CN107619430B - 一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于全程热启动Taq酶制备技术领域，公开了一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、用途。该配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对温度≤96℃条件热稳定，在温度≤96℃时，其封闭或开放Taq酶活是可逆的，可在整个PCR循环中全程参与Taq酶的热启动，实现每个循环过程都是在引物与模板处于严谨配对时Taq酶热启动，避免非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高了反应特异性和灵敏度，使得DNA聚合酶链式反应结果杂带少、噪音低，保真性更完善，同时又由于上述配体为短肽结构，与抗体相比较，分子量更小，对PCR干扰小，且不像单链DNA那样容易降解，用其制备的全程热启动Taq酶产品稳定性更好。

Description

一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于热启动Taq酶制备技术领域，具体涉及一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用。

背景技术

热启动Taq酶又称热启动耐高温DNA聚合酶，已越来越多地被用于PCR技术中，特别是多位点基因复合扩增技术中，如在动植物的微卫星基因、人的个体识别或亲子鉴定分析中。这种酶与普通Taq酶相比其最大的特点是：热启动Taq酶的酶活是在反应体系由高温(95℃)降至退火温度的过程中释放恢复的，即在反应体系中引物与模板处于一种严谨性配对结合状态下开始PCR扩增的，所以这种扩增是一种较严谨真实的扩增，杂带少、本底少、噪音低、效率高。

目前，制备热启动Taq酶的方法包括以下几种：石蜡包被法、抗体介导抑制法、化学修饰法、ssDNA链(适配子)结合法和肝素盐法。然而，通过这些方法制备的热启动Taq酶都是PCR开始循环阶段的“一次性热启动”，在石蜡包被法的制备过程中酶易被污染，抗体介导抑制法和肝素盐法因抗体和肝素盐分子量很大会影响PCR扩增过程，ssDNA链(适配子)结合法中单链DNA对热不稳定，因此上述方法制备的热启动Taq酶经过一个PCR循环就被降解贻尽，不稳定，无法全程热启动。再如中国专利文献CN101050453B公开的一种热启动耐高温DNA聚合酶及其制备方法，其通过特定的化学修饰法来可逆地封闭DNA聚合酶的活性，同时该酶在弱碱性条件下(pH＝8-9)经高温(94℃以上)处理一定时间，DNA聚合酶的活性经过解封闭逆转而得到恢复。经过该方法修饰的耐高温DNA聚合酶在DNA聚合酶链式反应过程中，极大地降低了DNA聚合酶在低温时的3’到5’端延伸的酶活性，从而极大地提高了该DNA聚合酶的反应特异性、可靠性、均一性和灵敏度，然而上述的热启动耐高温DNA聚合酶第一个循环为热启动酶，而后续循环就是普通Taq酶，也属于“一次性热启动”，因此使用上述的热启动耐高温DNA聚合酶进行DNA聚合酶链式反应还会存在一定的杂带和噪音，保真性不完善。

鉴于此，如何对现有的热启动Taq酶的制备方法进行改进以获得一种全程热启动Taq酶，这对于本领域的技术人员来说仍然是一个尚未解决的技术难题。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有的热启动耐高温DNA聚合酶进行DNA聚合酶链式反应存在杂带、噪音及保真性不完善的问题，从而提供一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体，所述配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了一种制备上述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体的方法，包括如下步骤：

(1)从噬菌体表面展示肽库中淘选出温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的阳性噬菌体；

(2)扩增步骤(1)中的阳性噬菌体，经消化酶消化后进行过滤，获得含有温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的配体的滤液，加热所述滤液至93-99℃保持110-130min，然后将所述滤液与所述Taq酶混合，从中筛选出在温度≤65℃条件下无Taq酶活性且温度>65℃条件下有Taq酶活性的滤液及其对应的阳性噬菌体；

(3)取步骤(2)中筛选出的所述阳性噬菌体，扩增后经消化酶消化过滤或分析其表面的展示肽亲和配体的序列组成后进行人工合成，获得所述热稳定的Taq酶温控亲和性配体，即得。

