CN116284361B - 抗新型冠状病毒及其突变株的单域抗体和应用 - Google Patents
抗新型冠状病毒及其突变株的单域抗体和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及生物医药工程技术领域，提供一种抗新型冠状病毒及其突变株的单域抗体和应用。单域抗体包括三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3中任意一种所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4‑6中任意一种所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7‑9中任意一种所示。本申请的单域抗体能够有效抑制RBD、S1、S Trimer蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS‑CoV‑2假病毒进入并感染细胞；同时对相关突变体均具有很好的亲和力以及抑制作用。
Description
技术领域
本申请属于生物医药工程技术领域，尤其涉及一种抗新型冠状病毒及其突变株的单域抗体和应用。
背景技术
新冠病毒是β-冠状病毒科的一种单链RNA病毒，其RNA基因组编码4种主要结构蛋白：刺突蛋白(Spike protein,S)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N)、跨膜蛋白(Membrane protein,M)和包膜蛋白(envelope protein,E)。新型冠状病毒2又称严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。研究发现，与其他包膜RNA病毒相似，SARS-CoV-2冠状病毒也使用病毒包膜上有独特的三聚体抗原(刺突蛋白)进入宿主细胞。SARS-CoV-2的三聚体刺突蛋白(S Trimer)与宿主细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，并通过膜融合介导随后的病毒进入，因此S蛋白在病毒的内化中发挥作用，也定义了宿主组织的趋向性和病毒的传播能力。S蛋白主要有N末端的S1亚单位和C末端的S2亚单位组成，S1主要负责病毒与宿主受体结合，S2主要起到膜融合的作用，其中S1亚单位的受体结合域(RBD)是直接结合ACE2的关键区域。
由于SARS-CoV-2病毒具有非常高的突变特性，据世界卫生组织(WHO)报道，已确定了值得关注的变体有：Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron，而Alpha、Delta以及Omicron突变体是造成新型冠状病毒感染大流行的主要病原体。目前主要的应对措施是接种疫苗以及现有药物再利用。然而，不断出现具有高传播力和逃避疫苗的变异株，使得疫苗在防治新冠病毒上面临了严峻的挑战。
发明内容
本申请的目的在于提供一种抗新型冠状病毒及其突变株的单域抗体和应用，旨在解决如何提供针对新型冠状病毒及其突变株具有很好的亲和力和抑制作用的单域抗体。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种抗新型冠状病毒及其突变株的单域抗体，单域抗体包括三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3中任意一种所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6中任意一种所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.7-9中任意一种所示。
在一实施例中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或者，CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；或者，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一实施例中，单域抗体包括四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4；其中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10-11中任意一种所示；FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12-15中任意一种所示；FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.16-21中任意一种所示；FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.22-23中任意一种所示。
在一实施例中，单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.24-29中任意一种所示。
第二方面，本申请提供一种核酸分子，核酸分子具有编码本申请的单域抗体的核苷酸序列或其互补序列。
在一实施例中，核酸分子具有如SEQ ID NO.30-35中任意一种所示的核苷酸序列。
第三方面，本申请提供一种表达载体，表达载体含有本申请的核酸分子。
第四方面，本申请提供一种细胞，细胞能表达本申请的单域抗体，或者细胞中转染了本申请的表达载体。
第五方面，本申请提供一种本申请的单域抗体在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
第六方面，本申请提供一种本申请的单域抗体在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本申请提供的针对新型冠状病毒及其突变株的单域抗体，其包括特有的三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。本申请通过实验发现该单域抗体作为靶向S1蛋白的中和抗体，能够有效抑制RBD、S1、S Trimer蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒进入并感染细胞；同时对相关突变体均具有很好的亲和力以及抑制作用，因此，这样的单域抗体可以作为防治新冠病毒的新药物，具有很好的应用前景。
本申请提供的核酸分子具有编码本申请上述单域抗体的核苷酸序列或其互补序列；本申请提供的表达载体含有本申请提供的特有核酸分子；本申请提供的细胞能表达本申请的单域抗体或者细胞中转染了本申请的表达载体。因此，可以通过基因工程技术手段，利用这样的核酸分子、表达载体或细胞制备本申请特有的单域抗体。
