CN114773459A - 抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体及其制备方法与应用，提供了纳米抗体Nb‑H6，能够特异性针对新型冠状病毒及其变异株S1，能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS‑CoV‑2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb‑H6与Delta,Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力，有利于广泛应用。

Description

抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体及其制备方法与应用
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体及其制备方法与应用。
背景技术
严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2，简称新冠病毒) 是目前正肆虐全球的冠状病毒疾病2019 (COVID-19)的病原体。截至2022年5月18日世界卫生组织 (WHO)统计数据显示在全球范围内，COVID-19已导致超过5.2亿例确诊病例和620万例死亡。新冠病毒是β-冠状病毒科的一种单链RNA病毒，其RNA基因组编码4种主要结构蛋白：刺突蛋白(Spike protein, S)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, N)、跨膜蛋白(Membraneprotein, M) 和包膜蛋白(envelope protein, E)。研究发现，S蛋白负责附着在宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶-2 (Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2) 上，在病毒的内化中发挥作用，也定义了宿主组织的趋向性和病毒的传播能力。S蛋白主要有N末端的S1亚单位和C末端的S2亚单位组成，S1主要负责病毒与宿主受体结合，S2主要起到膜融合的作用，其中S1亚单位的受体结合域 (RBD) 是直接结合ACE2的关键区域。
由于SARS-CoV-2病毒具有非常高的突变特性，目前针对新冠病毒突变株引发的疫情的防控与防治依然是世界公共卫生的头号问题。据世界卫生组织 (WHO) 报道，已确定了值得关注的变体有: Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron，特别是Alpha、Delta以及Omicron突变体，是造成新冠肺炎大流行的主要病原体。目前主要的应对措施是接种疫苗以及现有药物再利用。然而，不断出现具有高传播力和逃避疫苗的变异株，使得疫苗在防治新冠病毒上面临了严峻的挑战。因此，具有靶向作用，能阻断S1与ACE2结合的中和抗体的开发为新冠肺炎的防治提供了一种新思路。
发明内容
本申请的目的在于提供一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏一种能够同时与新型冠状病毒及其变异株有效结合的纳米抗体的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体Nb-H6，其中，纳米抗体Nb-H6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
第二方面，本申请提供一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
提供目的蛋白抗原，将目的蛋白抗原包被在免疫管上并与噬菌体文库进行结合，得到目的蛋白抗原-噬菌体文库；
将目的蛋白抗原-噬菌体文库进行洗脱处理得到洗脱液，将洗脱液与辅助噬菌体进行混合培养并进行富集筛选，并进行单克隆抗体筛选，得到特异性纳米抗体序列；
将特异性纳米抗体序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向新冠病毒的纳米抗体。
第三方面，本申请提供一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。
第四方面，本申请提供一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本申请第一方面提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体Nb-H6，其中，纳米抗体Nb-H6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示；该纳米抗体Nb-H6能够特异性针对新型冠状病毒及其变异株的S1，纳米抗体Nb-H6为一种全新靶向S1蛋白的中和抗体，能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta, Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；并且，该单域抗体适用的表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本，且由于该单域抗体为单结构域抗体，所以其抗体的多组合形式改造更为简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应，该单域抗体的亲和力范围更为宽泛，为后期不同用途的抗体提供多个选择，该单域抗体可以偶联药物分子起到双重或多重靶点治疗作用，应用范围更广。
本申请第二方面提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，该制备方法使用天然的纳米抗体-噬菌体文库筛选得到与新型冠状病毒蛋白S1具有亲和作用的纳米抗体，得到的纳米抗体Nb-H6能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta, Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；有利于后续纳米抗体的广泛应用。
本申请第三方面提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用，由于纳米抗体Nb-H6能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta, Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；因此，有利于在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。
