)进行反应，在固相上所合成的DNA链的末端添加核苷酸同聚物(图1、图2的步骤3; 图中显示polyC的例子)。如该领域所熟知，链终止NTP (链终止ATP、链终止TTP、链终止CTP或链终止GTP)是指核苷酸的3’位的OH基被修饰或改变成在与其他核苷酸分子的5’-磷酸部分之间不能形成磷酸酯键的核苷酸，也可称为不具有3’位的OH基(在与3’位结合的原子团中不含OH基)的核苷酸三磷酸。作为本发明中也可使用的普通的链终止NTP的具体例子，可列举：二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP) (ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP、ddUTP)、ddNTP的衍生物(典型的是3’位用不具有OH基的原子团修饰而得的ddNTP，例如3’-叠氮基-ddATP、3’-叠氮基-ddCTP、3’-叠氮基-ddGTP、3’-叠氮基-ddTTP、3’-叠氮基-ddUTP、3’-氨基-ddATP、3’-氨基-ddCTP、3’-氨基-ddGTP、3’-氨基-ddTTP等3’位用叠氮基或氨基修饰的ddNTP)、3’-脱氧核苷酸三磷酸(3’-dNTP) (3’-dATP、3’-dCTP、3’-dGTP、3’-dTTP、3’-dUTP)、3’-脱氧-5-甲基尿苷-5’-三磷酸，例如可以是ddNTP、或3’位用叠氮基修饰的ddNTP、特别是ddNTP，但不限于这些。使用的链终止NTP和形成同聚物的底物(dNTP)，希望使两者的碱基链一致。从特别希望抑制第2链合成反应所需的最低同聚物长度、第2链合成中使用的引物的3’末端同聚物部分的必需长度、来自游离引物的副产物的链长度的角度考虑，例如特别优选利用ddCTP等链终止CTP+dCTP、或ddGTP等链终止GTP+dGTP的组合来进行polyC添加或polyG添加。
关于链终止NTP的添加量，例如在使用ddNTP的情况下，以其与dNTP (dATP、dTTP、dCTP或dGTP)的比率计可以是ddNTP:dNTP =1:10～1:100左右，例如可按1:10～1:80、1:10～1:60、1:10～1:40、1:15～1:80、1:15～1:60或1:15～1:40的比率使用。其他的链终止NTP也可根据该比率来设定使用量。在链终止NTP的不共存下进行TdT反应的情况下，为了控制同聚物的链长度，需要根据酶的批次间活性的不同、或引物或cDNA等底物的量的差异来严格控制反应时间。另一方面，在本发明中，通过在链终止NTP的共存下进行基于TdT的同聚物添加反应，会随机摄入链终止NTP，同聚物伸长反应停止，因此基于TdT的反应时间延长的允许量大幅增加。
基于TdT的同聚物添加反应通常在2价阳离子的存在下进行。作为可使用的2价阳离子，可列举：Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Mg2+等2价金属阳离子，例如可以是Co2+或Mn2+，但不限于这些。
通过添加链终止NTP，基于TdT的反应时间延长的允许量大幅增加，因此可在TdT反应液中添加RNase H以同时进行mRNA降解反应和同聚物添加反应。因此，在本发明的1个方案中，mRNA降解步骤和同聚物添加步骤同时进行实施。
＜第2链合成步骤＞
在同聚物添加反应后，洗涤固相载体，进入到第2链合成步骤。在第2链合成步骤中，对于固相载体上所结合的互补的DNA链，使用第2链合成用引物进行第2链合成(图1、图2的步骤4)，该第2链合成用引物含有：包含与在包含cDNA的互补的DNA链的末端添加的核苷酸同聚物互补的同聚物部分的引物。在除mRNA以外还以与特异结合分子结合的寡核酸为靶核酸的情况下，第2链合成用引物可含有：上述的包含互补的同聚物部分的引物、和包含寡核酸中的部分区域(后述的通用序列)的引物。
互补的同聚物部分存在于第2链合成用引物的3’末端侧。关于互补的同聚物部分的链长度，在互补的DNA链中添加的同聚物尾是polyC或polyG的情况下，通常为6～20个碱基左右、例如6～13个碱基左右、7～15个碱基左右、或7～11个碱基左右，在同聚物尾是polyA或polyT的情况下，通常为15～30个碱基左右、例如18～25个碱基左右。另外，互补的同聚物部分在其3’末端可添加1～2个碱基左右的锚定序列。通过添加锚定序列，可提高第2链合成用引物在通过TdT添加在cDNA上的同聚物尾的起始点退火的概率。关于锚定序列，在互补的同聚物部分为polyG的情况下可使用H或HN (H=A、T或C；N=任何碱基(A、T、C或G))，在为polyC的情况下可使用D或DN (D=A、T或G；N=任何碱基(A、T、C或G))，在为polyA的情况下可使用B或BN (B=T、G或C；N=任何碱基(A、T、C或G))，在为polyT的情况下可使用V或VN (V=A、G或C；N=任何碱基(A、T、C或G))。