基于本申请提供的单域抗体能够有效抑制RBD、S1、S Trimer蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒进入并感染细胞，对相关突变体均具有很好的亲和力以及抑制作用；因此，这样的单域抗体可以用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物；或者用于制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例中免疫文库构建及单域抗体筛选流程示意图；
图2是本申请实施例中筛选分离单个阳性噬菌体克隆结果图；
图3是本申请实施例中单域抗体的SDS-PAGE凝胶电泳图；
图4是本申请实施例的单域抗体对RBD、S1以及S Trimer的亲和力以及抑制作用图；
图5是本申请实施例提供的单域抗体VHH-21和VHH-43与新型冠状病毒SARS-CoV-2突变株的突刺蛋白的亲和作用以及抑制作用图；
图6是本申请实施例提供的单域抗体VHH-21和VHH-43不同浓度与Omicron BA.2S1的相互作用图；
图7是本申请实施例提供的单域抗体VHH-21和VHH-43对SARS-CoV-2假病毒与ACE2结合的中和作用图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例实施过程构成任何限定。
本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。本申请的室温可以是25～27℃。
本申请实施例提供一种抗新型冠状病毒及其突变株的单域抗体，单域抗体包括三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3中任意一种所示；CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6中任意一种所示；CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.7-9中任意一种所示。
单域抗体(single-domain antibody，SdAb)一般只包含单一的抗体可变区(VH/VL)，其中位于重链抗体可变区的抗体片段被称为VHH单域抗体，也被称为纳米抗体(nanobody)。本申请提供针对新型冠状病毒及其突变株的单域抗体，该单域抗体通过三个互补决定区的作用能够有效抑制RBD、S1、S Trimer蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒进入并感染细胞；同时对相关突变体均具有很好的亲和力以及抑制作用，因此，这样的单域抗体可以作为防治新冠病毒的新药物，或者针对新型冠状病毒及其突变株的检测试剂。
本申请筛选得到特异性针对S1的单域抗体，并且通过原核表达即具有良好的结合活性，并能有效中和S1与人源ACE2的结合。具体有以下优势：1)单域抗体为单结构域抗体，易于改造，可通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体；2)单域抗体免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应；3)单域抗体既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本；4)单域抗体分子量小，易于穿过各种屏障到达靶点，亲和力范围更为宽泛，为后期不同用途的抗体提供多个选择。5)单域抗体可以偶联药物分子起到双重或多重靶点治疗作用，应用范围更广。
在一实施例中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或者，CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；或者，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。在一实施例中，单域抗体还包括四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4；其中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10-11中任意一种所示；FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12-15中任意一种所示；FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.16-21中任意一种所示；FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.22-23中任意一种所示。
在一实施例中，单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.24-29中任意一种所示。本申请实施例中，使用S1蛋白免疫羊驼，构建单域抗体免疫文库，通过噬菌体展示技术，经过三轮筛选后富集了抗S1的特异性单域抗体。SEQ ID NO.24-29所示的氨基酸序列的单域抗体实验中命名为：VHH-11、VHH-21、VHH-25、VHH-27、VHH-39和VHH-43。
本申请实施例提供一种核酸分子，核酸分子具有编码本申请实施例的单域抗体的核苷酸序列或其互补序列。具体地，核酸分子具有如SEQ ID NO.30-35中任意一种所示的核苷酸序列。本申请实施例提供的单域抗体或核酸分子的具体序列如下。
SEQ ID NO.1：GFTLDYYT。SEQ ID NO.2：GFTFSSYD。SEQ ID NO.3：GFTLDYHT。
SEQ ID NO.4：SSISPGGSTN。SEQ ID NO.5：SGINGDGSDT。SEQ ID NO.6：SSISSGGSTN。
SEQ ID NO.7：TAQSGSYYWTGLLGEEYE。SEQ ID NO.8：AKGEVSGGTWYGAGWANGMD。
SEQ ID NO.9：AAQSGSYYWAGLLGEEYE。SEQ ID NO.10：DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS。
SEQ ID NO.11：DVQLQESGGGLAQPGGSLRLSCAAS。SEQ ID NO.12：IGWFRQAPGKEREGV。
SEQ ID NO.13：MSWARQAPGKGLEWV。SEQ ID NO.14：IGWFRRAPGKEREGV。
SEQ ID NO.15：IGWFRQAPGEEREGV。
