CN112812180B - 一种bax纳米抗体库及其制备方法与应用 - Google Patents

一种bax纳米抗体库及其制备方法与应用 Download PDF

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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用。其制备方法包括以下步骤：(1)使用BAX抗原对羊驼进行免疫后，收集外周血液，分离得到淋巴细胞；(2)提取淋巴细胞的总RNA，反转录扩增cDNA，再经过巢式PCR对cDNA进行扩增，得到目的基因VHH；(3)将目的基因VHH与载体连接，并转化至感受态细胞，构建VHH基因文库；(4)从VHH基因文库中取活细胞进行接种培养，采用噬菌体进行培养，纯化噬菌体，得到噬菌体展示文库；(5)对噬菌体展示文库进行筛选，得到BAX纳米抗体库。所述BAX纳米抗体具有抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备肿瘤细胞抑制剂或抗肿瘤药物。

Description

一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用。
背景技术
BAX是与BCL-2同源的水溶性相关蛋白，是BCL-2基因家族中细胞凋亡促进基因，该基因编码的BAX蛋白可与BCL-2形成异二聚体，对BCL-2产生阻抑作用，是极重要的促进细胞凋亡基因之一。此外，BAX的表达较为广泛，可出现在肝细胞、肾小管上皮细胞、呼吸系上皮细胞和支气管平滑肌、血管平滑肌细胞中。细胞凋亡在肿瘤发生、发展及治疗中起重要作用，而BAX基因作为人体最主要的凋亡蛋白，可促进肿瘤细胞凋亡，能明显提高化疗药物以及放疗杀伤肿瘤细胞的敏感性。
单域抗体是骆驼科动物和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体，其抗原结合点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又称为纳米抗体。纳米抗体是目前天然来源的相对分子质量最小的抗体。由于传统的抗体分子质量过大，肿瘤组织穿透能力差，会造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分，并且具有很高的免疫原性。而与普通抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单，易于基因操作和克隆，抗原特异性好，使得纳米抗体在新药物发现方面表现出巨大的潜力。同时纳米抗体和靶点结合特异性更强，组织穿透力更高，稳定性更高，适合工业化大规模生产，更容易体外改造和优化，更容易人源化。纳米抗体技术在疾病治疗诊断和肿瘤的靶向治疗中具有很大的发展前景。
因此，希望提供一种BAX纳米抗体库的构建方法，从而制得能抑制肿瘤细胞生长的BAX纳米抗体。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用，所述BAX纳米抗体具有抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备肿瘤细胞抑制剂或抗肿瘤药物。
一种BAX纳米抗体库的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用BAX抗原对羊驼进行免疫后，收集羊驼外周血液，分离得到淋巴细胞；
(2)提取所述淋巴细胞的总RNA，反转录扩增cDNA，再经过巢式PCR对cDNA进行扩增，得到目的基因VHH；
(3)将所述目的基因VHH与载体连接，并转化至感受态细胞，构建VHH基因文库；
(4)从所述VHH基因文库中取活细胞进行接种培养，采用噬菌体进行培养，纯化噬菌体，得到噬菌体展示文库；
(5)对所述噬菌体展示文库进行筛选，得到阳性克隆，即为BAX纳米抗体库。
优选的，步骤(1)中将BAX抗原蛋白通过皮下注射的方式，对羊驼进行4次免疫，免疫间隔为14天，免疫剂量分别为2mg、1mg、0.5mg、0.5mg。
采用间接ELISA法测定每轮免疫后羊驼抗血清效价，用PBS溶液稀释BAX GST至2μg/ml，加入96孔酶标板中，4℃过夜；PBST洗板3次；加入4％脱脂乳，37℃封闭1h；PBST洗板3次；用PBS溶液倍比稀释每一轮免疫后的羊驼抗血清，分别加入96孔酶标板中，37℃孵育30min；加入稀释至1/10000的Goat anti-llama IgG(HRP)，37℃孵育30min；PBST洗板3次；加入TMB显色液，37℃孵育5min；终止反应，读取酶标仪数值。
优选的，步骤(2)所述巢式PCR共有两轮，包括：
(1)以cDNA为模板进行第一轮扩增，所扩增的产物进行分离纯化，备用
(2)利用第一轮所扩增的产物进行第二轮扩增，扩增得到目的基因VHH，分离纯化；
所述第一轮扩增和第二轮扩增中所用引物相同，所述引物的核苷酸序列为：
Primer For：5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCGAGTCTGGRGGAGG-3’(SEQ ID NO:1)，
Primer Rev：5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCWGGGT-3’(SEQID NO:2)。
所得目的基因VHH约500bp。
更优选的，步骤(2)所述巢式PCR中，第一轮扩增的体系为：10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μL，dNTP mixture(each 2.5mM)4μL，Primer For(10mM each)1μL，Primer Rev(10mM each)1μL，cDNA 1μL，Ex Taq 0.5μL，H2O补足到50μL；
第二轮扩增的体系为：10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μL，dNTP mixture(2.5mMeach)4μL，Primer For(10mM each)1μL，Primer Rev(10mM each)1μL，第一轮所扩增的产物1μL，Ex Taq 0.5μL，H2O补足到50μL。
更优选的，步骤(2)所述巢式PCR中，第一轮扩增的反应条件为98℃10s；50℃15s；72℃1min；重复30个循环；第二轮扩增的反应条件为98℃10s；55℃15s；72℃30s；重复25个循环。
优选的，步骤(3)所述VHH基因文库的构建方法，包括以下步骤：
将所述目的基因VHH和载体pComb3xss采用SfiI酶切，将酶切后的VHH和pComb3xss采用T4 DNA连接酶连接后，转化至TG1电穿孔感受态细胞中，构建得到VHH基因文库。
所述转化共进行10次，混合后均匀涂布于6块Ф150mm的培养皿中。同时分别取0.1μL，0.01μL，0.001μL和0.0001μL混合后的转化液均匀涂布于Ф90mm的培养皿，计算文库库容量。