在第2链合成步骤中，可通过热循环反应来多次实施第2链合成用引物的退火/伸长步骤。另外，在通过1次循环实施第2链合成后，可使用Bst DNA聚合酶等具有链置换活性的聚合酶实施后续反应。通过这样的处理，可提高第2链合成效率。
第2链合成用引物可在互补的同聚物部分的5’侧包含第2接头部分。图1的步骤4中以通用2表示的部分、图2的步骤4中以trP1表示的部分均为第2接头部分。第2接头部分在核酸扩增步骤中成为设定其中一个引物的区域。
第2链合成用引物可在第2接头部分与互补的同聚物部分之间包含分子条形码部分。该方案的第2链合成用引物具有从5’侧起以[第2接头]-[分子条形码]-[互补的同聚物]的顺序连接各部分而得的结构。分子条形码具有随机的核苷酸序列，通过之后的核酸扩增步骤扩增的DNA分子如果是来自同一双链cDNA的DNA，则具有同一分子条形码，如果是来自另一双链cDNA的DNA，则彼此具有不同的分子条形码。通过仅计数具有不同的分子条形码的DNA，可推断初始时的cDNA分子数、或补正不同的cDNA间的PCR扩增效率的差异。对分子条形码的链长度没有特别限定，典型的是12个碱基～30个碱基左右。由于分子条形码对序列错误具有耐性，所以可形成在随机核苷酸序列中插入有特定的固定序列的构成。
＜核酸扩增步骤＞
在第2链合成后，洗涤固相载体、或者不经洗涤而进入到核酸扩增步骤。在核酸扩增步骤中，以在固相载体上合成的双链DNA为模板进行核酸扩增反应(图1、图2的步骤5、步骤6)。在该核酸扩增反应中要求高度的准确性，因此希望使用通常作为高精度PCR酶而已知的聚合酶。有各种高精度PCR酶在出售。在本步骤中，不洗涤固相载体而追加添加核酸扩增反应液，从而可直接实施核酸扩增反应。
在采用第1接头和第2接头的方案中，可使用在这些接头中设定的引物组(引物对)来进行PCR。在SCT分析的情况下(图1)，由于是网罗地逆转录在各细胞中表达的mRNA进行扩增，所以通常是利用以第1和第2接头为靶的引物组来进行总cDNA扩增。这种情况下的引物组典型的是由第1接头序列构成的引物与由第2接头序列构成的引物的组，但在5’侧可包含任意的添加序列或基于生物素等的修饰。在图1所示的例子中，进行2次使用由第1接头序列构成的引物(通用引物1)和由第2接头序列构成的引物(通用引物2)的PCR，但这只是在SCT分析中利用本发明的核酸扩增方法的情况的一例，用于SCT分析的方案并不限于这一例。
在除mRNA以外还以与特异结合分子结合的寡核酸为靶核酸的情况下，除以第1接头为靶的引物和以第2接头为靶的引物之外，还使用包含寡核酸中的部分区域(后述的通用序列)的引物，来同时扩增cDNA和寡核酸。所得的扩增产物可使用磁珠等进行尺寸分级，分离所扩增的cDNA和寡核酸，在第2次的PCR中各自独立地进行扩增。
在TCR组库分析中的TCR可变区文库的调制中实施本发明的情况下(图2)，在固相载体上合成的cDNA分子中，只要扩增编码TCR可变区的cDNA区即可。因此，在这种情况下的核酸扩增步骤中，可使用以TCR恒定区为靶的引物代替以第1接头为靶的引物。不过，与图1同样，在使用以第1接头和第2接头为靶的引物组来进行总cDNA扩增后，可以以总cDNA扩增产物为模板，使用以TCR恒定区为靶的引物和以第2接头为靶的引物来扩增TCR可变区cDNA。
以下，作为本发明的核酸扩增方法的应用例，对SCT分析中的应用例、TCR组库分析中的应用例、以及与使用了寡核酸标记特异结合分子的分析的并用例进行说明。不过，本发明的核酸扩增方法的应用并不限于在这些分析方法中的应用，还可用于包含由珠粒或板等固相载体扩增cDNA的步骤的各种技术。
＜SCT分析中的应用例(图1)＞
根据图1对在SCT分析中应用本发明的核酸扩增方法的情况的一例进行说明。不过，SCT分析中的应用例并不限于这一例。
步骤1～步骤4只要按照上述的靶核酸捕捉步骤～第2链合成步骤进行即可。第2链合成用引物在第2接头部分与互补的同聚物部分之间可以不包含分子条形码部分。
核酸扩增步骤可作为2次扩增反应(第1 PCR、第2 PCR)来实施。均使用以第1接头为靶的引物和以第2接头为靶的引物。第1 PCR (图1的步骤5)为多个循环的PCR，进行第1PCR的扩增产物的尺寸选择和纯化。然后，进行第2 PCR，进一步扩增总cDNA (图1的步骤6)，再次进行尺寸选择和纯化，从而得到总cDNA的扩增产物。为了方便在之后的步骤中回收序列分析对象的片段，在第2 PCR中可使用在两引物的5’末端结合有生物素或胺等间隔物的引物。
对所得的总cDNA的扩增产物进行片段化、末端修复、A-加尾、序列用接头的添加等加工，以将其供于下一代测序仪的测序。通过这些加工，得到了加工成序列用构建体的cDNA的文库。作为片段化手段，可使用超声波或酶。序列用构建体的制作可使用常用的试剂，作为酶法的代表性方法，可使用New England Biolabs公司的NEBNext UltraII FS试剂盒、或KAPA Biosystems公司的KAPA HyperPlus试剂盒，作为超声波片段化装置，可使用Covaris或Bioruptor等仪器，也可使用其他的同等品。序列用接头只要使用适合于所使用的下一代测序仪的适当的接头即可。