SEQ ID NO.16：YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHSLKPEDTAVYYC。
SEQ ID NO.17：YADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC。
SEQ ID NO.18：DADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC。
SEQ ID NO.19：YYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYC。
SEQ ID NO.20：YADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC。
SEQ ID NO.21：YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC。
SEQ ID NO.22：YWGQGTQVTVSS。SEQ ID NO.23：YWGKGTQVTVSS。
SEQ ID NO.24(VHH-11)：
DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYTIGWFRQAPGKEREGVSSISPGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMHSLKPEDTAVYYCTAQSGSYYWTGLLGEEYEYWGQGTQVTVSS。
SEQ ID NO.25(VHH-21)：
DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYTIGWFRQAPGKEREGVSSISPGGSTNYADSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTAQSGSYYWTGLLGEEYEYWGQGTQVTVSS。
SEQ ID NO.26(VHH-25)：
DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYTIGWFRQAPGKEREGVSSISPGGSTNDADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTAQSGSYYWTGLLGEEYEYWGQGTQVTVSS。
SEQ ID NO.27(VHH-27)：
DVQLQESGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWARQAPGKGLEWVSGINGDGSDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAKGEVSGGTWYGAGWANGMDYWGKGTQVTVSS。
SEQ ID NO.28(VHH-39)：
DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYHTIGWFRRAPGKEREGVSSISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQSGSYYWAGLLGEEYEYWGQGTQVTVSS。
SEQ ID NO.29(VHH-43)：
DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYTIGWFRQAPGEEREGVSSISPGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTAQSGSYYWTGLLGEEYEYWGQGTQVTVSS。
SEQ ID NO.30：
GATGTTCAGCTGCAGGAAAGTGGTGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGTAGCTTACGTCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTTACCCTGGATTATTATACCATTGGCTGGTTTCGCCAGGCCCCGGGCAAAGAACGCGAAGGTGTGAGTAGTATTAGCCCGGGCGGCAGCACCAATTATGCAGATAGTGTGAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGCGATAATGCAAAAAATACCGTTTATCTGCAGATGCATAGTCTGAAACCGGAAGATACCGCCGTGTATTATTGTACCGCACAGAGCGGCAGCTATTATTGGACCGGCCTGCTGGGCGAAGAATATGAATATTGGGGTCAGGGCACCCAGGTTACCGTGAGTAGC。
SEQ ID NO.31：
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGTGGTGGTGGCCTGGTTCAGCCGGGTGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCAGCCAGCGGTTTTACCCTGGATTATTATACCATTGGCTGGTTTCGTCAGGCACCGGGTAAAGAACGCGAAGGCGTGAGTAGCATTAGTCCGGGCGGTAGTACCAATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAGTGCCAAAAATACCGTTTATCTGCAGATGAATAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCCGTTTATTATTGTACCGCCCAGAGTGGTAGTTATTATTGGACCGGTCTGCTGGGCGAAGAATATGAATATTGGGGCCAGGGTACCCAGGTTACCGTTAGTAGT。
SEQ ID NO.32：
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGTGGTGGTGGTCTGGTGCAGCCGGGCGGCTCACTGCGTCTGAGCTGCGCAGCCAGCGGTTTTACCCTGGATTATTATACCATTGGTTGGTTTCGTCAGGCCCCGGGTAAAGAACGTGAAGGTGTTAGTAGCATTAGTCCGGGCGGTAGCACCAATGATGCCGATAGTGTGAAAGGTCGTTTTACCATTAGTCGCGATAATGCCAAAAATACCGTGTATCTGCAGATGAATAGTCTGAAACCGGAAGATACCGCAGTTTATTATTGTACCGCCCAGAGTGGTAGCTATTATTGGACCGGTCTGCTGGGTGAAGAATATGAATATTGGGGTCAGGGCACCCAGGTTACCGTTAGCAGT。