优选的是，所述步骤(2)中所述滤液在96℃至少保持120min后仍有活性。

优选的是，在所述步骤(2)中或所述步骤(3)中，所述消化酶为胰蛋白酶。

本发明提供了一种上述热稳定的Taq酶温控亲和性配体或上述方法制备的热稳定的Taq酶温控亲和性配体在制备Taq酶活性的热稳定温控开关中的用途。所述热稳定的Taq酶温控亲和性配体可与Taq酶按比例混合而作为该Taq酶活性的热稳定温控开关，开关转换点温度为65℃，可在整个PCR循环过程中参与Taq酶的热启动。

本发明提供了一种Taq酶活性的热稳定温控开关，包括上述热稳定的Taq酶温控亲和性配体或上述方法制备的热稳定的Taq温控酶亲和性配体。

本发明提供了一种全程热启动Taq酶，包括上述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体、上述的方法制备的热稳定的Taq酶温控亲和性配体或上述的Taq酶活性的热稳定温控开关和Taq酶。

优选的是，将pfu为10⁸-10⁹的噬菌体经消化酶消化过滤后的滤液稀释1000～10000倍后与10μg/μL Taq酶等体积混合。

优选的是，通过人工合成的Taq酶温控亲和性配体与Taq酶按摩尔比为5～50：1混合。

本发明提供了一种试剂盒，包括上述所述的全程热启动Taq酶。

本发明的技术方案，具有如下优点：

1.本发明所述的热稳定性的Taq酶温控亲和性配体，所述配体的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，该配体与Taq酶的结合或解脱过程如图5所示，该配体在温度≤96℃条件下热稳定，当温度≤65℃时，上述配体可与Taq酶结合并封闭酶活，当温度高于65℃而低于96℃时，与Taq酶结合的上述配体解离下来，Taq酶酶活得到恢复，当温度再次≤65℃时，解离下来的上述配体再次与Taq酶结合并封闭酶活，当温度再次高于65℃而低于96℃时，上述配体再次解离并恢复Taq酶酶活，其封闭或开放Taq酶活是一种温变可逆过程，也可被理解为Taq酶活性区的温控开关，开关转换点为65℃，该配体可在整个PCR循环过程中全程参与Taq酶的热启动，实现每个循环过程都是引物与模板处于严谨配对时酶活的热启动，从而避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高了反应特异性和灵敏度，使得DNA聚合酶链式反应结果杂带更少、噪音更低，保真性更完善，同时又由于所述热稳定性的Taq酶温控亲和性配体为短肽结构，与抗体相比较，分子量更小，对PCR干扰更小，且不像单链DNA那样容易降解，所以使用其制备出来的全程热启动Taq酶产品稳定性更好。

2.本发明所述的一种制备所述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体的方法，包括如下步骤：(1)从噬菌体表面展示肽库中淘选出温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的阳性噬菌体；(2)扩增步骤(1)中的阳性噬菌体，经消化酶消化后进行过滤，获得含有温度在≤65℃时与Taq酶具有亲和性的配体的滤液，加热所述滤液至93-99℃保持110-130min，然后将所述滤液与所述Taq酶混合，从中筛选出在温度≤65℃条件下无Taq酶活性且温度>65℃条件下有Taq酶活性的滤液及其对应的阳性噬菌体；(3)取步骤(2)中筛选出的所述阳性噬菌体，扩增后经消化酶消化过滤或分析其表面的展示肽亲和配体的序列组成后进行人工合成，获得所述热稳定的Taq酶温控亲和性配体，即得；在上述方法中，通过噬菌体表面展示肽库中淘选出具有热稳定的Taq酶亲和性且对温度≤96℃下热稳定的表面展示肽及对应的阳性噬菌体，可通过扩增阳性噬菌体并经消化酶消化过滤得到，也可以通过分析阳性噬菌体表面展示肽的序列组成后人工合成，这两种方法均免去了动物免疫、饲养、检测、提取和纯化等一系列繁琐的抗体生产程序，提高了生产的效率并降低了成本。