文库的测序可使用通常被称作下一代测序仪的测序仪来实施。作为可优选使用的下一代测序仪的具体例子，可列举：Illumina公司的Novaseq 6000系统、Hiseq系统、Nextseq系统、MiSeq系统、Thermo Fisher Scientific公司的Ion Proton系统、该公司的Ion S5/Ion S5 XL系统等。
＜TCR组库分析中的应用例(图2)＞
根据图2对在TCR组库分析中应用本发明的核酸扩增方法的情况的一例进行说明。不过，在TCR组库分析中的应用例并不限于这一例。
步骤1～步骤4可按照上述的靶核酸捕捉步骤～第2链合成步骤来进行，但使用适合于序列分析中使用的下一代测序仪的序列用接头(图2、步骤4的trP1)作为第2接头。第2链合成用引物优选使用包含分子条形码部分的引物。
核酸扩增步骤可作为2次扩增反应(第1 PCR、第2 PCR)来实施。在第1 PCR中，使用在TCR恒定区设定的引物(图2、步骤5的TRAc和/或TRBc外部引物)和以第2接头为靶的引物(图2的trP1引物)。在TCR组库分析的分析对象为β链的情况下，可使用以β链恒定区为靶的引物(TRBc外部引物)和以第2接头为靶的引物。在分析对象为α链的情况下，可使用以α链恒定区为靶的引物(TRAc外部引物)代替以β链恒定区为靶的引物。如果混合以β链恒定区为靶的引物和以α链恒定区为靶的引物这两者(TRAc和/或TRBc外部引物)，并与以第2接头为靶的引物成组使用，则可扩增β链可变区和α链可变区两者。
步骤5的第1 PCR可通过巢式PCR (嵌套PCR)来进行。这种情况下，与以第2接头为靶的引物组合的引物在巢式PCR的第1次和第2次中均可设定在恒定区内。需要说明的是，像这样其中一个引物在第1次和第2次PCR中均相同的情况有时称为半巢式PCR。在该步骤中，通过使用设定在接头内的引物和设定在恒定区内的引物的组，可在没有PCR偏差(PCRbias，PCR偏倚)的情况下扩增TCR的cDNA。
在进行第1 PCR的扩增产物的尺寸选择和纯化之后，进行第2 PCR (图2的步骤6)。在第2 PCR中，使用由第2接头序列构成的引物(trP1引物)和以TCR cDNA片段上的恒定区为靶的引物(A-BC-TRC引物)。以TCR恒定区为靶的A-BC-TRC引物在5’末端具有第2序列用接头(lonA)的序列。通过该第2 PCR，可得到由在两末端添加有用于测序的接头的500～600bp左右的尺寸的DNA片段构成的TCR可变区文库。第2 PCR中使用的以TCR恒定区为靶的引物A-BC-TRC引物在第2序列用接头(lonA)的序列与TCR恒定区靶序列之间具有分子条形码序列(BC)。关于分子条形码，对于由相同的样品调制的相同的文库使用同一分子条形码，每个文库使用不同的分子条形码。由此，在使用下一代测序仪进行大量的序列分析后，可识别某个TCR可变区序列是来自哪个文库。
TCR可变区文库的测序可使用通常被称为下一代测序仪的测序仪来实施。作为可优选使用的下一代测序仪的具体例子，可列举：Thermo Fisher Scientific公司的Ion S5/Ion S5 XL系统、Illumina公司的MiSeq系统、Novaseq 6000系统等。
＜与使用了寡核酸标记特异结合分子的分析的并用例(图1)＞
根据图1对将寡核酸标记特异结合分子与本发明的扩增法并用的情形的一例进行说明。图1是将本发明的扩增法用于SCT分析的情况下的例子，但寡核酸标记特异结合分子与本发明的扩增法的并用例并不限于此，也可与TCR组库分析并用，除此以外，还可与包含由珠粒或板等固相载体扩增cDNA的步骤的各种技术并用。
在与寡核酸标记特异结合分子并用的情况下，mRNA和寡核酸成为靶核酸。固定在固相载体上的靶捕捉用核酸含有：包含用于捕捉mRNA的mRNA捕捉区的核酸、和包含用于捕捉上述寡核酸的寡核酸捕捉区的核酸，两者有时相同、或者有时不同。在寡核酸所具有的被捕捉区为polyA的情况下，作为靶捕捉核酸所具有的寡核酸捕捉区，可利用polyT，但这种情况下2种靶核酸均可通过包含polyT部分的1种靶捕捉用核酸来捕捉。在使寡核酸具有非polyA的任意序列作为被捕捉区的情况下，可使用包含与该任意序列互补的序列的寡核酸捕捉区的核酸作为用于捕捉结合有特异结合分子的寡核酸的靶捕捉用核酸，在珠粒载体上固定有包含polyT作为mRNA捕捉区的靶捕捉用核酸和包含与上述任意序列互补的序列作为寡核酸捕捉区的靶捕捉用核酸这2种。
在步骤1的靶核酸捕捉步骤之前实施以下步骤：通过使包含细胞的样品与寡核酸标记特异结合分子接触，使寡核酸标记特异结合分子与细胞表面结合的步骤；以及溶解细胞的步骤。在使用特异结合分子及其伙伴分子的间接标记的情况下，如上所述，只要首先用特异结合伙伴分子(生物素类等)处理细胞，以预先非特异性地标记细胞表面分子整体，然后使包含该细胞的样品与用寡核酸标记的特异结合分子(亲和素类等)接触进行反应即可。即，在间接标记的情况下，只要在进行通过使特异结合伙伴分子与细胞样品接触而使特异结合伙伴分子与细胞表面所存在的细胞表面分子结合的步骤之后，实施使寡核酸标记特异结合分子与细胞表面结合的步骤即可。在与SCT分析并用的情况下，只要将与寡核酸标记特异结合分子反应了的细胞装载到SCT分析的平台上，在微小孔或微小液滴内溶解细胞即可。