SEQ ID NO.33：
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGTGGTGGCGGTCTGGCACAGCCGGGTGGCTCACTGCGTCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGTTTTACCTTTAGTAGCTATGATATGAGCTGGGCACGCCAGGCCCCGGGTAAAGGCCTGGAATGGGTTAGCGGTATTAATGGTGACGGTAGCGATACCTATTATGCCGATAGTGTTAAAGGTCGCTTTACCATTAGTCGCGATAATGCCAAAAATACCGTGTATCTGCAGATGAATAGTCTGAAACCGGAAGATACCGCACTGTATTATTGCGCCAAAGGCGAAGTGAGCGGCGGTACCTGGTATGGCGCAGGTTGGGCAAATGGTATGGATTATTGGGGCAAAGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGC。
SEQ ID NO.34：
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGTGGTGGTGGTCTGGTGCAGCCGGGCGGCTCACTGCGTCTGAGTTGCGCAGCAAGCGGCTTTACCCTGGATTATCATACCATTGGTTGGTTTCGTCGTGCCCCGGGTAAAGAACGTGAAGGCGTGAGCAGCATTAGTAGCGGTGGTAGCACCAATTATGCCGATAGTGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAATGCCAAAAATACCGCATATCTGCAGATGAATAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCCGTTTATTATTGTGCCGCACAGAGTGGTAGCTATTATTGGGCCGGCCTGCTGGGTGAAGAATATGAATATTGGGGTCAGGGTACCCAGGTTACCGTGAGCAGC。
SEQ ID NO.35：
GATGTGCAGCTGCAGGAAAGTGGCGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGCGGTAGTCTGCGTCTGAGTTGCGCCGCAAGCGGCTTTACCCTGGATTATTATACCATTGGTTGGTTTCGTCAGGCACCGGGTGAAGAACGCGAAGGCGTGAGTAGCATTAGTCCGGGCGGTAGCACCAATTATGCAGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTAGTCGCGATAATGCCAAAAATACCGTTTATCTGCAGATGAATAGTCTGAAACCGGAAGATACCGCAGTGTATTATTGCACCGCCCAGAGCGGTAGTTATTATTGGACCGGTCTGCTGGGTGAAGAATATGAATATTGGGGTCAGGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGC。
如图1所示，为S1蛋白免疫文库构建以及单域抗体筛选流程示意图；申请人使用S1蛋白免疫羊驼得到的单域抗体文库筛选得到与新型冠状病毒蛋白S1具有明显的亲和作用的单域抗体，用ELISA检测单域抗体与RBD、S1和S Trimer蛋白的亲和力；使用竞争ELISA方法来检测单域抗体对RBD、S1和S Trimer蛋白与人ACE2蛋白结合的抑制作用；结果表明筛选的6个单域抗体与RBD、S1和S Trimer蛋白均具有明显的亲和作用和抑制作用；其中VHH-21(SEQ ID NO.25)和VHH-43(SEQ ID NO.29)的作用突出，均为nM级别。
进一步，本申请通过ELSA和竞争ELISA方法检测VHH-21和VHH-43与新型冠状病毒突变株(Alpha B.1.1.7和Delta B.1.617.2)的S1蛋白的结合以及抑制其与ACE2结合的作用，并以生物膜层干涉技术检测VHH-21和VHH-43与Omicron BA.2S1蛋白的相互作用，结果表明VHH-21和VHH-43对以上突变株的S1蛋白均匀明显的亲和作用，在抑制新型冠状病毒感染中有着巨大的潜能。在新型冠状病毒中和实验，实验结果显示，VHH-21和VHH-43能有效中和新型冠状病毒与ACE2结合，减少病毒感染细胞，结果进一步阐明了VHH-21和VHH-43在治疗新型冠状病毒药物开发中的重要作用，还对其他突变株的S1蛋白有明显亲和力，有望成为广谱的新型冠状病毒治疗药物。
本申请提供的核酸分子具有编码本申请上述单域抗体的核苷酸序列或其互补序列；本申请提供的表达载体含有本申请提供的特有核酸分子；本申请提供的细胞能表达本申请的单域抗体或者细胞中转染了本申请的表达载体。因此，可以通过基因工程技术手段，利用这样的核酸分子、表达载体或细胞制备本申请特有的单域抗体。
基于本申请提供的单域抗体能够有效抑制RBD、S1、S Trimer蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒进入并感染细胞，同时对相关突变体均具有很好的亲和力以及抑制作用。特别地，VHH-21和VHH43对Delta、Alpha以及Omicron突变体均具有更好的亲和力以及抑制作用；因此，这样的单域抗体可以用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物；或者用于制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1新型冠状病毒刺突蛋白免疫文库构建
1、RNA的提取和反转录：
1.1)抽取经SARS-CoV-2的S1蛋白免疫后的羊驼外周血，加入Trizol试剂，然后加入1/5体积的氯仿混匀，室温静置5分钟后离心。1.2)将离心后的上清液转移到新的离心管，并加入0.5-1倍体积的异丙醇，室温静置10分钟后离心。1.3)使用与Trizol试剂保存的外周血淋巴细胞等体积的75％乙醇清洗沉淀，4℃离心5分钟后溶解于无RNA酶的水中，合并样品即为总RNA。1.4)使用Takara反转录试剂盒对总RNA进行反转录。将总RNA样品分为两份，一份用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物，另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，分别保存到2个离心管中。