3.本发明所述的一种全程热启动Taq酶，包括热稳定的Taq酶温控亲和性配体和Taq酶，其在温度≤65℃时被热稳定的Taq酶温控亲和性配体封闭了活性，当温度高于65℃而低于96℃后，Taq酶与温控亲和性配体分开而恢复酶活，在下一个循环中随着温度从96℃降至65℃以下，该亲和性配体又可以与Taq酶结合而封闭酶活性，如此反复，即在30～40个PCR循环过程中每个循环，Taq酶都能保持热启动特性，由此可实现每个循环过程都是引物与模板处于严谨配对时酶活的热启动，从而避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高了反应特异性和灵敏度，保真性趋于完美，杂带更少，噪音更低。

4.用本发明的热稳定的Taq酶温控亲和性胚体制备的全程热启动Taq酶及包含其的试剂盒在进行PCR热启动时，不需要一个单独的高温温育步骤来激活酶，而是像普通Taq酶一样直接进入PCR循环，缩短了反应时间。

5.本发明的全程热启动Taq酶及包含其的试剂盒稳定性好，可广泛应用于分子生物学中的PCR过程，特别适合于个体识别中STR的DNA多位点复合PCR及其产品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的热稳定的Taq酶温控亲和性配体制备的全程热启动Taq酶用于14+1人类STR银染检测试剂盒的扩增效果图；

图2为普通热启动Taq酶用于14+1人类STR银染检测试剂盒的扩增效果图；

图3为本发明的热稳定的Taq酶温控亲和性配体制备的全程热启动Taq酶用于17+1人类STR荧光检测试剂盒的扩增效果图；

图4为普通热启动Taq酶用于17+1人类STR荧光检测试剂盒扩增效果图；

图5为本发明实施例1制备的热稳定的Taq酶温控亲和性配体与Taq酶结合或解脱过程示意图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

下述实施例中：

Ph.D.-7^TM肽库为New England Biolabs公司生产的试剂盒，肽库滴度为4×10¹²PFU/ml，受体菌为大肠杆菌ER2738；

Taq酶来自江西中德生物技术有限公司，普通热启动Taq酶为热启动金牌Taq酶(美国ABI公司产品)；

包被buffer：0.1M NaHCO₃，pH8.6；

预处理孔包被buffer：1L包被buffer加200mg BSA(小牛血清白蛋白Sigma产品)；

TBST：含50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH为7.5，每升加1～5ml的Tween20；

封闭液：1L包被buffer加10g BSA；

TBS：含50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH为7.5；

HRP-Anti-M13：辣根过氧化酶标记的鼠抗M13单克隆抗体(法马西亚产品)，使用时用TBS作1:4000稀释；

胰蛋白酶液：250mg/ml胰蛋白酶(法马西亚产品)溶于0.2mol/L碳酸氢铵中，pH8.9；胰蛋白酶消化buffer为含0.02％(v/v)Tween-20的0.2mol/L碳酸氢铵，pH8.9；

14+1人类STR银染检测试剂盒(江西中德生物技术有限公司)；

17+1人类STR荧光检测试剂盒(江西中德生物工程有限公司)；

酶标仪(北京普朗新技术有限公司的DNM-9602G型)；PCR扩增仪(美国伯乐集团公司的PTC-200型)；电泳仪(北京六一仪器厂)；垂直板电泳槽(珠海黑马公司)；ABI3130XL遗传分析仪(美国ABI公司)；

样品液：取1μL人的全血，用纯水稀释10倍后取2μL加至1mL离心管中，再加5％Chelex-100(SIGMA公司，美国)100μL，及20mg/mL的蛋白酶K(TAKALA公司)4μL,56℃保温30min,高速震荡5～10s,100℃水浴8min，震荡5～10s，13000r/min离心3min，取上清液即可。

实施例1：制备热稳定的Taq酶温控亲和性配体

本实施例所述的一种制备热稳定的Taq酶亲和性配体的方法，包括如下步骤：

1.酶标板的包被及封闭：用包被buffer将Taq酶蛋白的浓度稀释至100μg/mL，并将其作为第一轮淘选用的包被液，第二轮至第四轮淘选用的包被液按照上述方法进行稀释的浓度分别为：50μg/mL、25μg/mL和10μg/mL。酶标板经15W紫外灯间距10cm照射15mim后，将上述制备的包被液按100μL/孔分装至四个孔中，另外用预处理孔包被buffer包被两个预处理孔，置自封袋中，4～8℃孵育过夜，弃包被液，用TBST洗板4次，每次3min，拍干，每孔加入350μL封闭液，37℃封闭60min，弃封闭液，用上述的TBST洗板4次，每次3min，拍干，分别获得第一、二、三、四轮淘选用酶标板，备用；

