CN117106080B - 人源抗鼠疫耶尔森菌LcrV的抗体及其相关产品和用途 - Google Patents

人源抗鼠疫耶尔森菌LcrV的抗体及其相关产品和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人源抗鼠疫耶尔森菌LcrV的抗体及其相关产品和用途，所述抗体能够特异性结合鼠疫耶尔森菌LcrV，且具有非常高的特异性和亲和力，可有效用于检测鼠疫耶尔森菌，在鼠疫耶尔森菌相关的检测试剂或检测产品开发中具有重要的应用价值。

Description

人源抗鼠疫耶尔森菌LcrV的抗体及其相关产品和用途
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及人源抗鼠疫耶尔森菌LcrV的抗体及其相关产品和用途。
背景技术
鼠疫俗称黑死病，是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis，以下简称鼠疫菌)感染引起的一种自然疫源性烈性传染病。人感染鼠疫后可表现为腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫等，其中肺鼠疫发病急，传染性强(可通过飞沫传播)，不及时治疗病死率可达100％。鼠疫在人类历史上共引起三次大流行，共导致了约1.6亿人丧生。
鼠疫菌属于耶尔森菌属(Yersinia)，该属的典型形态是短而粗、两极浓染的小杆菌，有荚膜，无鞭毛和芽孢的革兰阴性菌。鼠疫菌的主要保护性抗原为F1抗原和低钙应答V抗原(low-calcium response V antigen，LcrV)，即V抗原。其中F1为细菌荚膜，是鼠疫的主要保护性抗原。抗F1抗体可协同干扰病原菌的类鞭状体结构(injectosome)头部的V抗原，同免疫细胞间的整合，从而对抗病菌的入侵。V抗原和其他分泌性耶氏菌外膜蛋白(Yersinia outer protein，Yop)YopB及YopD，由75kb LCR质粒编码，构成重要的III型分泌系统(type III secretion system，T3SS)，是鼠疫菌感染入侵的基本毒力因子和诱导机体产生保护性应答的重要抗原，抗V抗体可阻止效应蛋白Yop的递送。V抗原一直是鼠疫研究的热点，同样作为保护性抗原，V抗原和F1抗原具有协同保护效应，目前在研的鼠疫重组亚单位疫苗也都是采用F1+V的组合。同时针对V抗原的单克隆抗体也具有与F1抗体协同保护效果，甚至非保护性的V抗体也能明显提高F1抗体的保护效果。
因此，本研究拟采用基因工程手段，拟从鼠疫疫苗临床试验受试者外周血中获得针对鼠疫V抗原的全人源单克隆抗体，初步评价鼠疫抗体与抗原结合特异性参数等，进而深入了解鼠疫的致病机制，为研究人体针对鼠疫抗原免疫应答奠定基础，为制备针对鼠疫的诊断及治疗提供候选分子。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供人源抗鼠疫耶尔森菌LcrV的抗体及其相关产品和用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗鼠疫耶尔森菌LcrV的单克隆抗体。
进一步，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1-3，所述轻链可变区包含LCDR1-3；
所述HCDR1-3为如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的HCDR1-3；
所述LCDR1-3为如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区中的LCDR1-3。
进一步，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示或分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3具有至少70％同源性；
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6所示或分别与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少70％同源性。
在某些实施方案中，与所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3具有至少70％同源性的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的抗体同样包含在本发明的保护范围内，其中，至少70％同源性包括至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少86％同源性、至少87％同源性、至少88％同源性、至少89％同源性、至少90％同源性、至少91％同源性、至少92％同源性、至少93％同源性、至少94％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性或者至少99％同源性。
在本发明中，所述同源性是指一定程度的互补性。可以是部分同源、基本同源或完全同源。基本同源是指至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列。可在低严谨性条件下使用杂交实验(Southern或northern印迹，溶液杂交等)检验对完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本同源的序列或杂交探针在低严谨性条件下将竞争并抑制完全同源序列与靶序列的结合。这并不是说低严谨性条件允许非特异性结合；低严谨性条件需要两条序列的相互结合是特异性(选择性)相互作用。