优选的，步骤(5)中所述噬菌体展示文库进行筛选的方法，包括以下步骤：
(1)包被：向96孔酶标板中加入浓度50μg/mL的GST Tag N/A融合蛋白，4℃过夜；
(2)封闭：加入3％BSA，37℃封闭1h；
(3)抗原和噬菌体孵育：加入100μg/mL、50μg/mL的BAX GST融合蛋白，4℃过夜；加入所述噬菌体展示文库悬液100μL，弃上清液，用0.1％PBST洗板5次、0.1％PBS洗板5次；
(4)清洗：弃上清液，用0.1％PBST、0.1％PBS洗板；
(5)洗脱：加入100μL Gly-HCL洗脱缓冲液(pH 2.2)进行洗脱，室温8min，洗脱两次；
(6)将洗脱的噬菌体重复筛选过程2次，得到阳性克隆，即为BAX纳米抗体库。
本发明提供一种BAX纳米抗体，由以上制备方法制得。
本发明还提供所述BAX纳米抗体在制备肿瘤细胞抑制剂中的应用。
本发明还提供所述BAX纳米抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明所制备的BAX纳米抗体具有更高的组织穿透力、更高的稳定性、和更强的靶点结合特异性，因而更容易体外改造和优化，更容易人源化，适合工业化大规模生产。所述BAX纳米抗体对肿瘤细胞抑制剂、抗肿瘤药物的开发具有重要价值。
附图说明
图1表示巢式PCR的第一轮扩增后产物的电泳图；
图2表示巢式PCR的第二轮扩增后产物的电泳图；
图3表示pComb3xss和VHH酶切的电泳图；
图4表示菌落PCR验证文库的插入率。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种BAX纳米抗体库的制备方法，步骤如下：
一、羊驼免疫及抗血清效价检测
(1)羊驼免疫：将BAX抗原蛋白通过皮下注射的方式，对羊驼进行免疫，共免疫4次，免疫间隔为14天，免疫剂量分别为2mg、1mg、0.5mg、0.5mg；
(2)抗血清效价检测：采用间接ELISA法测定每轮免疫后羊驼抗血清效价，用PBS溶液稀释BAX GST至2μg/ml，加入96孔酶标板中，4℃过夜；PBST洗板3次；加入4％脱脂乳，37℃封闭1h；PBST洗板3次；用PBS溶液倍比稀释每一轮免疫后的羊驼抗血清，分别加入96孔酶标板中，37℃孵育30min；加入稀释至1/10000的Goat anti-llama IgG(HRP)，37℃孵育30min；PBST洗板3次；加入TMB显色液，37℃孵育5min；终止反应，读取酶标仪数值。
二、目的基因VHH的制备
总RNA提取：收集BAX羊驼外周血50mL，采用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞。采用RNA提取试剂RNAiso Plus提取总RNA。采用紫外分光光度计ND-1000对总RNA定量，总RNA浓度为1270ng/μL，测得OD260/OD280＝2.09，OD260/OD230＝2.21，表明RNA没有明显降解。
RT-PCR
反转录体系如下：
(1)Oligo dT引物1μL，上述总RNA3.71μg，RNase free H2O补足到12μL，混匀后，65℃保温5min，迅速冰浴；
(2)步骤(1)的反应液12μL，5×Reaction Buffer 4μL，dNTP Mix 2μL，RibolockRI 1μL，Revert Aid RT 1μL，混匀后，按如下条件反转录：25℃，5min；42℃，60min；70℃，5min，得到cDNA。
目的基因VHH的扩增
采用巢式PCR进行扩增，扩增共有两轮，包括：
(1)以上述cDNA为模板进行第一轮扩增，所扩增的产物进行分离纯化，备用；
第一轮扩增的体系为：10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μL，dNTP mixture(each2.5mM)4μL，Primer For(10mM each)1μL，Primer Rev(10mM each)1μL，cDNA 1μL，Ex Taq0.5μL，H2O补足到50μL；
第一轮扩增的反应条件为98℃10s；50℃15s；72℃1min；重复30个循环。PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化浓缩后，再采用DNA产物凝胶回收试剂盒回收条带，紫外分光光度计定量；
(2)利用第一轮所扩增的产物进行第二轮扩增，扩增得到目的基因VHH，分离纯化。
第二轮扩增的体系为：10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μL，dNTP mixture(2.5mMeach)4μL，Primer For(10mM each)1μL，Primer Rev(10mM each)1μL，第一轮所扩增的产物1μL，Ex Taq 0.5μL，H2O补足到50μL。PCR产物采用DNA产物凝胶回收试剂盒回收，紫外分光光度计定量。
上述第一轮扩增和第二轮扩增中所用引物相同，引物的核苷酸序列为：
Primer For：5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCGAGTCTGGRGGAGG-3’(SEQ ID NO:1)，
Primer Rev：5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCWGGGT-3’(SEQID NO:2)。
采用巢式PCR扩增VHH基因，结果如图1和图2所示，最终得到长度约500bp的目的基因VHH，采用PCR产物凝胶回收试剂盒回收VHH。
三、VHH基因文库的构建
将上述目的基因VHH和载体pComb3xss采用SfiI酶切，酶切后的电泳图如图3所示；将酶切后的VHH和pComb3xss采用T4 DNA连接酶连接后，转化至TG1电穿孔感受态细胞中，构建得到VHH基因文库，命名为BAX-Lib。
其中转化的次数共10次，混合后均匀涂布于6块Ф150mm的培养皿中。同时分别取0.1μL，0.01μL，0.001μL和0.0001μL混合后的转化液均匀涂布于Ф90mm的培养皿，用于文库库容量的计算，计算库容量结果为1.48×109cfu。
在上述用于计算库容量的培养皿中随机挑选48个菌落，进行菌落PCR，测算文库的目的基因插入率，文库插入率结果如图4所示为100％，文库实际库容量为1.48×109cfu。另随机挑选50个菌落扩增后测序，分析序列多样性，将DNA序列翻译成氨基酸序列，进行序列比对及预测功能分区。
四、噬菌体展示文库的构建
从上述VHH基因文库中取10-100倍库容量的活细胞进行接种培养，培养至对数期后加入M13K07辅助噬菌体进行培养，离心收集噬菌体，采用PEG-NaCl纯化噬菌体，即得噬菌体展示文库，命名为BAX-PDL，其滴度为3.3×1013cfu/mL，可直接用于后续特异性噬菌体的亲和筛选。