在步骤1中，mRNA和寡核酸被捕捉到珠粒载体上，进行通过逆转录反应由mRNA合成cDNA、和利用DNA聚合酶由寡核酸合成互补链。
步骤2只要按照上述的核酸外切酶处理步骤进行即可。
步骤3只要按照上述的mRNA降解步骤和同聚物添加步骤进行即可。在由mRNA逆转录的cDNA和由寡核酸合成的互补的DNA链两者的末端均添加同聚物。通过mRNA降解，珠粒载体上的cDNA成为单链状态，寡核酸在与其互补链形成了双链的状态下被捕捉到珠粒载体上。该双链可在同聚物添加反应前进行热变性而使结合有特异结合分子的寡核酸链解离，也可在同聚物添加反应后进行热变性而使之解离。
在步骤4中，作为第2链合成用引物，使用在互补的同聚物部分的5’侧包含第2接头部分的引物和包含通用序列的引物。前者是用于针对由mRNA合成的cDNA来合成第2链的引物，后者是用于针对由寡核酸合成的互补链来合成第2链的引物。在与SCT分析并用的情况下，前者的第2链合成用引物在第2接头部分与互补的同聚物部分之间可不包含分子条形码部分，在与TCR组库分析并用的情况下，优选使用包含分子条形码的第2链合成用引物。
在步骤5中，使用以第1接头部分为靶的引物、以第2接头部分为靶的引物和包含通用序列的引物，进行核酸扩增步骤中的第1 PCR。利用以第1接头为靶的引物和以第2接头为靶的引物的组来扩增由mRNA合成的cDNA。利用以第1接头为靶的引物和包含通用序列的引物的组来扩增寡核酸。
或者，在步骤5中可进一步组合以cDNA中的所期望的区域为靶的引物(为方便起见，记作引物X)进行使用。在与TCR组库分析并用的情况下，使用以TCR恒定区为靶的引物作为引物X。利用引物X和以第2接头为靶的引物的组，来扩增TCR可变区，利用以第1接头为靶的引物和包含通用序列的引物的组，来扩增由寡核酸合成的互补链。
使用磁珠等对通过第1 PCR得到的扩增产物进行尺寸分级，分离所扩增的cDNA和寡核酸，在步骤6的第2 PCR中分别独立地扩增cDNA和寡核酸。
实施例
以下，根据实施例更具体地说明本发明。不过，本发明并不受下述实施例的限定。
1. SMART法与现有的TdT法的比较(图3)
采用SMART法和现有的TdT法扩增利用Nx1-seq法(WO 2015/166768 A1;Hashimoto等人. Scientific Reports 2017 Oct 27; 7(1): 14225. doi: 10.1038/s41598-017-14676-3.)调制的、被捕捉到固相珠粒上的单细胞转录组文库(没有使用ddNTP以及核酸外切酶I)。所用引物的序列见下述表1。
在上述文库的调制中使用下述微孔板：将作为靶捕捉用核酸的具有通用接头部分、珠粒识别条形码部分和polyT部分的核酸(LibA-BC-接头(linker)-UMI-dT27VN)在无磁性珠粒上固相化，将这些珠粒一个个地填充在孔中而得的微孔板。装载来自小鼠肺单细胞悬浮液的细胞使各孔的大部分包含1个或0个细胞，以来自上述各细胞的mRNA分子为靶核酸，将其捕捉到1个珠粒上，使用所得珠粒作为单细胞转录组文库。
SMART法如下：按照非专利文献4所述的方法调制逆转录反应液(含有SuperscriptII逆转录酶、Betain、第1链缓冲液、RNase抑制剂、MgCl2、Biosg-LibB-TSO引物)，将上述的mRNA捕捉珠粒进行逆转录，进行cDNA的双链化，通过使用了添加在cDNA的两侧的针对LibB/LibA序列的引物(Biosg-LibA-引物、Biosg-LibB-引物)的PCR来扩增总cDNA。
现有的TdT法如下：使用Superscript IV进行逆转录，使用RNaseH降解mRNA，洗涤珠粒后，使用dATP和CoCl2来实施50秒的TdT反应。使用EDTA立即终止反应，通过热使TdT失活，洗涤珠粒后，使用LibB-dT25VN-引物通过1次退火进行第2链合成反应。洗涤珠粒后，与SMART法同样通过使用了添加在cDNA的两侧的针对LibB/LibA序列的引物(Biosg-LibA-引物、Biosg-LibB-引物)的PCR来扩增总cDNA。
结果见图3。与SMART法相比，现有的TdT法得到了更多的cDNA，但另一方面观察到在尺寸小的区域混入了来自mRNA捕捉用核酸的副产物。
[表1]
Figure DEST_PATH_IMAGE002
2. 核酸外切酶I处理对TdT法的影响(图4)
对Nx1-seq法中使用的固相珠粒没有进行mRNA捕捉/cDNA合成，而是用核酸外切酶I处置，进行TdT反应，比较了副产物的生成图。尽管进行了核酸外切酶I处理，也未观察到副产物的量减少，观察到其长度反而变长(图4)。
3. ddNTP对TdT法中的副产物生成的影响(图5、6、7)