在某些实施方案中，本发明所述HCDR1、HCDR2、HCDR3对应的氨基酸序列并不局限于如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，本发明所述LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的氨基酸序列也并不局限于如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，采用任何CDR编号方案(现有的CDR编号方案或将来产生的新的CDR编号方案)分别对如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3进行定义、对如SEQ IDNO:8所示的轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3进行定义得到的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。
在具体实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3是根据IMGT编号方案、Chothia编号方案、Kabat编号方案、Martin(增强型Chothia)编号方案、AbM编号方案、Aho编号方案、Contact编号方案中的任意一种定义或任意多种(两种或两种以上)组合定义得到的，经上述定义方式定义得到的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3对应的抗体的序列同样包含在本发明的保护范围内。
本发明的第二方面提供了一种双特异性抗体。
进一步，所述双特异性抗体包含本发明第一方面所述的单克隆抗体；
优选地，所述双特异性抗体还包含一个与其它抗原特异性结合的第二抗体；更优选地，所述第二抗体特异性结合鼠疫耶尔森菌F1抗原。
在某些实施方案中，本发明所述的第二抗体并不局限于特异性结合鼠疫耶尔森菌F1抗原，能够特异性结合目前本领域已知的任何抗原的第二抗原均可与本发明第一方面提供的单克隆抗体结合形成双特异性抗体，基于此得到的双特异性抗体均包含在本发明的保护范围内。
本发明的第三方面提供了一种分离的多核苷酸。
进一步，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体；
优选地，编码本发明第一方面所述单克隆抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
优选地，编码本发明第一方面所述单克隆抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明中，所述多核苷酸一般是指任何核酸序列，例如，任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，它可以是未修饰的RNA或DNA，或者修饰的RNA或DNA。包括但不限于：单链和双链DNA，包括单链和双链区的DNA，单链和双链RNA以及包括单链和双链区的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子(可为单链或(更典型的)双链或包含单链和双链区)。也包括含有RNA或DNA或者RNA和DNA的三链区。具体而言，包括mRNA、cDNA和基因组DNA及其任何片段。所述多核苷酸包括含有一个或多个修饰碱基如含氚碱基或非常见碱基如肌苷的DNA和RNA。本发明所述的多核苷酸可涵盖编码或非编码序列，或正义或反义序列或iRNA如siRNA。应当理解的是本文中每一处提及的多核苷酸或类似术语将包括全长序列，及其任何互补序列、片段、变化形式、衍生物或变体。
本发明的第四方面提供了一种表达载体。
进一步，所述表达载体包含本发明第三方面所述的多核苷酸；
优选地，所述载体包括质粒、病毒来源的载体、噬菌粒、粘粒、人工染色体；
更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体。
在本发明中，对表达本发明所述单克隆抗体或双特异性抗体的编码序列的载体并无特别限制，包括但不限于：微生物体如重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(如杆状病毒)转化的昆虫细胞系统；病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)或细菌表达载体(如Ti、pBR322质粒)转化的植物细胞；或动物细胞系统。对于细菌，有用的质粒包括Invitrogen公司的pET、pRSET、pTrcHis2和pBAD质粒；Novagen公司的pET和pCDF质粒以及Sigma-Aldrich公司的DirectorTM质粒。对于产甲烷菌，有用的质粒包括但不限于pME2001、pMV15和pMP1。