2、PCR扩增：
2.1)第一轮PCR扩增：以cDNA为模板，用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行扩增。取20μl的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将所有cDNA按照此模板量并使用相同条件进行PCR反应，将所有PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在600bp左右的条带，将所有纯化回收产物收集中至一个离心管中即为第一轮PCR扩增产物，-20℃保存。
2.2)第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮扩增。
反应结束后，取20μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将已获得的第一轮PCR扩增产物的1/15体积共240个反应按照此模板量并使用相同条件进行PCR反应后使用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应液进行DNA纯化；将所有回收产物收集至一个离心管中，即为第二轮PCR扩增产物，同时取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录，其余产物-20℃保存。
3、酶切和连接：
用Spe I、Sac I分别酶切10μg pComb3XSS载体和2μg第二轮PCR扩增产物，37℃孵育4h；使用DNA回收纯化试剂盒对pComb3XSS载体和第二轮PCR扩增产物进行纯化，然将载体和酶切片段连接。
4、细菌文库的构建
4.1)验证连接产物转化率：取一支50μl的TG1感受态细胞在冰上放置5-10min融化，加入100ng连接产物，转移到预冷的间距1mm的电转杯中，在电转仪中设定参数：1800V，1mm后，点击按钮点击转化，等待电转完成后立即加入37℃预热好的SOC培养液1ml，混匀后37℃，200rpm摇菌复苏1h，从1ml复苏后的菌液中取100μl进行10倍梯度稀释并涂板，根据稀释倍数和单菌落数计算每个反应能获得的转化菌落数目，即为连接产物的转化效率，同时随机挑选48个单克隆菌进行菌落PCR，PCR产物有在600bp左右的单一条带认为是阳性克隆，由此估算单克隆阳性率。4.2)细菌文库构建：取20个100ng连接体系按上述方法使用20管感受态进行电转反应，37℃复苏1h后从中取100μl进行10梯度稀释后涂板，37℃过夜培养，收集剩下所有菌液并均匀涂布到5个245mm方形培养板(2×YT含有100μg/ml Amp，2％glucose)中，37℃正置培养过夜，根据稀释倍数和单菌落数计算所有反应能获得的转化菌落数目，即为细菌文库的库容量；同时从梯度稀释板中随机挑选60个单克隆进行菌落PCR，验证细菌文库的克隆阳性率；将过夜培养的245mm方形培养板菌落使用2×YT液体培养基刮下，置于50ml离心管，测量其OD600值，添加终浓度20％甘油-80℃保存。
5、噬菌体文库制备：
5.1)根据细菌文库的OD600计算在100ml 2×YT液体培养基需要加入的细菌文库体积，根据计算结果接种细菌文库到100ml 2×YT液体培养基(含有100μg/μl Amp)中，37℃，250rpm培养直至OD600为0.5-0.55。5.2)根据辅助噬菌体效价，按照1：20(细菌个数：噬箘体数)的比例加入辅助噬菌体，37℃，250rpm孵育30min。5.3)加入终浓度为50μg/ml的Kana，30℃，250rpm过夜培养；5.4)将过夜培养的菌液4℃，4000rpm离心10min，然后将离心后的上清液转移到新的50ml离心管中。5.5)加入1/4的预冷PEG/NaCl储存液，混合均匀，冰上静置孵育30min。5.6)在4℃离心后弃上清，倒置控干2min。5.7)加入1mlPBS重悬至新的离心管，4℃离心。5.8)离心后转移上清至新的离心管中，再次加入1/4体积的预冷PEG/NaCl储存液，混合均匀，冰上孵育10min。5.9)在4℃离心弃上清，用1mlPBS重悬后离心，转移上清至新的离心管，-80℃保存，即为纯化后的噬菌体文库。
实施例2新型冠状病毒刺突蛋白单域抗体的筛选实验
1、免疫文库的扩增：
1.1)挑取E.coli TG1单克隆菌株至100mL含10mg/L Tet的2×YT培养基中，37℃、200rpm震荡培养至对数增长期(OD600nm＝0.5)。1.2)将储存于-20℃的VHH噬菌体免疫文库取100μL-200μL加到上述步骤的E.coli TG1菌液中，于37℃静置孵育1h。1.3)加入400mL 2×YT(含有2％glucose，100mg/L Amp)，37℃震荡培养至OD600nm＝0.5后，加入辅助噬菌体M13KO7(终浓度为1010pfu/mL)，于37℃静置孵育1h。1.4)将上述500mL菌液于6000rpm离心15min，弃上清(除去葡萄糖、游离的噬菌体以及游离的辅助噬菌体)，取沉淀用500mL 2×YT(含有100mg/L Amp，50mg/L Kan，50μM IPTG)液体培养基中在无菌条件下重悬，并转移液体至三角瓶中，37℃，200rpm过夜培养。1.5)将过夜培养的菌离心，分离上清至新的离心管中，加入1/4体积的PEG 8000/NaCl溶液混匀，于4℃静置2h以沉淀噬菌体。1.6)在4℃离心弃上清，收集沉淀。1.7)使用5mL PBS缓冲液重悬上述沉淀，然后离心去除不溶于PBS的物质，分离并转移上清至无菌的离心管中，4℃保存备用。1.8)取少量扩增后的文库上清按照10-1到10-14梯度稀释。1.9)分别取100μL各梯度稀释的样品(十分之一)加到400μL(OD600nm＝1.0)新鲜E.coli TG1菌液中混匀，然后加入4mL上层琼脂(0.7％琼脂，45℃)混匀后倾注到无抗性的2×YT固体培养基上，待上层琼脂凝固后37℃过夜培养。1.10)对噬菌斑进行计数，并计算出噬菌体的滴度。
2、筛选抗新型冠状病毒S1蛋白的单域抗体