将作为靶(mRNA)捕捉用核酸的BioEcoP-dT25-接头在Dynabeads M270链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)上固相化。使用该珠粒验证在TdT反应中ddNTP对副产物生成的抑制效果。在第2链合成中使用5’WTA-dT25引物或5’WTA-dG9引物，cDNA扩增使用5’WTA引物/3’WTA引物来实施。在TdT反应中使用dATP的情况下(polyA尾添加)以ddNTP：dNTP=1:20～1:100的比率添加ddATP，而在使用dCTP的情况下(polyC尾添加)以上述相同的比率添加ddCTP，实施20分钟的TdT反应(添加比率记录在图中)。即使TdT反应时间过长，在ddATP、ddCTP中也均观察到副产物的伸长被完全抑制(图5、6)。另外，在使用ddCTP的情况下比较TdT反应进行5分钟和30分钟的情况时，观察到ddCTP未添加组在反应时间为5分钟的时间点生成了超过1kbp的来自引物的副产物，其长度在30分钟时进一步扩大，相对于此，ddCTP添加组在反应时间5分钟和30分钟时来自引物的副产物的长度均停留在100bp附近，没有观察到显著的伸长(图7)。而且，Co2+添加组较Mg2+添加组更高效地合成第二链，观察到这些副产物通过Exo I处理几乎完全消失(图7、泳道10)。
若来自引物的副产物过度伸长，则其尺寸与靶cDNA扩增产物接近，因此难以分离副产物和cDNA扩增产物，其结果，产生cDNA扩增受到阻碍的问题。如本实验中所判明：通过添加ddNTP进行TdT反应，即使在因酶的批次不同或实验者的手法不同等而过度地实施TdT反应的情况下，也不会引起来自引物的副产物的过度伸长，因此可防止已伸长的副产物对cDNA扩增的阻碍。
[表2]
Figure DEST_PATH_IMAGE004
4. ddNTP法对cDNA扩增和第2链合成反应中的多次退火的影响(图8)
使用固相化有上述3.中制作的靶捕捉用核酸的珠粒，捕捉作为靶核酸的mRNA并进行逆转录，通过ddNTP-TdT法(在ddNTP共存下进行TdT反应的方法)扩增cDNA。作为ddNTP法，进行了添加polyA尾的ddATP法和添加polyC尾的ddCTP法。在第2链合成反应时，通过多次进行引物退火反应，发现了在ddATP法、ddCTP法中cDNA的收量均增加。另一方面，在ddATP法的情况下，观察到虽然微量但生成了尺寸小的来自mRNA捕捉用核酸的副产物。由此确认到：为了在保持高收量的同时稳健地扩增cDNA，ddCTP法比ddATP法优异。另一方面，在反应系统中添加作为单链RNA降解酶的RNase If，仅轻微地观察到使cDNA量减少的影响。
5. 基于ddCTP法的cDNA扩增和核酸外切酶I的并用效果(图9)
使用固相化有上述3.中制作的靶捕捉用核酸的珠粒，捕捉作为靶核酸的mRNA，在各种条件下进行逆转录。将逆转录后的珠粒平分成两份，其中一份供于核酸外切酶I处理。之后，通过ddCTP-TdT法扩增总cDNA。其结果发现了：通过核酸外切酶I处理，来自靶捕捉用核酸的副产物减少，同时cDNA收量也增加2-4倍左右。
6. 将本发明适用于使用了固相磁珠的单细胞转录组分析平台的情况下的效果
基于本发明的方法的在珠粒上固相化的cDNA的稳健、高灵敏度的扩增法可广泛适用于：使用固相珠粒的概括性的单细胞RNA-seq法、例如Drop-seq法(非专利文献10、WO2016/040476 A1)、Nx1-seq法(WO 2015/166768 A1; Hashimoto等人. ScientificReports 2017 Oct 27; 7(1): 14225. doi: 10.1038/s41598-017-14676-3.)、Seq-孔法(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5376227/)、BD Rhapsody系统等、或使用载玻片上的固相寡核酸作为除珠粒以外的固相载体的空间转录组法(spaticaltranscriptomics公司, https://spatialtranscriptomics.com/products/)等不论平台如何均使用固相载体的系统。为了验证本发明在单细胞转录组分析中的有效性，作为一例，将本扩增法适用于BD Rhapsody系统，实施稳定状态小鼠肺和博莱霉素损伤小鼠肺(给药后第3天、第7天、第10天)的全细胞的单细胞转录组分析。
将8周龄的小鼠肺回流后摘出，用剃刀切细后，使用Liberase TM和DNase I进行酶消化，得到了全肺的单细胞悬浮液。通过使用了Percoll的密度梯度离心去除死细胞/红细胞，使用流式细胞仪计数细胞，按照Rhapsody的操作说明书，在微孔柱筒(microwellcartridge)上以适当的密度装载细胞/珠粒，溶解细胞，分别将来自1个细胞的mRNA捕捉到1个珠粒上(包含Rhapsody通用接头作为mRNA捕捉用核酸) (mRNA捕捉步骤)。按照制造商的推荐，进行逆转录反应(cDNA合成步骤)，之后，通过核酸外切酶I处理去除了珠粒上的未反应的mRNA捕捉用核酸(核酸外切酶处理步骤)。需要说明的是，在珠粒上固相化的Rhapsody通用接头是具有下述结构的DNA，CLS1 (细胞标记选择1)～CLS3采用由9个碱基构成的各96种、总计288种的已知固有序列，构成整体为约90万的珠粒识别条形码部分。在序列表的SEQID NO: 11中，将CLS1～CLS3表示为NNNNNNNNN。