五、BAX纳米抗体库的制备
对上述噬菌体展示文库进行筛选，其筛选方法包括以下步骤：
(1)包被：向96孔酶标板中加入浓度50μg/mL的GST Tag N/A融合蛋白，4℃过夜；
(2)封闭：加入3％BSA，37℃封闭1h；
(3)抗原和噬菌体孵育：加入100μg/mL、50μg/mL的BAX GST融合蛋白，4℃过夜；加入上述噬菌体展示文库悬液100μL，弃上清液，用0.1％PBST洗板5次、0.1％PBS洗板5次；
(4)清洗：弃上清液，用0.1％PBST、0.1％PBS洗板；
(5)洗脱：加入100μL Gly-HCL洗脱缓冲液(pH2.2)进行洗脱，室温8min，洗脱两次；
(6)将洗脱的噬菌体重复筛选过程2次，得到阳性克隆，即为BAX纳米抗体库。
实施例2
本实施例采用Phage ELISA鉴定阳性克隆
用PBS溶液稀释BAX GST蛋白至2μg/ml，加入96孔酶标板，4℃，过夜；PBST洗板3次，加入4％脱脂乳粉，封闭；PBST洗板3次，加入扩增后的噬菌体菌液，孵育；PBST洗板，加入HRP标记的抗M13KO7噬菌体单克隆抗体，孵育；PBST洗板3次，加入TMB显色液，显色后读取每个孔的吸光值。
通过间接ELISA方法检测93个单克隆对应的噬菌体上清液同BAX蛋白的反应性，取阴性对照OD450值的3倍以上为阳性克隆，将阳性克隆全部测序，比对分析后，共筛选到22株氨基酸序列差异性较大的纳米抗体，其序列分别如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:24所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种BAX纳米抗体库及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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catgccatga ctgtggccca ggcggccgag tctggrggag g 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catgccatga ctcgcggccg gcctggccgg agacggtgac cwgggt 46
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<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr
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Leu Leu Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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<213> 人工序列
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Thr Ile Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Val Trp Ile
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Arg Tyr Ala Asn Thr Asn Tyr Pro Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Ala Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Asp Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Leu Leu Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala
100 105 110
His His Ser Glu Asp Pro His Gly Gln Ala Gly Gln
115 120
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Gly Trp Ser
20 25 30
Ser Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Val Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Thr Ala Ala Gly Gly Thr Thr Asn Phe Pro Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu His Leu Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala His His Ser Glu Asp Pro His Gly Gln Ala Gly Gln
115 120 125
<210> 12
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Ile Asp Phe Arg Val Tyr
20 25 30
Ser Leu Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ser Ile Gly Thr Ala Tyr Asn Thr Asn Tyr Pro Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Arg Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Pro Glu
100 105 110
Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln
115 120 125
<210> 13
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Arg Arg Ala
20 25 30
Ser Leu Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys His Arg Thr Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Asn Thr Glu Phe Ser Thr Asn Tyr Pro Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Pro Ala
100 105 110
His His Ser Glu Asp Pro His Gly Gln Ala Gly Gln
115 120
<210> 14