2.噬菌体展示肽的预结合和亲合：向上述步骤1的第一轮淘选用酶标板上的两个预处理孔中分别加入95μL的TBST和5μL的Ph.D.-7^TM肽库，混匀，室温下与预处理孔中的BSA预结合20min，以除去肽库中与BSA有亲和性的噬菌体展示肽，然后再将该噬菌体展示肽库液均分转移至预先加入50μLTBST的四个包被孔中于37℃，在100rpm下结合60min；

3.噬菌体的洗脱：将上述步骤2的酶标板包被液弃之，用常温TBST洗板10次，洗去未结合及低亲和力的噬菌体，然后在每个包被孔加入0.2M的甘氨酸-盐酸缓冲液(pH为2.2，含1mg/mL的BSA)洗脱液100μL，室温，100rpm维持15min，解离已结合的噬菌体，吸出洗脱液立即加入60μL中和液(1Mtris-HCl pH9)，即得到第一轮淘选所得洗脱物；

4.噬菌体的扩增：上述步骤3得到的淘选所得洗脱物除留下20μL用作滴度测定，其余的都转入20mL的ER2738敏感态菌液中，置37℃于230rpm下扩增4.5小时，将所得扩增液转入离心管中，于4℃，9000rpm离心10min，将得到的上清液转入新离心管，同条件再次离心。收集上清液并向其中加入1/6上清液体积的PEG/NaCl(含20％PEG-8000，2.5M NaCl)，4℃孵育过夜。4℃10000rpm离心15min，弃上清液，沉淀重悬于1mL TBS中，室温下10000rpm离心5min，将得到的上清液加入1/6上清液体积上清液的PEG/NaCl，冰浴60min，4℃下10000rpm离心10min，将得到的沉淀重悬于200μL的TBS 0.02％NaN₃中，室温下10000rpm离心5min，得到的上清液即为第一轮淘选所得洗脱物的扩增物；

5.重复上述步骤2-4：以上一轮淘选所得洗脱物的扩增物为候选噬菌体，再分别用第二、三、四轮淘选用酶标板重复“亲和－淘洗－扩增”过程，通过4轮筛选直至洗脱的噬菌体滴度稳定在一定数量级。铺板，挑取单克隆噬菌斑。其中：后3轮筛选时TBST中的Tween 20浓度增加为0.5％。结果显示第4轮筛选后与第1轮相比，单克隆噬菌斑富集了400倍(富集倍数＝第4轮回收率/第1轮回收率)；

6.噬菌斑的扩增：第四轮噬菌体滴度测定时，在≤100个蓝色噬菌斑(噬菌体单克隆)的平皿上，以无菌牙签随机挑取48个(1个/管)噬菌斑，转入5mL ER2738敏感态菌液中，置37℃230rpm扩增4.5小时，培养物经室温12000rpm离心5min得到上清液即为扩增的单个噬菌体克隆；

7.阳性噬菌体克隆的鉴定：对上述步骤6的单个噬菌体克隆采用ELISA法进行鉴定，即用含Taq酶(10μg/mL)的包被液，按100μL/孔包被酶标板48孔作为检测孔，同时用含质量浓度1％BSA的包被液包被48个空白对照孔，4℃～8℃孵育过夜，经封闭、洗板后，分列48对，将48个单克隆噬菌体(上清液)按100μL/孔分别对应加入48对检测孔和空白对照孔中，37℃孵育2h后用TBST洗板4次，每次3min，加入HRP-Anti-M13稀释液，37℃孵育1h，用TBST洗板4次，立即加入TMB显色剂，37℃避光显色15min，用2M硫酸中止反应后，于450nm读取吸光度值(A₄₅₀)，以(A₄₅₀)值高于空白对照3倍以上作为阳性。结果显示，其中有35个噬菌体克隆显示与Taq酶具有较高亲和性结合能力；