＜Rhapsody通用接头的结构＞
ACACGACGCTCTTCCGATCT-(CLS1)-ACTGGCCTGCGA-(CLS2)-GGTAGCGGTGACA-(CLS3)-NNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO: 11)
核酸外切酶I处理后，使用半量的珠粒(约3000-4000个细胞)，按照本发明的扩增法扩增总cDNA。在反应液中添加RNase H和TdT，同时进行mRNA降解步骤和同聚物添加步骤。在同聚物添加步骤中，在含有Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、磷酸钾、MgSO4、CoCl2、TritonX-100、甘油的反应液中，以ddCTP：dCTP=1:20～1:40的量使用ddCTP，进行TdT反应，从而以长度受限的形式在磁珠上的cDNA末端添加了polyC尾。洗涤珠粒后，使用LibA-dG9引物和作为高精度PCR酶的KAPA HiFi Hotstart Readymix实施了第2链合成反应。退火次数为16次。洗涤珠粒后，使用NH2-LibA引物和NH2-通用引物、KAPA HiFi Hotstart Readymix进行了第1 PCR。用0.65倍浓度的AmPure XP珠粒纯化2次后，使用NH2-LibA引物和NH2-通用引物、KAPA HiFiHotstart Readymix进行了第2 PCR。在使用安捷伦生物分析仪确认DNA浓度和尺寸分布时，通过总计17个循环的PCR得到了以1-1.5kb为峰的约1μg的cDNA (图10)。各步骤中使用的引物序列如表3所示。使用NEBNext UltraII FS试剂盒，按照试剂盒的操作指南(protocol)对所得的cDNA进行片段化、接头添加、基于PCR的illumina用序列接头/条形码的添加，构建了序列分析用文库(图10)。使用Illumina用KAPA文库定量试剂盒，对所得文库进行定量，使用安捷伦生物分析仪确认尺寸分布，使用Illumina Novaseq 6000实施了测序。用于制作序列分析用文库的接头/引物序列如表4所示。
[表3]
Figure DEST_PATH_IMAGE006
[表4]
Figure DEST_PATH_IMAGE008
将所得的单细胞转录组数据与通过现有的SCT分析方法(Smart-Seq2法和10×Genomics公司的Chromium系统)得到的稳定状态小鼠肺细胞的分析数据进行比较。现有的分析方法的数据采用了Tabula Muris Consortium的数据。其结果发现了：尽管序列的量为Smart-seq2法的1/10，但BD Rhapsody与本发明的cDNA扩增法的组合在总检测基因数、每1个细胞的检测基因数方面均超过现有的2种方法(图11)。在利用Seurat软件、根据检测到的高变异基因(在每个细胞中都大幅表达变动的基因)数来评价各单细胞转录组数据以何种程度的分辨率捕捉细胞间的基因表达差异时，发现BD Rhapsody与本发明的cDNA扩增法的组合具有超过现有的2种方法的分辨率(图11)。再利用Seurat软件来分析包括博莱霉素损伤小鼠肺的经时性(第0天、第3天、第7天、第10天)数据，从而网罗性地鉴定了肺的各种性质不同的细胞群，也对其细胞群各自特异性地表达的标志物基因进行了鉴定(图12)。由此显示了本发明的扩增法在单细胞转录组分析中的有效性。
7．本发明在并用寡核酸标记抗体的单细胞转录组分析中的效果
作为并用寡核酸标记抗体的单细胞转录组分析的1例，显示来自colon26小鼠皮下移植肿瘤模型的CD45阳性白细胞的分析例。作为寡核酸标记抗体，使用14种不同的用单链DNA标记抗体(抗CD45抗体和抗MHC I类抗体的混合物：商品名Biolegend TotalseqHashtag-A：https://www.biolegend.com/en-us/totalseq)而得的DNA标记抗体。标记DNA是具有下述结构的DNA，条形码部分采用由15个碱基构成的14种已知固有序列。在序列表的SEQ ID NO: 25中，将条形码部分表示为NNNNNNNNNNNNNNN。其是具有polyA作为被捕捉区的DNA，与mRNA同样，可通过具有polyT部分的靶捕捉核酸来捕捉。
＜Biolegend Hashtag Totalseq-A的标记DNA结构＞
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNN-BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA*A*A(SEQ ID NO: 25) *表示硫代磷酸酯键。