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Arg Arg Ala
20 25 30
Ser Leu Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys His Arg Thr Trp Ile
35 40 45
Gly Ser Ile Asn Thr Gly Phe Thr Thr Asn Tyr Pro Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Thr Trp Gln Gly Glu Ala Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro His Gly Gln Ala Gly Gln
115 120 125
<210> 15
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ile Gly Phe Pro Leu Glu His Tyr
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Thr Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Glu Ile Ile Arg Gly Ile Arg Thr Gly Asp Thr Met
100 105 110
Cys Ala Gln Lys Ser Gly Leu Asp Phe Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val
115 120 125
Asn Val Ser Ala Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala
130 135 140
Gly Gln
145
<210> 16
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Thr Asn Ile Asn Ile Gly Arg Phe
20 25 30
Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Asp Ile Ile Arg Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Ser Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
His Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Ala Val Val Leu Ser Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly
115 120 125
Gln
<210> 17
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Ser Phe Val Asp Ser
20 25 30
Thr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Val Trp Val
35 40 45
Ala Ser Thr Ser Gly Val Gly Asp Ser Ala Asn Tyr Pro Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Phe Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Ile Val Ser Ser
100 105 110
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln
115 120 125
<210> 18
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 18
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Ser Ile Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Xaa Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Arg Ile Phe Asn Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ser Phe Leu Gly Thr Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly
115 120 125
Gln
<210> 19
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ala Leu Phe Thr Val Val Gly Thr Thr Asn Ile Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg
85 90 95
Ser Phe Arg Pro Gly Trp Gly Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120 125
Gly Gln Ala Gly Gln
130
<210> 20
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Val Ser Ile Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Thr Lys Val Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ala Pro Tyr Thr Val Asn Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Val Glu Ser Leu Gly Thr Gly Val Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln
115 120 125
Ala Gly Gln
130
<210> 21
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Trp Leu Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Pro Thr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Gln Asp Val Ala Phe Arg Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln
115 120 125
Ala Gly Gln