本申请第四方面提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用；由于纳米抗体Nb-H6能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta, Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；因此，有利于在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的纳米抗体筛选流程示意图。
图2是本申请实施例提供的第三轮富集后用噬菌体-ELISA法筛选分离单个阳性噬菌体克隆分析图。
图3是本申请实施例提供的纳米抗体表达纯化及亲和力验证分析图。
图4是本申请实施例提供的Nb-H6对S1的亲和力以及抑制作用分析图。
图5是本申请实施例提供的Nb-H6与新型冠状病毒SARS-COV2 突变株的突刺蛋白的亲和作用分析图。
图6是本申请实施例提供的检测Nb-H6对SARS-COV2 假病毒与ACE2结合的中和作用分析图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项（个）或复数项（个）的任意组合。例如，“ a,b,或c中的至少一项（个）”，或，“a,b,和c中的至少一项（个）”，均可以表示：a, b, c, a-b（即a和b）, a-c, b-c, 或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是µg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX 。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体Nb-H6，其中，纳米抗体Nb-H6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
本申请实施例第一方面提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体Nb-H6，其中，纳米抗体Nb-H6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示；该纳米抗体Nb-H6能够特异性针对新型冠状病毒及其变异株的S1，纳米抗体Nb-H6为一种全新的靶向S1蛋白的中和抗体，能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta, Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；并且，该单域抗体适用的表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本，且由于该单域抗体为单结构域抗体，所以其抗体的多组合形式改造更为简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应，该单域抗体的亲和力范围更为宽泛，为后期不同用途的抗体提供多个选择，该单域抗体可以偶联药物分子起到双重或多重靶点治疗作用，应用范围更广。
在一些实施例中，纳米抗体Nb-H6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，其中，Seq.IDNO.1具体为：
QLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASERALSSFHMGWFRQAPGKQRAFVAAIKWRDGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLEPEDTAVYYCYYRGRWGT YWGQGTQVTVSS。
在一些实施例中，纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。
其中，纳米抗体Nb-H6中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2为QLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAS。
FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3为MGWFRQAPGKQRAFV。
FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4为YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLEPEDTAVYYC。
FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5为YWGQGTQVTVSS。
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.6为ERALSSFH。
CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，SEQ ID NO.7为AAIKWRDGTTY。
CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，SEQ ID NO.8为YYRGRWGT。
在一些实施例中，纳米抗体Nb-H6的碱基序列如Seq.ID NO.9所示，Seq.ID NO.9为：
CAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGAACGGGCCTTAAGTAGCTTTCACATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGTGCGTTTGTAGCAGCGATTAAGTGGCGTGATGGTACTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTTATTATCGTGGGCGTTGGGGGACCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGC。
本申请实施例第二方面提供一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
S01.提供目的蛋白抗原，将目的蛋白抗原包被在免疫管上并与噬菌体文库进行结合，得到目的蛋白抗原-噬菌体文库；