控制元件和调节序列是载体的非翻译区-增强子、启动子、5′和3′非翻译区--它们与宿主细胞蛋白质相互作用，进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可能不同。根据所使用载体系统和宿主类型，可使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当克隆进细菌系统时，可使用诱导型启动子，如BLUESCRIPT噬菌粒或pSPORT1质粒的杂交lacZ启动子等。可在昆虫细胞中使用杆状病毒多角体蛋白启动子。可将来源于植物细胞基因组(如热休克、RUBISCO和存储蛋白质基因)的启动子或增强子或来自于植物病毒的启动子或增强子(如病毒启动子或前导序列)克隆到载体中。
本发明的第五方面提供了一种宿主细胞。
进一步，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述的多核苷酸或本发明第四方面所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；
更优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；
更优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、链球菌、放线菌；
最优选地，所述哺乳动物细胞包括NS0细胞、CHO细胞、COS细胞、HEK293细胞、Vero细胞、卵母细胞。
在本发明中，对所述宿主细胞的类型并无特别限制，任何适当的宿主细胞均可用于编码本发明所述单克隆抗体的DNA序列或本发明所述核酸分子的表达，包括但不限于：哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。在一些实施方案中，优选为哺乳动物细胞为宿主细胞。
本发明的第六方面提供了一种检测试剂或检测产品。
进一步，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体；
优选地，所述检测试剂还包含与本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体偶联或缀合的诊断剂；
更优选地，所述诊断剂包括生物发光剂、化学发光剂、顺磁性离子、放射性核素、酶、光敏诊断剂；
优选地，所述检测产品包含所述检测试剂；
更优选地，所述检测产品包括检测试剂盒、检测试纸条、检测芯片。
在本发明中，所述诊断剂并不局限于生物发光剂、化学发光剂、顺磁性离子、放射性核素、酶、光敏诊断剂，任何能够与本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体偶联或缀合以用于鼠疫耶尔森菌检测或鼠疫耶尔森菌感染性疾病诊断的试剂均在本发明的保护范围内。
本发明的第七方面提供了一种药物组合物或药物制剂。
进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体；
优选地，所述药物制剂包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体和/或所述药物组合物。
在某些实施方案中，本发明提供的药物组合物或药物制剂可通过任何本领域已知的途径对有需要的受试者进行施用，包括但不限于：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠方式。
在某些实施方案中，本发明提供的药物制剂的剂型包括但不限于：注射剂、片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊剂、凝胶剂、糖浆、浆液或混悬剂。
在某些实施方案中，本发明提供的药物组合物或药物制剂中还可包含药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂包括但不限于：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇；淀粉；甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠；阿拉伯胶、黄芪胶；明胶、胶原；交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐，如藻酸钠；滑石粉、硬脂酸镁；脂肪油；聚乙二醇；卡波姆凝胶；二氧化钛；可食用染料；右旋糖苷。
本发明的第八方面提供了如下任一种方法：
(1)一种生产本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤：在适合抗体产生的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从宿主细胞培养产物中分离得到本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体；
(2)一种制备本发明第五方面所述的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体引入到宿主细胞中，得到本发明第五方面所述的宿主细胞；
(3)一种非诊断目的地检测待测样品中鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第六方面中所述的检测试剂与待测样品接触，检测LcrV蛋白与所述抗体免疫复合物的形成。
本发明的第九方面提供了如下任一种应用：
(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白的检测试剂中的应用；