2.1)包被：用PBS配制终浓度40μg/mL的抗原S1，在高吸附免疫管中加800μL抗原蛋白，4℃过夜包被，而后弃去管内溶液，PBST溶液1mL洗涤5次。2.2)封闭：加入1mL封闭液(交替用5％脱脂牛奶和0.5％ BSA)封闭反应孔，室温下孵育1h后弃去管内溶液，PBST溶液1mL洗涤5次。2.3)加文库：加入800μL扩增后噬菌体文库，室温孵育1h后弃液体，1mL PBST清洗5次。2.4)噬菌体的洗脱：加800μL的0.1M HCl溶液，室温孵10min洗脱与抗原特异性结合的噬菌体，收集洗脱液800μL于1.5mL离心管中，加入1M Tris-HCl 64μL充分混匀以中和洗脱的噬菌体中的HCl，4℃保存。2.5)感染细菌：将洗脱下来的噬菌体加入到用10mL的2×YT(含有10mg/L Tet)液体培养基培养的E.coli TG1(OD600nm＝0.5)菌液中，37℃孵育1h；加入40mL的2×YT(含有2％glucose，100mg/L Amp)液体培养基，37℃震荡培养至OD600nm＝0.5。2.6)辅助噬菌体超感染：向50mL菌液加入辅助噬菌体M13KO7达到1010pfu/mL的终浓度，37℃震荡培养1h。2.7)筛选扩增噬菌体：将50mL菌液离心弃上清，取沉淀用50mL 2×YT(含有100mg/LAmp，50mg/L Kan，50μM IPTG)液体培养基中重悬，并转移液体至250mL三角瓶中，37℃，200rpm过夜培养(文库中的噬菌体具有氨苄青霉素抗性，辅助噬菌体M13KO7有卡那霉素抗性，故加双抗生素可筛选得到被文库噬菌体和辅助噬菌体同时感染了的E.coli TG1)。2.8)将过夜培养的菌液离心取40mL上清，加入10mL PEG 8000/NaCl溶液(菌液上清：PEG 8000/NaCl＝1：4)，混匀后冰上静置1h以沉淀噬菌体。其余上清4℃保存，用于测定每轮筛选效价。2.9)于4℃离心弃上清后，用1mL PBS重悬沉淀离心去除不溶于PBS的物质，得到用于下一轮筛选的噬菌体文库，以此为一轮筛选。2.10)对得的噬菌体文库进行滴度测定(同上)。
重复以上步骤进行3轮筛选。通过滴度计算富集程度和筛选效果，当富集比(与第一轮筛选的回收率比值)大于100倍以上时，认为筛选足够，进行ELISA检测。每轮筛选效价和富集程度如表1所示：
表1
| 筛选轮数 | 输入效价 | 输出效价 | 回收率(输出/输入) | 富集倍数 |
| 第1轮 | 6.6×1012 | 5.4×107 | 8.2×10-6 | - |
| 第2轮 | 4.1×1012 | 1.3×1010 | 3.2×10-3 | 390 |
| 第3轮 | 1.3×1013 | 2.2×1010 | 1.7×10-3 | 207 |
由上可知：通过每一轮单域抗体输出量与输入量的比值来分析筛选的回收率和富集倍数，在经过三轮筛选后，富集倍数(富集倍数是指每一轮筛选的回收率与第一轮相较于第一轮回收率的比值)达到207倍，证明筛选过程有效的富集了与S1特异性结合的单域抗体。
3、噬菌体-ELISA检测阳性单克隆
3.1)把第3轮筛选所洗脱的噬菌体文库加入到10mL用2×YT(含有10mg/L Tet)液体培养基培养的E.coli TG1(OD600nm＝0.5)菌液，37℃孵育1h。3.2)按10-1到10-4进行梯度稀释，然后各取100μL均匀涂布于2×YT(含有100mg/L Amp)固体平板上，37℃过夜培养。3.3)在过夜培养的平板上随机挑取96个单菌落于分装有2×YT(含2％glucose，100mg/L Amp)液体培养基400μL的96孔深孔板中，37℃，200rpm培养至OD600nm＝0.5。3.4)加入400μL 2×YT液体培养基和终浓度为100mg/L Amp，50mg/L Kan，50μM IPTG，以及1010M13KO7辅助噬菌体，37℃，200rpm过夜培养。3.5)将菌液离心得到的上清转移到无菌的带封口膜的96孔深孔板中，4℃保存备用。3.6)用PBS配制终浓度40μg/mL的抗原S1，在高吸附的96酶标板加100μL/孔抗原蛋白，4℃过夜包被后弃去液体，用200μL PBST清洗5次；同时包被相同浓度的BSA作为阴性对照。3.7)加入200μL封闭液(5％脱脂牛奶)，室温封闭1h后弃液体，用200μL PBST清洗5次。3.8)分别加入步骤3.5中的菌液上清100μL，室温轻微震荡2h后弃去液体，使用200μLPBST清洗。3.9)每孔加入100μL稀释8000倍M13 Bacteriophage Antibody(HRP)，MouseMab，室温孵育1h后弃去抗体，使用200μL PBST清洗5次。3.10)加入100μL TMB底物室温轻微震荡至样品明显产生蓝色，加入100μL 1M HCl终止反应并在OD450nm处测定吸光度。3.11)选取具有明显阳性的单克隆菌液上清，各取100μL上清，重复步骤3.6-3.10作为实验组，同时以相同浓度BSA替换抗原S1包被于酶标板中，进行与实验组相同的实验作为阴性对照组，以实验组与对照组吸光度的比值来判断阳性克隆，从筛选出S1特异性单域抗体。
4、噬菌体-竞争ELISA
4.1)用PBS配制终浓度6μg/mL的抗原ACE2，在96酶标板加100μL/孔抗原蛋白，4℃过夜包被后弃去液体，用200μL PBST清洗。4.2)加入200μL封闭液(5％脱脂牛奶)，室温封闭1h后弃液体，用200μL PBST清洗。4.3)选取具有阳性的单克隆菌液上清各取50μL上清，分别与50μL S1(终浓度为6μg/mL)混合均匀后于37℃孵育1h；然后把混合液加入包被了ACE2的酶标板中，室温震荡1h后弃去液体，使用200μL PBST清洗。4.4)每孔加入100μL稀释3000倍Anti-S1 Antibody(HRP)，Mouse Mab，室温孵育1h后弃去抗体，使用200μL PBST清洗。4.5)加入100μL TMB底物室温震荡至样品产生蓝色，加入100μL1M HCl终止反应并在OD450nm处测定吸光度。4.6)以不加单克隆菌液上清为阳性对照，得到的吸光度之与阳性对照比值得出抑制作用，选出既有亲和力也有抑制作用的单域抗体。
实验结果如图2所示：为了排除假阳性，同时使用BSA为阴性对照(如图2中A)，随后挑出亲和力最好的前48个单克隆(即与阴性对照的OD 450比值大于37)。为了进一步比较48个单克隆与S1的亲和力以及抑制作用，分别与S1蛋白进行二次ELISA并以BSA为对照以排除假阳性(如图2中B)；以及与S1和ACE2进行竞争ELISA并与对照比较计算抑制作用(如图2中C)。根据亲和力以及抑制作用挑选出前6个最优的单克隆，根据编号将单域抗体依次命名为VHH-11、VHH-21、VHH-25、VHH-27、VHH-39和VHH-43。
5、特异性S1蛋白的单域抗体质粒提取及序列鉴定
5.1)分别取上述筛选得到的S1特异性单域抗体菌液上清30μL加入到270μLE.coli TG1(OD600nm＝0.5)菌液中37℃孵育1h后，转移至10mL 2×YT(含100mg/L Amp)培养基中37℃，200rpm过夜培养。5.2)质粒提取使用Omega Bio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I(200)，按照说明书提取。5.3)送样测序；得到的6个阳性克隆送基因测序，用GENtle软件将单域抗体序列翻译成氨基酸结果如SEQ ID NO.24-29所示。