S02. 将目的蛋白抗原-噬菌体文库进行洗脱处理得到洗脱液，将洗脱液与辅助噬菌体进行混合培养并进行富集筛选，并进行单克隆抗体筛选，得到特异性纳米抗体序列；
S03. 将特异性纳米抗体序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向新冠病毒的纳米抗体。
本申请实施例第二方面提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，该制备方法使用天然的纳米抗体-噬菌体文库筛选得到与新型冠状病毒蛋白S1具有亲和作用的纳米抗体，得到的纳米抗体Nb-H6能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta,Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；有利于后续纳米抗体的广泛应用。
步骤S01中，提供目的蛋白抗原，将目的蛋白抗原包被在免疫管上并与噬菌体文库进行结合，得到目的蛋白抗原-噬菌体文库。
在一些实施例中，噬菌体文库的扩增包括如下步骤：
1) 挑取E. coli TG1单克隆菌株至 100 mL 含10mg/L Tet 的2×YT 培养基中37℃ ，200rpm 震荡培养至对数增长期 ( OD 600 nm = 0.5 )；
2) 将储存于-20℃ 的VHH噬菌体天然文库取 100 μL -200 μL加到 1 中的E. coli TG1 菌液中，于37℃ 静置孵育1 h；
3) 加入400 mL 2×YT（含有2% glucose, 100 mg/L Amp），37℃，200 rpm震荡培养，至OD600 nm = 0.5后，加入辅助噬菌体 M13KO7 ( 终浓度为1010 pfu/mL )，于37℃ 静置孵育1 h；
4) 将上述500 mL 菌液于6000 rpm 离心 15 min，弃上清（除去葡萄糖、游离的噬菌体以及游离的辅助噬菌体），取沉淀（被噬菌体和辅助噬菌体同时感染了的E. coli TG1）用500 mL 2×YT（含有 100 mg/L Amp,50 mg/L Kan，50μM IPTG）液体培养基中在无菌条件下重悬，并转移液体至三角瓶中，37℃, 200 rpm过夜培养；
5) 将过夜培养的菌离心 (8000 rpm , 20 min)，分离上清至新的离心管中，加入1/4 体积的PEG 8000/NaCl 溶液混匀，于4℃ 静置2 h以沉淀噬菌体；
6) 4℃ 离心 (10,000 rpm，20 min)，弃上清，收集沉淀；
7) 使用5 mL PBS 缓冲液重悬上述沉淀，然后4000 rpm 离心1 min，沉淀不溶于PBS的物质，分离并转移上清至无菌的离心管中，4℃ 保存备用。
8) 取少量扩增后的文库上清按照10-1到10-14 梯度稀释；
9) 分别取 100μL 各梯度稀释的样品（十分之一）加到 400μL（OD600 nm = 1.0）新鲜E. coli TG1 菌液中混匀，然后加入 4mL 上层琼脂（0.7% 琼脂，45℃）混匀后倾注到无抗性的 2×YT 固体培养基上，待上层琼脂凝固后 37℃ 过夜培养；得到噬菌体文库。
进一步，提供目的蛋白抗原，将目的蛋白抗原包被在免疫管上并与噬菌体文库进行结合，得到目的蛋白抗原-噬菌体文库。
在一些实施例中，目的蛋白抗原的浓度为40~50 μg/mL。
在一些实施例中，将目的蛋白抗原包被在免疫管上并与噬菌体文库进行结合，得到目的蛋白抗原-噬菌体文库；具体步骤包括：
1) 包被：用PBS配制终浓度 40 μg/mL 的抗原S1，在高吸附免疫管中，加 800μL抗原蛋白，4 ℃过夜包被，而后弃去管内溶液，PBST溶液1mL洗涤5次；
2) 封闭：加入1mL封闭液（交替用5%脱脂牛奶和0.5% BSA），室温下孵育1h后弃去管内溶液，PBST溶液1 mL洗涤5次；
3) 加文库：加入 800μL 扩增后噬菌体文库，室温孵育1h 后弃液体，1mL PBST 清洗 5 次；得到目的蛋白抗原-噬菌体文库。
步骤S02中，将目的蛋白抗原-噬菌体文库进行洗脱处理得到洗脱液，将洗脱液与辅助噬菌体进行混合培养并进行富集筛选，并进行单克隆抗体筛选，得到特异性纳米抗体序列；
在一些实施例中，富集筛选的步骤中，进行3~4轮富集筛选。
在一些实施例中，进行富集筛选的步骤，具体包括：
1) 噬菌体的洗脱：在目的蛋白抗原-噬菌体文库中，加800 μL的0.1 M HCl溶液，室温孵10 min洗脱与抗原特异性结合的噬菌体，收集洗脱液800 μL于1.5 mL离心管中，加入1 M Tris-HCl 64 μL充分混匀以中和洗脱的噬菌体中的HCl，4℃ 保存；
2) 感染细菌：将洗脱下来的噬菌体加入到用 10 mL 的 2×YT（含有10 mg/LTet）液体培养基培养的E. coli TG1（OD600 nm = 0.5）菌液中，37℃ 孵育1h；加入 40 mL的 2×YT（含有2% glucose, 100 mg/L Amp）液体培养基，37℃，200 rpm 震荡培养至OD600 nm = 0.5；
3) 辅助噬菌体超感染：向这50 mL 菌液，加入辅助噬菌体 M13KO7 达到 1010pfu/mL 的终浓度，37℃，200 rpm 震荡培养 1 h；
4) 筛选扩增噬菌体：将50 mL菌液 5000 rpm 离心 10 min，弃上清（除去含葡萄糖、游离的噬菌体、和游离的辅助噬菌体），取沉淀用50 mL 2×YT（含有 100 mg/L Amp, 50mg/L Kan，50 μM IPTG）液体培养基中重悬，并转移液体至 250 mL 三角瓶中，37℃, 200rpm 过夜培养(文库中的噬菌体具有氨苄青霉素抗性，辅助噬菌体M13KO7有卡那霉素抗性，故加双抗生素可筛选得到被文库噬菌体和辅助噬菌体同时感染了的E. coli TG1)。
5) 将过夜培养的菌 7000 rpm 离心，20 min，取40 mL上清，加入10 mL PEG8000/NaCl 溶液(菌液上清：PEG 8000/NaCl = 1：4 )，混匀后冰上静置1h以沉淀噬菌体。其余上清4℃ 保存，用于测定每轮筛选效价；
6) 于4℃ 离心 (10000 rpm , 20 min) 弃上清后，用1 mL PBS重悬沉淀，4000rpm 离心1min 去除不溶于PBS的物质，得到用于下一轮筛选的噬菌体文库，以此为一轮筛选；
7) 对得的噬菌体文库进行滴度测定，方法同S01的步骤8-9；
8) 重复以上步骤进行3轮筛选。通过滴度计算富集程度和筛选效果，当富集比（与第一轮筛选的回收率比值）大于100倍以上时，认为筛选足够，进行ELISA检测。
进一步，进行单克隆抗体筛选，得到特异性纳米抗体序列。
在一些实施例中，进行单克隆抗体筛选，得到特异性纳米抗体序列的具体步骤包括：