8.阳性噬菌体与Taq酶亲和性的热稳定筛选：用含Taq酶(10μg/mL)的包被液，按100μL/孔包被酶标板，相对于上述步骤7淘选到的35个阳性噬菌体，共需包被两组，每组36个孔，增加了一组热处理，其余操作同步骤7，即：将每个阳性噬菌体(上清液)按100μL/孔分别加至35个孔，留1个空白对照孔中，一组用常温TBST洗板，另一组用65℃的恒温TBST洗板，以筛选出温度≤65℃条件下与Taq酶亲和性稳定的阳性噬菌体，并用65℃ELISA的OD₄₅₀值与常温ELISA的OD₄₅₀值比值的百分数来代表其热稳定性。结果有12个噬菌体的65℃亲和性(OD₄₅₀值)为0.64～0.83。常温亲和性(OD₄₅₀值)为0.82～0.91，热稳定性为0.78％～91.2％；

9.96℃热稳定的Taq酶温控亲和性配体的筛选：对上述步骤8筛到的12个噬菌体进行扩增至pfu＝10¹³，分别取100μL噬菌体加100μL胰蛋白酶液200μL胰蛋白酶消化buffer，37℃酶解4小时，酶解液通过超滤得到12种含有亲和配体肽的滤液，各约350μL。，将12种滤液置于96℃保持120min，再将滤液稀释至1000-10000倍，逐一与10μg/μLTaq酶等体积混合，取其1μL加至已含有引物和模板的PCR预混液49μL中，共做两个平行组，一组65℃保持4小时，另一组进入94℃变性—55℃退火—72℃延伸的常规PCR循环。根据焦磷酸法测定Taq酶活性原理和检测PCR扩增阳性产物原理，从中找出了65℃条件下能封闭Taq酶活性、但在96℃下保持了120min后仍有活性的的2号滤液及其对应的2号阳性噬菌体；

10.获取Taq酶温控亲和性配体：对上述步骤9筛到的2号噬菌体进行扩增至pfu＝10¹³，取10μL噬菌体加10μL胰蛋白酶和和20μL胰蛋白酶消化buffer，37℃酶解4小时，酶解液通过超滤得到含有Taq酶亲和配体肽的滤液，再将滤液稀释至1000-10000倍；

实施例2：Taq酶温控亲和性配体的氨基酸序列的测定

对实施例1淘选到的噬菌体，进行克隆扩增，以碘化钠溶解抽提噬菌体单链DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR检验，再进行DNA测序。根据编码链中噬菌体pⅢ基因的阅读框架推导出与pⅢ蛋白融合的外源多肽的氨基酸序列为H-Thr-Trp-Leu-His-Phe-Pro-His-OH，即所述配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例3：全程热启动Taq酶的制备