6、单域抗体表达纯化
6.1)将pET23a-VHH重组质粒转化到表达感受态细胞E.coli BL21(DE3)中。6.2)从-80℃取感受态细胞50μL于冰浴上融化；加入1μL重组质粒于感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min；于42℃水浴中热激90s，立即于冰上放置2-3min；加入SOC液体培养基500μL，于37℃恒温摇床振荡培养1h；取100μL菌液均匀涂布于含100mg/L Amp的LB固体培养基上，先放置在37℃恒温培养箱中30～60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来于37℃恒温培养箱过夜。6.3)挑取单菌落于6mL的LB培养基中，37℃、250rpm培养5h，然后按1:100转接到新鲜的250mL LB培养基中37℃、250rpm条件培养；待菌液OD600nm＝0.6-0.8时，加终浓度为0.5mM IPTG诱导剂，16℃诱导培养15h。6.4)将培养后菌液离心收集菌体，然后用Binding buffer(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH为7.4)重悬细菌，并进行超声破碎(350W，work 5s，off 3s，时间20min)。然后离心收集上清，0.45μm滤膜过滤，置冰上。6.5)将5mL HisTrap FF预装柱与蠕动泵连接使用Binding Buffer以每分钟1mL的流速冲洗镍柱5-10个柱体积，以平衡镍柱；将过蛋白样品溶液以1mL/min的流速通过5mL HisTrap FF预装柱进行亲和层析；在所有样品通过层析柱后继续使用Binding Buffer冲洗镍柱5-10个柱体积，洗下可能存在非特异性吸附的杂蛋白；使用镍柱Elution Buffer(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，500mM咪唑，pH为7.4)洗脱并收集吸附在镍柱上的蛋白。6.6)对收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测；SDS-PAGE凝胶电泳结果如图3。蛋白浓度使用PierceTMBCA蛋白定量试剂盒进行测定。
7、ELISA法检测单域抗体与RBD、S1和S Trimer的亲和作用
7.1)分别用PBS配制终浓度4μg/mL的抗原RBD、S1和S Trimer，在八孔酶标条中加100μL/孔抗原蛋白，4℃过夜包被后弃液体，用PBST清洗。7.2)加入200μL封闭液(5％BSA)，室温封闭1h后弃去液体，用PBST清洗。7.3)加入100μL/孔倍比稀释的单域抗体，室温孵育1h后弃液体，用PBS清洗。7.4)每孔加入100μL按1：3000稀释的Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT，室温震荡1h后弃抗体并使用PBST清洗。7.5)加入100μL TMB底物室温震荡至样品产生蓝色，然后加入100μL 1M HCl终止反应，在OD450nm处测定OD值。
8、竞争ELISA法检测单域抗体与RBD、S1和S Trimer与ACE2结合的抑制作用
8.1)用PBS配制终浓度6μg/mL的抗原ACE2，在96酶标板加100μL/孔抗原蛋白，4℃过夜包被后弃去液体，用PBST清洗。8.2)加入200μL封闭液(5％脱脂牛奶)，室温封闭1h后弃液体，用PBST清洗。8.3)各取50μL倍比稀释的单域抗体，分别与50μL RBD、S1和S Trimer(终浓度为6μg/mL)混合均匀后于37℃孵育1h；然后把混合液加入包被了ACE2的酶标板中，室温震荡1h后弃去液体，用PBST清洗。8.4)每孔加入100μL稀释3000倍Anti-HIS Antibody(HRP)，Mouse Mab，室温孵育1h后弃去抗体，使用PBST清洗。8.5)加入100μL TMB底物室温震荡至样品明显产生蓝色，加入100μL 1M HCl终止反应并在OD450nm处测定吸光度。8.6)以不加单域抗体为阳性对照，得到的吸光度之与阳性对照比值，并用三参数-拟合曲线拟合并计算得出IC50。
结果如图4所示：使用ELISA的方法进行分析时，把单域抗体稀释成不同的浓度(0.012-1000nM)分别与包被好的RBD、S1以及S Trimer进行结合，表明6个抗体与RBD、S1以及S Trimer均具有很好的亲和力(图4中A、B、C)；使用竞争ELISA的方法进行分析时，把单域抗体稀释不同浓度(0.032-1000nM)分别与终浓度为4μg/mL的RBD、S1以及S Trimer混合均匀后于37℃孵育1h后，一起加入到包被好的ACE2中进行反应，结果表明6个单域抗体对的RBD、S1以及S Trimer与人源的ACE2结合均有明显的抑制作用(图4中D、E、F)，用三参数-非线性拟合计算得各单域抗体与RBD、S1以及S Trimer的IC50结果如图4中G，其中VHH-21和VHH-43两个单域抗体的作用最优。
9、ELISA法检测VHH-21和VHH-43对新型冠状病毒突变株S1 Alpha B.1.1.7和Delta B.1.617.2与ACE2结合作用
9.1)用PBS配制终浓度4μg/mL的人源ACE2-mFC，在八孔酶标条中加100μL/孔，4℃过夜包被后弃液体，用PBST清洗。9.2)加入200μL封闭液(5％BSA)，室温封闭1h后弃去液体，用PBST清洗。9.3)将倍比稀释的单域抗体加入到封闭好的96孔板中，室温孵育1h后弃液体，用PBST清洗。9.4)每孔加入100μL按1：3000稀释的Anti-mouse-His-HRP，室温震荡1h后弃去抗体并使用PBST清洗。9.5)加入100μL TMB底物室温震荡至样品产生蓝色，加入100μL 1MHCl终止反应，并在OD450nm处测定OD值。
10、竞争ELISA法检测VHH-21和VHH-43对新型冠状病毒突变株S1 Alpha B.1.1.7和Delta B.1.617.2与ACE2结合的抑制作用
10.1)用PBS配制终浓度6μg/mL的人源ACE2-mFC，在八孔酶标条中加100μL/孔，4℃过夜包被后弃液体，PBST清洗。10.2)加入200μL封闭液(5％BSA)，室温封闭1h后弃去液体，用PBST清洗。10.3)将倍比稀释的单域抗体与S1(终浓度为6μg/mL；不加入单域抗体的为对照组A0)混匀后，加入到封闭好的96孔板中，室温孵育1h后弃液体，用200μL PBST清洗5次。10.4)每孔加入100μL按1：3000稀释的Anti-His-HRP，室温震荡1h后弃去抗体并使用PBST清洗。10.5)加入100μL TMB底物室温轻微震荡至样品明显产生蓝色，然后加入100μL 1M HCl终止反应，并在OD450nm处测定OD值。