从小鼠体内摘出皮下肿瘤，用Liberase TM和DNase I进行酶消化，调制单细胞悬浮液，之后通过磁珠的磁分离(MACS)分取了CD45阳性细胞。将所得的来自不同小鼠的14个样品分别用14种不同的以单链DNA标记的上述DNA标记抗体进行染色，用FACS缓冲液洗涤细胞。使用流式细胞仪计数细胞后，将用抗体标记的细胞以等比率进行混合，使用BDRhapsody系统，按照Rhapsody的操作说明书，在微孔柱筒上以适当的密度装载细胞/珠粒，溶解细胞，将来自各单个细胞的mRNA和与该细胞结合的抗体上所结合的标记单链DNA捕捉到1个珠粒上(包含Rhapsody通用接头作为靶捕捉用核酸) (靶核酸捕捉步骤)。按照制造商的推荐，进行逆转录反应和抗体标记单链DNA的互补链合成(互补链合成步骤)，之后，通过核酸外切酶I处理去除了珠粒上的未反应的靶捕捉用核酸(核酸外切酶处理步骤)。
核酸外切酶处理后，使用半量的珠粒(约9000-10000个细胞)，按照本发明的扩增法扩增了总cDNA。在反应液中添加RNase H和TdT，同时进行了mRNA降解步骤和同聚物添加步骤。在同聚物添加步骤中，在含有Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、磷酸钾、MgSO4、CoCl2、TritonX-100、甘油的反应液中，以ddCTP：dCTP=1:20～1:40的量使用ddCTP，进行TdT反应，从而以长度受限的形式在磁珠上的cDNA末端添加了polyC尾。
洗涤珠粒后，使用5’BDWTA-dG9引物和作为高精度PCR酶的KAPA HiFi HotstartReadymix实施了第2链合成反应。退火次数为16次。
洗涤珠粒后，使用NH2-5’BDWTA引物/NH2-通用引物和Hashtag普通引物、KAPAHiFi Hotstart Readymix进行了第1 PCR。在50μL PCR反应液中添加32.5μL AmPure XP珠粒溶液(珠粒浓度的0.65倍)进行混合，用磁铁回收珠粒，进行洗涤/溶出，从而获取了链长度为400bp以上的cDNA组分。再向上清中添加0.65倍浓度的AmPure XP珠粒溶液(终浓度为1.3倍)，同样进行纯化，从而获取了链长度为150bp～400bp的抗体标记DNA组分。纯化后，对cDNA组分使用NH2-5’BDWTA引物和NH2-通用引物、KAPA HiFi Hotstart Readymix进行了第2 PCR。对抗体标记DNA组分使用Hashtag普通引物和NH2-通用引物、KAPA HiFi HotstartReadymix进行了第2 PCR。
在使用安捷伦生物分析仪确认第2 PCR反应液的DNA浓度和尺寸分布时，cDNA组分得到了以1kbp为中心的不清晰的成片谱带，而且一定链长度的抗体标记DNA组分得到了单峰的DNA (图13)。各步骤中使用的引物序列如表5所示。使用NEBNext UltraII FS试剂盒，按照试剂盒的操作规则，对所得的cDNA进行片段化、接头添加、基于PCR的illumina用序列接头/条形码的添加，构建了序列分析用文库。关于DNA标记抗体，通过PCR进行illumina用序列接头/条形码的添加，构建了序列分析用文库。使用Illumina用KAPA文库定量试剂盒，对所得文库进行定量，使用安捷伦生物分析仪确认尺寸分布，使用Illumina Novaseq 6000实施了测序。用于制作序列分析用文库的接头/引物序列如表6所示。
[表5]
Figure DEST_PATH_IMAGE010
[表6]
Figure DEST_PATH_IMAGE012
在根据来自各细胞的抗体标记DNA的标签计数的多少对所得的单细胞转录组数据实施聚类时，发现了可根据抗体标记DNA的表达量对来自各细胞的样品进行分类，并且所得的各细胞的细胞数几乎一定(图13)。另外，充分检测到2种以上的来自DNA标记抗体的标签的细胞被鉴定为双联体(doublet) (图13)。而且，在将各样品中的各细胞的检测基因数作图时，14个样品几乎均匀地检测到基因，发现了双联体样品的检测基因数比它们多(图13)。由此显示了本发明的扩增法在通过并用DNA标记抗体而对多个样品同时进行单细胞转录组分析中的有效性。
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Claims (26)

1.使用固相载体的核酸扩增方法，该方法包括以下步骤：
靶核酸捕捉步骤，经由固相载体上所结合的靶捕捉用核酸，将包含mRNA的靶核酸捕捉到固相载体上；
互补链合成步骤，由捕捉到固相载体上的靶核酸合成包含cDNA的与靶核酸互补的DNA链；
核酸外切酶处理步骤，通过核酸外切酶处理降解去除未捕捉靶核酸的固相载体上的靶捕捉用核酸；
mRNA降解步骤，利用RNA降解酶来降解mRNA；
同聚物添加步骤，在dATP、dTTP、dCTP或dGTP和链终止核苷酸三磷酸的存在下进行基于末端脱氧核苷酸转移酶的反应，在上述互补的DNA链的末端添加核苷酸同聚物；