1) 把第3轮筛选所洗脱的噬菌体文库加入到 10 mL 用 2×YT（含有10 mg/LTet）液体培养基培养的E. coli TG1 (OD 600nm = 0.5) 菌液，37℃ 孵育1 h；
2) 按10-1到10-4进行梯度稀释，然后各取100 μL 均匀涂布于 2×YT (含有 100mg/L Amp) 固体平板上，37℃ 过夜培养；
3) 在过夜培养的平板上随机挑取96 个明显的单菌落于分装有2×YT (含2%glucose, 100 mg/L Amp) 液体培养基400 μL，的96孔深孔板中，37℃ ，200 rpm 培养至OD600nm= 0.5；
4) 加入400 μL 2×YT液体培养基和终浓度为100 mg/L Amp，50 mg/L Kan，50 μMIPTG，以及1010 M13KO7 辅助噬菌体，37℃ ，200 rpm 过夜培养；
5) 5000 rpm离心10 min，得到的上清为融合了纳米抗体的单克隆噬菌体，转移上清到无菌的带封口膜的96孔深孔板中，4℃ 保存备用。
6) 用PBS配制终浓度 40 μg/mL 的抗原S1，在高吸附的96酶标板加100 μL/孔抗原蛋白，4℃过夜包被后弃去液体，用 200 μL PBST 清洗 5 次；
7) 加入 200 μL 封闭液（5%脱脂牛奶或 0.5% BSA），室温封闭 1 h后弃液体，用200μL PBST清洗 5 次；
8) 分别加入步骤5中的菌液上清 100 μL，室温轻微震荡 2 h后弃去液体，使用200μL PBST清洗5次；
9) 每孔加入100 µL稀释8000倍M13 Bacteriophage Antibody (HRP),MouseMab，室温孵育1h后弃去抗体，使用200 μL PBST清洗 5 次；
10) 加入 100μL TMB 底物室温轻微震荡至样品明显产生蓝色，加入100 μL 1MHCl终止反应并在 OD450 nm 处测定吸光度；
11) 选取步骤10中具有明显阳性的单克隆菌液上清，各取 100 μL上清，重复步骤6-10作为实验组，同时以相同浓度BSA替换抗原S1包被于酶标板中，进行与实验组相同的实验作为阴性对照组，以实验组与对照组吸光度的比值来判断阳性克隆，从筛选出S1特异性纳米抗体。
步骤S03中，将特异性纳米抗体序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向新冠病毒的纳米抗体。
具体步骤包括：先进行特异性S1蛋白的纳米抗体质粒提取及序列鉴定，
1) 分别取筛选得到的S1特异性纳米抗体菌液上清30 μL加入到270 μL E.coliTG1 ( OD 600 nm =0.5 ) 菌液中37℃ 孵育1 h后，转移至10 mL 2×YT (含100 mg/LAmp) 培养基中 37℃ ，200rpm 过夜培养；
2) 质粒提取使用Omega Bio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I（200），按照说明书提取；
3) 送样测序；通过测序结果进行氨基酸序列比对，以分析筛选的纳米抗体是否有相同。
进一步，确定了序列之后，再进行纳米抗体表达纯化。
在一些实施例中，表达载体选自pET23a载体。宿主细胞选自大肠杆菌。
具体步骤包括：
1) 将pET23a-Nb-H6重组质粒转化到表达感受态细胞E.coli BL21 ( DE3 )中：
从-80℃ 取感受态细胞50 μL于冰浴上融化；加入1 μL重组质粒于感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30 min；于42 ℃ 水浴中热激90 s，立即于冰上放置2-3 min；加入SOC液体培养基500 μL，于37 ℃ 恒温摇床250 rpm 振荡培养1 h；取100 μL菌液均匀涂布于含100mg/L Amp的LB固体培养基上，先放置在37℃ 恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来于37℃ 恒温培养箱过夜。
2) 挑取单菌落于6 mL的 LB 培养基中， 37℃、250 rpm 培养5h，然后按 1:100转接到新鲜的 250 mL LB培养基中 37℃、250 rpm 条件培养；待菌液 OD 600 nm=0.6-0.8时，加终浓度为0.5 mM IPTG 诱导剂，16℃诱导培养15 h。
3) 将培养后菌液 4000 rpm, 10 min 离心收集菌体，然后用 Binding buffer(50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，20 mM咪唑，pH为7.4) 重悬细菌，并进行超声破碎（350W，work 5s，off 3s，时间 20 min）。然后 18000 rpm, 4℃离心 15 min，收集上清，0.45 μm滤膜过滤，置冰上；
4) 将5 mL HisTrap FF 预装柱与蠕动泵连接使用Binding Buffer 以每分钟1mL 的流速冲洗镍柱5-10个柱体积，以平衡镍柱；将过蛋白样品溶液以1 mL/min 的流速通过5 mL HisTrap FF预装柱进行亲和层析；在所有样品通过层析柱后继续使用BindingBuffer冲洗镍柱5-10个柱体积，洗下可能存在非特异性吸附的杂蛋白；使用镍柱ElutionBuffer (50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，500 mM咪唑，pH为7.4) 洗脱并收集吸附在镍柱上的蛋白；
5) 对收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测；蛋白浓度使用Pierce™ BCA 蛋白定量试剂盒进行测定，再进行后续分析。
本申请实施例第三方面提供了抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。
本申请实施例第三方面提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用，由于纳米抗体Nb-H6能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta, Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；因此，有利于在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。