将实施例1步骤10的1000倍稀释滤液与10μg/μLTaq酶按等体积混合即成全程热启动Taq酶。

实施例4：全程热启动Taq酶的制备

将实施例1步骤10的10000倍稀释滤液与10μg/μLTaq酶按等体积混合即成全程热启动Taq酶。

实施例5：全程热启动Taq酶的制备

1.根据实施例2中的氨基酸序列人工合成热稳定的Taq酶温控亲和性配体；

2.将合成的热稳定的Taq酶温控亲和性配体七肽定量溶解稀释并与Taq酶按5：1摩尔比混合，即为全程热启动Taq酶。

实施例6：全程热启动Taq酶的制备

1.根据实施例2中的氨基酸序列人工合成热稳定的Taq酶温控亲和性配体；

2.将合成的热稳定的Taq酶温控亲和性配体七肽定量溶解、稀释并与Taq酶按50：1摩尔比混合，即为全程热启动Taq酶。

实施例7：全程热启动Taq酶的试剂盒

本实施例提供了一种全程热启动Taq酶的试剂盒，所述试剂盒包括实施例3-6中任一实施例制备的全程热启动Taq酶。

实验例1

以实施例1制备的热稳定性的Taq酶温控亲和性配体与普通Taq酶按照实施例3的方法制备成全程热启动Taq酶，作为实验组，普通热启动Taq酶做对照组；将实验组和对照组分别用于早期的14+1人类STR银染检测试剂盒，采用如下样品液按照试剂盒中的说明书进行PCR，所述样品液按照如下方法获得：取1μL人的全血，用纯水稀释10倍后取2μL加至1mL离心管中，再加5％Chelex-100(SIGMA公司，美国)100μL，及20mg/m L的蛋白酶K(TAKALA公司)4μL,56℃保温30min，高速震荡5～10s,100℃水浴8min,震荡5～10s，13000r/min离心3min,取上清液1μL作为25μL体系的PCR模板。将所得的PCR反应液进行PAGE胶电泳和银染，检测结果见图1和图2，图1为本发明的全程热启动Taq酶扩增效果图，图2为普通热启动Taq酶扩增效果图。由图1可见，15个STR基因位点分布在5个PCR反应管中进行3基因位点的复合扩增，结果全部得到扩增，而且扩增的DNA条带清晰均一，几乎无杂带。由图2可见，虽然15个STR基因位点也全部得到了扩增，但是存在明显的非特异性杂带，表明采用实施例1制备的热稳定性的Taq酶温控亲和性配体与普通Taq酶制备成的全程热启动Taq酶产品可以全程热启动，实现每个循环过程都是在引物与模板处于严谨配对时酶活的热启动，从而避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高了反应特异性和灵敏度，保真性趋于完美，杂带更少，噪音更低。

实验例2

以实施例2的测定的所述配体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1进行人工合成(由吉尔生化(上海)有限公司合成)的热稳定的Taq酶温控亲和性配体与普通热启动Taq酶按照实施例5的方法制备成全程热启动Taq酶，作为实验组，普通热启动Taq酶做对照组；将实验组和对照组分别用于17+1人类STR荧光检测试剂盒，采用如下样品液按照试剂盒中的说明书进行PCR，所述样品液按照如下方法获得：取1μL人的全血，用纯水稀释10倍后取2μL加至1mL离心管中，再加5％Chelex-100(SIGMA公司，美国)100μL，及20mg/mL的蛋白酶K(TAKALA公司)4μL,56℃保温30min，高速震荡5～10s,100℃水浴8min,震荡5～10s，13000r/min离心3min,取上清液1μL作为25μL体系的PCR模板。将所得的PCR反应液经遗传分析仪进行遗传分析，检测结果见图3和图4，图3为用本发明的热稳定的Taq酶温控亲和性配体制备的全程热启动Taq酶用于17+1人类STR荧光检测试剂盒的扩增效果图，图4为普通热启动Taq酶用于17+1人类STR荧光检测试剂盒的扩增效果图。实验中18个STR基因位点集中在一个PCR反应管中进行复合扩增，由图3可见，实验组中所有位点都得到了扩增，而且扩增的DNA条带可分辨性良好，噪音低，背景干净。由图4可见，对照组中虽然所有位点也都得到了扩增，但出现了较多的杂带干扰，表明采用实施例2所述配体的氨基酸序列人工合成的热稳定性Taq酶温控亲和性配体与普通Taq酶制备的全程热启动Taq酶产品可以全程热启动，实现每个循环过程都是引物与模板处于严谨配对时酶活的热启动，从而避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高了反应特异性和灵敏度，保真性趋于完美，杂带更少，噪音更低。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 江西省科学院微生物研究所

<120> 一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体及其制备方法、应用

<130> 2017

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 噬菌体展示肽库(Phange display peptide library)

<400> 1

Thr Trp Leu His Phe Pro His

1 5

Claims (4)

1.一种热稳定的Taq酶温控亲和性配体，其特征在于，所述配体的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.一种全程热启动Taq酶，其特征在于，包括：权利要求1所述的热稳定的Taq酶温控亲和性配体和Taq酶。

3.根据权利要求2所述的全程热启动Taq酶，其特征在于，将人工合成的Taq酶温控亲和性配体与Taq酶按摩尔比为5～50：1混合。

4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2-3任一项所述的全程热启动Taq酶。

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