(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面中所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白的检测产品中的应用；
(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面所述的检测试剂或检测产品在制备用于诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的产品中的应用；
(4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面所述的检测试剂或检测产品在非诊断目的地检测鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白中的应用；
(5)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染性疾病的药物组合物或药物制剂中的应用。
此外，本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：采用本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面所述的检测试剂或检测产品对受试者来源的待测样品进行检测，通过抗原抗体反应来检测待测样品中鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白的存在情况，以诊断和/或辅助诊断受试者是否患有鼠疫耶尔森菌感染性疾病。
在某些实施方案中，本发明对待测样品并无特别限制，所述待测样本来源于有需要的受试者的临床样本，包括但不限于：细胞、组织、体液，例如：皮肤；黏膜；血液；血液衍生物，例如血清；提取的胆汁；活组织检查或手术取出的组织，包括例如未固定的、冷冻的、固定在福尔马林和/或包埋在石蜡中的组织；泪液；乳汁；皮屑；表面清洗液；尿液；痰液；脑脊液；前列腺液；脓；骨髓吸出物；中耳流出物；支气管肺泡灌洗物；痰液或唾液。在另一些实施方案中，所述待测样品还可以是环境样品或食品样品。
此外，本发明还提供了一种治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第七方面所述的药物组合物或药物制剂。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明提供了一种全新的针对鼠疫耶尔森菌LcrV抗原的全人源单克隆抗体RV-B4，经实验验证发现，所述单克隆抗体RV-B4能够特异性结合鼠疫耶尔森菌LcrV，且具有非常高的特异性和亲和力，可有效用于检测鼠疫耶尔森菌，在鼠疫耶尔森菌相关的检测试剂或检测产品开发中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为噬菌体ELISA筛选文库中的目的抗体；
图2为3株人源单克隆抗体与rV重组蛋白结合特异性鉴定结果，其中，A图：3株人源单抗与rV蛋白间接ELISA结果图；B图：3株抗体与rV蛋白的Western Blot结果图，其中，M为相对分子质量标准，1，2，3分别为RV-B4，RV-D1和RV-E8抗体；
图3为3株人源单克隆抗体与rV抗原结合的动力学分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例针对鼠疫V抗原的全人源单克隆抗体的筛选及效果验证
1、材料与方法
1.1抗原、全血标本、菌株、实验动物
鼠疫耶尔森菌重组V抗原(recombinant low-calcium response V，rV)由兰州生物制品研究所有限责任公司保存并提供；5份全血标本来自于兰州生物制品研究所有限责任公司的鼠疫重组疫苗II期临床项目(临床试验批件号：2012L01329)；鼠疫菌强毒株141株由青海地方病预防控制所鼠疫专业实验室分离鉴定并保存；BALB/c小鼠购自江苏华创信诺生物公司。克隆菌株DH5α，建库菌株XL1-Blue均由本室保存。
1.2载体、细胞、试剂耗材
建库载体pComb3XSS，抗体IgG表达载体pGI由本室构建及保存；HEK293F购自ACTTT；人单核细胞系THP-1由本室保存；反转录试剂盒，PCR试剂购自TaKaRa公司；SfiI内切酶，T4链接酶购自NEB公司；TNFαCBA试剂盒购自BD公司；其他化学试剂均为分析纯。
1.3文库构建
经知情同意及伦理审查，从鼠疫疫苗II期临床项目中采集完成三次免疫后的志愿者全血标本共5份，每份采集10mL抗凝血。使用Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，使用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取总RNA，然后采用Roche公司的第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis for RT-PCR进行反转录。根据文献报道方法扩增抗体的轻链及重链可变区基因，并且经过融合PCR链接成ScFv片段(参考文献：KüGLER J,TOMSZAK F,FRENZEL A,et al.Construction of Human Immune andNaive scFv Libraries[J].Methods Mol Biol,2018,1701:3-24.)。ScFv片段经SfiI酶切后与同样经SfiI酶切的pComb3XSS载体链接后电击宿主菌XL1-Blue感受态制备噬菌体抗体文库，噬菌体抗体文库经野生型辅助噬菌体VCSM13包装后进行后续筛选，具体方法按文献进行。