本申请实施例第四方面提供了抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本申请实施例第四方面提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用；由于纳米抗体Nb-H6能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta, Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；因此，有利于在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体Nb-H6及其制备方法
制备方法如图1所示，具体如下：
1. 天然文库的扩增与滴定：
1) 挑取E. coli TG1单克隆菌株至 100 mL 含10mg/L Tet 的2×YT 培养基中37℃ ，200rpm 震荡培养至对数增长期 ( OD 600 nm = 0.5 )；
2) 将储存于-20℃ 的VHH噬菌体天然文库取 100 μL -200 μL加到 1 中的E. coli TG1 菌液中，于37℃ 静置孵育1 h；
3) 加入400 mL 2×YT（含有2% glucose, 100 mg/L Amp），37℃，200 rpm震荡培养，至OD600 nm = 0.5后，加入辅助噬菌体 M13KO7 ( 终浓度为1010 pfu/mL )，于37℃ 静置孵育1 h；
4) 将上述500 mL 菌液于6000 rpm 离心 15 min，弃上清（除去葡萄糖、游离的噬菌体以及游离的辅助噬菌体），取沉淀（被噬菌体和辅助噬菌体同时感染了的E. coli TG1）用500 mL 2×YT（含有 100 mg/L Amp,50 mg/L Kan，50μM IPTG）液体培养基中在无菌条件下重悬，并转移液体至三角瓶中，37℃, 200 rpm过夜培养；
5) 将过夜培养的菌离心 (8000 rpm , 20 min)，分离上清至新的离心管中，加入1/4 体积的PEG 8000/NaCl 溶液混匀，于4℃ 静置2 h以沉淀噬菌体；
6) 4℃ 离心 (10,000 rpm，20 min)，弃上清，收集沉淀；
7) 使用5 mL PBS 缓冲液重悬上述沉淀，然后4000 rpm 离心1 min，沉淀不溶于PBS的物质，分离并转移上清至无菌的离心管中，4℃ 保存备用。
8) 取少量扩增后的文库上清按照10-1到10-14梯度稀释；
9) 分别取 100μL 各梯度稀释的样品（十分之一）加到 400μL（OD600 nm = 1.0）新鲜E. coli TG1 菌液中混匀，然后加入 4mL 上层琼脂（0.7% 琼脂，45℃）混匀后倾注到无抗性的 2×YT 固体培养基上，待上层琼脂凝固后 37℃ 过夜培养；
10) 对噬菌斑进行计数，并计算出噬菌体的滴度。
2. 筛选抗新型冠状病毒S1蛋白的纳米抗体
1) 包被：用PBS配制终浓度 40 μg/mL 的抗原S1，在高吸附免疫管中，加 800μL抗原蛋白， 4 ℃ 过夜包被，而后弃去管内溶液，PBST溶液1mL洗涤5次；
2) 封闭：加入1mL封闭液（交替用5%脱脂牛奶和0.5% BSA）封闭反应孔，室温下孵育1h后弃去管内溶液，PBST溶液1 mL洗涤5次；
3) 加文库：加入 800μL 扩增后噬菌体文库，室温孵育1h 后弃液体，1mL PBST 清洗 5 次；
4) 噬菌体的洗脱：加800 μL的0.1 M HCl溶液，室温孵10 min洗脱与抗原特异性结合的噬菌体，收集洗脱液800 μL于1.5 mL离心管中，加入1 M Tris-HCl 64 μL充分混匀以中和洗脱的噬菌体中的HCl，4℃ 保存；
5) 感染细菌：将洗脱下来的噬菌体加入到用 10 mL 的 2×YT（含有10 mg/LTet）液体培养基培养的E. coli TG1（OD600 nm = 0.5）菌液中，37℃ 孵育1h；加入 40 mL的 2×YT（含有2% glucose, 100 mg/L Amp）液体培养基，37℃，200 rpm 震荡培养至OD600 nm = 0.5；
6) 辅助噬菌体超感染：向这50 mL 菌液，加入辅助噬菌体 M13KO7 达到 1010pfu/mL 的终浓度，37℃，200 rpm 震荡培养 1 h；
7) 筛选扩增噬菌体：将50 mL菌液 5000 rpm 离心 10 min，弃上清（除去含葡萄糖、游离的噬菌体、和游离的辅助噬菌体），取沉淀用50 mL 2×YT（含有 100 mg/L Amp, 50mg/L Kan，50 μM IPTG）液体培养基中重悬，并转移液体至 250 mL 三角瓶中，37℃, 200rpm 过夜培养(文库中的噬菌体具有氨苄青霉素抗性，辅助噬菌体M13KO7有卡那霉素抗性，故加双抗生素可筛选得到被文库噬菌体和辅助噬菌体同时感染了的E. coli TG1)。
8) 将过夜培养的菌 7000 rpm 离心，20 min，取40 mL上清，加入10 mL PEG8000/NaCl 溶液(菌液上清：PEG 8000/NaCl = 1：4 )，混匀后冰上静置1h以沉淀噬菌体。其余上清4℃ 保存，用于测定每轮筛选效价；
9) 于4℃ 离心 (10000 rpm , 20 min) 弃上清后，用1 mL PBS重悬沉淀，4000rpm 离心1min 去除不溶于PBS的物质，得到用于下一轮筛选的噬菌体文库，以此为一轮筛选；
10) 对得的噬菌体文库进行滴度测定，方法同的步骤1.中8-9；
11) 重复以上步骤进行3轮筛选。通过滴度计算富集程度和筛选效果，当富集比（与第一轮筛选的回收率比值）大于100倍以上时，认为筛选足够，进行ELISA检测。
3. 噬菌体-ELISA检测阳性单克隆
1) 把第3轮筛选所洗脱的噬菌体文库加入到 10 mL 用 2×YT（含有10 mg/LTet）液体培养基培养的E. coli TG1 (OD 600nm = 0.5) 菌液，37℃ 孵育1 h；
2) 按10-1到10-4进行梯度稀释，然后各取100 μL 均匀涂布于 2×YT (含有 100mg/L Amp) 固体平板上，37℃ 过夜培养；
3) 在过夜培养的平板上随机挑取96 个明显的单菌落于分装有2×YT (含2%glucose, 100 mg/L Amp) 液体培养基400 μL，的96孔深孔板中，37℃ ，200 rpm 培养至OD600nm= 0.5；
4) 加入400 μL 2×YT液体培养基和终浓度为100 mg/L Amp，50 mg/L Kan，50 μMIPTG，以及1010 M13KO7 辅助噬菌体，37℃ ，200 rpm 过夜培养；
5) 5000 rpm离心10 min，得到的上清为融合了纳米抗体的单克隆噬菌体，转移上清到无菌的带封口膜的96孔深孔板中，4℃ 保存备用。
6) 用PBS配制终浓度 40 μg/mL 的抗原S1，在高吸附的96酶标板加100 μL/孔抗原蛋白，4℃过夜包被后弃去液体，用 200 μL PBST 清洗 5 次；
7) 加入 200 μL 封闭液（5%脱脂牛奶或 0.5% BSA），室温封闭 1 h后弃液体，用200μL PBST清洗 5 次；