130
<210> 22
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Tyr Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Val Pro Asn Phe Gly Gly Glu Arg Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Asp Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
His Val Arg Arg Asn Leu Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly
115 120 125
Gln
<210> 23
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Arg Ile Thr Gly Thr Gly Ser Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asp Ala Arg Arg Glu Ser Ser Val Phe Arg Glu Thr His Arg Glu Ser
100 105 110
Ser Tyr Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
115 120 125
Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln
130 135 140
<210> 24
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Ala His Glu Trp Val
35 40 45
Gly Ser Ile Gly Ala Arg Gly Val Thr Asn Tyr Pro Ala Asn Thr Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ser Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu
100 105 110
Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln
115 120 125

Claims (6)

1.一种BAX纳米抗体，其特征在于，所述BAX纳米抗体的序列选自如SEQ ID NO:3、SEQID NO:5-17、SEQ ID NO:19-24所示的其中一种；
所述BAX纳米抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）将BAX抗原蛋白通过皮下注射的方式，对羊驼进行4次免疫，免疫间隔为14天，免疫剂量分别为2mg、1mg、0.5mg、0.5mg；再收集羊驼外周血液，分离得到淋巴细胞；
（2）提取所述淋巴细胞的总RNA，反转录扩增cDNA，再经过巢式PCR对cDNA进行扩增，得到目的基因VHH；
（3）将所述目的基因VHH与载体连接，并转化至感受态细胞，构建VHH基因文库；
（4）从所述VHH基因文库中取活细胞进行接种培养，采用噬菌体进行培养，纯化噬菌体，得到噬菌体展示文库；
（5）对所述噬菌体展示文库进行筛选，得到阳性克隆，可制得所述BAX纳米抗体。
2.根据权利要求1所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（2）所述巢式PCR共有两轮，包括：
（1）以cDNA为模板进行第一轮扩增，所扩增的产物进行分离纯化，备用
（2）利用第一轮所扩增的产物进行第二轮扩增，扩增得到目的基因VHH，分离纯化；
所述第一轮扩增和第二轮扩增中所用引物相同，所述引物的核苷酸序列为：
Primer For：5’-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCGAGTCTGGRGGAGG-3’（SEQ ID NO:1），
Primer Rev：5’-CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCWGGGT-3’（SEQ IDNO:2）。
3.根据权利要求2所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（2）所述巢式PCR中，第一轮扩增的体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，2.5mM dNTP mixture 4μL，10mM Primer For 1μL，10mM Primer Rev 1μL，cDNA 1μL，Ex Taq 0.5μL，H2O补足到50μL；
第二轮扩增的体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，2.5mM dNTP mixture 4μL，10mMPrimer For 1μL，10mM Primer Rev 1μL，第一轮所扩增的产物 1μL，Ex Taq 0.5μL，H2O补足到50μL。
4.根据权利要求2所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（2）所述巢式PCR中，第一轮扩增的反应条件为98℃ 10s；50℃ 15s；72℃ 1min；重复30个循环；第二轮扩增的反应条件为98℃ 10s；55℃ 15s；72℃ 30s；重复25个循环。
5.根据权利要求1所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（3）所述VHH基因文库的构建方法，包括以下步骤：
将所述目的基因VHH和载体pComb3xss采用SfiI酶切，将酶切后的VHH和pComb3xss采用T4 DNA连接酶连接后，转化至TG1电穿孔感受态细胞中，构建得到VHH基因文库。
6.根据权利要求1所述的BAX纳米抗体，其特征在于，步骤（5）中所述噬菌体展示文库进行筛选的方法，包括以下步骤：
（1）包被：向96孔酶标板中加入浓度50μg/mL的GST Tag N/A融合蛋白，4℃过夜；
（2）封闭：加入3%BSA，37℃封闭1h；
（3）抗原和噬菌体孵育：加入100μg/mL、50μg/mL的BAX GST融合蛋白，4℃过夜；加入所述噬菌体展示文库悬液100μL，弃上清液，用0.1%PBST洗板5次、0.1%PBS洗板5次；
（4）清洗：弃上清液，用0.1%PBST、0.1%PBS洗板；
（5）洗脱：加入100μL Gly-HCL洗脱缓冲液进行洗脱，室温8min，洗脱两次；
（6）将洗脱的噬菌体重复筛选过程2次，得到阳性克隆，可制得所述BAX纳米抗体。
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