1.4文库筛选
按照结合、洗涤、洗脱、扩增的方式，对上述噬菌体展示抗体文库进行亲和淘选。将重组表达的鼠疫rV抗原包被于免疫管中进行固相化，包被浓度依次为500、300、200ng/mL。具体步骤如下：向免疫管中加入相应量的rV蛋白，4℃包被过夜；弃上清，0.05％ PBST洗板3次，加入3％ BSA 37℃封闭2h；弃封闭液，0.05％ PBST洗板3次，加入抗体文库，37℃先振荡孵育1h，再静置孵育1h；弃上清，0.1％ PBST洗涤10次，加入PH＝2.2的0.1M Gly-HCl洗脱，再用2M Tris中和至PH＝7.0，取10μL测定滴度，剩余噬菌体感染XL1-Blue宿主菌后进行扩增，次日用PEG6000沉淀噬菌体再进行下一轮筛选。
1.5阳性克隆鉴定
从第三轮筛选测滴度的平板上随机挑取96个单菌落于96孔深孔板中，37℃260rpm培养4h，然后1：10转接至新的深孔板中再震荡培养4h，加入1mM IPTG 37℃诱导过夜。次日用间接ELISA法检测上清中抗体的表达，具体如下：首先将鼠疫rV抗原以200ng/孔包被于96孔酶标板中，加入50μL 3％脱脂牛奶和50μL深孔板中表达上清，37℃震荡孵育1h，PBST洗板3次，加入HRP标记的抗M13噬菌体单克隆抗体，37℃孵育30min后，PBST洗板，加入TMB显色液显色10min，用2M硫酸溶液终止反应后读取OD450的吸光度值。阳性克隆提质粒后送测序，测序结果经IMGT数据库比对抗体可变区的基因序列，选取序列有差异的克隆进行全抗体表达。
1.6抗鼠疫rV人源IgG1型全抗体表达
将rV抗体的重链可变区基因经AgeI和SalI酶切位点克隆入全抗体表达载体pGI-H，轻链基因经AgeI和BsiwI酶切位点克隆入pGI-K载体。测序正确后，使用PEI转染试剂将双质粒共转染293F细胞，5天后收取细胞上清，用Protein A柱纯化目的抗体。
1.7rV人源抗体与rV抗原结合特异性鉴定
采用间接ELISA及Western Blot法鉴定人源抗体与rV抗原的结合特异性。首先，将rV蛋白以200ng/孔包被96孔酶标板，纯化抗体从1μg/mL开始倍比稀释，一抗37℃孵育1h，PBST洗涤后加入HRP标记的抗人IgG，然后37℃孵育30min，后TMB显色，终止后读取OD450吸光度值，每个样品重复3次取平均值。然后，对目的抗体进行Western Blot检测，将10μg的rV蛋白经SDS-PAGE后，将PAGE胶上蛋白转印到PVDF膜中，经3％脱脂牛奶封闭及重组rV人源单抗孵育，洗涤后加入HRP标记的抗人IgG。最后用DAB直接在PVDF膜上显色。
1.8抗体亲和力测定
本研究使用生物膜干涉技术(BLI)检测人源抗体与rV抗原结合的亲和力及动力学参数。使用Pro A传感器将抗体固化于传感器表面，再与稀释后的rV抗原反应，通过分析表面光干涉的改变得到分子间相互作用的信息。使用Octet Red96大分子作用仪实时监测整个结合及解离过程。具体步骤包括：Pro A传感器预湿、传感器平衡、固化抗体、固化后平衡、结解离以及传感器再生，利用ForteBio Data Acquistion软件实时采集和分析分子相互作用和结合动力学数据。具体操作方法参考仪器说明。
2、实验结果
2.1人源抗鼠疫耶尔森菌噬菌体文库的构建
收集了5份鼠疫疫苗接种后志愿者的外周全血，通过密度梯度离心分离出PBMC，分别提取mRNA和反转录，然后将cDNA等比例混合后用19对人ScFv引物分别扩增抗体的轻重链可变区序列，大小均为350bp左右。然后采用Overlapping PCR将轻重链随机连接成ScFv，大小约为700bp左右。酶切后连接噬菌体载体，连接产物电击2次XL1-Blue感受态细胞，测定文库的库容量达7.54×108CFU(colony-forming units)，经菌落PCR验证文库中正确插入率为100％。
2.2人源抗体的筛选及抗体序列分析
经3轮筛选后，挑取的96个单克隆菌落，经过IPTG诱导及噬菌体ELISA，确定OD450nm>1.0的阳性克隆29个，经测序后得到轻重链序列完整的克隆26株，如图1。经过IMGT数据库比对序列，获得3株特异性单克隆抗体，分别命名为RV-E8、RV-B4、RV-D1。3株抗体序列经IMGT数据库分析，发现RV-B4抗体的VH基因为VH1-46家族，轻链为Lambda 1-51；RV-D1和RV-E8重链均为VH3-30，轻链分别为Kappa链的VK3-20和VK1-39胚系基因，如表1所示。其中，抗体RV-B4的序列信息如表2所示。
表1 3株rV特异性抗胚系基因及变异度分析
表2抗体RV-B4的序列
2.3人源抗体与rV抗原结合特异性鉴定
为了进一步确定表达纯化的3株人源抗体与rV抗原结合的特异性，本发明分别进行了抗体与rV重组蛋白的间接ELISA和Western Blot实验。如图2A，3株人源抗体与rV重组蛋白ELISA结果显示所述3株抗体均能与rV抗原特异性结合，且对该重组抗体的检测灵敏度可达3ng/mL左右。Western Blot结果显示2株抗体均能与rV抗原反应，在37kD处出现明显条带，同时此结果显示所述3株抗体均识别抗原上的线性表位，如图2B。以上结果表明了3株抗体RV-E8、RV-B4、RV-D1对rV抗原均具有较高的特异性。
2.4抗体亲和力测定