8) 分别加入步骤5中的菌液上清 100 μL，室温轻微震荡 2 h后弃去液体，使用200μL PBST清洗5次；
9) 每孔加入100 µL稀释8000倍M13 Bacteriophage Antibody (HRP),MouseMab，室温孵育1h后弃去抗体，使用200 μL PBST清洗 5 次；
10) 加入 100μL TMB 底物室温轻微震荡至样品明显产生蓝色，加入100 μL 1MHCl终止反应并在 OD450 nm 处测定吸光度；
11) 选取步骤10中具有明显阳性的单克隆菌液上清，各取 100 μL上清，重复步骤6-10作为实验组，同时以相同浓度BSA替换抗原S1包被于酶标板中，进行与实验组相同的实验作为阴性对照组，以实验组与对照组吸光度的比值来判断阳性克隆，从筛选出S1特异性纳米抗体。
4. 特异性S1蛋白的纳米抗体质粒提取及序列鉴定
1) 分别取3. 11中筛选得到的S1特异性纳米抗体菌液上清30 μL加入到270 μL E.coli TG1 ( OD 600 nm =0.5 ) 菌液中37℃ 孵育1 h后，转移至10 mL 2×YT (含100mg/L Amp) 培养基中 37℃ ，200rpm 过夜培养；
2) 质粒提取使用Omega Bio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I（200），按照说明书提取；
3) 送样测序；通过测序结果进行氨基酸序列比对，以分析筛选的纳米抗体是否有相同。
5. 纳米抗体表达纯化
1) 将pET23a-Nbs重组质粒转化到表达感受态细胞E.coli BL21 ( DE3 )中：
从-80℃ 取感受态细胞50 μL于冰浴上融化；加入1 μL重组质粒于感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30 min；于42 ℃ 水浴中热激90 s，立即于冰上放置2-3 min；加入SOC液体培养基500 μL，于37 ℃ 恒温摇床250 rpm 振荡培养1 h；取100 μL菌液均匀涂布于含100mg/L Amp的LB固体培养基上，先放置在37℃ 恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来于37℃ 恒温培养箱过夜。
2) 挑取单菌落于6 mL的 LB 培养基中， 37℃、250 rpm 培养5h，然后按 1:100转接到新鲜的 250 mL LB培养基中 37℃、250 rpm 条件培养；待菌液 OD 600 nm=0.6-0.8时，加终浓度为0.5 mM IPTG 诱导剂，16℃诱导培养15 h。
3) 将培养后菌液 4000 rpm, 10 min 离心收集菌体，然后用 Binding buffer(50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，20 mM咪唑，pH为7.4) 重悬细菌，并进行超声破碎（350W，work 5s，off 3s，时间 20 min）。然后 18000 rpm, 4℃离心 15 min，收集上清，0.45 μm滤膜过滤，置冰上；
4) 将5 mL HisTrap FF 预装柱与蠕动泵连接使用Binding Buffer 以每分钟1mL 的流速冲洗镍柱5-10个柱体积，以平衡镍柱；将过蛋白样品溶液以1 mL/min 的流速通过5 mL HisTrap FF预装柱进行亲和层析；在所有样品通过层析柱后继续使用BindingBuffer冲洗镍柱5-10个柱体积，洗下可能存在非特异性吸附的杂蛋白；使用镍柱ElutionBuffer (50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，500 mM咪唑，pH为7.4) 洗脱并收集吸附在镍柱上的蛋白；
5) 对收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测；蛋白浓度使用Pierce™ BCA 蛋白定量试剂盒进行测定。
得到的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体Nb-H6的氨基酸序列如Seq.IDNO.1所示，其中，Seq.ID NO.1具体为：QLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASERALSSFHMGWFRQAPGKQRAFVAAIKWRDGTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLEPEDTAVYYCYYRGRWGT YWGQGTQVTVSS。
性质测试：
（一）ELISA法检测纳米抗体与S1的亲和作用
测试方法：
（1）用PBS配制终浓度4 μg/mL的抗原S1，在高吸附的八孔酶标条中，加100 μL/孔抗原蛋白，4℃ 过夜包被后弃液体，200 μL PBST 清洗 5 次；
（2）加入 200 μL 封闭液（5 % BSA），室温封闭 1 h后弃去液体，用200 μL PBST清洗 5 次；
（3）加入100 μL /孔倍比稀释的纳米抗体，于室温孵育 1 h后弃液体，用 200 μLPBS 清洗 5 次；
（4）每孔加入100 μL按1：3000 稀释的 Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT，室温轻微震荡 1 h后弃去抗体并使用 200 μL PBST 清洗5 次；
（5）加入 100 μL TMB底物室温轻微震荡至样品明显产生蓝色，然后加入100 μL 1M HCl终止反应，并在OD 450 nm 处测定其OD值。
（二）生物层干涉法 (BLI) 检测Nb-H6与S1的亲和作用
（1）S1生物素化：使用生物素-N-琥珀酰亚胺基酯 ( NHS-Biotin ) 并按照其说明书操作对抗原S1进行生物素化，使其可以连接在分子相互作用仪配套的链霉素亲和素生物传感器上并用于检测；
（2）将已生物素化的S1 (S1-Bio) 使用PBS稀释至0.1 mg/mL；分别使用PBS稀释纳米抗体成4个不同的浓度；按照说明书进行开机及程序设定，并提前水化链霉素亲和素生物传感器10 min以上；然后使用150 μL PBS平衡传感器直至基线平稳；将150 μL S1-Bio放入样品槽中使抗原分子偶联到传感器上；使用150 μL PBS平衡传感器直至基线平稳；使用150μL特定浓度的纳米抗体同传感器上偶联的抗原分子进行结合；将结合纳米抗体的生物传感器放入150 μL PBS中测定抗原抗体分子的解离；
（3）重新装载新的链霉素亲和素生物传感器同抗原分子进行偶联，测定多个不同浓度抗体与抗原分子的结合与解离；