用ELISA法分析VHH-21和VHH-43稀释不同浓度(500、125、31.25、7.81、1.95、0.49、0.12和0.03nM)后分别与S1 Alpha和S1 Delta亲和作用；用竞争ELISA法分析VHH-21和VHH-43稀释不同浓度(1000、333.33、111.11、37.04、12.35、4.12和1.37nM)后分别与S1 Alpha和S1 Delta抑制作用，并用三参数-非线性拟合计算得IC50。结果如图5所示：VHH-21和VHH-43对突变株Alpha B.1.1.7和Delta B.1.617.2具有明显的亲和力(图5中A和B)，同时具有很强的抑制作用(图5中C和D)，计算得到的IC50结果如图5中E所示。
11、生物层干涉法(BLI)检测VHH-21和VHH-43与S1 Omicron BA.2的亲和作用
11.1)S1 Omicron BA.2生物素化：使用生物素-N-琥珀酰亚胺基酯并按照其说明书操作对抗原S1 Omicron BA.2进行生物素化，使其可以连接在分子相互作用仪配套的链霉素亲和素生物传感器上并用于检测。11.2)将已生物素化的S1 Omicron BA.2-Bio使用PBS稀释至0.1mg/mL；分别使用PBS稀释单域抗体成4个不同的浓度；按照说明书进行开机及程序设定，并提前水化链霉素亲和素生物传感器10min以上；然后使用150μL PBS平衡传感器直至基线平稳；将150μL S1 Omicron BA.2-Bio放入样品槽中使抗原分子偶联到传感器上；使用150μL PBS平衡传感器直至基线平稳；使用150μL特定浓度的单域抗体同传感器上偶联的抗原分子进行结合；将结合单域抗体的生物传感器放入150μL PBS中测定抗原抗体分子的解离。11.3)重新装载新的链霉素亲和素生物传感器同抗原分子进行偶联，测定多个不同浓度抗体与抗原分子的结合与解离。11.4)完成多个浓度的结合与解离后，使用仪器专用分析工具BLItz Pro 1.3.0.2分析数据，得到平衡解离常数kD。
结果如图6所示：Omicron BA.2的S1与VHH-21(图6中A)和VHH-43(图6中B)的亲和常数kD分别为1.33和0.59μM，证明与Omicron BA.2均具有良好的亲和作用。
12、检测VHH-21和VHH-43中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合作用
12.1)细胞铺板：将待感染的HEK293T-ACE2细胞接种于96孔细胞培养板中，接种量约为2×104，至于培养箱过夜培养，使得次日进行病毒感染时，细胞接种密度约30％。12.2)取SARS-CoV-2-GFP假病毒和单域抗体于4℃融化后，于室温混合孵育1h(单域抗体用DMEM完全培养基分别配制成终浓度为0、0.03、0.3、3、30和300nM；假病毒终浓度为6.3×104TU/mL)。12.3)取出提前铺好的HEK293T-ACE2细胞，将上层培养基弃去，吸取上述10.2孵育好的假病毒-单域抗体混合液100μL到铺好HEK293T-ACE2细胞的96孔板中，三个复孔，于细胞培养箱中感染6h后换新鲜的DMEM完全培养基继续培养48h，用荧光显微镜观察假病毒的感染情况。12.4)于48h后，用荧光素酶试剂盒检测SARS-CoV-2-GFP假病毒感染细胞后的荧光信号并按下述公式计算分析单域抗体的中和作用。
其中，N指加了单域抗体组别的荧光信号；N0指单域抗体终浓度为0组别的荧光信号。
结果如图7所示，使用不同浓度的单域抗体(0,0.03,0.3,3,30,和300nM)与带GFP-Luciferase的SARS-CoV-2假病毒共孵育后一起加到过表达ACE2的HEK293T细胞中培养；48h后在显微镜下观察GFP荧光(图7中A和C)，结果显示随着加入抗体浓度增加，荧光越少，表明VHH-21和VHH-43有明显的抑制SARS-CoV-2假病毒与ACE2结合并进入细胞的作用；使用荧光素酶试剂盒检测48h后Luciferase的信号(图7中B和D)，结果与显微镜下观察一致，抗体浓度越高，Luciferase的信号越低；根据实验组(含有单域抗体)和对照组(不含单域抗体)的Luciferase信号比值来表示中和作用，使用三参数-非线性拟合计算得到IC50为3.3nM和0.77nM。因此，VHH-21和VHH-43对SARS-CoV-2假病毒进入HEK293T-ACE2细胞具有明显的中和作用。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种抗新型冠状病毒及其突变株的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包括三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或者，
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；或者，
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2. 如权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.24-29中任意一种所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-2任一项所述的单域抗体。
4. 如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有如SEQ ID NO.30-35中任意一种所示的核苷酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3或4所述的核酸分子。
6.一种细胞，其特征在于，所述细胞能表达如权利要求权利要求1-2任一项所述的单域抗体，或者所述细胞中转染了如权利要求5所述的表达载体。
7.如权利要求1-2任一项所述的单域抗体在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
8.如权利要求1-2任一项所述的单域抗体在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
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