利用膜干涉技术，对3个人源单克隆抗体分别与rV抗原结合、解离数据进行分析。结果如图3所示，结果显示3个鼠疫抗体与rV抗原均有很高的亲和力，其中RV-E8的Kd值最高，为1.24nM，RV-B4和RV-D1的KD值分别为2.1nM和42nM。以上结果表明了3株抗体RV-E8、RV-B4、RV-D1对rV抗原均具有很高的亲和力。

Claims (24)

1.一种抗鼠疫耶尔森菌LcrV的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1-3，所述轻链可变区包含LCDR1-3；
所述HCDR1-3为如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的HCDR1-3；
所述LCDR1-3为如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区中的LCDR1-3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1或2所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1或2所述单克隆抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
5.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1或2所述单克隆抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述载体包括质粒、病毒来源的载体、噬菌粒、粘粒或人工染色体。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸或权利要求6-8中任一项所述的表达载体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括真核细胞或原核细胞。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。
12.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、链球菌或放线菌。
13.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括NS0细胞、CHO细胞、COS细胞、HEK293细胞、Vero细胞或卵母细胞。
14.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。
15.根据权利要求14所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包含与权利要求1或2所述的单克隆抗体偶联或缀合的诊断剂。
16.根据权利要求15所述的检测试剂，其特征在于，所述诊断剂包括生物发光剂、化学发光剂、顺磁性离子、放射性核素、酶或光敏诊断剂。
17.一种检测产品，其特征在于，所述检测产品包含权利要求14-16中任一项所述检测试剂。
18.根据权利要求17所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品包括检测试剂盒、检测试纸条或检测芯片。
19.一种生产权利要求1或2所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在适合抗体产生的条件下，培养权利要求9-13中任一项所述的宿主细胞，从宿主细胞培养产物中分离得到权利要求1或2所述的单克隆抗体。
20.一种制备权利要求9-13中任一项所述的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1或2所述的单克隆抗体引入到宿主细胞中，得到权利要求9-13中任一项所述的宿主细胞。
21.一种非诊断目的地检测待测样品中鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求14-16中任一项所述的检测试剂与待测样品接触，检测LcrV蛋白与所述抗体免疫复合物的形成。
22.权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸、权利要求6-8中任一项所述的表达载体和/或权利要求9-13中任一项所述的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白的检测试剂中的应用。
23.权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸、权利要求6-8中任一项所述的表达载体、权利要求9-13中任一项所述的宿主细胞和/或权利要求14-16中任一项中所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白的检测产品中的应用。
24.权利要求1或2所述的单克隆抗体、权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸、权利要求6-8中任一项所述的表达载体、权利要求9-13中任一项所述的宿主细胞、权利要求14-16中任一项所述的检测试剂和/或权利要求17或18所述的检测产品在非诊断目的地检测鼠疫耶尔森菌LcrV蛋白中的应用。
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