（4）完成多个浓度的结合与解离后，使用仪器专用分析工具BLItz Pro 1.3.0.2分析数据，得到平衡解离常数kD。
（三）竞争ELISA法检测Nb-H6对S1与ACE2结合的抑制作用
（1）用PBS配制终浓度4 μg/mL的S1，在高吸附的八孔酶标条中加100 μL/孔，4℃过夜包被后弃液体，200 μL PBST 清洗 5 次；
（2）加入 200 μL 封闭液（5 % BSA），室温封闭 1 h后弃去液体，用200 μL PBST清洗 5 次；
（3）将倍比稀释的纳米抗体与S1 (终浓度为4 μg/mL；不加入纳米抗体的为对照组A0) 混匀后，加入到封闭好的96孔板中，室温孵育 1 h后弃液体，用 200 μL PBST 清洗 5次；
（4）每孔加入100 μL按1：3000 稀释的 Anti-mouse-Fc-HRP，室温轻微震荡 1 h后弃去抗体并使用 200 μL PBST 清洗5 次；
（5）加入 100 μL TMB底物室温轻微震荡至样品明显产生蓝色，然后加入100 μL 1M HCl终止反应，并在OD450 nm 处测定其OD值。
（四） BLI检测Nb-H6与SARS-COV2 突变株S1蛋白的亲和作用
（1）把SARS-COV2 突变株的突刺蛋白 (S1 Alpha B.1.1.7, Delta B.1.617.2,和 Omicron BA.2) 生物素化，方法同“生物层干涉法 (BLI) 检测Nb-H6与S1的亲和作用”；
（2）用BLI法检测生物素化的S1突变蛋白与Nb-H6的结合解离，方法同“生物层干涉法 (BLI) 检测Nb-H6与S1的亲和作用”。
（五）检测Nb-H6中和SARS-COV2 假病毒与ACE2的结合作用
（1）细胞铺板：将待感染的HEK293T-ACE2细胞接种于96孔细胞培养板中，接种量约为2×104，至于培养箱过夜培养，使得次日进行病毒感染时，细胞接种密度约30%。
（2）取SARS-COV2-GFP 假病毒和纳米抗体于4℃融化后，于室温混合孵育1h；（纳米抗体用DMEM完全培养基分别配制成终浓度为0, 0.625, 2.5, 8, 10, 和50 μM；假病毒终浓度为6.3×104 TU/mL）
（3）取出提取铺好的HEK293T-ACE2细胞，将上层培养基弃去，吸取上述2中孵育好的假病毒-纳米抗体混合液100 μL到铺好HEK293T-ACE2细胞的96孔板中，三个复孔，于细胞培养箱中感染6 h后换新鲜的DMEM完全培养基继续培养48 h，并在不同时间段下用荧光显微镜观察假病毒的感染情况；
（4）48 h后，用胰酶把细胞消化下来，进行流式分析，在波长488 nm下检测SARS-COV2-GFP 假病毒感染细胞后的GFP，并按下述公式计算分析纳米抗体的中和作用。
中和作用 (%)=(1-(N GFP-空白)/(N0 GPF-空白))%；
其中N是指加了纳米抗体的组别；N0是指纳米抗体终浓度为0的组别。
结果分析
1. 纳米抗体富集筛选结果分析
通过每一轮纳米抗体输出量与输入量的比值来分析筛选的回收率和富集倍数，在经过三轮筛选后，富集倍数（富集倍数是指每一轮筛选的回收率与第一轮相较于第一轮回收率的比值）达到143.8倍(表1)，证明筛选过程有效的富集了与S1特异性结合的纳米抗体。
表1
Figure 222637DEST_PATH_IMAGE001
2. 第三轮富集后用噬菌体-ELISA法筛选分离单个阳性噬菌体克隆分析
如图2所示，分离第三轮筛选后的单个噬菌体并随机挑取与S1进行ELISA实验（图2的A）；随后挑出亲和力最好的前15个单克隆进行二次ELISA验证，为了排除假阳性，使用BSA为阴性对照，与阴性对照的OD450比值大于2为阳性克隆，得到4个阳性克隆分别为1，3，4和8(图2的B)。
3. 纳米抗体表达纯化及亲和力验证。
把筛选得到的纳米抗体表达纯化并进行SDS-PAGE凝胶电泳验证，结果如图3所示，由图3的A可以看出，Nb-H6, Nb-G7, 和Nb-B7的分子量分别为15.4, 16.7,和16 kDa, 于SDS-PAGE凝胶电泳上蛋白条带大小相符；分别把三个纯化后的纳米抗体蛋白与S1蛋白进行ELISA验证，结果如图3的B所示, 三个纳米抗体分别稀释至终浓度为200, 50, 12.5,3.12, 0.78, 0.2, 和0.049 nM，从结果可得，Nb-H6与S1的亲和力最好，故后续实验选用Nb-H6进行。
4. Nb-H6对S1的亲和力以及抑制作用
为了研究Nb-H6对S1与人源的ACE2结合的抑制作用，如图4的A所示，提供BLI技术分析不同浓度的Nb-H6 与S1的相互作用；进一步，如图4的B所示，使用竞争ELISA的方法进行分析，把Nb-H6稀释至终浓度为42.5, 14.16, 10, 4, 1.33, 0.44, 0.12和0.014 μM，与终浓度为4 μg/mL的hACE2混合均匀后，一起加入到包被好的S1中进行反应，结果表明Nb-H6对S1与人源的ACE2结合有抑制作用，用四参数-非线性拟合，计算得IC50为9.8 μM。
5. Nb-H6与新型冠状病毒SARS-COV2 突变株的突刺蛋白的亲和作用
为了探究Nb-H6与SARS-COV2 突变株的突刺蛋白的作用，使用BLI法检测AlphaB.1.1.7, Delta B.1.617.2, 以及 Omicron BA.2的S1与Nb-H6的亲和作用，结果显示Nb-H6不仅与野生型的S1有亲和作用，与其突变株Alpha B.1.1.7 (图5的A), DeltaB.1.617.2 (图5的B), 以及 Omicron BA.2 (图5的C)的S1均具有一定的亲和作用，对应亲和常数kD分别为1.08, 1.12 以及0.2 μM，与Omicron BA.2的亲和力最好。
6. 检测Nb-H6对SARS-COV2 假病毒与ACE2结合的中和作用
为了检测Nb-H6对SARS-COV2 假病毒进入过表达ACE2细胞系的中和作用，使用不同浓度的Nb-H6 (0, 0.625, 2.5, 8, 10, 和50 μM) 与带GFP的SARS-COV2 假病毒共孵育后一起加到过表达ACE2的HEK293T细胞中培养；48 h后在显微镜下观察GFP荧光(图6的A)，结果显示随着加入纳米抗体浓度增加，荧光越少，表明Nb-H6有明显的抑制SARS-COV2假病毒与ACE2结合并进入细胞的作用；为了进一步检测带有GFP荧光的细胞比例，使用流式技术检测48 h后GFP的信号(图6的C和图6的D)，结果与显微镜下观察一致，Nb-H6浓度越高，GFP阳性细胞比例越低，且加入抗体和不加抗体的GFP阳性细胞比例具有显著性差异；根据实验组（含有Nb-H6）和对照组（不含Nb-H6）的GFP阳性细胞比例的比值来表示中和作用(图6的B)，使用四参数-非线性拟合计算得到IC50为8.23 μM，Nb-H6对SARS-COV2 假病毒进入HEK293T-ACE2细胞具有明显的中和作用。