第2链合成步骤，使用包含与上述核苷酸同聚物互补的同聚物部分的第2链合成用引物，对固相上所结合的上述互补的DNA链进行第2链合成；以及
核酸扩增步骤，以在固相载体上合成的双链DNA为模板进行核酸扩增反应。
2.权利要求1所述的方法，其中，链终止核苷酸三磷酸为ddNTP、ddNTP的衍生物、3’-dNTP、或3’-脱氧-5-甲基尿苷-5’-三磷酸。
3.权利要求2所述的方法，其中，ddNTP的衍生物为3’位用不具有OH基的原子团修饰而得的ddNTP。
4.权利要求1所述的方法，其中，链终止核苷酸三磷酸为ddNTP。
5.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，mRNA降解步骤和同聚物添加步骤同时进行实施。
6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在同聚物添加步骤中，进行polyC添加或polyG添加。
7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，靶捕捉用核酸含有包含polyT部分的核酸。
8.权利要求7所述的方法，其中，靶捕捉用核酸在polyT部分的5’侧包含第1接头部分。
9.权利要求8所述的方法，其中，固相载体为珠粒，靶捕捉用核酸在第1接头部分与polyT部分之间包含珠粒识别条形码部分。
10.权利要求8所述的方法，其中，固相载体为板，靶捕捉用核酸被固定在板的多处的分区上，在第1接头部分与polyT部分之间包含分区识别条形码部分。
11.权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，第2链合成用引物在互补的同聚物部分的5’侧含有包含第2接头部分的引物。
12.权利要求11所述的方法，其中，第2链合成用引物在第2接头部分与互补的同聚物部分之间包含分子条形码部分。
13.权利要求8～12中任一项所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使用以第1接头部分为靶的引物和以第2接头部分为靶的引物，进行核酸扩增反应。
14.权利要求13所述的方法，其中，固相载体为珠粒，靶核酸捕捉步骤在微小孔或微小液滴中进行实施。
15.权利要求11或12所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使用以cDNA中的所期望的区域为靶的引物和以第2接头部分为靶的引物，进行核酸扩增反应。
16.权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，靶核酸包含mRNA和与特异结合分子结合的寡核酸，靶捕捉用核酸含有：包含用于捕捉mRNA的mRNA捕捉序列的核酸、和包含用于捕捉上述寡核酸的寡核酸捕捉区的核酸，上述寡核酸包含与寡核酸捕捉区互补的序列的被捕捉区，在互补链合成步骤中，进行由mRNA通过逆转录反应合成cDNA和由上述寡核酸合成互补链。
17.权利要求16所述的方法，其中，上述被捕捉区为polyA，靶捕捉用核酸含有包含polyT部分的核酸作为包含mRNA捕捉区的核酸和包含寡核酸捕捉区的核酸。
18.权利要求16或17所述的方法，其中，特异结合分子是直接或经由特异结合伙伴分子间接地与细胞表面分子结合的至少1种分子。
19.权利要求18所述的方法，其中，特异结合分子为针对细胞表面分子的至少1种抗体或抗体片段。
20.权利要求18所述的方法，其中，特异结合分子为亲和素类，特异结合伙伴分子为生物素类。
21.权利要求16～20中任一项所述的方法，该方法包括：在靶核酸捕捉步骤之前，使包含细胞的样品与用上述寡核酸标记的特异结合分子接触，从而使该特异结合分子直接或间接地与细胞表面结合的步骤；以及溶解细胞的步骤。
22.权利要求16～21中任一项所述的方法，其中，上述寡核酸在被捕捉区的5’侧包含通用序列，靶捕捉用核酸在polyT部分的5’侧包含第1接头部分。
23.权利要求22所述的方法，其中，上述寡核酸在通用序列与被捕捉区之间包含特异结合分子识别条形码部分。
24.权利要求22或23所述的方法，其中，第2链合成用引物在互补的同聚物部分的5’侧含有包含第2接头部分的引物和包含上述通用序列的引物。
25.权利要求24所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使用以第1接头部分为靶的引物、以第2接头部分为靶的引物和包含通用序列的引物，进行核酸扩增反应。
26.权利要求24所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使用以cDNA中的所期望的区域为靶的引物、以第1接头部分为靶的引物、以第2接头部分为靶的引物和包含通用序列的引物，进行核酸扩增反应。
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