综上，本申请提供的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体Nb-H6，其中，纳米抗体Nb-H6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示；该纳米抗体Nb-H6能够特异性针对新型冠状病毒及其变异株的S1的单域抗体，纳米抗体Nb-H6为一种全新的靶向S1蛋白的中和抗体，能够有效抑制S1蛋白与ACE2结合，并且能有效中和SARS-CoV-2假病毒与ACE2的结合，从而阻止病毒进入并感染细胞；同时Nb-H6与Delta, Alpha以及Omicron突变体均具有很好的亲和力；并且，该单域抗体适用的表达体系选择灵活，既可以在原核系统中表达也可以在酵母细胞或哺乳动物细胞的真核系统中表达，且其在原核表达系统中的表达成本低，可降低后期生产成本，且由于该单域抗体为单结构域抗体，所以其抗体的多组合形式改造更为简单，通过基因工程的方式简单的串联即可以获得多价、多特异性的抗体，并且其免疫异质性很低，在不经过人源化改造的情况下也不会产生较强的免疫反应，该单域抗体的亲和力范围更为宽泛，为后期不同用途的抗体提供多个选择，该单域抗体可以偶联药物分子起到双重或多重靶点治疗作用，应用范围更广。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体及其制备方法与应用
<130> 2020-6-6
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ala Leu Ser Ser Phe His Met
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Ala Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Lys Trp Arg Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Tyr
85 90 95
Arg Gly Arg Trp Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Ala Phe Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
1 5 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Glu Arg Ala Leu Ser Ser Phe His
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Ala Ala Ile Lys Trp Arg Asp Gly Thr Thr Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Tyr Tyr Arg Gly Arg Trp Gly Thr
1 5
<210> 9
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
cagctggtgg agtctggggg aggattggtg caggctgggg actctctgag actctcctgt 60
gcagcctctg aacgggcctt aagtagcttt cacatgggct ggttccgcca ggctccaggg 120
aagcagcgtg cgtttgtagc agcgattaag tggcgtgatg gtactacata ctatgcagac 180
tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaacgcca agaacacggt gtatctgcaa 240
atgaacagcc tggaacctga ggacacagcc gtctattact gttattatcg tgggcgttgg 300
gggacctact ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct caggc 345

Claims (10)

1.一种抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb-H6，其中，所述纳米抗体Nb-H6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，所述纳米抗体Nb-H6中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体Nb-H6的碱基序列如Seq.ID NO.9所示。
4.一种权利要求1~3所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供目的蛋白抗原，将所述目的蛋白抗原包被在免疫管上并与噬菌体文库进行结合，得到目的蛋白抗原-噬菌体文库；
将所述目的蛋白抗原-噬菌体文库进行洗脱处理得到洗脱液，将所述洗脱液与辅助噬菌体进行混合培养并进行富集筛选，并进行单克隆抗体分离和筛选，得到特异性纳米抗体序列；
将所述特异性纳米抗体序列克隆至表达载体中得到重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞中诱导表达并进行纯化，得到靶向新冠病毒的纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白的浓度为40~50 μg/mL。
6.根据权利要求4所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述富集筛选的步骤中，进行3~4轮富集筛选。
7.根据权利要求4所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述表达载体选自pET23a载体。
8.根据权利要求4所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌。
9.权利要求1~3任一所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。
10.权利要求1~3任一所述的抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体在制备检测新型冠状病毒的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
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